Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:IgG- и IgE-аутоантитела у больных атопическим дерматитом

На правах рукописи

Самойликов Павел Владимирович

/

ДО- и 1§Е-АУТОАНТИТЕЛА У БОЛЬНЫХ АТОПИЧЕСКИМ ДЕРМАТИТОМ

14.00.36. - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва -2005

Работа выполнена в ГУ Научно-исследовательском институте вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова РАМН.

Научный руководитель:

заслуженный деятель науки, профессор, доктор медицинских наук В. Б. Гервазиева.

Официальные оппоненты:

член-корр. РАМН

профессор, доктор медицинских наук И. И. Балаболкин

доктор биологических наук И. В. Мирошниченко.

Ведущее учреждение:

Московский НИИ педиатрии и детской хирургии МЗСР.

Защита состоится «#»2005 года в часов на заседании диссертационного совета Д 001.035.01 при ГУ НИИВС им И.И. Мечникова РАМН по адресу: 105 064, г Москва, Малый Казенный пер., д. 5а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН.

Автореферат разослан «#» 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета канд. биол. наук

И В"Яковлева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Среди аллергических заболеваний одно из ведущих мест занимает атопический дерматит (АД) - распространенный, упорно протекающий дерматоз, занимающий в структуре аллергических заболеваний 50-60%, причем эта цифра неуклонно растет.

Рост числа аллергических заболеваний в развитых странах связывают с факторами окружающей среды и с изменившимся типом инфекционного воздействия на человека. Инфицирование вирусами семейства Herpesviridae, в частности, вирусом простого герпеса утяжеляет клиническое течение и характер аллергопатологии [Огородова JI.M., Козина О.В., 2002].

АД сохраняет свои клинические признаки на протяжении многих лет и нередко трансформируется в бронхиальную астму с так называемым тяжелым атопическим синдромом [Lawrence F. с соавт., 2003]. Многолетние наблюдения за больными, страдающими АД, позволяют говорить о нем, как о системном заболевании с поражением не только кожи, но и внутренних органов, таких как органы пищеварения, JIOP-органы, дыхательная система, мочевыводящие пути.

Ведущим иммунопатологическим механизмом в развитии АД является изменение соотношения Th \ /ТЬ2-лимфоцитов в пользу последних с появлением характерной IgE-реактивности и высокой продукцией специфических IgE-антител к различным экзоаллергенам. В то же время имеются данные об участии клеточно-опосредованных аллергических реакций в иммунопатогенезе АД, особенно его хронических тяжелых форм.

Кроме того, в последние годы указывается на возможное участие аутореактивности в патогенезе АД и в частности, иммунного ответа к человеческим белкам, содержащимся в клетках разных органов: кожа, легкие, мышцы и мозг. Более того, обострение АД у определенных больных оказалось связанным с увеличением IgE-аутореактивности [Valenta R. с соавт., 1996-1997].

Одним из механизмов запуска аутоиммунного феномена может быть активация иммунной системы перекрестно-реактивными антигенами (аллергенами). Так, молекулярный анализ многих аллергенов выявил их сходство с человеческими белками [Crameri R. с соавт., 1996; Valenta R с со авт., 1991]. При этом аллергены даже с низким уровнем гомологии в структуре или ее полным отсутствием могут хорошо имитировать трехмерную структуру человеческих белков [De Marino S. с соавт., 1999; Fedorov А. А. с соавт., 1997].

В этом аспекте можно рассматривать также явление микробной мимикрии как один из механизмов запуска аутоиммунной патологии при ряде аллергических заболеваний. Установлено наличие общих антигенов у Proteus mirabilis, Moraxella catarrhalis, Yersinia enterocolitica с антигенами человеческих тканей [Маркина О. А., 2003.]. Кроме того, выявлены IgG-AT к Р62 белку - синтетическому пептиду, соответствующему антигену вируса Эпштейна-Барр, которые реагируют с человеческим эпидермальным кератином, денатурированным коллагеном 2-го типа и актином [Davies J.M., 1997.].

Все это говорит о том, что наряду с атопией в механизме формирования АД определенную роль могут играть аутоиммунные реакции, определяющие хроническое рецидивирующее течение заболевания.

Таким образом, определение аутоиммунного компонента к тем или иным тканевым антигенам и выяснение взаимоотношения его с определенными показателями атопии и состоянием гуморального противовирусного иммунитета у больных АД может представлять определенный интерес в плане понимания патогенеза этого сложного хронического заболевания.

Цель и задачи исследования

Цель - выявить в сыворотке крови IgG- и IgE-AT к некоторым тканевым антигенам и оценить их взаимоотношение с уровнем IgG-ответа к антигенам вирусов семейства Herpesviridae у больных атопическим дерматитом.

Задачи:

1. Сформировать группы больных АД разной возрастной категории, длительностью течения и тяжестью заболевания и определить некоторые иммунологические показатели: уровень общего IgE, IgE-AT к инфекционным и неинфекционным аллергенам и IgG-ответ к антигенам вирусов семейства Herpesviridae.

2. Создать многокомпонентную иммуноферментную тест-систему для количественного определения IgG - и IgE-AT к тканевым антигенам и определить нормальные значения этих антител у здоровых.

3. Определить содержание IgG- и IgE-AT к тканевым антигенам у больных АД в зависимости от тяжести заболевания.

4 Выявить взаимоотношение между аутоиммунными, атопическими реакциями и гуморальным ответом на хронические вирусы герпетической группы у больных АД.

Научная новизна.

1. Создана многокомпонентная иммуноферментная тест-система для количественного определения IgG- и IgE-антител к 7 тканевым антигенам и впервые определены среднестатистические значения содержания этих антител в сыворотке крови здоровых лиц разного возраста.

2. Впервые у больных АД детей и взрослых выявлено повышенное содержание IgG- и IgE-аутоантител к широкому спектру тканевых антигенов, особенно высокое к коллагену III и VI типа, кератину и миозину, при этим установлена прямая корреляция между уровнем этих антител, уровнем общего IgE и степенью тяжести заболевания.

3. Впервые у больных АД легкой и средней степени тяжести установлена прямая коррелятивная связь между содержанием ^в-АТ к некоторым тканевым антигенам и уровнем ^й-антител к вирусам семейства НегрешгШе.

4. Впервые показано, что у детей с АД уровень ^й-АТ к вирусам Негрешпекге коррелирует с общим ^Е.

Практическая значимость.

Созданная тест система для количественного определения и ^в-АТ к тканевым АГ может быть использована в качестве дополнительного иммунологического метода диагностики АД.

Основные положения выносимые на защиту.

1. Многокомпонентная иммуноферментная тест-система позволяет определить количественное содержание и 1§Е-антител к 7 тканевым антигенам (кератин, коллаген VI и III типа, эластин, антиген ткани легкого, миозин, ОБМ) в сыворотке крови человека, в том числе установить их «нормальные» значения.

2. АД у детей и взрослых сопровождается образованием повышенного содержания и 1§Е-аутоантител к антигенам, которые представлены в органах-мишенях атопии. Повышенное содержание и частота выявления этих аутоантител зависят от тяжести течения заболевания.

3. Установленная прямая корреляция между повышенным уровнем 1яС- и ^Е-АТ к некоторым тканевым антигенам (АГ ткани легкого, коллаген VI типа, тиреоглобулин) и содержанием общего 1§Е, повышенным уровнем ^в-АТ к АГ ткани легкого, эластина и уровнем ^в-АТ к ВПГ, а также повышенным уровнем ДО-АТ к ВПГ и уровнем общего может свидетельствовать об участии ауторективности и хронической вирусной инфекции в патогенезе АД.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе 2 статьи в центральных журналах.

Апробация диссертации.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на конференции молодых ученых НИИВС им И. И. Мечникова (Москва, 2004 г.), на IV Российском конгрессе «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии» М.2005 г. и IV конференции иммунологов Урала г. Уфа 2005 г. Апробация диссертации состоялась на заседании отдела аллергологии института 29.09.2005.

Объем и структура диссертации:

Материалы диссертации изложены на JfrT страницах машинописного текста, иллюстрированы 4 рисунками и 27 таблицами, состоят из введения, обзора литературы, 6 глав результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка использованной литературы, включающего 116 источников.

Собственные исследования.

Материалы и методы исследования.

1 Материалы.

Объектом исследования служили сыворотки крови 108 больных, находившихся на обследовании в клинико-диагностическом центре НИИВС им И.И.Мечникова и МОНИКИ им. Владимирского с диагнозом АД, а также сыворотки крови 53 здоровых людей.

В работе были использованы коммерческие реагенты для ИФА: полистироловые микроячеистые модули фирмы Costar (Дания); препараты антигенов кератина, коллагена VI и III типа, эластина, миозина, ОБМ фирмы

Sigma (США); мышиные моноклональные антитела к IgG человека (клон 21g/5A9) и пероксидазный конъюгат анти-IgE-MKAT фирмы ООО «Полигност» (С-Петербург, Россия); референс-стандарты для количественного определения IgG- и IgE-AT к аллергенам фирмы Dr Fooke (Германия).

Антиген ткани легкого, полученный методом субклеточного фракционирования, был любезно предоставлен лабораторией иммунохимической диагностики НИИВС им. И.И. Мечникова (руководитель лаб. K.M.H. H. Е. Ястребова).

2. Методы исследования.

Получение конъюгата МкАТ к IgG человека с пероксидазой хрена проводили методом периодатного окисления по Nakane (1974).

Определение общего уровня IgE проводили с использованием набора реагентов для количественного иммуноферментного определения общего IgE в сыворотке крови фирмы ООО «ЦКФФ» (Россия) в соответствии с инструкцией по применению.

Определение содержания IgE-специфических антител к бытовым, пищевым аллергенам и аллергенам условно-патогенных микроорганизмов проводили с помощью метода ИФА, разработанного в лаборатории аллергодиагностики НИИВС им. И. И. Мечникова РАМН.

Определение уровня противовирусных IgG-AT проводили с помощью коммерческих наборов ЗАО «ВЕКТОР-БЕСТ» (г. Новосибирск, Россия) с использованием очищенных рекомбинантных антигенов вируса простого герпеса (ВПГ) и цитомегаловируса, белка EBNA-1 р72 в соответствии с инструкцией по применению. Содержание IgG-AT к вирусам выражали в единицах оптической плотности ОП.

Определение IgG-AT к тиреоглобулину проводили с помощью коммерческого набора НПЦ «Медицинская иммунология» (Россия) в соответствии с инструкцией по применению. За нормальный уровень

IgG-AT к тиреоглобулину у детей и взрослых принимали значение ниже 100 МЕ/мл.

Определение IgE-AT к тиреоглобулину проводили с помощью метода ИФА, разработанного в лаборатории иммунологической диагностики эндокринных заболеваний НИИВС им. И. И. Мечникова РАМН (зав. лаб. к. м. н. Н. С. Кузьмина). Содержание IgE-AT к тиреоглобулину выражали в единицах ОП.

Полученные результаты обрабатывали с использованием компьютерных программ Microsoft Excel и StatSoft Statistica 6, вычисляя средние арифметические значения, средние квадратичные отклонения, средние квадратичные ошибки и доверительные границы, а также достоверность разности средних арифметических и коэффициент корреляции.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Характеристика групп больных АД на основании тяжести заболевания и иммунологического исследования.

Исследованные в работе сыворотки крови получены от больных с

диагнозом АД и здоровых людей, которые были разделены на группы в зависимости от возраста (табл. 1).

Таблица 1.

Групповое распределение больных АД и здоровых.

Возраст Число сывороток

Больные АД Здоровые

От 1 года до 6 лет 11 мес. (дошкольный возраст) 62 17

От 7 до 17 лет 11 мес. (школьный возраст) 24 12

От 18 лет и старше (взрослые) 22 24

Итого: 108 53

Таким образом, каждой группе больных соответствовала контрольная группа здоровых.

Давность заболевания у детей составила от 1 года до 13 лет, у взрослых -от 15 до 30 лет.

Большая часть больных имела легкую или среднюю степень тяжести АД. Поскольку больные с тяжелым течением АД составили лишь 6,5 % всей выборки и были представлены не во всех группах обследования, мы сочли возможным исключить их из рассмотрения при анализе связи полученных результатов со степенью тяжести заболевания.

Результаты определения содержания общего у больных и здоровых людей контрольных групп представлены в табл. 2.

Из таблицы видно, что во всех группах больных АД среднее значение содержания общего ^Е было выше возрастной нормы: в 5,49 раз в группе детей школьного возраста, в 46,1 раз в группе детей дошкольного возраста и в 20,2 раза у взрослых. Уровень общего 1§Е в группах контроля практически не превышал нормальные значения (не более 2 человек имели значения общего 1{>Е выше нормальных).

Таблица 2.

Определение общего 1&Е в сыворотках больных АД.

Группы Чис- Содержа- Частота Частота Коэффициент

обследованных ло ние выявления выявления увеличения

лиц общего повышенного высокого уровня

1£Е (М±т) вкЕ/л уровня общего (%) (>1000 кЕ/л) уровня ^ (%) общего 1дЕ (1йЕМеЕ)

Боль- дети 62 404±65 89 12,9 46,1*± 10,94

ные дошкольного

АД возраста

дети 24 396±58 54 16,7 5,49*±1,2

школьного

возраста

взрослые 22 1569±300 68 31,8 20,2*±6,3

Здоро- дети 17 12±3,2 12 0 2,4А 1,5

вые дошкольного возраста

дети 12 57±4,5 8 0 2,1±0,8

школьного

возраста

взрослые 24 66,7±12,8 8 0 0,68±0,3

* - достоверное различие значений общего 1§Е между группами больных и

здоровых (1>2,4; р<0,05)

Сыворотки больных всех групп содержали 1§Е-АТ к бытовым аллергенам и аллергенам условно-патогенных микроорганизмов. Сенсибилизация к пищевым аллергенам была выявлена только у детей. Частота выявления 1§Е-АТ ко всем изучаемым аллергенам у детей увеличивалась с возрастом, в то время как у взрослых она была ниже, чем у детей школьного возраста. В группе контроля сенсибилизация к бытовым, пищевым и бактериальным аллергенам практически отсутствовала.

Степень сенсибилизации к исследуемым спектрам аллергенов, соответствующая классу реакции 4 (очень высокая), не выявлялась ни у одного больного АД.

Таким образом, результаты иммунологического исследования сывороток больных АД показали увеличение уровня общего 1{>Е у большей их части и наличие сенсибилизации к экзоаллергенам.

2. Определение ^в-АТ к антигенам вирусов группы Негреютйае.

Для оценки гуморального ответа к вирусам семейства Негреытйае у больных АД в сыворотках 52 больных и сыворотках 40 лиц групп контроля определяли содержание ^в-АТ к вирусу простого герпеса (ВПГ), цитомегаловирусу (ЦМВ), вирусу Эпштейна-Барр (ВЭБ). Результаты представлены в табл. 3.

Таблица 3.

Содержание ^С-АТ к вирусам семейства НегреыЬШае у больных АД н в группах

здоровых.

Группы обследованных Число обследованных Уровни ^в-АТ к вирусам (М + т) в единицах ОП

ВПГ ЦМВ ВЭБ

Дета с АД 31 1,2 + 0,23* 1,68 + 0,22* 2,17 + 0,17

Взрослые с АД 21 2,3 ±0,24* 2,4 ±0,19* 2,4 + 0,13

Здоровые дети 16 0,97 ±0,25* 1,2 ±0,25* 1,9+0,2

Здоровые взрослые 24 2,25 ±0,24* 2 ±0,21* 2,8 + 0,7

Максимальные значения ОП нормального содержания ВДЗ-АТ к вирусам.

0,3 0,3 0,45

* - достоверность различия между уровнем ДО-АТ у детей и взрослых.

Видно, что содержание 1§0-АТ к герпесвирусной инфекции повышено во всех группах обследованных. При этом и у больных АД, и здоровых уровень ^в-АТ к ВПГ оказался достоверно более высоким у взрослых (1 = 3,3, р < 0,05; 1=4,7, р<0,05). Ту же закономерность можно отметить при анализе данных содержания АТ к ЦМВ (больные АД - I = 2,4; группа контроля - г = 3,3; р < 0,05). Гуморальный иммунный ответ к ВЭБ оказался примерно одинаковым во всех группах исследования.

Выявление возрастных отличий в уровне гуморального иммунного ответа может отражать тенденцию к постепенному нарастанию титра с увеличением длительности персистенции ВПГ и ЦМВ в организме.

Анализ полученных данных не выявил зависимоста содержания ^в-АТ к вирусам семейства Негреьтпйае у больных АД от степени тяжести заболевания.

Взаимосвязь между уровнями 1§С-АТ к вирусам и повышенным уровнем общего являющегося одним из основных показателей наличия атопии, представлена в табл. 4.

Таблица 4.

Корреляция уровней противовирусных ^С-АТ и уровня общего Ц>Е.

Вирусы семейства НеграшШае Коэффициент корреляции (г) между уровнем общего 1&Е и Ь&ЛТ к вирусам в сыворотках

Дети с АД Взрослые с АД Группы контроля

Здоровые дети Здоровые взрослые

ВПГ <М2* -0,01 -0,16 0,19

ЦМВ 0,21 -0,02 0,15 0,24

ВЭБ 0,02 0,39 0,35 -0,23

* - р <0,05

Видно, что в группе детей с АД выявлена четкая взаимосвязь между уровнями 1§0-АТ к ВПГ и общего ^Е (г = 0,42, р < 0,05), т.е. высокий гуморальный ответ к ВПГ коррелирует с высоким уровнем общего 1§Е. Содержание 1§0-АТ к ЦМВ и ВЭБ не коррелировало с уровнем общего ^Е ни в одной из исследуемых групп.

Таким образом, результаты нашего исследования показали, что в уровне IgG-AT к ВПГ и ЦМВ есть возрастные отличия, как у больных, так и у здоровых.

Наши данные о наличии коррелятивной связи между уровнем антител к ВПГ и уровнем общего IgE у детей с АД согласуются с результатами других авторов, показавших, что инфицирование вирусом простого герпеса ассоциировано с достоверно более высоким уровнем общего IgE в сыворотке крови, расширением спектра атопических заболеваний и увеличением числа больных с атопией среди детей и взрослых [Огородова JI.M., Козина О.В., 2002.].

3. Разработка нммуноферментного метода количественного определения IgG- и IgE-антител к тканевым антигенам.

Для выявления аутоантител у больных АД мы сформировали тест-систему, позволяющую количественно определить IgG- и IgE-AT к тканевым антигенам. В основу тест-системы положены разработанные ранее в лаборатории аллергодиагностики НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН метод твердофазного ИФА для количественного определения IgG-AT к ОБМ [Гервазиева В.Б., Воробьева H.JI., Сверановская В.В., 2000], а также метод полуколичественного определения специфических IgE-AT в сыворотках крови, внедренный в производство НПО «Аллерген» (г. Ставрополь).

При выборе антигенов исходили из того, что при АД IgE-аутореактивносгь направлена на антигены следующих тканей и органов-кожа, ЖКТ, легкое, мозг, щитовидная железа и мышцы [Valenta R. с соавт., 1996-1998; Mittermanna I. с соавт., 2004; Mossabeb R. с соавт., 2002; Natter S. с соавт., 1998.]. В этой связи мы использовали 6 коммерческих белков (коллаген III и VI типа, эластин, кератин, ОБМ, миозин) и один экспериментальный препарат - экстракт ткани легкого.

Вначале во всех сыворотках больных АД и здоровых лиц определяли содержание IgG- и IgE-AT к каждому тканевому антигену, учитывая

параметры ИФА ранее разработанные в лаборатории в методах-прототипах. Так, для определения IgG-AT разведение сыворотки составило 1:100 и пероксидазного конъюгата Мк анти-IgG-AT - 1:15000. Для определения IgE-AT разведение сыворотки было 1:4, а разведение пероксидазного конъюгата Мк анти-IgE-AT - 1:3000. В качестве субстрата использовали тетраметилбензидин (ТМБ). Результаты иммуноферментной реакции оценивали в единицах ОП на спектрофотометре ЭФОС 3305 (Россия).

Результаты определения позволили отобрать положительный (пул сывороток крови с повышенным содержанием IgE- и IgG-AT) и отрицательный (пул сывороток крови с низким содержанием IgE- и IgG-AT) контроли. С помощью этих контрольных пулов отрабатывали дозу сорбции тканевых антигенов на полистироловые планшеты фирмы Costar (США) в концентрациях от 1 мкг/мл до 11 мкг/мл при стандартных условиях постановки реакции (рН КББ = 9,6,18 часов при 37° С).

При определении IgE- и IgG-AT для большинства используемых антигенных препаратов оптимальной оказалась доза сорбции в 5 мкг/мл. При этой дозе значения ОП положительного контроля были больше отрицательного в 2 раза и более, что делало тест-систему чувствительной к содержанию низкого и высокого уровней IgE- и IgG-AT.

В результате отработки параметров всех реагентов была создана многокомпонентная унифицированная тест-система для определения IgG- и IgE-AT, в которой каждый тканевой антиген был сорбирован на отдельном стрипе разборного планшета. Исследуемые сыворотки использовали в разведении 1:4 и 1:100 (дня определения IgE- и IgG-AT, соответственно), а разведения конъюгатов Мк анти-IgE- и анти-IgG-AT с пероксидазой хрена -1:3000 и 1:20000, соответственно.

Для количественной оценки содержания IgG- и IgE-AT в сыворотке крови больных АД в качестве калибровочных образцов нами были использованы коммерческие реагенты фирмы "Dr. Fooke" (Германия), включающие калибраторы (специфические IgG- и IgE-AT) и твердую фазу,

сорбированную соответствующими аллергенами. По этим референс-реагентам были построены калибровочные кривые зависимости ОП от концентрации 1§0-АТ и 1£Е-АТ.

Специфичность выявления 1§0-АТ и ^-АТ к тканевым антигенам определялась специфичностью моноклональных анти-^О- и анти-^Е-АТ в пероксидазном коньюгате (ООО «Полигност», С.Петербург).

Чувствительность разработанной иммуноферментной тест-системы для ^й-АТ составила 0,25 мкг/мл, а для 1§Е-АТ - 0,35 МЕ/мл и определялась минимальным содержанием соответствующих референс-реагентов.

Таблица 5.

Содержание Х^С-аутоантител к тканевым антигенам в сыворотке здоровых лиц.

Возрастные группы Антиген Среднее значение уровня АТ (№ш) в мкг/мл «Нормальные» значения 1 содержания ^¿-АТ 1 (М+2ш) в мкг/мл

Дошкольный возраст кератин 171±12 195

Коллаген VI типа 5&Ы0 76

АГ ткани легкого 57±13 83

Эластин 34±3 40

Коллаген 111 типа 64±8 80

Миозин 166*15 196

ОБМ 139±25 189

Школьный возраст кератин 155±18 191

Коллаген VI типа 36±5 46

АГ ткани легкого 56±9 74

Эластин 27±2 31

Коллаген III типа 59±12 83

Миозин 125±32 189

ОБМ 202±12 226

Взрослые кератин 15б±15 187

Коллаген VI типа 29±2 34

АГ ткани легкого 66±10 86

Эластин 29±2 33

Коллаген III типа 40±4 48

Миозин 137±10 157

ОБМ 188±16 220

Прежде чем определять уровень ДО-АТ в сыворотках больных аллергическими заболеваниями, мы определили количественное содержание этих АТ к каждому антигену в сыворотках людей группы контроля (всего 53

человека), выразив среднюю концентрацию в мкг/мл в соответствии с калибровочной кривой.

Полученные количественные значения с учетом удвоенной стандартной ошибки были приняты нами за «нормальные» показатели содержания 1дО-АТ к каждому антигену у здоровых людей. Результаты проведенного исследования представлены в табл. 5.

Уровень ^Е-АТ к тканевым АГ у здоровых людей был очень низкий и не имел существенных различий в разных возрастных группах. В связи с этим за «нормальное» значение их содержания мы приняли среднее значение ^Е-АТ в МЕ/мл с учетом удвоенной ошибки в объединенной группе сывороток крови 24 здоровых людей в возрасте от 4 до 37 лет (табл. 6).

Таблица 6.

Уровень 1$>Е-аутоантител к тканевым антигенам в сыворотках здоровых людей.

Антигены Среднее значение уровня 1еЕ-АТ (М±ш) в МЕ/мл «Нормальные» значения содержания АТ (М+2ш) в МЕ/мл

кератин 1,53±0,06 1,65

Коллаген VI типа 1,41±0,004 1,418

АГ ткани легкого 1,41±0,011 1,432

Эластин 1,4*0 1,4

Коллаген 111 типа 1,4±0 1,4

Миозин 1,87±0,25 2,37

ОБМ 1,5±0,075 1,65

4. Определение и ^Е-АТ к тканевым антигенам у больных АД.

Результаты определения ^в-АТ к тканевым АГ (табл. 7) показали, что сыворотки больных АД всех групп содержали повышенные уровни ^О-АТ ко всем АГ При этом максимально часто выявляли ^в-АТ к кератину (75%), к коллагену VI типа (83%) у детей школьного возраста и к коллагену III тина (81,8%) у взрослых больных. Частота выявления повышенного уровня ^в-АТ к ОБМ во всех возрастных группах была минимальна. Кроме того, у больных детей АД старшей возрастной группы отмечалась тенденция к увеличению частоты выявления определяемых аутоантител.

Оказалось также, что у больных АД средней степени тяжести уровень 1§0-АТ к некоторым тканевым АГ выше, чем у больных АД легкого течения

заболевания (р<0,05): у детей дошкольного возраста - к миозину, у детей школьного возраста - к АГ ткани легкого и коллагену III типа и у взрослых с АД - к коллагену III и VI типа, АГ ткани легкого и ОБМ.

Таблица 7.

Количественное определение IgG-AT (мкг/мл) к тканевым антигенам у больных

атипическим дерматитом.

Возрастные Антигены Число Среднее значение Частота выявления

группы сыво- IgG-AT (M±m) повышенного уровня

роток в мкг/мл IgG-AT в %

Дети дошкольного возраста кератин 62 247 ±10* 46,8

Коллаген VI типа 62 109± 11* 43,5

АГ ткани легкого 62 150 ±18* 24,2

Эластин 62 113 ±17* 32,3

Коллаген III типа 62 116 ±9* 27,4

Миозин 62 322 ± 30* 21

ОБМ 62 269 ±20* 11,3

Дети школьного возраста кератин 24 322 ±27* 75

Коллаген VI типа 24 160 ±23* 83

АГ ткани легкого 24 174 ±42* 37,5

Эластин 24 123 ±18* 45,8

Коллаген III типа 24 144 ±18* 58,3

Мишин 24 310 ±60* 29,2

ОБМ 24 278 ±24 16,7

Взрослые кератин 22 373 ±41* 50

Коллаген VI типа 22 160 ±46* 68

АГ ткани легкого 22 238 ±64* 27

Эластин 22 150 ±33* 59

Коллаген II) типа 22 244 ±51* 81,8

Миозин 22 263 ± 35* 36

ОБМ 22 364 ±61* 22,7

* р<0,05 - достоверное различие с содержанием IgG-AT у здоровых людей по t-критерию Стьюдента.

Полученные данные позволяют говорить о выявлении у больных АД аутоиммунного ответа, обусловленного ^в-АТ. Причем наличие аутоантител не зависит от возраста больного, но их уровень был выше у больных со среднегажелым течением заболевания. При этом с наибольшей частотой определялся гуморальный ответ к кератину, коллагенам III и VI типов (75%, 81,8% и 83%, соответственно).

При определении 1{>Е-АТ к тем же тканевым антигенам оказалось, что их содержание повышено в сыворотке больных всех возрастных групп. Процент

выявления \ф-АТ к миозину (72,7%) у детей дошкольного возраста и кератину (77,8%) у детей школьного возраста оказался максимальным (табл. 8), а частота выявления ^Е-АТ к ОБМ была минимальной независимо от возраста больных.

Таблица 8.

Выявление 1&Е-АТ к тканевым антигенам у больных АД.

Возрастные группы Антигены Число сывороток Среднее значение IgE-AT (М±ш) в МЕ/мл Частота выявления 1 повышенного уровня 1 18Е-АТ в %

Дети дошкольного возраста кератин 44 16,66 ±5,13* 61,4

Коллаген VI типа 44 6,91 ± 2,04* 68,2

АГ ткани легкого 44 8,1 ± 2,11* 63,6

Эластин 44 6,94 ±2,36* 70,5

Коллаген III типа 44 6,89 ±1,6* 56,8

Миозин 44 12,31 ±2,46* 72,7

ОБМ 44 11,59 ±4,7* 47,7

Дети школьного возраста кератин 18 16,05 ±5,7* 77,8

Коллаген VI типа 18 5,99 ±2,6* 50

АГ ткани легкого 18 5,32 ± 1,7* 66,7

Эластин 18 3,1 ±0,28* 66,7

Коллаген III типа 18 4,23 ±1,4* 44,4

Миозин 18 13 ± 3,53* 61,1

ОБМ 18 2,23 ±0,4 38,9

Взрослые кератин 13 12,9 ±3,01* 69,2

Коллаген VI типа 13 9,37 ±1,25* 53,8

АГ ткани легкого 13 15,67 ±4,9* 61,5

Эластин 13 9,04 ±4,11* 69,2

Коллаген III типа 13 4,97 ±1,32* 46,2

Миозин 13 7,36 ±1,8* 61,5

ОБМ 13 4,44 ±1,6* 46,2

* - р<0,05 - достоверное различие между средними значениями 1^Е-АТ у больных и у здоровых людей по ^критерию Стьюдента.

Анализ связи уровня 1§Е-АТ со степенью тяжести АД показал, что с утяжелением течения АД увеличивается средний уровень ^Е-АТ. Так, в группе детей дошкольного возраста со среднетяжелым течением АД уровень ^Е-АТ к кератину, АГ ткани легкого, эластину и ОБМ был достоверно выше, чем при легком течении Такая же закономерность была выявлена в уровне 1§Е-АТ к коллагену VI типа и миозину в группе детей школьного возраста, а у взрослых больных АД - к коллагену III типа.

Определение и ^Е-АТ к тиреоглобулину, проведенное нами

совместно с лабораторией иммунологической диагностики эндокринных заболеваний НИИВС им. И. И. Мечникова РАМН, показало, что уровень ^в-АТ к тиреоглобулину у всех больных АД (за исключением 1 больного 15 лет) был в пределах возрастной нормы. В свою очередь, во всех возрастных группах были выявлены сыворотки с повышенным содержанием 1§Е-АТ к тиреоглобулину. При этом средние значения содержания 1&Е-АТ существенно не отличались по группам, и частота их выявления была невысокой (31,1%; 28,6%; 33,3%). Однако у больных АД средней степени тяжести частота выявления повышенных уровней 1;*Е-АТ к тиреоглобулину оказалась в 2,5 раза выше, чем у больных с легким течением заболевания.

Таким образом, наши данные позволяют говорить, что АД сопровождается аутоиммунным ответом, обусловленным и 1^-АТ к широкому спектру тканевых антигенов. Аутоиммунные реакции, обусловленные ^в-АТ, прежде всего направлены на коллаген III и VI типа, то есть на антигены, хорошо представленные в дерме и паренхиматозных органах. В то же время аутоиммунные реакции, обусловленные 1£Е-АТ, направлены на миозин и кератин, представленные в мышечной ткани и эпидермисе. Кроме того, и 1{^}-аутоантшела выявляются чаще у больных с более тяжелым течением, что может говорить об определенном вкладе этих антител в патогенез АД.

5. Корреляционные взаимоотношения между показателями гуморального иммунного ответа к тканевым антигенам, уровнем общего 1йЕ и уровнем ^(5-АТ к герпесвирусам у больных АД.

Корреляционный анализ уровней ^Е-АТ к тканевым антигенам и общего 1§Е в сыворотках больных позволил выявить прямую достоверную взаимосвязь между уровнями ^Е-АТ к коллагену VI типа и общего ^Е у больных АД в возрасте до 7 лет (г = 0,32; р<0,05), а также между уровнями 1§Е-АТ к тиреоглобулину и общего ^Е у больных АД школьного возраста

(г = 0,78; р<0,05). Значимой корреляции у взрослых больных выявить не удалось.

У детей дошкольного возраста установлена прямая корреляционная связь между IgG-AT к АГ ткани легкого и общим IgE (г = 0,26; р<0,05).

Мы также выявили достоверную прямую корреляцию между повышенным уровнем IgG-AT к ВПГ и уровнем IgG-AT к антигену ткани легкого (г = 0,42, р<0,05) и к эластину у детей до 7 лет (г = 0,29, р<0,05). Достоверная обратная корреляция была выявлена между уровнем IgG-AT к коллагену VI типа и уровнем IgG-AT к ВЭБ у детей дошкольного возраста (г = -0,28; р<0,05), а также к ВПГ и ВЭБ у взрослых больных АД (г = -0,79 и -0,55, соответственно; р<0,05).

Выявленные корреляции, а также установленная связь аутоиммунного ответа с тяжестью АД позволяют заключить, что при АД аутореактивность, атопия и гуморальный ответ к ВПГ взаимосвязаны в патогенезе этого заболевания. Взаимосвязь меж™ аутоиммунитетом и атопией реализуется, по-видимому, через IgE-реактивные аутоантигены, которые могут способствовать высвобождению гистамина из базофилов и тучных клеток и вызывать немедленный тип кожных реакций, что ведет к утяжелению воспалительного процесса в ткани-мишени [Appenzeller U. с соавт., 1999; Crameri R. с соавт., 1996; Meyer С. с соавт., 1999; Valenta R. с соавт., 1991.].

Аутоантигены могут активировать аутореактивные Т-клетки и тем самым вносить вклад в развитие заболевания. С другой стороны, аутореактивные Т-клетки могут активироваться через IgE-антителоопосредованную презентацию аутоаллергенов дендритными клетками или моноцитами. Присутствие Т-клеток, распознающих IgE- аутоантигены, уже показано у атонических больных [Mossabeb R с соавт., 2002].

Влияние вирусов простого герпеса на аутоиммунные реакции при АД возможно связано с явлением эпитопной мимикрии. Постулируется, что у инфекционного агента (паразиты, бактерии, дрожжи или вирусы) есть

эпитопы, иммунологически сходные с АГ детерминантами хозяина, благодаря чему антигенные различия между ними минимальны. Иммунный ответ, вызванный эпитопами АГ инфекционного агента, способен нарушить толерантность к эпитопам аутоАГ, вследствие чего возникает патогенный аутоиммунный ответ, ведущий к развитию АИЗ [Oldstone М., 1987]. Известно, что вирусы способны поражать Т-клетки, встраиваться в их геном и тем самым изменять Т-клеточный контроль над аутореактивными Т-клетками.

С другой стороны известно, что вирусы семейства Herpesviridae обладают иммунодепрессивными свойствами. В частности, ВЭБ подавляет продукцию цитокинов активированными Т-лимфоцитами, и иммунный ответ не развивается. Вирусные белки обладают прямым сродством к молекулам МНС клеток человека и, «залипая» на молекулах МНС, препятствуют распознаванию антигена Т-лимфоцитами [Хаитов P.M., Игнатьева Г.А., 2000]. Показано также, что ЦМЕ^" способа« инфицировать

дендритные клетки через их CD209 лектиновый рецептор. При этом инфицированная дендритная клетка теряет способность презентировать антиген Т-клетке [Halaiy F., 2005.]. Можно полагать, что выявленная нами отрицательная корреляция между уровнем IgG-AT к некоторым герпесвирусам и уровнем IgG-AT к коллагену VI типа у взрослых больных АД может быть связана с длительной персистенцией вируса в организме и развитием вторичного иммунодефицита.

Выводы. '

1. Создана многокомпонентная иммуноферментная тест-система для количественного определения ДО- и ^-антител к 7 тканевым антигенам (кератин, коллаген VI и III типа, эластин, антиген ткани легкого, миозин, ОБМ), которая обладает высокой специфичностью и чувствительностью и позволяет оценить аутоиммунный ответ у лиц разного возраста.

2. У больных АД, детей и взрослых, с полисенсибилизацией к пищевым, бытовым аллергенам и аллергенам условно-патогенных микроорганизмов установлено наличие повышенного и высокого

I

(>1000 кЕ/л) уровня общего ^Е в 54%-89% и 12,9%-31,8% случаев, соответственно, а также выраженный гуморальный ответ к вирусам семейства НегретгШе, опосредованный ^С-АТ. У детей больных АД выявлена достоверная корреляция между уровнями общего 1§Е и 1§С-антител к вирусу простого герпеса.

3. В сыворотке крови всех больных АД обнаружены 1яО-аутоантитела ко всем исследованным тканевым антигенам с наибольшей частотой выявления к кератину, коллагену VI и III типов у детей школьного возраста в 75%, 83% и 58,3% случаев, а у взрослых больных в 50%,

68% и 81,8% случаев, соответственно. >

4. У больных АД в сыворотке 1фови обнаружено высокое содержание 1£Е-аутоантител ко всем исследуемым тканевым антигенам, включая тиреоглобулин, с наибольшей частотой выявления к кератину, эластину, коллагену VI типа, миозину и микросомальному антагену из ткани легкого (61,4%-77,8%).

5. Установлено, что у взрослых и детей с АД частота выявления ^О- и ^Е-аутоантител к тканевым АГ при среднетяжелом течении заболевания выше, чем при легком его течении (р<0,05).

6 Выявлена значимая прямая корреляция между уровнями 1§0-АТ к

ВПГ и ^в-АТ к антигенам ткани легкого и эластина у детей

дошкольного возраста, а также достоверная обратная корреляция между уровнем ^в-АТ к коллагену VI типа и уровнем ^й-АТ к ВЭБ у детей дошкольного возраста и к ВПГ и ВЭБ у взрослых больных АД-

7. У детей с АД дошкольного возраста выявлена значимая прямая корреляция между содержанием общего и уровнями 1§0-АТ к антигену ткани легкого и 1{»Е-АТ к коллагену VI типа и тиреоглобулину.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Самойликов П. В., Фомина Д. С., Штерншис Ю. А. Взаимосвязь между гуморальным ответом к вирусу простого герпеса, цитомегаловирусу и вирусу Эпштейна-Барр и повышением уровня общего ^Е у детей с аллергическими заболеваниями. Материалы II Российского конгресса «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии». Москва 2003, с. 180-181.

2. Штерншис Ю. А., Самойликов П. В., Гервазиева В. Б. Острые и хронические вирусные инфекции и атопия; Материалы III Российского конгресса «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии» Москва, 2004, с. 43-44.

3. Штерншис Ю. А., Самойликов П. В., Червинская Т. А. Гервазиева В. Б. Влияние вирусных инфекций на уровень общего 1§Е при бронхиальной астме и атопическом дерматите. Российский аллергологический журнал. 2004, № 2, с. 32-36.

4. Гервазиева В. Б., Самойликов П. В. Аутоиммунный ответ к некоторым тканевым антигенам у больных аллергическими заболеваниями. Материалы IV конференции иммунологов Урала. Уфа, 17-19 октября 2005. Иммунология Урала, 2005, №1(4), с. 168

5. Самойликов П. В., Штерншис Ю. А., Гервазиева В. Б.. Определение уровня IgG-антител к некоторым тканевым антигенам у больных аллергическими заболеваниями. Материалы IX Всероссийского научного форума с международным участием имени академика В. И. Иоффе. Дни иммунологии в С-Петербурге. Мед. иммунология. 2005, т.7, №2-3, с. 136.

6. Samoilikov P.V., Shtemshis Yu.A., Gervazieva V. Determination of Immunoglobuline G antibodies to some tissue antigens in patients with allergic diseases. J. Allergy Clin. Imm. Int.: J. World Allergy Org. 2005, №1, p. 294-295.

7. Штерншис Ю. А., Сверановская В. В., Самойликов П. В. Эпитопная мимикрия и ее роль в развитии аутоиммунных реакций. Ж. микробиол., 2005, №1, с. 96-100.

8. Штерншис Ю.А., Кривицкая В.З., Самойликов П.В., Гервазиева В.Б. Влияние вирусной инфекции на развитие атопической бронхиальной астмы. Инфектология. 2005, ХЬП, с. 26-30.

Отпечатано в ООО «Компания Спутник+» ПД № 1-00007 от 25.09.2000 г. Подписано в печать 10.11.05 Тираж 100 экз. Усл. пл. 1,38 Печать авторефератов (095) 730-47-74,778-45-60

i ï

I

I

II t

Р 2 2 8

РНБ Русский фонд

2006-4 27804

Актуальность проблемы. Широкая распространенность аллергических заболеваний, охвативших более 20% населения планеты, усиление тяжести клинического течения и резкое снижение качества жизни пациентов превратили проблему аллергии в глобальную медико-социальную проблему.

Среди аллергических заболеваний одно из ведущих мест занимает атопический дерматит (АД) - распространенный, упорно протекающий дерматоз, занимающий в структуре аллергических заболеваний 50%-60%.

Рост числа аллергических заболеваний в развитых сообществах связывают с факторами окружающей среды и с изменившимся типом инфекционного воздействия на человека. Хронические вирусные инфекции вызванные, в частности, вирусом простого герпеса, утяжеляют клиническое течение и характер АД [9].

Атопический дерматит сохраняет свои клинические признаки на протяжении многих лет и нередко трансформируется в бронхиальную астму с так называемым тяжелым атопическим синдромом [51]. Многолетние наблюдения за больными, страдающими АД, позволяют говорить о нем, как о системном заболевании с поражением не только кожи, но и внутренних органов и систем организма, таких как органы пищеварения (80-97% больных), JIOP-органы, дыхательная система, мочевыводящие пути.

Ведущим иммунопатологическим механизмом в развитии АД является изменение соотношения ТИ1/ТЬ2-лимфоцитов в пользу последних, приводящее к появлению характерного для IgE-реактивности цитокинового профиля и высокой продукции специфических IgE-антител к различным экзоаллергенам. В то же время имеются данные об участии клеточно-опосредованных аллергических реакций в иммунопатогенезе АД, особенно его хронических тяжелых форм. Основное значение в развитии таких реакций придают инфекционным агентам (S. aureus, С. albicans, микробно-вирусные ассоциации), колонизирующим не только кожу больного, но и слизистые оболочки ВДП и ЖКТ.

Кроме того, в последние годы указывается на возможное участие аутореактивности в патогенезе АД. Показано формирование у больных IgE-аутореактивности к человеческим белкам, содержащимся в клетках разных органов: кожа, легкие, ЖКТ, мышцы и мозг [106, 108]. Более того, обострение АД у определенных больных оказалось связанным с увеличением IgE-аутореактивности [108].

Одним из механизмов запуска аутоиммунного феномена может быть активация иммунной системы перекрестно-реактивными антигенами (аллергенами). Так, молекулярный анализ аллергенов с помощью ДНК-клонирования выявил поразительное сходство между некоторыми экзогенными аллергенами и человеческими белками [29; 104]. Показано также, что даже при низком уровне гомологии в структуре или при ее полном отсутствии экзоаллергены могут хорошо имитировать трехмерную структуру человеческих протеинов [31; 34].

В качестве одного из механизмов запуска аутоиммунной патологии при ряде аллергических заболеваний можно рассматривать также явление микробной мимикрии. Установлено наличие общих антигенов у P. mirabilis и кишечника, М. catarrhalis и легочной ткани, Y. enterocolitica и ткани щитовидной железы и мозга [7]. Оказалось, что IgG антитела к Р62 белку (синтетический пептид, соответствующий глицин/аланиновой последовательности ядерного антигена-1 вируса Эпштейна-Барр), реагируют с человеческим эпидермальным кератином, денатурированным коллагеном 2-го типа и актином [12, 30].

Таким образом, наряду с атопией в механизме формирования АД определенную роль могут играть аутоиммунные реакции, в том числе обусловленные наличием хронической-инфекции.

В связи с этим, выявление взаимосвязи между показателями аутореактивности, атопии и гуморального противовирусного ответа у больных АД может представлять определенный интерес в плане понимания патогенеза этого сложного хронического заболевания.

Цель исследования:

Цель - выявить в сыворотке крови IgG- и IgE-AT к некоторым тканевым антигенам и оценить их взаимоотношение с уровнем IgG-ответа к антигенам вирусов семейства Herpesviridae у больных атопическим дерматитом.

Задачи исследования:

1. Сформировать группы больных АД разной возрастной категории, длительностью течения и тяжестью заболевания и определить некоторые иммунологические показатели: уровень общего IgE, IgE-AT к инфекционным и неинфекционным аллергенам и IgG-ответ к антигенам вирусов семейства Herpesviridae.

2. Создать многокомпонентную иммуноферментную тест-систему для количественного определения IgG - и IgE-AT к тканевым антигенам и определить нормальные значения этих антител у здоровых.

3. Определить содержание IgG- и IgE-AT к тканевым антигенам у больных АД в зависимости от тяжести заболевания.

4. Выявить взаимоотношение между аутоиммунными, атопическими реакциями и гуморальным ответом на вирусы герпетической группы у больных АД.

Научная новизна:

1. Создана многокомпонентная иммуноферментная тест-система для количественного определения IgG- и IgE-антител к 7 тканевым антигенам и впервые определены среднестатистические значения содержания этих антител в сыворотке крови здоровых лиц разного возраста.

2. Впервые у больных АД, детей и взрослых, выявлено повышенное содержание IgG- и IgE-аутоантител к широкому спектру тканевых антигенов, особенно высокое к коллагену III и VI типа, кератину и миозину, при этом установлена прямая корреляция между уровнем этих антител, уровнем общего IgE и степенью тяжести заболевания.

3. Впервые у больных АД легкой и средней степени тяжести установлена прямая коррелятивная связь между содержанием IgG-AT к некоторым тканевым антигенам и уровнем IgG-антител к вирусам семейства Herpesviridae,

4. Впервые показано, что у детей с АД уровень IgG-AT к вирусам семейства Herpesviridae коррелирует с общим IgE.

Практическая значимость:

Созданная тест система для количественного определения IgE - и IgG-AT к тканевым АГ может быть использована в качестве дополнительного иммунологического метода диагностики АД.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Многокомпонентная иммуноферментная тест-система позволяет определить количественное содержание IgG- и IgE-AT к 7 тканевым антигенам (кератин, коллаген VI и III типа, эластин, антиген ткани легкого, миозин, ОБМ) в сыворотке крови человека, в том числе установить их «нормальные» значения.

2. Атопический дерматит у детей и взрослых сопровождается образованием повышенного содержания IgG- и IgE-аутоантител к антигенам, которые представлены в органах-мишенях атопии. Повышенное содержание и частота выявления этих аутоантител зависят от тяжести течения заболевания.

3. Установленная прямая корреляция между повышенным уровнем IgG- и IgE-AT к некоторым тканевым антигенам (АГ ткани легкого, коллаген VI типа, тиреоглобулин) и содержанием общего IgE, повышенным уровнем IgG-AT к AT ткани легкого, эластина и уровнем IgG-AT к ВПГ, а также повышенным уровнем IgG-AT к ВПГ и уровнем общего IgE может свидетельствовать об участии ауторективности и хронической вирусной инфекции в патогенезе АД.

ВЫВОДЫ.

1. Создана многокомпонентная иммуноферментная тест-система для количественного определения IgG- и IgE-антител к 7 тканевым антигенам (кератин, коллаген VI и III типа, эластин, антиген ткани легкого, миозин, ОБМ), которая обладает высокой специфичностью и чувствительностью и позволяет оценить аутоиммунный ответ у лиц разного возраста.

2. У больных АД, детей и взрослых, с полисенсибилизацией к пищевым, бытовым аллергенам и аллергенам условно-патогенных микроорганизмов установлено наличие повышенного и высокого (>1000 kE/л) уровня общего IgE в 54%-89% и 12,9%-31,8% случаев, соответственно, а также выраженный гуморальный ответ к вирусам семейства Herpesviridae, опосредованный IgG-AT. У детей больных АД выявлена достоверная корреляция между уровнями общего IgE и IgG-антител к вирусу простого герпеса.

3. В сыворотке крови всех больных АД обнаружены IgG-аутоантитела ко всем исследованным тканевым антигенам с наибольшей частотой выявления к кератину, коллагену VI и III типов у детей школьного возраста в 75%, 83% и 58,3% случаев, а у взрослых больных в 50%, 68% и 81,8%) случаев, соответственно.

4. У больных АД в сыворотке крови обнаружено высокое содержание IgE-аутоантител ко всем исследуемым тканевым антигенам, включая тиреоглобулин, с наибольшей частотой выявления к кератину, эластину, коллагену VI типа, миозину и микросомальному антигену из ткани легкого (61,4%-77,8%).

5. Установлено, что у взрослых и детей с АД частота выявления IgG-и IgE-аутоантител к тканевым АГ при среднетяжелом течении заболевания выше, чем при легком его течении (р<0,05).

6. Выявлена значимая прямая корреляция между уровнями IgG-AT к ВПГ и IgG-AT к антигенам ткани легкого и эластина у детей дошкольного возраста, а также достоверная обратная корреляция между уровнем IgG-AT к коллагену VI типа и уровнем IgG-AT к ВЭБ у детей дошкольного возраста и к ВПГ и ВЭБ у взрослых больных АД.

7. У детей с АД дошкольного возраста выявлена значимая прямая корреляция между содержанием общего IgE и уровнями IgG-AT к антигену ткани легкого и IgE-AT к коллагену VI типа и тиреоглобулину.

Глава 5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Нами было проведено исследование сывороток больных с диагнозом АД и выявлены особенности гуморального иммунного ответа при воздействии внешних антигенов (аллергенов), а также внутренних (тканевых) антигенов. Выбор данного направления научной работы был связан, прежде всего, с двумя причинами - это, во-первых, широкая распространенность, тяжелое течение и наличие осложнений при АД, а также появление новых данных о возможном влиянии аутоиммунных реакций на патогенез данного заболевания. В настоящее время атопический дерматит активно изучается вследствие возрастающего воздействия на организм человека бытовых и инфекционных факторов, нарушений экологического баланса, что, несомненно, лежит в основе этиологии не только АД, но и других аллергических заболеваний. Кроме того, дискуссионным остается вопрос и о классификации АД. Ряд авторов предлагают новые типы - неаллергический АД и/или аутоиммунный АД [87, 113]. Рассмотренные выше причины побудили нас провести собственное исследование по выявлению взаимоотношения между атопическими и аутоиммунными реакциями на экзо- и аутоаллергены при АД.

Для достижения поставленной цели нами было проведено комплексное исследование сывороток больных АД, которое включало определение уровня общего и специфических IgE-AT к бытовым, пищевым аллергенам и аллергенам бактерий и грибов, в том числе исследован гуморальный иммунный ответ на вирусы семейства Herpesviridae. Разработан метод ИФА оценки аутоиммунных реакций на тканевые АГ. Проведен анализ взаимосвязи выявленных показателей гуморального противовирусного иммунного ответа, аутоиммунного и атопического процессов при АД.

Нами были исследованы сыворотки больных разных возрастных групп с установленным диагнозом атопический дерматит разной степени тяжести заболевания на основании критериев изложенных в рекомендации для практических врачей [15].

При иммунологическом исследовании сывороток больных были выявлены существенные отличия между больными АД разных возрастных групп, разной степени тяжести заболевания, а также между больными АД и группой контроля (здоровые люди). Средние значения общего IgE, наиболее высокие уровни и частота его выявления отмечены у больных детей АД дошкольного возраста и у больных с более тяжелым течением заболевания. Анализ определения специфических IgE-AT в сыворотках больных АД показал, что ранее всего у них выявляется сенсибилизация к пищевым аллергенам, к которой в последствии присоединяется IgE-ответ к бытовым аллергенам и аллергенам бактерий и грибов. В группе контроля уровень общего IgE и специфических IgE-AT к исследуемым аллергенам у большинства людей был в пределах нормы. В работах отечественных и зарубежных авторов [2, 6] также показано, что у детей с АД в раннем возрасте часто имеется непереносимость пищевых продуктов, а у взрослых чаще выявляется сенсибилизация к домашней пыли, в меньшей степени к микробным аллергенам и к грибам [116]. Кроме того, отмечено, что пищевая аллергия у детей является триггером развития АД [14]. Таким образом, мы можем говорить, что сенсибилизация ко всем исследуемым аллергенам начинается у детей дошкольного возраста и достигает максимума у детей школьного возраста, а у взрослых спектр сенсибилизирующих аллергенов снижается вплоть до нулевого уровня за счет IgE-AT к пищевым аллергенам.

Мы попытались найти связь между гуморальным иммунным ответом к вирусным антигенам семейства Herpesviridae и формированием атопии. Для этого определяли в сыворотке крови больных АД и здоровых IgG-AT к антигенам ВПГ, ЦМВ и ВЭБ. Оказалось, что во всех группах обследованных, в том числе и в группе контроля, определяется повышенный уровень IgG-AT ко всем вирусам семейства Herpesviridae, причем уровень IgG-AT к ВПГ и ЦМВ увеличивался с возрастом как у больных АД, так и в группе контроля. Была выявлена также достоверная корреляция (г = 42, р<0,05) между повышенным уровнем IgG-AT к ВПГ и повышенным уровнем общего IgE у детей с АД.

Наши данные о наличии коррелятивной связи между уровнем антител к ВПГ и уровнем общего IgE у детей с АД согласуются с результатами других авторов, показавших, что инфицирование вирусом простого герпеса ассоциировано с достоверно более высоким уровнем общего IgE в сыворотке крови, расширением спектра атопических заболеваний и увеличением числа больных среди детей и взрослых [9]. Возможно, персистенция герпесвирусной инфекции вызывает изменения в иммунной системе, сопровождающиеся снижением содержания Т-лимфоцитов, субпопуляций Т-хелперов и Т-супрессоров, что, в свою очередь, приводит к усилению пролиферации В-лимфоцитов, увеличению выработки иммуноглобулинов и потенцированию развития аллергических заболеваний [3].

Для решения дальнейшей задачи, а именно, выявления аутоиммунного ответа у больных АД, нам необходимо было разработать иммуноферментную тест-систему количественного определения антител к тканевым антигенам. Прежде всего, мы определили спектр тканевых антигенов, к которым необходимо определить антитела в сыворотках больных АД и здоровых. При выборе антигенов исходили из того, что при

АД IgE-аутореактивность направлена на цитоплазматические антигены следующих тканей и органов: кожа, ЖКТ, легкое, мозг, щитовидная железа и мышцы [106]. В этой связи мы использовали для разработки метода ИФА 6 коммерческих белков (коллаген III и VI типа, эластин, кератин, ОБМ, миозин) и один экспериментальный препарат - экстракт ткани | легкого. А для определения AT к тиреоглобулину мы применили методы ИФА, разработанные в лаборатории иммунологической диагностики эндокринных заболеваний НИИВС им. И. И. Мечникова РАМН.

В разработанной нами многокомпонентной количественной иммуноферментной тест-системе мы использовали референс-реагенты dr. Fooke (Германия) и спектр тканевых антигенов, который позволил определять IgG- и IgE- антитела в сыворотках и оценивать степень аутоиммунного ответа у больных АД в сравнении с нормальными значениями этих аутоантител у здоровых людей разных возрастных групп. j

При исследовании сывороток больных АД были выявлены повышенные уровни IgG-AT от 46,8 до 75% случаев к кератину, от 43,5 до 83% к коллагену VI типа и от 27,4% до 81,8% к коллагену III типа. Согласно полученным данным во всех возрастных группах выявлялся повышенный уровень IgG-AT к тканевым антигенам. При этом установлено достоверное различие между средними значениями уровня IgG-AT к тканевым антигенам у больных АД и здоровых. У больных этот показатель в 1,5 и более раз превышал таковые значения у здоровых людей. Частота выявления повышенного уровня IgG-AT к ОБМ была | минимальна и не зависела от возраста. Процент выявления IgG-AT к коллагену VI типа и коллагену III типа был максимален во всех группах больных АД. Кроме того, у больных детей АД старшей возрастной группы отмечалось увеличение числа случаев повышенного уровня аутоантител, тогда как у взрослых больных процент выявляемых аутоантител был ниже, чем у школьного возраста.

Кроме того, мы провели сравнительный анализ данных и выяснили, что у больных АД средней степени тяжести уровень IgG-AT к тканевым антигенам выше, чем у больных АД легкого течения заболевания. Причем достоверные различия по этим показателям были обнаружены у детей дошкольного возраста к миозину, у детей школьного возраста к АГ ткани легкого и коллагену III типа и у взрослых с АД к коллагену III и VI типа, АГ ткани легкого и ОБМ.

Полученные данные позволяют говорить о наличии у больных АД аутоиммунных реакций, обусловленных IgG-AT. Причем наличие аутоантител не зависит от возраста больного, но их уровень и частота выявления были больше у больных со среднетяжелым течением заболевания. При этом с наибольшей частотой определялся гуморальный ответ к коллагенам III и VI типов (81,8% и 83%, соответственно).

При исследовании IgE-AT к тем же тканевым антигенам оказалось, что повышенные содержания этих антител были выявлены во всех группах больных, частота их выявления была выше у детей по сравнению с взрослыми больными, тогда как обнаружение IgE-AT к ОБМ было минимальным (от 38,9% до 47,7%) независимо от возраста больных. Процент выявления IgE-AT к миозину и кератину оказался максимальным (72,7% и 77,8%, соответственно).

Далее мы проанализировали, как наличие IgE-AT ассоциируется со степенью тяжести течения АД. Для этого мы сравнили их средние значения у больных легкой и средней степени тяжести заболевания. Оказалось, что в каждой группе больных достоверное различие по среднему уровню IgE-AT к тому или иному АГ отличалось. Так, в группе детей дошкольного возраста уровень IgE-AT был достоверно выше к кератину, АГ ткани легкого, эластину и ОБМ; в группе детей школьного возраста с более тяжелым течением заболевания - к коллагену VI типа и миозину, а у взрослых больных АД достоверно выше был уровень IgE-AT к коллагену III типа.

Таким образом, наши данные позволяют говорить, что наряду с общей картиной аутоиммунного ответа, обусловленного IgG- и IgE-AT к тем или иным тканевым антигенам, аутоиммунные реакции, обусловленные IgG-AT прежде всего направлены на коллаген III и VI типа, то есть на АГ хорошо представленный в дерме и паренхиматозных органах, в то время как аутоиммунные реакции, обусловленные IgE-AT, направлены на миозин и кератин, которые входят в состав миофибрил и эпидермиса. Кроме того, IgE-аутоантитела выявляются чаще у больных с более тяжелым течением заболевания, что может говорить об определенном вкладе этих антител в патогенез АД.

Поскольку в литературе уже сообщалось о наличии антител к антигенам щитовидной железы у больных АД [106], мы сочли необходимым исследовать сыворотки больных на наличие IgG- и IgE - AT к тиреоглобулину. При этом показатели IgG-AT к тиреоглобулину у больных АД оказались в пределах возрастной нормы, за исключением сыворотки 1 больного 15 лет. Не исключено, что именно у этого больного имелась сочетанная патология в виде аутоиммунного тиреоидита и АД.

При определении IgE-AT к тиреоглобулину в сыворотках больных всех возрастных групп было обнаружено повышенное содержание этих антител, причем средние значения IgE-AT к тиреоглобулину во всех возрастных группах отличались незначительно и частота их выявления была невысокой в целом по группам больных (31,3; 28,6; 33,3 %). Однако у больных АД средней степени тяжести частота выявления повышенных уровней IgE-AT к тиреоглобулину оказалась выше по сравнению с больными, у которых отмечалось легкое течение заболевания («50% и 20% соответственно).

Одним из основных механизмов патогенеза АД является IgE-обусловленная аллергия, или повышенная чувствительность к различным экзоаллергенам. Особо тяжелые формы АД протекают на фоне высокого уровня общего IgE в сыворотке. Также показано, что при утяжелении течения АД в сыворотке крови больных обнаруживаются аутоантитела к различным тканевым антигенам, уровень которых при ремиссии АД снижается [49, 68, 89].

Исходя из этих данных мы попытались выяснить, в каких взаимоотношениях находятся аутоантитела и уровень общего IgE у больных АД.

С этой целью мы провели корреляционный анализ уровней IgE-AT к тканевым антигенам и уровня общего IgE в сыворотках больных. Коэффициент корреляции между этими двумя показателями выявил прямую достоверную взаимосвязь между изменением уровня IgE-AT к коллагену VI типа и общим IgE у больных АД в возрасте до 7 лет, а также между изменением уровня IgE-AT к тиреоглобулину и общим IgE у больных АД школьного возраста. Значимой корреляции у взрослых больных выявить не удалось.

Корреляционный анализ уровня IgG-AT к тканевым антигенам и общим IgE показал, что достоверная корреляция выявляется между повышением уровня IgG-AT к АГ ткани легкого и общим IgE у детей дошкольного возраста, но в других возрастных группах больных АД обнаруженная корреляция оказалась недостоверной.

Таким образом, полученные данные позволяют заключить, что в развитии аллергических реакций при АД определенную роль играют аутоантитела класса иммуноглобулинов Е и G. Причем, как показали наши данные, лишь IgE-AT к коллагену VI типа и к тиреоглобулину, а также IgG-AT к АГ ткани легкого коррелируют с повышенным уровнем общего IgE. Взаимосвязь между аутоиммунитетом и атопией реализуется, повидимому, следующим образом: IgE-аутоантигены являются причиной высвобождения гистамина из базофилов и тучных клеток и вызывают немедленный тип кожных реакций [103, 29, 60, 19], что ведет к повреждению ткани шокового органа и утяжелению атопии. Кроме того, возможно IgE-аутоантигены могут активировать аутореактивные Т-клетки и тем самым вносить вклад в развитие заболевания. С одной стороны, аутореактивные Т-клетки могут активироваться через IgE-антителоопосредованную презентацию аутоаллергенов дендритными клетками или моноцитами. С другой, возможно, что IgE аутоантигены активируют Т-клетки через не IgE зависимые механизмы. Присутствие Т-клеток, распознающих IgE аутоантигены уже показано у атопических больных [64].

Представляло также интерес выяснить, каким образом аутоиммунитет может утяжелять течение АД и что способствует возникновению аутоиммунных реакций у больных АД. С этой целью мы попытались провести анализ полученных данных и выявить, могут ли хронические вирусные инфекции, обусловленные семейством вирусов Herpesviridae, провоцировать появление аутоантител.

Нами была выявлена достоверная корреляция между повышением уровня IgG-AT к герпесвирусным инфекциям и уровнем аутоантител только класса IgG. В частности, была выявлена достоверная корреляция между уровнем IgG-AT к ВПГ и уровнем IgG-AT к антигену ткани легкого (г = 0,42, р<0,05), а также к эластину у детей до 7 лет (г = 0,29, р<0,05). Поэтому, исходя из наших данных, мы можем сказать, что герпесвирусные инфекции могут влиять на аутоиммунитет и увеличивать уровень IgG-AT к тканевым АГ.

Такое влияние вирусов простого герпеса возможно связано с явлением эпитопной мимикрии. Постулируется, что у инфекционного агента (паразиты, бактерии, дрожжи или вирусы) есть эпитопы, иммунологически сходные с АГ детерминантами хозяина, благодаря чему антигенные различия между ними минимальны. Иммунный ответ, вызванный эпитопами патогена, способен нарушить толерантность к эпитопам хозяина. В результате перекрестного реагирования Т- и В-клеток возникает патогенный аутоиммунный ответ, ведущий к развитию АИЗ [76]. Кроме того, известно, что вирусы способны поражать Т-клетки, встраиваться в их геном и тем самым изменять Т-клеточный контроль над аутореактивными Т-клетками.

С другой стороны, известно, что вирусы семейства Herpesviridae обладают иммунодепрессивными свойствами [16]. Вирусные белки обладают прямым сродством к молекулам МНС клеток человека и, «залипая» на молекулах МНС, препятствуют распознаванию антигена Т-лимфоцитами. Кроме того, известно, что ВЭБ подавляет продукцию цитокинов активированными Т-лимфоцитами, и иммунный ответ не развивается. Показано также, что ЦМВ способен инфицировать дендритные клетки через их CD209 лектиновый рецептор. При этом инфицированная дендритная клетка теряет способность презентировать антиген Т-клетке [Halary F. 2005].

Мы выявили отрицательную корреляцию между уровнем IgG-AT к ВПГ и ВЭБ и уровнем IgG-AT к коллагену VI типа у взрослых больных АД. Возможно, это связано с длительной персистенцией вируса в организме и развитием вторичного иммунодефицита, который обуславливает развитие аутоиммунитета у взрослых больных. У детей с

АД дошкольного возраста были установлены прямые коррелятивные связи между иммунным ответом на вирус простого герпеса и аутоантителами к ткани легкого и эластина. В то же время у детей школьного возраста каких-либо корреляций между показателями противовирусного иммунитета и аутоантителами выявить не удалось.

Таким образом, при помощи разработанной нами количественной тест-системы были определены IgG- и IgE-AT в сыворотках группы здоровых лиц и найдены показатели нормальных уровней аутоантител к 7 тканевым АГ, что позволило выявить широкий спектр повышенного содержания IgG- и IgE-аутоантител в сыворотках крови больных АД. Нам удалось выявить тенденцию увеличения частоты обнаружения аутоантител в зависимости от тяжести заболевания, определить преимущественный иммунный ответ к тем или иным тканевым антигенам, среди которых по степени убывания можно отметить коллаген VI типа, кератин, коллаген III типа и миозин. Все это говорит о возможном использовании данного метода ИФА в диагностике аллергических заболеваний.