Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Хроматографический анализ и фармакокинетика десмопрессина

На правах рукописи

Нгуен Чи Тхань

ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ И ФАРМАКОКИНЕТИКА ДЕСМОПРЕССИНА

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

1 о [ЧН "Р")

""" «.и ¡¿.

Москва-2012

005017546

Работа выполнена в ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Минздравсоцразвития России

Научный руководитель: доктор фармацевтических наук

Чистяков Виктор Владимирович

Официальные оппоненты: Раменская Галина Владиславовна

доктор фармацевтических наук, профессор, заведующая кафедрой фармацевтической и токсикологической химии фармацевтического факультета ГБОУ ВПО Первый МГМУ имени И.М. Сеченова Минздавсоцразвития России

Берляид Александр Семёнович

доктор фармацевтических наук, профессор, заведующий кафедрой общей и биоорганической химии ГБОУ ВПО Московский государственный медико-стоматологический университет Минздравсоцразвития России

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Российский университет дружбы

народов»

Защита диссертации состоится « 23 » мая 2012 г в 14:00 часов на заседании Диссертационного Совета Д.208.040.09 при ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Минздравсоцразвития России по адресу: 119991, г. Москва, Трубецкая ул., д.8, строение 1, НИЦ.

С диссертацией можно ознакомиться в ГЦНМБ Первый МГМУ имени И.М.Сеченова по адресу: 117998, г. Москва, Нахимовский проспект, д.49.

Автореферат разослан « /с/ » с/лр РЛ Л 2012г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета доктор фармацевтических наук, профессор

№

Садчикова Наталья Петровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В 1974 году был создан синтетический аналог природного аргинин вазопрессина - десмопрессин (1-деаино-8-0-агинин вазопрессин), специфический агонист рецепторов V2. Десмопрессин получен в результате изменений в строении молекулы вазопрессина-дезаминирование 1-цистеина и замещение 8-Ь-аргинина на 8-О-аргинин.

Важный шаг вперед был сделан, когда наблюдения за клиническим применением десмопрессина (синтетического аналога вазопрессина) доказали, что он увеличивает уровень, фактора VIII и фактора Виллебранда у людей с нормальным содержанием их в плазме крови. В отличие от естественного антидиуретического гормона, применение десмопрессина приводило к незначительному сужению сосудов, слабому увеличению артериального давления; не приводило к спазмам матки или желудочно-кишечного тракта, поэтому препарат был допущен для клинического применения. Был сделан большой шаг вперед, когда десмопрессин стали использовать для предотвращения и купирования кровотечений, при удалении зубов, а затем и при остальных хирургических процедурах у людей.

В 1977 году десмопрессин был впервые применен для лечения больных гемофилией и болезнью Виллебранда, наиболее распространенных нарушений свертываемости крови (Kim R.J. et al., 2004). После клинических испытаний, выполненных в Италии, десмопрессин стал использоваться во многих других странах, и Всемирная организация здравоохранения включила этот препарат в список основных лекарственных средств для лечения данных заболеваний. Препарат, который мог повышать уровень фактора VIII и фактора Виллебранда (болезнь Виллебранда), не являясь препаратом крови, был особенно востребован в начале 1980-х, во время, когда вирус иммунодефицита человека стал передаваться через инфицированные факторы свертывания больными с врожденными нарушениями свертываемости.

Клинические показания быстро расширили применение десмопрессина среди пациентов, не имеющих гемофилии и болезни Виллебранда. Состав показал себя эффективным даже при кровотечениях по причине дисфункции фактора VIII или болезни Виллебранда, включая врожденные и приобретенные дефекты функций тромбоцитов и таких частых аномалий гемостаза, которые были связаны с хроническими заболеваниями почек и заболеваниями печени. Десмопрессин также использовался для профилактики кровотечений у больных, подвергающихся хирургическим воздействиям, обусловленными большой потерей крови и необходимым ее пополнением (Goudemand J., 2007).

В рамках проблемы эффективности и безопасности воспроизведенных лекарственных средств (ЛС) важное место отводится изучению их биодоступности и биоэквивалентности по сравнению с зарегистрированными в первую очередь оригинальными лекарственными препаратами (Кукес В.Г. с соавт., 2004,2008).

В России был разработан отечественный генерический препарат десмопрессина Натива (Т) - препарат, который имеет фармацевтическую эквивалентность препарату Минирин (R). Разработка данного препарата соответствует провозглашенной Правительством РФ лекарственной политике, направленной на импортзамещение, что подтверждается фактом включения десмопрессина в список стратегически важных ЛС, производство которых должно быть налажено на территории РФ (Постановление Правительства РФ №1141-р от 6 июля 2010, подписано Председателем Правительства Российской Федерации В.Путиным). В соответствии с нормами Федерального закона №61-ФЗ от 12 апреля 2010 года «Об обращении лекарственных средств» , перед внедрением воспроизведенного препарата десмопрессина Натива должны быть проведены сравнительные биофармацевтические и фаркмакокинетические исследования, для чего необходимо провести изучение сравнительной кинетики растворения для изучаемых препаратов и разработать методику определения концентрации десмопрессина в биологических жидкостях.

Все выше изложенное определило цель и задачи настоящего исследования.

Целью настоящего исследования является разработка метода экстракции и количественного определения десмопрессина в плазме крови и сравнительное фармакокинетическое изучение препаратов, содержащих десмопрессин.

Задачи исследования:

1. Разработать методики хроматографического анализа (ТСХ и ВЭЖХ) десмопрессина в растворах.

2. Разработать методику количественного определения десмопрессина в плазме крови добровольцев.

3. Подобрать условия экстракции десмопрессина из плазмы крови.

4. Провести изучение высвобождения десмопрессина из лекарственных форм в условиях in vitro (по тесту кинетики растворения).

5. Провести сравнительное изучение фармакокинетики препаратов Минирин (Швеция) и Натива (Россия).

Научная новизна. Разработана методика количественного определения десмопрессина в лекарственной форме и в биологических жидкостях; впервые изучена клиническая фармакокинетика нового отечественного воспроизведенного препарата Натива; изучена кинетика высвобождения десмопрессина из твердых лекарственных форм.

Практическая значимость работы. Разработана методика, позволяющая с высокой точностью определять концентрации десмопрессина в плазме крови, обеспечивающая повышение контроля качества воспроизведенных лекарственных средств, содержащих десмопрессин.

В ходе исследований фармакокинетики добровольцев (пациенты) сопоставлены основные фармакокинетические параметры после однократного приема препаратов Натива и Минирин. Это позволило сделать заключение о фармакокинетической эквивалентности отечественного генерического препарата Натива оригинальному препарату Минирин и выпустить на отечественный фармацевтический рынок новый российский препарат, соответствующий мировым стандартам лечения.

Внедрение в практику. Результаты исследования используются в аналитической и клинической практике в Центре клинической фармакологии и в Филиале «Клиническая фармакология» НЦ БМТ РАМН, в педагогическом процессе на кафедре клинической фармакологии и пропедевтики внутренних болезней ГБОУ ВПО «Первый МГМУ имени И.М. Сеченова» Минздравсоцразвигия России.

Связь задач исследования с проблемным планом. Диссертационная работа выполнялась в соответствии с тематикой и в соответствии с научным направлением «Совершенствование образовательных технологий додипломного и последипломного медицинского и фармацевтического образования» (номер регистрации 01.2011.68237).

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на научной конференции совместного заседания кафедры клинической фармакологии и пропедевтики внутренних болезней лечебного факультета и кафедры фармацевтической и токсикологической химии фармацевтического факультета ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М.Сеченова Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (Москва, 2011).

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Разработка качественной и количественной методики разделения десмопрессина методами ТСХ и ВЭЖХ.

2. Разработка методики количественного определения десмопрессина в плазме крови методом ВЭЖХ с LC/MS.

3. Изучение высвобождения десмопрессина из препаратов Натива и Минирин в условиях in vitro.

4. Изучение фармакокинетики десмопрессина у добровольцев после однократного приема изучаемых препаратов.

Публикации по работе. По теме диссертации опубликовано 3 печатные статьи в рецензируемых журналах перечня, рекомендованного ВАК РФ.

Личный вклад автора. Разработаны методы определения концентрации десмопрессина в фармпрепаратах и биологическом материале, валидированы методики фармацевтического анализа субстанции и лекарственной формы десмопрессина. Непосредственный анализ проб на ВЭЖХ, расчет фармакокинетических параметров с использованием компьютерной программы.

Проведена статистическая обработка полученных результатов. Установлены научно обоснованные нормы качества изучаемого лекарственного препарата.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.04.02 -фармацевтическая химия, фармакогнозия. Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 2 и 4 паспорта специальности фармацевтическая химия, фармакогнозия.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследований и их обсуждения, заключения и выводов.

Результаты эксперимента обобщены 25 таблицами и проиллюстрированы 13 рисунками. Библиографический указатель включает 34 отечественных и 100 иностранных публикаций.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

В качестве стандартного образца использовали субстанцию десмопрессина ацетата (ООО «НАТИВА», серия: 18062010, годен до 06.2012). Содержание основного компонента в используемом стандартном образце 99,0%.

Исследуемые препараты:

•Препарат Я - Минирин (Швеция), таблетки, содержащие 0,1 мг десмопрессина (препарат сравнения).

•Препарат Т - Натива (Россия), таблетки, содержащие 0,1мг десмопрессина (тестируемый препарат).

В работе использовано следующее оборудование и материалы: хромата графические пластинки TLC plates RP-18 F254S ,весы аналитические, рН-метр Metrohm 744, водная баня, магнитная мешалка, лабораторная центрифуга, лопастная мешалка ERWEKA DT 600, вибровстряхиватель Vortex, роторный испаритель с вакуумным насосом, холодильная (+4°С) и морозильная (-35°С) камеры.

Анализ проб, с целью определения качества и количества десмопрессина в лекарственной форме и субстанции, проводили на жидкостном хроматографе Gilson (Франция) со спектрофотометрическим детектором.

Для оценки пригодности хроматографической системы рассчитывали: величину подвижности (Rf); число теоретических тарелок (N); коэффициент емкости (к); селективность (а); степень разделения (R).

Концентрацию десмопрессина в плазме крови добровольцев определяли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии Agilent 1200 Serie SL с масс-спектрометрическим детектором.

В фармакокинетическое исследование бьшо включено 18 добровольцев с массой тела 65,5±10,7 кг, ростом 171,1±8,9 см и возрастом 25,8±5,1 лет. В качестве добровольцев были привлечены мужчины и женщины, добровольно изъявившие желание участвовать в исследовании. Добровольцы в период 1-14 дней проходили углубленное врачебное исследование (сбор анамнеза, врачебный осмотр, биохимическое исследование крови, общие анализы крови и мочи).

Добровольцы были проинформированы о том, что во время всего исследования они должны соблюдать стандартный режим: не подвергаться физической и психической нагрузке, не употреблять спиртные напитки, кофе и чай, а также не принимать никакие другие лекарственные препараты. В обязанности добровольцев также входило сообщение о любых изменениях режима и самочувствия во время и после проведения фармакокинетического исследования. После получения полной информации о ходе проведения исследования, при наличии письменного согласия волонтера, наличии у него всех

критериев включения, отсутствия критериев исключения проводилось страхование добровольца

В день начала исследования врач, руководящий исследованием, проводил клиническое исследование добровольца и делал запись в индивидуальной карточке добровольца. Затем устанавливал разовый кубитальный катетер, через который проводился забор крови.

Исследования проводились в рамках испытаний по биоэквивалентности лекарственных средств в соответствии с методологическими указаниями Минздравсоцразвития России по испытаниям биоэквивалентности и были одобрены комитетом по этике.

Прием препаратов осуществлялся per os в 8.30 часов утра. Забор проб крови осуществлялся из кубитальной вены в количестве 5 мл в гепаринизированные стеклянные пробирки до приема и спустя после приема препаратов. Пробы центрифугировали 15 мин при 3000 об/мин, отбирали 1,5 мл плазмы и хранили до анализа в морозилке при -35°С.

Для оценки пригодности хроматографической системы рассчитывали величину подвижности.

Для оценки системных параметров фармакокинетики использовали модельно-независимый метод статистических моментов (M-IND).

В качестве оценки относительной степени всасывания (f - относительная биодоступность) для тестируемого препарата (Натива) использовали соотношение:

f = AUCVt/AUCVt,

а скорости всасывания - отношение Cmax /AUQ-t. В каждом случае вычисляли величину отношения C^n^/C11^ (f').

Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета Microsoft Office Excel 2007, SigmaPlot 10.0 для персонального компьютера. Используя программу Statistica, рассчитывались следующие статистические параметры: среднее арифметическое значение (Mean), среднее геометрическое значение (GMean); стандартное отклонение (SD), коэффициент вариации (CV),

медианы (Median) и их интервальной оценки (L-95%, Up-95%). Достоверность различий полученных параметров оценивали с помощью дисперсионного анализа (ANOVA). Проведено попарное сравнение фармакокинетических параметров.

Разработка методики разделения десмопрессина методом тонкослойной хроматографии

Исследование субстанции и лекарственных форм десмопрессина проводили с использованием обращено-фазовых пластинок со слоем модифицированного силикагеля TLC plates RP-18 F254S> фирмы "Merck". Обозначение F254 показывает, что сорбент введен флуоресцентный индикатор с рабочей длиной волны 254. Хроматографическую пластинку предварительно активировали в течение 1 часа при температуре 100°С.

На хроматографическую пластинку размером 10 х 10 см на линию старта наносили в виде точек и в качестве свидетеля по 50 мкл стандартного раствора десмопрессина. Далее пластинку помещали в камеру с системой растворителей: метанол/вода (60/40), предварительно насыщенную в течение 1 часа. Хроматографировали одномерным восходящим способом. Когда фронт растворителей прошел 8 см, пластинку вынули из камеры и просушили на воздухе до исчезновения запаха растворителей. Для расчета параметров и количественной оценки результата ТСХ использовали денситометр Сорбфил. Предназначенную для расчета пластинку ТСХ закрепляли на предметном столике и помещали в осветительную камеру прибора. Камера освещалась светом с выбранной длиной волны Х-220 нм.

Изображение пластины с помощью видеокамеры, закрепленной на камере осветительной, вводилось в память компьютера и обрабатывалось по программе (1.1.0.100). На рис. 1 представлена денситограмма десмопрессина.

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 05 06 07 0.8 0.9 «

Рис. 1 Денситограмма десмопрессина

На хроматограмме препарата в дневном свете обнаруживается зона розового цвета стандарта десмопрессина с ~ 0.75. Идентификации также не мешали сопутствующие гидрофобные вещества, которые остаются на старте.

В таблице 1 представлены хроматографические параметры разделения (ТСХ) десмопрессина.

Таблица 1

Результаты расчета параметров ТСХ

Пик Б (площадь пика) Н (высота пика) %Н ЫТР (число теоретических тарелок) Аб (асимметрия пика)

1 0,75 5092 100 687 100 1635 0,93

Сумма 5092 687

В результате проведенного исследования показано, что лучшее разделение происходит с критерием 1^=0,75. Симметрия пика 0,93 при требовании 1,0 говорит о достаточном хроматографическом разделении.

Таким образом, в результате хроматографического разделения были подобраны оптимальные условия для определения десмопрессина методом ТСХ. Анализ ТСХ показал отсутствие примесей в субстанции десмопрессина («Натива», Россия).

Количественное определение десмопрессина в JIC методом жидкостной хроматографии

Для определения содержания и однородности содержания десмопрессина, подлинности десмопрессина в препаратах Минирин и Натива использовали метод ВЭЖХ со спектрофотометрическим детектированием.

Наилучшее разделение наблюдалось при использовании колонки Nucleosil 100-5 С18 (250x4 мм, 5 мкм) и подвижной фазы состава: ацетонитрил -фосфатный буфер с рН=б,8 в соотношении 18:82.

Хроматографические характеристики приведенной методики определения десмопрессина в растворах представлены в таблице 2.

Таблица 2

Хроматографические характеристики разделения десмопрессина

Параметры Обозначение Значение

Время удерживания t(MHH) 7,3±0,2

Коэффициент емкости к' 4,5

Число теоретических тарелок N 3875

Фактор симметрии As 0,95

Селективность А 0,8

Коэффициент удерживания R 1,4

Высота, эквивалентная теоретической тарелке-ВЭТТ (мм) Н 0,1

Количественное определение проводили методом абсолютной калибровки по площади пиков. Маточный раствор для калибровки десмопрессина (1 мг/мл) готовили в воде и хранили при -18°С (раствор стабилен 2 недели). Для построения калибровочного графика готовили стандартные растворы десмопрессина в воде с концентрациями 5, 10,15,20 и 25 мкг/мл и анализировали наВЭЖХ.

Калибровочная зависимость десмопрессина носила линейный характер в диапазоне концентраций 2-12 мкг/мл. Калибровочный график описывался линейным уравнением вида: у=а+Ьхх, где у- площадь хроматографического пика десмопрессина; х- концентрация десмопрессина в стандартных растворах (мкг/мл); Ь - угловой коэффициент линейной зависимости; а - свободный член линейной зависимости. Коэффициенты: а=3,6468, Ь=1,3132, коэффициент корреляции составил г2 =0,995. Предел обнаружения 0,1 мкг/мл.

Для оценки точности и воспроизводимости разработанной методики количественного определения десмопрессина в растворах по результатам 6-ти параллельных измерений 5-ти концентраций препарата были рассчитаны метрологические характеристики метода. Проведение статистической обработки полученных результатов показало их достоверность: относительная ошибка метода не превышала 2%.

Используя разработанный ВЭЖХ метод количественного определения десмопрессина в растворах, определяли содержание и однородность содержания десмопрессина в таблетках Натива и Минирин, содержащих по 0,1 мг десмопрессина.

По отдельности взвешивали по 20 таблеток изучаемых препаратов, фиксируя полученные значения в мг. Измельчали в ступке в порошок, дважды взвешивая полученный порошок (с точностью до 0,01 мг). Далее переносили порошок в стеклянные колбы, добавляли в каждую колбу по 10 мл 0,9% раствора натрия хлорида, перемешивали при помощи магнитной мешалки в течение 0,5 часа. Затем фильтровали через мембранный фильтр 0,45 мкм. Первые 2 мл

фильтрованного раствора для анализа не использовали. Каждый раствор содержал около 10 мкг/мл.

Стандартный раствор десмопрессина (1 мкг/мл) после фильтрации анализировали 6 раз (тест пригодности хроматографической системы в качестве стандарта для калибровки) на ВЭЖХ. Далее анализировали каждую испытуемую пробу. Полученные данные представлены в таблице 3.

Таблица 3

Количественное содержание десмопрессина в препаратах Натива и Минирин

Препараты Средняя масса Содержание десмопрессина

Натива 185-215 0,090-0,1 мг/таб

Минирин 185-215 0,098-0,1 мг/таб

Как видно из представленных данных, средняя масса таблеток находилась в пределах 185-215 мг для препаратов Натива и Минирин. Содержание десмопрессина у обоих изученных препаратов одинаковое. Доказано, что количество и однородность содержания десмопрессина в таблетках Натива (Россия) и Минирин (Швеция) эквивалентно.

Таким образом, в результате хроматографического разделения были подобраны оптимальные условия для количественного определения десмопрессина методом ВЭЖХ в ЛС.

Изучение сравнительной кинетика растворения

Исследование проводили на таблетках Натива и Минирин (доза 0,1 мг) Основной состав и условия таблетирования были идентичны. Таблетки по всем физико-химическим показателям соответствовали нормативным документам.

Для изучения высвобождения/растворения в условиях in vitro проводили в трех средах растворения со значениями рН 1,2 (солянокислый буферный раствор); 4,5 (ацетатный буферный раствор) и 6,5 (фосфатный буферный раствор).

Стандартные растворы десмопрессина с концентрацией 0,2 мкг/мл готовили в исследуемых средах.

Для испытания помещали по 1 таблетке в 6 стаканов прибора с предварительно нагретой до 37°С средой растворения. Последовательный отбор проб проводили через 10, 15, 20, 30 и 45 мин по 3,8 мл, причем такой же объем среды растворения добавлялся в соответствующий стакан для сохранения объема. Смешивание отобранных проб со средой растворения проводили на аппарате Vortex. Полученные пробы охлаждали и фильтровали через бумажный фильтр «синяя лента».

Измерения проводили на ВЭЖХ в максимуме поглощения при длине волны 220 нм.

Количество десмопрессина, перешедшего в раствор, вычисляли по формуле:

р(мг в таблетке)=А,хС.^си/А,.,=( A,xQt/Ast) xFcu

где:

At - средняя площадь пика десмопрессина на хроматограмме испытуемого раствора;

Cst - концентрация десмопрессина в стандартном растворе в мг/мл;

Ast- средняя площадь пиков десмопрессина стандартного раствора;

Vcu - объем в мл 0,9% раствора натрия хлорида, использованного в приготовлении испытуемого раствора;

Fcu - фактор калькуляции для ВЭЖХ системы (FCU=VCU) для расчета однородности содержания.

Проведенные исследования показали, что кинетику растворения/высвобождения десмопрессина из J1C необходимо проводить в среде растворения - фосфатный буфер с рН=6,5.

В таблице 4 и на рисунке 2 представлены результаты высвобождения десмопрессина в условиях in vitro в фосфатном буфере с рН=6,5.

Полученные профили растворения оценивали с помощью фактора различия и фактора подобия по методике, предложенной FDA.

Таблица 4

Количество десмопрессина, перешедшего в раствор в процентах (среда

растворения рН=6,5)

Время Мин Высвобождение десмопрессина (%)

1|2|3|4|5|6| Меап | ЯББ

Таблетки Натива

10 41,42 42,68 44,35 43,93 42,26 46,68 43,58 1,93 0,35

15 50,63 56,49 52,76 54,81 51,88 55,65 53,70 2,30 0,42

20 70,71 73,64 75,73 74,48 79,08 74,48 74,69 2,73 0,49

30 85,36 90,38 86,61 88,28 89,96 84,10 87,65 2,52 0,46

45 99,58 97,91 99,8 96,65 97,91 98,74 98,47 1,23 0,22

Таблетки Минирин

10 43,93 45,06 43,10 43,26 43,93 44,77 43,93 1,18 0,22

15 55,23 52,72 53,97 55,23 54,81 59,00 55,16 2,11 0,38

20 77,41 74,90 75,73 70,71 72,80 73,64 74,20 2,35 0,43

30 86,19 87,45 89,12 84,1 88,28 89,54 87,45 2,03 0,37

45 99,58 95,82 100,0 95,40 99,16 98,05 98,05 1,97 0,35

130 117 £ ™4 Я 91 5 78 Ч 65 | 52

Я 39 £ 26 13 О

О 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60

Время, мин

Рис.2. Усредненные кривые высвобождения действующего вещества из таблеток Натива и Минирин (среднее арифметическое значение ± стандартное отклонение, п=6). Среда растворения фосфатный буфер с рН=6,5

В результате обработки полученных данных скорость высвобождения у препаратов оказалась приблизительно одинаковой (за 30 мин - 85-90%)

Рассчитанные факторы сходимости и расходимости в среде фосфатный буфер: f2=80,5 и f,=2,l.

Как видно из представленных данных, кинетика перехода лекарственного средства в раствор из испытуемых препаратов Натива и Минирин в среде растворения - фосфатный буфер рН=6,5 - эквивалентна.

Количественное определение десмопрессина в плазме крови методом ВЭЖХ с хромато-масс-спектрометрическим детектированием

Так как (по литературным данным) концентрация десмопрессина в плазме мала, поэтому исследуемые пробы анализировали на жидкостном хроматографе "Agilent 1200" (США) с масс-спектрометрическим детектором (электроспрей ). Разделение проводилось на колонке Phenomenex Luna С18 (150x2мм, 5мкм) (США).

Масс-спектрометрическое детектирование проводилось в режиме положительной ионизации электрораспылением (ESI, Positive). В масс-спектре десмопрессина, полученном при ионизации вещества в режиме MC (или MS) с квадрупольным анализатором, наблюдался интенсивный пик с m/z, соответствующий протонированному молекулярному иону (М+Н)+ целевого вещества.

В анализе использован мониторинг 1 выбранного иона: первый анализатор (MCI) настроен на пропускание ионов с одним фиксированным значением m/z 328(для десмопрессина), второй анализатор (МС2) фиксирует количество прошедших ионов либо по одному, либо по нескольким (Multiple Reaction Monitoring - MRM) каналам с заданными значениями m/z 276 фрагментов (m/z выбранного дочернего иона десмопрессина). Параметры работы детектора подбирались для достижения максимального выхода MRT.

Наилучшее разделение десмопрессина было достигнуто при температуре разделения 30°С, подвижной фазе, состоящей из смеси метанола и

деионизированной воды с 0,05% муравьиной кислоты (в режиме градиентного разделения), скоростью потока 0.2 мл/мин. Объем вводимой пробы - 50 мкл. Фрагментатор НОВ, напряжение на капилляре 4,0 кВ; температура капилляра-245°С; температура в камере ионизации - 200°С, расход газа 4,5 л/мин, давление небулайзера 20 psi. В этих условиях время удерживания десмопрессина составило 9,2 мин.

Экстракция. Извлечение десмопрессина из биологических образцов плазмы человека проводили методом твердофазной экстракции. Твердофазную экстракцию осуществляли на колонках Strata-X 8B-S100-TAK Cl 8-Е (33 мкм, 30 мг) фирмы «Phenomenex» (Torrance, СА, США). Кондиционирование колонки проводили путем последовательного пропускания через нее 3,0 мл метанола с последующим кондиционированием 3,0 мл 0,1 M фосфатного буферного раствора (рН= 6,0). Далее через колонку медленно (1-2 мл/мин) пропускали образец плазмы, затем колонку промывали 3,0 мл воды деионизованной со скоростью 3 -5 мл/мин и подкисляли 2,0 мл 1М раствора уксусной кислоты. После колонку просушивали в токе азота при 20 psi в течение 2 минут. Далее через колонку последовательно пропускали 3,0 мл гексана и 1,7 мл смеси, состоящей из метиленхлорида, изопропилового спирта и гидроксида аммония (78:20:2) со скоростью 3-5 мл/мин.

Элюирование десмопрессина проводили 1,7 мл смеси гексан-этилацетат (1:1) при скорости потока 1-2 мл/мин. Собранный элюат высушивали в токе азота при комнатной температуре и перерастворяли в 100 мкл подвижной фазы. Образец объемом 50 мкл вводили в ВЭЖХ-МС систему.

Количественное определение. Для количественной оценки бьш применен метод абсолютной калибровки. Для построения калибровочной кривой и расчета процента извлечения десмопрессина из плазмы крови готовили его концентрированный раствор (10 мкг/мл). Методом последовательных разведений получили серию стандартных растворов десмопрессина в воде в диапазоне концентраций от 1,0 - 100 пг/мл. В изучаемом диапазоне концентраций (1-100 пг/мл) отмечена линейная зависимость между концентрацией десмопрессина и

соответствующей площадью хроматографического пика. Коэффициент корреляции составил г=0,98.

Достоверность результатов количественного определения десмопрессина в плазме крови оценивали, рассчитывая метрологические характеристики данной методики по результатам 5 параллельных измерений концентрации в семи образцах модельной смеси плазмы крови.

Порог чувствительности метода (абсолютная чувствительность по десмопрессину в анализируемой пробе) составляла не ниже 1 пг десмопрессина в мл плазмы крови. Относительная ошибка определения составляла 4,2; 4,5; 5,7; 6,9; 1,4; 1,6 и 2,9% при концентрации препарата 1, 2, 5, 10, 25, 50 и 100 пг/мл соответственно. Истинное содержание препарата в пробах находится в рассчитанных доверительных границах, а представленная методика количественного определения десмопрессина в плазме крови свободна от систематических ошибок. Таким образом, разработанная методика отвечает основным требованиям, предъявляемым к аналитическим методам, используемым для изучения распределения лекарственных препаратов в биологических жидкостях.

Изучение сравнительной фармакокинетики препаратов Натива и Минирин

Оценка биоэквивалентности проводилась путем определения концентрации десмопрессина в плазме крови добровольцев, которая определялась методом ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектором.

Усредненные значения динамики концентрации десмопрессина в плазме крови добровольцев после однократного перорального приема препаратов Натива и Минирин в дозе 0,1 мг приведены в таблицах 5,6.

В нулевой точке (перед введением препарата) исследование проб плазмы крови всех испытуемых не выявило присутствия в плазме крови десмопрессина.

Таблица 5

Усредненная динамика содержания десмопрессина (пг/мл) в плазме крови добровольцев после однократного приема внутрь 0,1 мг препарата

Натива

Время после введения препарата, ч

0,5 1 1,5 2 3 4 6 8 12

Меап 34 51 64 59 43 31 21 14 9

вМеап 32 48 60 55 39 28 19 13 8

13 17 23 23 20 15 11 7 4

СУ 40 33 36 39 47 48 53 51 46

МесНап 29 49 56 55 38 28 20 12 8

Таблица б

Усредненная динамика содержания десмопрессина (пг/мл) в плазме крови добровольцев после однократного приема внутрь 0,1 мг препарата

Минирин

Время после введения препарата, ч

0,5 1 1,5 2 3 4 6 8 12

Меап 31 53 63 58 44 32 22 14 8

ОМеап 28 50 59 52 39 28 19 12 7

ББ 13 16 25 24 21 17 12 7 2

СУ 43 30 40 43 48 54 55 50 31

МесИап 30 53 56 53 38 26 18 12 8

Средние значения концентрации десмопрессина статистически достоверно не различались для каждого момента времени как после приема препарата Натива, так и после приема препарата Минирин.

Следует отметить, что после приема исследуемых препаратов имеет место значительная межиндивидуальная вариация кинетических кривых во всех точках отбора крови.

Характер фармакокинетических кривых, полученных после введения указанных препаратов, в целом сходен (рис.3). После приема как препарата сравнения, так и испытуемого препарата, десмопрессин быстро всасывается в системный кровоток из желудочно-кишечного тракта. Максимальный уровень

десмопрессина достигался к 1,5 часам, и также быстро препарат выводится из организма.

Рис.3. Усредненные кинетические кривые после однократного приема препаратов Натива и Минирин добровольцами (среднее арифметическое значение ± стандартное отклонение)

Полученные экспериментальные данные концентрации исследуемых веществ были обработаны с использованием метода математического моделирования, что позволило количественно оценить фармакокинетические процессы и рассчитать параметры фармакокинетики. Значения усредненных фармакокинетических параметров десмопрессина представлены в табл. 7, 8.

Таблица 7

Усредненные фармакокинетические параметры препарата Натива

АиСо., Лис«, Г ^птах Т 1 тах К-аЬэ Т1/2 МЯТ УББ/И

пгхч/мл пгхч/мл пг/мл ч 1/ч ч ч л

Меап 268 347 67 1,5 2,2 3,5 4,9 1582

ОМеап 250 322 65 1,4 1,9 3,4 4,7 1471

БО 108 145 21 0,4 1,2 0,9 1,2 609

СУ 40 42 32 26 54 27 25 38

МеШап 242 285 60 1,5 1,7 3,7 5,0 1505

Таблица 8

Усредненные фармакокинетические параметры препарата Минирин

АиС<м АиС„ Стах Т 1 тах К-аЬБ Т,д МЯТ Убб/Р

пгхч/мл пгхч/мл пг/мл Ч 1/4 Ч ч л

Меап 269 337 68 1,5 2,0 3,3 4,6 1594

вМеап 247 310 65 1,4 1,7 3,2 4,4 1421

ББ 117 148 24 0,4 1,5 0,9 1.1 818

СУ 43 44 36 28 73 27 24 51

Ме&ап 228 298 60 1,5 1,8 3,3 4,7 1575

Имел место значительный индивидуальный разброс фармакокинетических параметров после однократного приема изучаемых препаратов.

Как видно из представленных данных, не выявлено достоверно значимых различий для сравниваемых величин всех рассчитанных параметров фармакокинетики. Так, среднее значение площади под фармакокинетической кривой десмопрессина для препарата Натива составляло 347±145 пгхч/мл, а для препарата Минирин - 337±148 пгхч/мл. Максимальная концентрация (Стах) для препарата Натива составила 67±21 пг/мл, а для препарата Минирин - 68±24 пг/мл. Время достижения максимальной концентрации для обоих препаратов составило 1,5±0,4 часа.

Значение отношений максимальной концентрации к площади под фармакокинетической кривой С^/АиС для двух исследуемых препаратов десмопрессина статистически достоверно не различалось и составляло в среднем соответственно 0,19 и 0,20±1/ч.

Усредненные параметры относительной биодоступности десмопрессина после однократного приема препаратов Натива и Минирин представлены в таблице 9.

Как видно из представленных данных, средние значения и доверительные интервалы генеральных средних для Г и Г' не выходят за допустимые пределы.

Доверительный интервал для отношений 1п АиСм составил 0,876 (нижний предел) и 1,093 (верхний предел). Рассчитанный 90% доверительный интервал не выходит за установленные рамки.

Таблица 9

Усредненные параметры относительной биодоступности десмопрессина после однократного приема препаратов Натива и Минирин

f f'

Средние арифметические значения 1,06 1.00

Средние геометрические значения 1,04 1,00

Стандартное отклонение 0.20 0,10

Медиана 1,11 1,02

Коэффициент вариации 18,6 10,5

Интервальные значения 0,75-1,37 0.80-И,17

Исследования показали, что сравниваемые препараты являются биоэквивалентными.

Таким образом, в целях повышения экономической доступности лекарственных средств (Распоряжение Правительства РФ от б июля 2010 г № 1141-р) для лечения несахарного диабета разработан препарат Натива (Россия), который по изученным параметрам не отличается от зарубежного аналога препарата Минирин (Швеция).

ВЫВОДЫ

1. Разработана простая воспроизводимая методика качественного и количественного определения десмопрессина в субстанциях и таблетках методом ТСХ и ВЭЖХ с применением УФ-детекции.

2. Разработан чувствительный, воспроизводимый метод количественного определения десмопрессина в плазме крови добровольцев с помощью ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектором: подобраны оптимальные условия экстракции, хроматографического разделения и детектирования. Предел обнаружения десмопрессина в плазме крови составил 0,5 пг/мл.

3. Подобраны условия и изучены степень и скорость высвобождения десмопрессина из таблеток в условиях in vitro. Проводить кинетику высвобождения десмопрессина необходимо в среде растворения - фосфатный буфер с рН=6,5.

4. Оценены основные фармакокинетические параметры (AUCo-i, AUC„, Т1/2, Kabs, Vss/F) после однократного приема препаратов Натива и Минирин добровольцами. Площадь под фармакокинетической кривой в среднем составляет 347±145 пгхч/мл для препарата Натива и 337±148 пгхч/мл для препарата Минирин. Период полуэлиминации - 3,5±0,9 ч и 3,3±0,9 ч соответственно для изучаемых препаратов.

5. Дисперсионный анализ значений AUCo-t, С^, Cmax/AUCo-t проведенный после их логарифмического преобразования не выявил статистически значимых различий между изучаемыми препаратами. Согласно методическим указаниям «Оценка биоэквивалентности лекарственных средств» 2008 г. сравниваемые препараты Натива (Россия) и Минирин ( Швеция) биоэквивалентны.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Нгуен Чи Тхань, A.A. Карлицкая, К.С. Давыдов, В.Г. Кукес. Определение десмопрессина методом хроматомасс-спектрометрии. // Химико-фармацевтический журнал. -2011. - Том 45, № 8. - С. 53-55.

2. Нгуен Чи Тхань, А.Б. Прокофьев. Несахарный диабет: подходы к заместительной терапии десмопрессином. // Клиническая медицина. - 2011. - № 4.-С. 30-33.

3. Нгуен Чи Тхань. Условия хромато-масс-спектрометрического определения десмопрессина в биологических образцах. // Биомедицина. -Москва, 2011,- №4. -С. 113-114.

Подписано в печать: 19.04.2012 Объем 1,0 усл. п. л. Тираж: 100 экз. Заказ № 109 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, Страстной бульвар, д. 6, стр. 1 (495) 978-43-34; www.reglet.ru