Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Характеристика продуктов секреции околощитовидных желез

ЕРЕВАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ

на правах рукописи

СААКЯН Рузам Аршавиронна

УДК 616.447

X Л |> л К 1 Е Р ИСТ И К А ПРО Д У КТОВ СЕКРЕЦШI ОКСМОЩИТОВИДНЫХ ЖЕЛЕЗ

14.00.16 - патофизиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ЕРЕВАН- 1992

РабйТЯ Р Централизм Н4У'И}Р-НС слс-дсн-'.'.телккрй лд-

Pppwippm МНПЧ1ТУГ4-

ЩПНН«5 рукр(юлите-1м;

локтоп HP^HHHif-THi ррофсс^р А-й-Зй-Ч^ЧН

донрр (Ш'к Л\С.Саадчм

Оф»1Ц»НИН!НР РПЦЯНРИТИ5

,WTpp «ayii» г»рЦ).и!скочн ».л.

др^ТРР яррф.Аьомяц Ж.И-

BfWWffP УЧРР'-'И'ИР - PppRi»4C»cnf| ^yijiipnuciuujK н»ет»|Тут усовершенствования врачей

Защита состоится "_"__1991 г. к__часов на

засдазадм Специализированной» Совета К 075.U3.03. при Ерев; ч-ркрм цр^ндмнском институте ( 575025, Ереван, ул.Корюна. 2 ).

С диссертацией можно cur ¡юмиткя » шн>..потеке К ренанскою м ед и пинского и нет и тута

Автореферат разое-чан " " 14()2г. \

Учении секретарь Специализированного Совета кандидаг su ¡.¡ia\ -: л.А.Казарян

roïïr - ■•¿.ViAÄ ; -г-}

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

В последнее десятилетие стало формироваться представление о целостной автономной многокомпонентной системе, обеспечивающей гомеостаз кальция в организме. Центральным регуляторным-органом этой системы являются околощитовидные железы.

Большинство авторов придерживается того мнения, что эффекты кальцийрёгулирующих гормонов на многие интегративные процессы, и в первую очередь, на иммунные механизмы, опосредуются исключительно через кальциевый механизм. Имеется обширная литература о роли Ca** в иммунных процессах. Показана его важная роль в активации комплемента (Hadden, 1979), нейтрофилов (Hume,Gordon,1983; Naccache,1983; Ochs, 1983; Sheram, e.a., 1983), в инициации Т-лимфоцитарных реакций (Gearing,e.a., 1985), в митогенной активации лимфоцитов (Blitstein, Diamanstein, 1978; Desaymard,e.a.,1980), в синтезе иммуноглобулинов (Brawn,1970; Boiis,1971), дифференцировке клеток (Green,e.a., 1976),в распознавании по типу "рецептор - лиганд" (Lichtman, 1983), и так далее. Вместе с тем имеются, единичные сведения, согласно которым функции кальций-регулирующих гормонов, и в частности паратиреоидного гормона и кальцитонина, далеко не всегда реализуются через кальциевые механизмы. Их следует рассматривать не только в качестве медиаторов, оказывающих сугубо разрешающее действие на отдельные органы-мишени, а в более широком плане - в качестве секреторно-активных веществ общебиологического спектра действия. С этой точки зрения наиболее актуальным является изучение взаимосвязи между кальцийрегулируюхци-ми гормонами и иммунной системой. Имеется ряд данных, указывающих на наличие тесных реципрокных взаимоотношений между центральным органом иммуногенеза - тимусом и околощитовидными железами <Perris,e.a.,1967; 1970; Perry,e.a., 1984). Изучение взаимодействия гормонального комплекса, обеспечивающего гомеостаз кальция, с иммунной системой, является необходимым для

/

понимания многих сторон процесса реализации тех или иных иммунных функций. К сожалению, проведенные в этой области исследования носят фрагментарный характери не позволяют получить достаточного представления об уровне взаимодействия иммунной ситемы и системы, обеспечивающей кальциевый гомеостаз. Имеющиеся в литературе сведения по этому вопросу немногочисленны и затрагивают лишь отдельные звенья сложной многогранном системы клеточного и гуморального иммунитета. Так, известно, что па-ратгормон стимулирует, а кальцитонин тормозит митотическое деление незрелых лимфоидных клеток в тимусе (Whitfield, е.а., 1970; Potts, Deffos, 1974). Выявлены высокоаффинные рецепторы к пара-ти peo ид ному гормону на различных субпопуляциях лимфоцитов (Perry, е.а., 1984; Bialasievich, е.а., 1979; Yamamoto, е.а., 19S3). Имеются отдельные сведения, косвенно свидетельствующие в пользу модулирующей роли медиаторов тимуса на секреторные процессы в околещитовидной и щитовидной железах. Из тимуса удалось выделить фактор, обладающий способностью, снижать подобно хальци-дшину уровень кальция в крови ¡Potop, 1966; Milcu, е.а., 1973). КемеАевон с сотрудниками (Ксмелева,1984) было показано, что удхтение тимуса приводит к стойкому резкому повышению уровня паратиреоидном гормона в крови. Наличие функциональной связи в известной мере подтверждается и единым эмбриональным происхождением околощитовидных желез и тимуса: показано, что они оба развиваются из одной и той же группы клеток третьего жаберного кармана (Gilmor, 1937; Aria, е.а., 1983).

Таким образом, литературные данные свидетельствуют о важной роли кальцийрегулирующих гормонов в реализации реакций клеточного н гуморального иммунитета, однако судить о конкретных механизмах взаиморег>ляции и зависимости между околощи-товид шми железами и органами иммуногенеза на сегодняшний день не представляется возможным.

В настоящей работе предпринята попытка выявить роль пептидных гормонов, регулирующих кальциевый гомеостаз, в функционировании клеток иммунной системы.

Цель исследования. Целью настоящей работы являлось выделение и очистка продуктов секреции околощитовидных желез и изучение действия ряда препаратов, полученных из ткани околощитовидных желез на митотическую активность иммунокомпентных клеток.

Основные задачи исследования:

1. Выделить продукты секреции окслощитовтдных желез.

2. Про? ест и хромато графическое разделение экстрактов околощитовидных желез на сефадексе С-'00.

3. Провести хроматографическин разделение экстрактов околощитовидных желез на геле ТОУО-РЕАКЬ ЬШ-55.

4. Провести анализ иммуномодуляторной активности различных фракций, полученных при хроматографическом разделении экстрактов околощитовидных желез, на лимфоидных клетках лабораторных животных.

5. Провести анализ иммуномодуляторной активности различных фракций, полученных при хроматографическом разделении экстрактов околощитовидных желез, на лимфоидных клетках, полученных из тимуса,селезенки и лимфоузлов человека.

Новизна исследования. Впервые получены новые сведения, указывающие на тесную взаимосвязь между функциональным состоянием иммунной системы и гормонами, регулирующими гоме-остаз кальция в организме.

Показано, что паратиреоидный. гормон и экстракт из околощитовидных желез способны изменять митотическую активность им-мунокомпетентных клеток в 10 и более раз, что говорит о высокой специфичности взаимодействия. Показано, что кальцийрегулиру-ющие пептиды, и в частности, паратиреоидный гормон, могут связываться с митогенными рецепторами лимфоцитов, а в определенных условиях также модулировать митотическую активность конканавалина А и фитогемагглютинина. Проведен хроматографи ческий анализ экстрактов околощитовидных желез. Изучена имму-номодуляторная активность различных фракций (паратгормонсо-держащих и паратгормон не содержащих). Впервые показано, что

иммуномодуляторную активность кроме паратиреоидного гормона имеют и другие соединения, полученные из экстрактов тканей околощитовидных желез.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные результаты указывают на существование связей между системами, регулирующими иммунный и кальциевый гомеостаз.

Эти результаты позволяют научно обосновать существование большого количества иммунодефицитных состояний при эндокринных патологиях, сопровождающихся нарушениями в кальцийрегу-лирующей системе.

Полученные результаты являются основой для разработки новых методов очистки биоактивных соединений из тканей околощи-товидиых желез с применением гелей ТОУО-РЕАКЬ, с последующей тестировкой биологической активности полученных препаратов.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены и обсуждены на:

- 4-ом Всесоюзном симпозиуме"Регуляция иммунного гомеоста-за" (Суздаль, 1986);

- 2-ой конференции по проблемам физико-химической биологии в биотехнологии в медицине (Ереван, 1986);

- 4-ой республиканской молодежной конференции по физико-химической биологии (Севан, 1987);

- конференции молодых специалистов и ученых медицинского института "Современные вопросы общей и частной патологии" (Ереван, 1988).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 работ. На основании полученных результатов даны два рационализаторских предложения.

Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, трех глав, содержащих изложение результатов собственных исследований, выводов и указателя литературы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе были использованы клетки тимуса и селезенки мышей-самцов линии СзН и крыс-самцов линии Spraque-Dawley. Для получения поликлональных антисывороток иммунизировали кроликов, породы Шиншилла. Животные были получены из питомника АМН СССР "Столбовая", из питомника "Светлые горы", из питомника "Арзни" АН Армянской республики.

Использовали следующие коммерческие препараты: паратирео-идная субстанция (Sigma, USA, Cat.n Р4410), паратиреоидин (Московский эндокринный закол), N-концевой синтетический фрагмент ПТГ ]-34 (Peptide Institute Ine, Dsaca, Japan, Lxit. 370407), С-концевой фрагмент 1ГГГ 39-84 (Pepude Institute Inc, Osaca, Japan, Lot. 370407), кальиипар (кальцитонин) (Rorer, Espania),aH-тисыворотка k N-концевомуфрагменту 1-34 ПТ (Scantibodies Laboratory Inc, USA).

Реакцию6.KK i трансформации лим^мцитов (РБТЛ) ставили по модифицированном \ тетолу (ШюттХ., 1987). В качестве митоге-нои использовали конкананалин А (КонА) (SIGMA, США) и фито-гематглютинчн «<1>Г.-\> (GlВСО, США).

Инкубацию клеток при Р1Л"Л проводили в течение 72 часов. За !6 часок до конца инкубации н каждою лунку добавляли меченый зН-тими.иш ' \MI RSHAM, США или PRAHA, ЧССР) с конечной ' активностям i мк СИ/чл. I ¡олечетактивности проводили на ецнн-тилляциоином дн> хкана.тьном (}>отометре RAC-BETA 2101 (LKB, Швеция). Oó¡ aóoiKa конечных результатов проводилась на компьютерах "GAMMA COMP". "IBM PS/2 50Z" и "APPLE Не".

Клетки человеческой селезенки и лимфатических узлов выделяли из соответствующих лимфоидных органов при патана комическом вскрытии людей, погибших в автомобильной катастрофе или от инфаркта миокарда и доставленных в Институт хирургии им/. Склифосовского. Их возраст не превышал 50 лет. Материал забирался не позже 4 часов после констатации смерти и обрабатывался непосредственно н лаборатории, размещенной в больнице.

В работе использовался ацетоновый экстракт из i камей околощитовидных желез. Для се получения во время забоя скота осуществляли забор желез у быков. Дл я получения ацетонового экстракта заливали полученную пудру холодным ацетоном (-20Х) в соотношении веса к объему 1:5, перемешивали в течение 20 минут при 4" С, затем центрифугировали при ЗОООоб/мин 10 минут. Надосадо жую жидкость ст и вал и, а к осадку приливали этиловый эфир в соотношении 1:2. Проводили 20-минутную инкубацию в холодных условиях при постоянном помешивании, затем надосадочную жидкость сливали, а процедуру с эфиром повторяли 2 раза. Полученный осадок высушивали в вакуумной камере и растирали в 0,0 J М TRIS-НС1 буфере pH 7,3 с добавлением 0,001 М ЭДТА и 0,2 М NaCl. Экстракцию проводили в течение 16-24-х часов при 4°С при непрерывном помешивании.

Для получения фосфатных экстрактов пудру после растирания в жидком азоте заливали 0,1 М Na-Na фосфатным буфером pH 7,4 с добавлением 0,2 М NaCl и 0,001 М ЭДТА. Экстракцию проводили 24 часа при 4 С. После экстракции образцы центрифугировали при 10000 об/мин в течение 40 минут; разливали аликвоты во флаконы и хранили при температуре не ниже -20°С. Перед употреблением экстракт пропускали через ацетатцеллюлозные фильтры фирмы Millipore марки GS или НА с диаметром пор 0,22 или 0,45 ммк для освобождения от нерастворимых частиц.

Хроматографическое разделение экстрактов проводили яря помощи гелей TOYO PEARL HW-55( TOYO-SODA, Япония). Для хроматографии использовали комплекс аппаратов фирмы LKB (Швеция), состоящий из холодильного шкафа, насоса, спектрофотометра.

Паратгормон и кальцитоиин определяли радиоиммунологическим методом (Reuter,с.а.,1976), используя наборы фирмы Byk Ма lünckrodt (ФРГ), рассчитанные на 100 определений. Образцы хранили до проведения анализа при - 20'С.

Полученные результаты обрабатывались при помощи критерия Стьюдснта-Фишера, а также полных программ для обработки ра-

диоиммунологических данных, предложенных ВОЗ в 1984 г. "PR Edwards, department of molecular endocrinology" Аб и "Джон Ат-хиис" 1981 г.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Характеристика экстрактов околощитовидных желез

В настоящей работе мы применяли щадящие методы получения и очистки гомогената. Вследствие этого профиль элгоции, полученный нами после гель-фильтрации на сефадексе G-100 fine (колонка размером 85x2, элюирующий буфер -0,01 М фосфатный буфер,содержащий 0,2 М NaCl pH 7,4,скоростьэлюции30мл/час).несколько отличается от описанного в литературе ( Auerbach and Potts, 1964).

Нами было получено 7 белковых пиков. Наибольшее количество ларатериоидного гормона - 46,5% от общего содержания гормона -содержалось в первых двух пиках (фракции 11-15). Четвертый пик (фракции 27-31) содержал в два раза меньше гормона - 25,5% от общего содержания гормона, а третий пик (фракции 19-21) - 7,8% от общего содержания ПТГ. В шестом пике (фракции 57-58) содержание гормона было незначительным - 0,56 мг/мл (рис.1). Кальци-тонин содержался во всех фракцитх. Наибольшее его количество выходило в пятом пике, а наименьшее - в третьем пике. Однако, количество кальцитонина было на два порядка меньше, чем ПТГ. Применение геля TOYO PEARL HW-55 фирмы TOYO SODA (Япония), обладающего той же пропускной способностью, что и сефа-декс G-100, дало нам возможность не только получать лучшее разрешение при фракционировании экстракта ОЩЖ, но и получать фракции экстракта, свободные от присутствия вышеупомянутых гормонов. Э.-:юцию проводили 0,01 М фосфатным буфером, содер

лдсорОация при 260 мм

Рис.1. Профш. элюции экстракта околощитовидных желез на колонке с гелем сефадекс С- /00. Размер колонки - 100 х 1,6 см; скорость элюции - 36 мл/час; элюирующй раствор - 0,01 М; фосфатный буфер с 0,2 М ЫаС1. а - концентрация белка в элюенте б - концентрация паратиреоидного гормона в - концентрация кальцитонина

жащям 0,2 М NaCI, pH 7,4, скорость элюции 30 мл/час. Фракционирование дает 4 четко отделенных друг от друга пика. Определение кальцитоннна проводили при помощи наборов фирмы Byg Mallinckrodt, а ПТГ- наборов фирмы Sorin, которые слабо перекре-стносвязываются с ПТГ, содержащейся в бычьей сыворотке. За счет этого определяемое количество ПТГ в различных сериях экспериментов различалось. В первом пике (фракции ,15-20) содержалось окаю 12% всего ПТГ, третий и четвертый пики были свободны от присутствия гормона, и наибольшее количество ПТГ содержалось в четвертом пике (фракции 40-44) - 86,5% от общего количества гормона. Кальцитонин содержался во всех фракциях. Наименьшее его количество содержалось в первой фракции - 5% от общего содержания гормона: Наибольшее количество кальцитонина содержалось во втором и третьем пиках - 25,8% и 67,4% соответственно."В четвертом пике содержани гормона было незначительным - 0,74% от общего содержани кальцитонина (рис.2).

Присутствие паратиреоидного гормона и кальцитонина в небольших количествах почти во всех пиках можно объяснить высокой агрегационной способностью этих гормонов, а также наличием в экстракте фрагментов ПТГ, имеющих антигенную детерминанту 64-84 (Brown Е.М.,1982), которая определяется используемыми наборами.

2. Влияние фракций экстрактов околощитовидных желез , на синтез ДНК в иммунекомпетентных клетках.

В качестве модулирующих агентов использовали фракции фосфатного экстракта ОЩЖ, полученного после гель-фильтрации с использованием гелей TO-YO-PEARL. »

Начиная с 17-ой фракции и до 27-ой наблюдалось увеличение включения меченного тимидина в ДНК. 23-я фракция стимулировала включениемеченноготимидинавДНКв2,4 раза по сравнению с контролем. Фракции 30-31 не обладали модулирующим действи

гр* 260

Рис.2 Профиль олюции экстракта околощипнмшдных желез на колонке с гелем ТО УО-РКЛМ. Н И^-55. Размер колонки - 100x1,6 см,' скорость элюции - 36 мл!час; элюирующий раствор - 0,01 М; фосфатный буфер с 0,2 М ЫаС1 а - концентрация белка с элюенте 6 - концентрация паратиреоидного гормона в - концентрация кальцитонина

ем на синтез ДНК. 34 - 40 фракции подавляли синтез ДНК в 1,5 раза, фракции 44-47 - в 3,5 раза (рис.3).

При введении подпороговой дозы конканавалина А (0,08 мг/мл или 0,004 мг на лунку) в среду культивирования фракции 17-21 и 24-27 практическине влияли на синтез ДНК (фракции 17-21 понижали в 1,2 раза включение меченного тимидина в ДНК, а фракции 24-27 повышали его во столько же раз), т.е. указанные фракции обладали полярным действием. Начиная с фракций 30-31 синтез ДНК увеличивался (в 2,4 раза), фракции 39-40 увеличивали включение меченного тимидина в ДНК в 8,5 раз,а фракции 39-40 - в 21 раз.Затем уровень включения тимидина резко падал: фракции 4447 подавляли включение тимидина в ДНК почти в 2 раза. 50-ая фракция не изменяла уровень включения меченного тимидина в ДНК (рис.4).

3. Изменение интенсивности синтеза в лимфоидных клетках человека под влиянием экстрактоколощитовидных желез.

Эксперименты проводили на лимфоидных клетках человека. Их получали не позже, чем через 2-3 часа после смерти в патанатоми-ческом отделении НИИ скорой помощи им.Склифоссофского. Стерильно забирали аортальные и легочные лимфоузлы, селезенку, тимус. Весь материал обрабатывали тут же и готовили стерильные лимфоцитарные суспензии, которые отмывали два раза средой 199, центрифугировали при 1200об/мин 10 мин, затем наслаивали на градиент фикалла 1,077г/мл и центрифугировали при комнатной температуре от 25 до 30 мин. В контрольных экспериментах в полученной фракции с плотностью меньше 1,077 г/мл в основном обнаруживались лимфоциты (более 95%) и в небольших количествах моноциты. Полученные лимфоциты разводили до концентрации клеток - 2x10 в 1 мл и культивировали по методике, описанной в главе "Матернейи н методы".

Во время получения суспензии лимфоузлов приходилось неод

Рис.3. Иммуномодуляторная активность фракций ОЩЖ. Элкщия экстракта ОЩЖна колонке с гелем ТО YO PEARL HW-55. Размер колонки 100 х 1,6 см, скорость элюции - 36 мл!час, элюирующй раствор - 0,01 М фосфатный буфер, содержащий 0,2 М NaCL

а - кривая включения меченного тимидина в синтез ДНК. б ' профиль элюции.

14

Рис.4. Характеристика иммуномодуляториой активности фракций, полученных после гель-фильтрации на колонке с гелем

TOYO PEARL, а - активность белковых фракций

б - совместная активность белковых фракций и конканавалииа А

15

иократноотмывать клетки от смолистых веществ и угольной пыли, в большом количестве присутствующей в этой ткани. Отмывали клетки столько раз, чтобы первоначальный серый цвет суспензии сменился на бледно-розовый. В некоторых случаях остатки эритроцитов лнзировал>. при помощи раствора хлористого аммония с бикарбонатом калия и натриевой солью ЭДТА.

В качестве модулирующего агента использовался экстракт Г1ЩЖ, получаемый нами из паращитовидных желез половозрелых коров и быков.

Введение пол\ ченного нами гру'ого экстраркта ПЩЖ в культу-ральную среду, содержащую спленоциты в дозе 0,01мг/мл, вызывало небольшое (в 1,4 раза) увеличение включения меченного ти-мидина в ДНК, увеличение дозы до 0,04 мг/мл приводило к снижению синтеза ДНК в 1,2 раза, 10-кратное увеличение первоначальной дозы вызывало снижение синтеза ДНК приблизительно в 2 раза.

В тимоцитах дозэ препарата 0.01 мг/мл практически не влияла на синтез ДНК, 4-кратное увеличение дозы снижало синтез в 1,5 раза, а 10-кратное - увеличивало включение меченного тимидина в 1,4 раза.

В лимфоцитах, выделенных из лимфоузлов, доза в 0,01 мг/мл препарата не влияла на включение меченного тимидина в ДНК. а дозы препарата в 0,04 и 0,1 мг/мл вызывали увеличение включения меченного тимидина в ДНК в 1,6 и 1,5 раза соответственно.

Эти данные свидетельствуют о том, что препарат обладает им-муномодуляторной активностью и способен изменять пролифера-тивную активность лимфоцитов тимуса и селезенки человека.

Для выявления возможности конкурирования исследуемых гормонов за митпгенные рецепторы нами был использован конканава-лин А.

Добавление в культуральную среду, содержащую спленоциты человека, конканавалина А в дозе 0,08 мг/мл или 0,004 мг на лунку не приводило к изменению синтеза ДНК при дозе экстракта 0,01 мг/мл. Увеличение дозы препарата в 4 раза приводило к увеличе-

нию синтеза ДНК в 1,3 раза, а Ю-кратнЗггувелш.сиие дозы - к 2-кратному увеличению включения меченного гимидина в ДНК.

В тимусе добавление конканавалина А уменьшало включение меченноготимидина в ДНК при дозах препарата в 0,01 мг/мл и 0,04 мг/мл в 2 и 1,6 раза соответственно, а в дозе 0,1 мг/мл не влияло на синтез ДНК.

В лимфоцитах, выделенных из лимфоузлов, в присутствии конканавалина А препарат в дозе 0,01 мг/мл снижал количество включенного радиоактивного тимидина в ДНК в 1,4 раза. При дозах в 0,04 мг/мл и 0,1 мг/мл аналогичный показатель снижался в 1,4 и 1.7 раза соответственно.

Эти результаты позволяют предположить, что не существует конкуренции за митогенные рецепторы между грубым экстрактом и конканавалином А в лимфоцитах из тимуса, селезенки и лимфатических узлов.

Известно, что кофеин потенцирует действие гормонов, оказывающих свое воздействие опосредованно через активацию цАМФ (Robinson G'.F. et.al 1968). Было показано, что паратериоидный гормон стимулирует пролиферацию лимфоцитов, причем кофеин потенцирует его действие (F.Witfield et.al 1970).

Для проверки возможности действия исследуемых гормонов через циклазнуюсистему нами был использован кофеин в концентрации 0,3 мМ/мл.

Добавление кофеина в культуральную жидкость, содержащую спленоциты практически не вызывало изменений в синтезе ДНК при тестировке препаратов ОЩЖ.

В тимоцитах введение кофеина приводило к уменьшению включения меченного тимидина в ДНК во всех трех дозах: в дозе 0,01 мг/мл - в 2 раза, в дозе 0,04 мг/мл и 0,1 мг/мл - приблизительно в 1,7 раза

Добавление кофеина в культуральнуюсреду, содержащую лим-ф»щиты из лимфоузлов > неличиволо синтез ДНК в 2 раза при дозе 0.01 мг/м. I, в 2.4 раза при дозе 0,04 мг/мл и в 1,2 раза при дозе 0,! mi/мл.

Таким образом, проведенные эксперименты показали, что изучаемый нами препарат не обладает ярко выраженной модулирушей активностью по отношению к синтезу ДНК влимфоидных клетках тимуса, селезнки и лимфатических узлов человека.

В последующей серии эксперимеиитов нами была изучена активность паратирсоидной субстанции (Sigma,USA,Cal.nP4410) и парзтиреоидина (Московский эндокринный завод). В таблице 4 показано влияние паратирсоидной субстанции на интенсивность синтеза ДНК в тимических лимфоцитах крыс линии Август при воздействии субоптимальных доз конканавалина А.

ТАБЛИЦА 4

Влияние паратирсоидной субстанции на интенсивное! ь синтеза ДНК в тимических лимфоцитах крыс линии Август

ПТГ Кон А ПТГ+ Кон А

контроль 409+62 8900+290

1,2 Г.Д/мл 373+95 48641+13576

0,12 ЕД/мл 234+23 19410+1638

0,012 Г!Л/мл 253+11 7106+1180

0,0012 ЕД/мл 315+11I 4398+173

Как видно из полученных результатов, Г1ТГ (паратиреоидимй гормон) обладает мощным потенцирующим действием по отношению к митогенному эффекту конканавалина А. При изучении селезеночных клеток было показано (табл.51, что помимо потенцирующего действие ПТГ обладает также и самостоятельным мито-генным воздействием.

Аналогичным, но более слабим дейстнием обладал препарат московского эндокринного завода "паратиреоидин". Таким образом, нам удалось показать мощное стимулирующее действие продуктов пара щитовидной железы на синтетические процессы, вызываемые

м»ггогенной стимуляцией.По отношению к селезеночным клеткам изучаемые препараты обладали также и самостоятельными мито-гснными потенциями.

ТАБЛИЦА 5

Влияние паратиреоидной субстанции на интенсивность синтеза ДНК в селезеночных лимфоцитах крыс линии Август

птг Кон А ПТГ+КонА

контроль 1979+259 43053+2216

1,2 ЕД/мл 26074+1606 168880+16888

0,12 ЕД /мл 4879+435 107165+17302

0,012 ЕД/мл 1554+51 59911+5749

0,0012 ЕД/мл 1292+431 65601+7606

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Разработан новый метод очистки белковых соединений из тканей околощитовидных желез с применением геля ТОУО-РЕАКЬ.

Проведенные нами исследования позволили выявить ряд неизвестных фактов, указывающих на существование тесных взаимосвязей между кальцийрегулирующей и иммунной системами. Было показано, что секреты паращитовидных желез, и в том числе пара-тиреоидный гормон, обладают способностью изменять митотиче-скую активность клеток селезенки и тимуса как у крыс, так и у мышей. При этом основные эффекты, видимо, осуществляются не только через аденилатциклазную систему (поскольку при добавлении в культуральную среду известного стимулятора аденилатцик-лазы - кофеина, не происходило стимулирования эффекта препаратов околощитовидных желез).

Полученные результаты указывают на существование взаимосвязи между гормональной системой, обеспечивающей кальциевый гомеостаз, и иммунокомпетентными клетками.

ВЫВОДЫ

1. Гормоны околощитовидных желез являются непосредственными модуляторами функциональной активности иммунокомпен-тентных клеток.

2. Экстракт паращитовидных желез является модулятором интенсивности синтеза ДНК и белка в спленоцитах и в тимоцитах, а синтетический аналог паратиреоидного гормона обладает выраженным иммуностиму лирующим действием на тимические лимфоциты и спленоциты.

3. В экстрактах ОЩЖ присутствуют соединения, обладающие разнонаправленными иммуномодуляторными свойствами и отличные по своим антигенным и хроматографическнм характерист икам

от паратирсоидного гормона и кальцитонина.

4. Препараты околощитовидных желез являются потенциаторами мигогенного эффекта конканавалина А по отношению к тими-ческим и селезеночным лимфоцитам. По отношению к селезеночным клеткам препараты обладают также и самостоятельной мито-генной потенцией. Препараты околощитовидных желез оказывают слабое воздействие на лимфоидные клетки тимуса, селезенки и лимфоузлов человека.

5. Белковые фракции околощитовидных желез, полученные при разделении на гелеТОУО PEARLHW-55 обладают иммуномодуля-торной активностью.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Влияние белковых фракций, полученных из околощитовидных желез на пролиферативную активность тимоцитов. Тезисы 4-го всесоюзного симпозиума "Регуляция иммунного гомеостаэа", Ленинград, 1986, с.63.

2. Действие препаратов,полученных из ОЩЖ, на тимоциты крыс. Тезисы докладов 2-ой конференции по проблемам физико-химической биологии и биотехнологии в медицине. Ереван, 1986, с.54-55.

3. Модулирующее действие белковых фракций, полученных из околощитовидных желез. В кн.: Материалы 4-ой республиканской молодежной конференции по физико-химической биологии. Ереван, 1987, с.33-34.

4. Очистка и характеристика экстракта пара щитовидных желез. В сб.трудов молодых специалистов и ученых ЕрМИ "Современные вопросы общей и частной патологии", 1988, с.44-45.

5. Влияние экстракта ПЩЖ на синтез ДНК в тимоцнтах и спле-

ноцитах крыс в норме и при митогенной стимуляции. Там же, с.748-749.

6. Влияние экстракта пара щитовидных желез на синтез ДНК в лимфоцитах из различных нммунокомпетентных органов человека. Доклады АН АрмССР, N 1, 1988, с.45-48.

7. Хроматографичсскос разделение экстракта пара щитовидных желез. Доклады АН АрмССР, N 3,1988, с.127-131.

8. Влияние экстракта пара щитовидных желез на синтез ДНК в лимфоцитах тимуса и селезенки лабораторных животных. Доклады АН АрмССР, N 4,1988, с.181-185.