Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Характеристика полиморфноядерных лейкоцитов и гуморальных показателей иммунитета при ожоговой болезни

Челябинская государственная медицинская академия

■\0 С Г. _ 9 \т ^

на правах рукописи НИКУШКИНА Карина Викторовна

ХАРАКТЕРИСТИКА ПОЛИМОРФНОЯДЕРНЫХ ЛЕЙКОЦИТОВ И ГУМОРАЛЬНЫХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ИММУНИТЕТА ПРИ ОЖОГОВОЙ БОЛЕЗНИ

14.00.36 — Аллергология и иммунология

АФТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Челябинск—1997

Работа выполнена в Челябинской государственной медицинской

академии

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: доктор медицинских наук,

профессор С.Н. Теплова

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: доктор медицинских наук,

профессор Г.В. Брюхин доктор медицинских наук, профессор В;В. Сперанский

Ведущее учреждение — Российский государственный университет

Защита состоится _1997 г. в —' часов,

на заседании диссертационного совета по присуждении степени кандидата медицинских наук /Д.084.04.02/ Челябинской государственной медицинской академии.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Челябинской государственной медицинской академии.

Автореферат разослан 1997 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета доктор медицинских наук,

профессор А.В. Зурочка

Актуальность исследования определяется высокой распространенностью ожогового травматизма при чрезвычайных ситуациях и тяжестью течения ожоговой болезни, приводящей к длительной потере трудоспособности', инвалидизации и в ряде случаев к летальному исходу. По сведениям ВОЗ, ожоги занимают по частоте среди всех травм третье место, а в некоторых развитых странах второе, уступая лишь транспортной травме (Кузин М.И., Сологуб В,К., 1982., Новиков B.C., Семенов B.C., 1995).

В патогенезе развития ожоговой болезни на всех ее этапах и особенно в период септикотоксемии важное значение принадлежит развитию тяжелого иммунодефицитного состояния, характеризующегося снижением функции активности Т- и В-лимфоцитарного звеньев иммунитета, системы комплемента (Беляков И.М., 1992., Звеняцковская Е.Р., 1993., Панченков Н.Р., 1978., Пекарский Д.Е., Захаренко О.М., 1987., Петрухин В.А., Пачин С.Ф., 1982., Шкраб Л.О., Вишневская С.М., 1988., Kravitz М„ 1993.).

В условиях ожоговой травмы при обширных площадях поражения создаются предпосылки для инвазии поврежденных тканей большим числом микробных агентов различной природы из окружающей среды, а также представителями нормальной микрофлоры ,в связи с их транслокацией и адгезией в очаге травмы (Долгушин И.И., Эберт Л.Я., 1980., Зурочка А.В., 1984., Яковлев A.M., 1967., Aulick L. et al., 1989., Wilmore D. et al., 1978.) В периоде формирования иммуносупрессии и массивной полимикробной инвазии поврежденных тканей специфический иммунный ответ может быть мало эффективным в обеспечении противоинфекционной защиты организма. В условиях повреждения тканей, выполняющих пограничную функцию (кожа, слизистые), снижения специфического иммунного ответа эволюционно более древние неспецифиче-

ские механизмы (система комплемента, фагоциты и-др.) могут приобретать первостепенное значение в борьбе с массивным количеством, поступающей извне, микрофлоры разнообразного характера.

Цель исследования: Анализ количества и функций поли-морфновдерных лейкоцитов и гуморального иммунитета в динамике течения ожоговой болезни.

Задачи исследования:

1. Изучение количества и функций полиморфноядерных лейкоцитов

»

в разные сроки после ожога и при различных площадях ожога.

2. Изучение показателей гуморального, звена иммунитета в динамике ожоговой болезни при разных площадях ожога.

3. Изучение влияния растворимых агентов (кожный экстракт и сыворотка обожженных) на функции фагоцитов.

4. Определение прогностического значения иммунологических показателей в исходе ожоговой болезни.

Научная новизна. Научная новизна исследования определяется установлением важного значения адекватной активации полиморфноядерных лейкоцитов в период супрессии гуморального иммунного ответа для обеспечения благоприятного течения ожоговой болезни.

Показано, что при фатальном развитии болезни имеются признаки гиперактивации некоторых функций ПЯЛ: резкое усиление адгезивной и секреторной активности, респиратоного бурста лейкоцитов, которые могут иметь повреждающее значение в патогенезе неблагоприятного течения ожоговой болезни. Впервые установлено, что при ожоговой болезни происходит снижение осмотической резистентности лейкоцитов, наиболее выраженное при фатальном течении заболевания. Показано накопление ЦИК, антигенов, Р-белков в кровотоке при ожогах, что связано не только с их повышенным

поступлением в циркуляцию из поврежденных тканей, но и с нарушением элиминационной функции фагоцитов в результате изменения числа ПЯЛ в циркуляции, экспрессирующих рецепторы СДИв, СД71, опосредующих адгезию и активациию клеток, а также, вследствие, снижения спонтанной миграции, поглотительной активности ПЯЛ.

Теоретическая и практическая значимость: Выявлены прогностические маркеры неблагоприятного течения исхода ожоговой болезни, к которым относятся повышение концентрации Р-белков, адгезии и гиперсекреции полиморфноядерных лейкоцитов.

Выявление признаков неадекватной активации ПЯЛ, имеющих неблагоприятное прогностическое значение, а также обнаружение других маркеров дисфункции фагоцитрующих клеток (гиперлейкоцитоз, усиление кислородзависимой микробоцидной активности, снижение поглотительной фагоцитарной активности и осмотической резистентности ПЯЛ) в условиях накопления ЦИК,Р-белков, свидетельствующих о неадекватной элиминации поступающих в кровоток антигенных продуктов микроорганизмов и поврежденных тканей, является патогенетическим теоретическим обоснованием для разработки новых методов направленного воздействия на активность фагоцитирующих клеток.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. При ожоговой болезни, характеризующейся массивной полимикробной инвазией поврежденных тканей и супрессией специфических механизмов иммунитета, адекватное увеличение количества лейкоцитов в кровотоке, СД16-гранулоцитов, экспрессирующих" низкоаффинные Fe gamma рецепторы, усиление адгезивной, секреторной, кислородзависимой активности клеток может приобре-

тать первостепенное аначениие в обеспечении защиты организма от инфекции.

2. Гиперактивация полиморфноядерных лейкоцитов, характеризующаяся выраженным увеличением адгезивной и секреторной функции, резким снижением осмотической резистентности в условиях постожогового иммунодефицитного состояния не обеспечивает эффективную элиминацию ЦИК, Р-белков, несмотря на повышенную опсоническую емкость крови, и является неблагоприятным прогностическим признаком исхода ожоговой болезни.

3. Для ожоговой болезни характерно изменение количества лейкоцитов и субпопуляционного спектра клеток, экспрессирующих маркеры СД11в, СД16 и СД71.

ВНЕДРЕНИЕ В ПРАКТИКУ:

Новые данные, расширяющие имеющиеся представления об участии полиморфноядерных лейкоцитов в патологии ожоговых болезней используются при изучении иммунопаталогии студентами Челябинской государственной медицинской академии.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ:

Материалы диссертации доложены на .научной конференции "30 лет Центральной научно-исследовательской лаборатории" в г.Екатеринбурге, 1994г. и на XII Российской научной конференции в г. Челябинске, 1995г.

ПУБЛИКАЦИИ:

По материалам диссертации опубликовано 7 работ. СТРУКТУРА И ОБЬЕМ ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация представлена на 123 страницах машинописи, содержит 4 рисунка, 16 таблиц, состоит из введения, обзора литературы, трех глав собственных исследований и их обсуждения, общего за-

ключения, выводов, списка использованной литературы /91 отечественных и 143 иностранных источника/.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование проводилось на базе Центральной научно-исследовательской лаборатории Челябинской медицинской академии и областного ожогового центра. Всего было обследовано 170 больных с ожоговой травмой в возрасте от 18 до 55 лет. Обследование проводилось на 2-4 сутки после получения ожоговой травмы (период острой токсемии), на 7-10 сутки заболевания (период сеп-тикотоксемии) и перед выпиской больных (период реконвалесцеи-ции). Наличие, площадь, степень тяжести ожога определял специалист-комбустиолог.

Больных объединили в 3 группы по площади ожоговой поверхности: 1 группа (до 10%) - 55 пациентов, 2 группа (10-20%) - 65 и 3 группа (более 20%) - 50 пациентов.

Концентрацию иммуноглобулинов в сыворотке крови мы определяли методом радиальной диффузии в геле по Мапаш /1966г./.

Концентрацию циркулирующих иммунных комплексов определяли с помощью ПЭГ-преципитации по методу, предложенному В.Гашковой и соавт. / 1978г./, с определением размеров ЦИК по методике Стручкова П.В. и соавт., 1985. При изучении качественного состава ЦИК анализировали присутствие А,М,С в составе комплексов по методу О^оп й а!., 1977.

Выявление антигена кожи в ЦИК проводилось с помощью полуколичественного метода радиальной диффузии в геле. Для этого в агар Дифко вводили антисыворотку против кожи человека.

полученную путем иммунизации кролика антигеном из кожи человека. С целью получения антигена кожи был взят экстракт из кожного лоскута трупа женского пола с 0/1/ группой, Rh+ с концентрацией белка 5г/л, который использовали для иммунизации кролика по общепринятой методике с применением адьюванта Фрейнда при подкожном введении антигена.

В течение всего цикла иммунизации кролик получил 180 мг. белка. После постановки РПГА с кожным антигеном титр антисыворотки оказался равным 1:160. Остаточные антитела к антигенам эритроцитов удалили путем адсорбции эритроцитарной массой IV/АВ/ группы крови Rh+. Специфичность реакции с кожным антигеном подтверждалась параллельной постановкой реакций с другими тканевыми антигенами (сердечный и почечный антигены).

Уровень Р-белков определяют по методу Кульберга А.Я., Бартовой AM., /1989г./ в реакциии торможения гемагтлютина-ции: между эритроцитами человека 0/1/,Rh+ в присутствии исследуемой сыворотки и анти-Рсыворотки. Анти-Р-сыворотка получена из научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им.Н.Ф.Гамалеи г.Москвы.

Количество полиморфно-ядерных клеток определяли стандартным методом по общему анализу и формуле крови. Популяцию нейтрофилов периферической крови получали с помощью центрифугирования на двойном градиенте плотности по методу, предложенному Wong I.,Wilson R„ /1975г./. Фракция ПЯЛ состояла на 98-100% из нентрофилов с незначительной примесью лимфоцитов.

Осмотическую резистентность ПЯЛ определяли кондукто-метрически с помощью Laborskel-analisator фирмы M.edicor Венгрия по методу Тепловой С.Н., Чернова В.А, 1990г.

Оценку адгезивных свойств нейтрофилов проводили по методу А.Ф.Блюгер и соавт. /1980г./. Подсчет общего числа ПЯЛ и числа неадгезированных клеток проводили с помощью Laborskel-analisator.

Для определения спонтанной миграции ПЯЛ и РТМЛ в присутствии кожного антигена нами была использована методика миграции лейкоцитов под слоем агарозы в модификации Nelson R.D. et al./1981/.

Секреторную активность и стабильность лизосомальных мембран ПЯЛ определяли по методу Шаронова A.C. на основе секреции лизоцима.

Для оценки респиратоного бурста ПЯЛ применяли люминол-зависимую хемилюминесценцию /ХЛ/ по методу S.Donglas, P.G.Quie /1981/.

Оценку поглотительной активности фагоцитов и опсонической емкости сыворотки крови обожженных проводили турбодиметрнче-ским методом Kuypers Т. et а1./1989/ в присутствии сыворотки больного и пула сывороток, полученных от доноров AB/IV/.

Определение количества популяций нейтрофилов проводили путем идентификации СД-молекул, экспрессированных на мембране клеток, методом непрямой иммунофлюоресценции с моноклональ-ными антителами. Нами были испытаны МКА серии ИКО производства НИИ "ПРЕПАРАТ", Н.Новгород. Панель МКА содержала диагностические сыворотки, позволяющие выявить СДИв - молекулы адгезии, СД16 - низкоаффинные Fe gamma RIJI и СД71 - трансферриновые репторы на полиморфноядерных лейкоцитах.

Число В-лимфоцитов также определяли с помощью СД-типирования по рецептору СД22 после выделения лимфоцитов на градиенте 1,077.

Статистическая обработка полученных результатов проводилась на специализированной автоматической статистической программе Quattro Pro для Windows Rus на компьютере PENTIUM-100.

Прогностическое значение предложенных иммунологических параметров было просчитано по Байесу /Е.В.Гублер, 1978/.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Гуморальные показатели иммунитета у больных с ожоговой болезнью были изучены параллельно с оценкой фагоцитарного звена иммунитета, исходя из важного значения их кооперации в иммунном ответе. Были изучены следующие показатели гуморального иммунитета: количество В-лимфоцитов, концентрация иммуноглобулинов классов A, M, G и циркулирующих иммунных комплексов, которые являются маркерами антигенемии. Дополнительно было изучено количество Р-белков /рис.1 /-

Р-белки рассматриваются в настоящее время, как "плавающие" мембранные рецепторы клеток, попадающие в Циркуляцию в результате процессов деструкции мембран при воздействии на них андо- и экзотоксинов, и могут служить маркерами клеточно-деструктивных процессов / А~Я.Кульберг,1988 /.

На основе анализа содержания Р-белков при ожоговой болезни было установлено, что, начиная со 2-4 суток с момента получения термической травмы по 30 день при площадях ожога менее

10%, 11-20% и более 21% поверхности тела имеются признаки циркуляции в кровотоке продуктов деструкции тканей / Рис.1/.

Количество Р-белков, по нашим данным, при всех площадях ожога и во все сроки наблюдения значительно превышает показатели у доноров, достигая максимальных значении на 2-4 сутки с момента получения термической травмы, и может отражать интенсивность деструкции клеток и поступления в циркуляцию их фрагментов после ожога.

Наши данные о повышении концентрации Р-белков совпадают с исследованиями В.С.Новикова и В.С.Смирнова при ожогах / 1995 /.

Об этом же свидетельствует увеличение количества ЦИК в наших исследованиях, а также в работах Долгушина И.И.,1979., Mendez M.V., 1993, Rioja L.F, Alonso Р.,1993. Количество ЦИК в кровотоке достоверно повышено при всех площадях ожога и во все сроки наблюдения и достигает максимальных чисел при обширных площадях поражения ( более 21%) /Рис. 1/. Нами также установлено наличие при этих площадях преобладание мелко- и сред-недисперсных иммунных комплексов.

В прямых исследованиях содержание кожных антигенов в составе ЦИК нам удалось обнаружить наличие данного антигена в циркуляции в течение 2-х недель при ожогах до 20%, а при обширных ожогах На протяжении всего периода наблюдения.

Совокупность полученных результатов свидетельствует, таким образом, об увеличении в периферггаеской крови количества Р-белков, ЦИК, о наличии в циркуляции антигенов дермального происхождения, что в целом может доказывать высокий уровень гипе-рантигенемии и изменение гомеостаза организма.

Нарушение иммунного гомеостаза при ожоговой болезни характеризуется ранним снижением количества СД22-лимфоцитов.

Минимальные уровни В-лимфоцитов обнаружены нами у больных с обширными ожогами ( более 21% поверхности тела ), хотя снижение данного показателя наблюдается при всех площадях ожога и во все сроки наблюдения. Снижение В-лимфоцитов в ранние сроки (2-4 сутки) с момента получения термической травмы может быть связано со стресс-индуцированным перераспределением лимфоидных клеток, и усилением лимфолизиса, процессов апоптоза под действием активированных СД4 и СД8 Т-лимфоцитов, а также со снижением лимфопоэза в результате миелотоксического действия продуктов тканевого и бактериального происхождения, снижением секреции цитокинов - факторов роста для лимфоидных клеток /Долгушин И.И., Эберт Л.Я., 1980., Mendez М., Molloy R., 1993, Rioja L. Alonso Р., 1993/.

Нормализация количества СД22 -лимфоцитов отмечается при площадях ожога до 20% к 30-м суткам наблюдения, что свидетельствует о восстановлении лимфопоэза, миграции этих клеток, определяющих кинетику В-лимфоцитов.

При снижении абсолютного количества В-лифоцитов в ранние сроки наблюдается уменьшение количества иммуноглобулинов А и G при всех площадях ожога, что дает основание специалистам-комбустиологам говорить о наличии иммунодефицитного состояния гуморального типа при ожоговой болезни /Звеняцковская Е.Р., 1993., Новиков B.C., Семенов B.C., 1995./. К снижению концентрации иммуноглобулинов А и G приводит плазмаррея увеличение проницаемости сосудистой стенки в результате развития воспаления, потребление иммуноглобулинов при образовании иммунных комплексов и в результате прикрепления их к объектам фагоцитоза,

и

катаболический профиль обмена веществ, сопровождающийся распадом белков и нарушением их синтеза. Вместе с тем, по нашим данным, а также по литературным сведениям /Абрамовская Л.В., Коваленко В.Л., 1990., Долгушин И.И., Эберт Л.Я., Лифшиц Р.И., 1989., Eichinard С., Bernard D., 1985., Kagan R., Bratescu A., 1989., Munster A., 1988., Peterson V., Robinson W„ 1985./. При ожоговой болезни повышенна концентрация иммуноглобулина первичного иммунного ответа, что является результатом увеличения нагрузки на организм "новыми" антигенами и сохранением IgM при плпзмопотерях вследствие их большей молекулярной массы, а также их отсутствием в составе ЦИК. По нашим данным, в составе ЦИК при ожоговой болезни обнаружены IgA и IgG при отсутствии IgM.

Высокий уровень IgM, а также активация комплемента по классическому и альтернативному пути, определенная в работе Зве-няцковской Е.Р., 1993, объясняют механизм повышения опсониче-ской емкости сыворотки крови, установленную в наших исследованиях при ожоговой болезни. Наиболее высокие показатели опсони-ческой емкости сыворотки крови зафиксированы при больших площадях ожога на протяжении всего периода наблюдения. Максимальных значений данный показатель достигает к 30-м суткам наблюдения, то есть в период продуктивной фазы иммуногенеза. В опытах in vitro пулированная сыворотка обожженых пациентов с площадью ожога менее 15 % и более 30 % поверхности тела оказывала стимулирующий эффект на функции интактных лейкощггов доноров в отношении адгезивной, секреторной активности, респираторного бурста и понижающий эффект в отношении спонтанной миграции, поглотительной фагоцитарной активности, осмотической

резистентности мембран клеток, числа лейкоцитов, экспрессирую-щих СДИЬ и СД71.

Антибактериальная защита организма связана не только с функцией гуморального и клеточного звеньев иммунитета, но и в значительной степени определяется фагоцитарными клетками, которые выполняют важную функцию на протяжении всего периода ожоговой болезни, в том числе, в периоде репарации тканей после ожогов.

Адекватная активация фагоцитирующих клеток в значительной степени влияет на исход термической травмы. Напротив, дефицит функций фагоцитов может быть одним из механизмов снижения противомикробной защиты организма при ожоговой болезни /Долгушин И.И., Зурочка A.B., и др., 1988., Яковлев А.М., 1967./.

Изучение количества ПЯЛ, процессов их активации, деактивации и гиперактивации при ожоговой болезни и послужило предметом дальнейшего изучения. 1

При ожоговой болезни отмечается двухволновый характер лейкоцитоза: через 6-12 часов и 5-10 дни постожогового периода.

Первая волна лейкоцитоза имеет нервнорефлекторньш и эндокринный генез и связана с повышением функции надпочечников и гипоадреналинемией / Панченков Н.Р. и др., 1976., 1978., 1982./. Изменение количества лейкоцитов в первые сутки после ожога имеет также перераспределительный харахтер и связано с миграцией клеток из костного мозга в циркуляцию, далее в очаги ожога в результате повышения количества хемоаттрактантов сывороточного и клеточного генеза: интерлеикины 1. 8, СЗа, С4а, С5а /Gamer W., Rodriquez J„ 1994., O'Riordain M. et al., 1992/. Снижение количества лейкоцитов между первой и второй волной

можно связать с разрушением и потерей их в пораженных областях и вымыванием из поврежденных тканей, что ведет к некоторому опустошению костномозгового резерва ПЯЛ, а в дальнейшем компенсируется нарастающим увеличением лейкопоэза.

Вторичный лейкоцитоз обусловлен ответом организма на инфекцию, гиперпродукцией интерлейкинов (ИЛ-1.ИЛ-8), КСФ и именно этим объясняется выраженная устойчивость лейкоцитоза на протяжении всей ожоговой болезни /Persson К., Larson I., 1993./. По данным Peterson V.M., Robinson WA et al. 1985 /196/ ИЛ-8 в циркуляции является продуктом, поступающим из пораженной кожи.

Изменения количества ПЯЛ /Рис.2./ непосредственно связано с функциональными изменениями клеток и прежде всего с ответом фагоцитов на хемоаттрактаятные стимулы, поступающие из очага травмы, так как, в соответствии с существующими представлениями, при воспалении меняется больше перераспределение клеток, мобилизация их из маргинального пула, чем клеточная продукция /Штивельбанд М.И., 1994/.

При появлении хемоаттрактантных стимулов происходит активация клеток, вследствие этого наступает необратимая адгезия и трансмиграция клеток в очаг воспаления. Исходя из этого, при анализе функций ПЯЛ мы провели изучение адгезивной активности клеток при ожоговой болезни. В нашей работе при ожоговой болезни установлено со 2-4 суток увеличение адгезивностн клеток, циркулирующих в кровотоке при всех площадях ожога, более выраженное при больших площадях пораженной поверхности тела, что свидетельствует об активации клеток, их готовности к адгезии и транслокации в очаг воспаления с локальным увеличением хемоат-трактантов.

К 7-10 суткам наблюдения после термической травмы при площади ожога до 20% этот показатель не отличается от нормы, при обширных площадях ожоговой поверхности (более 21%) показатель адгезии нормализуется лишь к 30 суткам наблюдения /Табл.1/.

Изучение субпопуляционного состава ПЯЛ показало, что на 2-4 сутки после травмы при обширных ожогах в момент увеличения адгезивности клеток происходит существенный подъем числа клеток, экспрессирующих CD16, то есть низкоаффинные FcgammaRIII /Табл.3/.

Параллельно отмечено снижение популяции клеток, экспрессирующих CDllb( CR3) и CD71 (рецептор к трансферрину). Возможно, снижение этих популяций связано с блокадой рецепторов естественными лигандами, количество которых в этот период резко повышено в крови.

Естественными лигандами могут быть компоненты комплемента, трансферрин, фрагменты тканевого происхождения. Косвенным подтверждением этого могут быть результаты изучения адгезивных свойств ПЯЛ в присутствии экстракта из кожи в условиях in vitro.

При добавлении экстракта из кожи in vitro к лейкоцитам обожженных пациентов мы наблюдали снижение адгезивных свойств клеток, что может свидетельствовать о блокаде рецепторов, участвующих в адгезии, лигандами из экстракта.

Снижение в циркуляции ПЯЛ, экспрессирующих интегрино-вые компоненты, может предположительно отражать перераспределение клеток: когда в циркуляции преобладают клетки, экспресси-рующие селектины, а в очаге воспаления преобладают клетки, экс-прессирующие интегрины. Снижение клеток, экспрессирующих

CD71, может быть одним из механизмов, лежащих в основе развивающейся при ожоговой болезни анемии. •

Усиление адгезии ПЯЛ на ранних этапах ожоговой болезни сопровождается снижением спонтанной подвижности нейтрофилов. При площади ожога до 20% к 7-10 дню наблюдения, когда адгезия нормализуется, спонтанная миграция клеток остается сниженной.

Снижение спонтанной миграционной активности наблюдается вплоть до периода реконвалесценции. Снижение мобильности фагоцитов может зависеть от присутствия токсических продуктов, оказывающих ингибирующее действие на движение клеток, изменения метаболизма клеток, их энергетики, повреждения микротубул, актина или актинсвязывающего протеина, миозина, входящих в цитоске-лет .клеток, которые в совокупности определяют инициальную ориентацию ПЯЛ в хемотаксическом градиенте /Mandell G., Bennet J., 1995., Peterson V. et al, 1985./.

При ожоговой болезни наряду с изменениями адгезии и подвижности происходит изменение метаболизма ПЯЛ, о чем свидетельствует увеличение спонтанной хемилюминесценции /Табл.1/.

Увеличение спонтанной ХЛ отражает активацию мембранных и цитозольных оксидаз, повышение внутриклеточной продукции агрессивных форм кислорода. Увеличение адгезивности нейтрофилов может приводить к закреплению клеток на поврежденных поверхностях, генерации мощного внутриклеточного сигнала, усилению респираторного бурста, увеличению микробоцидного потенциала клеток в ранние сроки после ожога при различных площадях, которое сохраняется во все сроки наблюдения, что может иметь компенсаторный характер при формировании клеточного и гуморального иммунодефицита. Вместе с тем, индуцированная частицами латекса

хемилюминесценция при площадях ожога до 20% остается в пределах нормы во все сроки наблюдения. При обширных площадях наблюдается ее увеличение, начиная с 7-10 суток наблюдения и сохраняющееся и в период реконвалесценции / Мапс1е11 в. Л а1.,

1995/.

При ожоговой болезни при малых, средних и больших площадях во все сроки наблюдения отмечается повышение секреторной активности клеток. Спонтанно секретируемый нейтрофилами лизо-цим у обожженных пациентов, значительно увеличен при всех исследуемых площадях ожога. Активность внутриклеточного энзима также находится на высоких цифрах при всех площадях ожога и во все сроки наблюдения /Табл.1/.

По данным литературы, такие функции ПЯЛ, как адгезив-ность, выраженность респираторного взрыва и секреторная активность обычно взаимосвязаны. Возможно, эта связь и повышение адгезивности циркулирующих ПЯЛ зависит от усиления метаболизма и секреции, так как при дегрануляции клеток из специфических гранул освобождаются также некоторые рецепторы, например, адгезивные молекулы /Мапс1е11 С. е1 а1., 1995 /.

Осмотическая резистентность клеток значительно снижена во все сроки наблюдения и зависит от площади ожога /Табл.2/. Влияние кожного экстракта на лейкоциты больных и пулированной сыворотки обожженных на фагоциты доноров также проявляется снижением устойчивости мембран ^клеток к гипоосмолярным нагрузкам.

В условиях изменения мембранных функций (адгезия, мобильность, осмотическая резистентность) поглотительная активность ПЯЛ при фагоцитозе при всех 1«лощадях ожога и во все сроки наблюдения значительно снижена /Табл.1./. Нарушение поглоти-

тельной активности может быть связано с изменением захвата адге-зированных объектов фагоцитоза, когда фагосомы и лизосомы сливаются без полного их соприкосновения, что ведет к регургитации жидкости в экстрацеллюлярное пространство, ибо в условиях повышенной адгезивности клеток нет оснований предполагать нарушения адгезии объектов фагоцитоза.

При добавлении растворимых стимулов в опытах in vitro (кожный экстракт) происходит снижение поглотительной активности ПЯЛ, что может происходить за счет экранирования адгезивных молекул, добавляемыми извне лектинами, препятствующими взаимодействию рецепторов клеток с объектами фагоцитоза.

Таким образом, при ожоговой болезни установлено увеличение количества лейкоцитов, субпопуляций CD16, увеличение адгезивной, секреторной активности, хемилюминесцентной активности ПЯЛ со снижением спонтанной миграции, поглотительной активности, осмотической резистентности и числа клеток, экспрессирующнх CDllb и CD71/Табл.3./.

В заключение нами был проведен анализ прогностической значимости изменения показателей фагоцитирующих клеток у больных с ожоговой болезнью с благоприятным и летальным исходом заболевания /Табл.4/.

В соответствии с методом расчета прогностических признаков по Байесу нами были установлены пограничные значения иммунологических показателей, характерные для благоприятного исхода заболевания: титр Р-белков менее 1:34300, индекс адгезии менее 77,77%, секретируемый лизоцим менее 16,25 мг/мл, общий лизо-цим менее 17,9 мг/мл, показатель стабильности лизосомальных мембран менее 87,5 /Табл.4./. Каждый из приведенных показателей в отдельности имел низкую информативность для прогноза

ожоговой болезни. При использовании всех избранных 5 показателей точность прогноза благоприятного исхода была равна 98,8%. Точность прогноза неблагоприятного исхода заболевания была несколько выше и составила 99,9%.

Таким образом гиперактивация адгезии, секреторной активности ПЯЛ, нарушения проницаемости мембран и продукции агрессивных форм кислорода при неблагоприятном течении заболевания может предположительно расцениваться, как неадекватная ответная реакция фагоцитирующих клеток, создающая предпосылки для реализации повреждающего действия секреторных продуктов ПЯЛ на пораженные и здоровые ткани человека. Подобный же механизм реализуется при септическом состоянии и приводит к мультиорган-ной патологии (G.R.Border, 1988, C.G. Carneo, 1993).

Адекватный же уровень активации фагоцитарного звена иммунитета, характеризующийся умеренным изменением анализируемых функций, может быть важным защитно-компенсаторным механизмом при формировании дефицита специфических факторов иммунитета, определяя благоприятный исход ожоговой болезни.

ВЫВОДЫ:

1. При ожоговой болезни формируется иммунодефицитное состояние гуморального типа, характеризующееся снижением числа СД22-лимфоцитов, концентрации иммуноглобулинов А и G в начальной стадии после травмы при различных площадях ожоговой поверхности (менее 10%, 11-20% и более 21%).

2. Повышение концентрации Р-белков, ЦИК, наличие в их составе антигенов кожи, преобладание мелко- и среднедисперсных комплексов в начальном периоде ожоговой болезни при всех плаща-

дях ожога отражает высокий уровень антигенемии и поступление в кровоток продуктов деструкции собственных клеток.

3. Одним из механизмов повышения концентрации ЦИК при ожоговой болезни является нарушение их элиминации из кровотока в результате гипоиммуноглобулинемии, снижения абсолютного и относительного количества лейкоцитов, несущих рецепторы к CDllb для компонентов комплемента, снижение поглотительной активности ПЯЛ.

4. В опытах in vitro установлен высокий уровень опсонической активности сыворотки обожженных, ее стимулирующий эффект на функции интактных лейкоцитов доноров в отношении адгезивной, секреторной активности, респираторного бурста и понижающий эффект в отношении спонтанной миграции, поглотительной фагоцитарной активности, осмотической резистентности мембран клеток, числа лейкоцитов, экспрессирующих CDllb и CD71.

5. У пациентов с благопритяным исходом ожоговой болезни установлены прогностически значимые титры Р-белков (титр должен быть <1:34300), общего лизоцима (.-< 17,9 мг/мл ), секрети-руемого лизоцима ( < 16,25 мг/мл ), показателя стабильности лизосомальных мембран ( < 87,5 % ), адгезивной активности ПЯЛ (< 77,77 %).

6. Высокая прогностическая значимость оценки уровня активности ПЯЛ в исходе ожоговой болезни свидетельствует о принципиальном значении адекватной активации этих клеток в патогенезе развития ожоговой болезни.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Количественная и функциональная характеристика полиморфно ядерных лейкоцитов при ожоговой болезни. Никушкина К.В., Коростелев М.Ю., Теплова С.Н., Крюкова Л.И. // Тез. докл. науч. конф. к 30-летию Центр, научно-исслед. лаборатории г. Екатеринбург, - 1994, - С.72-73.

2. Pharmakological correction of elimination processes in burned patients. Teplova S.N., Zvenyatskovskaya E.R., Kryukova L.I., Nikushkina K.V., Chernov V.A Chelyabisk, Rossia / / International Journal of Immunorehabilitation - 1994. - N.l - Supplement. - P. 349-350.

3. Клеточные и гуморальные механизмы нарушения элиминации ЦИК при ожоговой болезни. Теплова С.Н., Крюкова Л.И., Звеняцковская Е.Р., Никушкина К.В. - В кн: Актуальные вопросы практ. и теорет. мед-ны. Материалы к научн. конф. ин-та. - Челябинск. - 1995. - С. 64.

4. Оценка элиминации циркулирующих иммунных комплексов при тяжелых приобретенных иммунодефицитных состояниях. Теплова С.Н., Крюкова Л.И., Маслова О.В., Никушкина К.В., Звеняцковская Е.Р. - В кн: Факторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физиологических состояниях. - Тез. докл. XII Российской научн. конф. - Челябинск. - 1995. - С. 110.

5. Новые технологии исследования фагоцитирующих клеток. Теплова С.Н., Чухарева ЕА-, Крюкова Л.И., Никушкина К.В., Попова С.Д. - В кн: Новые технологии в медицине . - Мат. меж-дунар. мед. конф. - Трехгорный. - 1996. - С. 84-86.

6. Функциональные дефекты фагоцитов при ожоговой болезни. Никуш кина К.В., Теплова С.Н., Крюкова Л.И., Коростелев М.Ю., Подкорытов И.Л. - В кн: Актуальные проблемы камбу-

стиологии, реаниматологии и экстремальной медицины. - Тез. докл. мемориальной конф. памяти проф. Р.И. Лифшица. - Челябинск. 1996. - С. 17-19.

7. Характер нарушения фагоцитарного звена иммунитета при ожоговой болезни. Теплова С.Н., Никушкина К.И., Крюкова Л.И.

- В. кн: Современные проблемы аллергологии, клин, иммунологам и иммунофармакологии. - Сборник трудов. - 1-я Нац. конф. Российской Ассоцциации аллергологов и клин, иммунологов. Москва.

- 1997. - С. 331.

Прилож

ение

500 400

300 200

Рисунок 1. показатели гуморального иммунитета

> ГЬ - N. \1 я /.

|1 ■ \ 1 — г

2-4 7-10 30 7-4 7-10 30 2-4 7-10 30 дон

<10% И % - 20% [>21%

В-лимф ЕЗ ЦИК ВД1дА [Щ 1дМ □ 1дС ИЗ Р-белки |

_рблица 1: Функциональная характеристика ПЯЛ обожженных в динамике заболевания

при разных площадях поражения

.лощадь Сутки Секреторная активность Фагоцитоз Хемилюминееценция

ожога Инд Адг Сп Миф Сек Лизоц ОбЛизоц СЯМ огл ОпсЕмк Сп1мин Сп2мин Индуц Ин рир

менее10% 2-4 М 61.1 * 0.8* 11.5 " 13.87 * ?8.8* -Й61- 63.4 * 9893* 10540* 78910* ей*

ш 0.4 0.01 1.5 1.15 1.7 0 1 0 15 1560 1300 1000 0.1

п 35 35 35 35 35 35 35 35 35 35 35

7-10 М 57.2 0.69* 15.4 * 18.1 * 80.3 * 2.01 * 66.3* 7560* 8580* 71620* 7*

т 0.3 0.04 1.4 1.05 1 0.12 0.18 1200 1200 1000 1.5

п 35 35 35 35 35 35 35 35 35 35 35

болееЗО м 67.1 * 0.73 * 17.4* 25.8* 67.4* 2 36* 64.3 6125* 7400* 69428 * 8.94*

т 0.32 0.03 0.1 0.3 5.1 0.13 0.1 1600 1250 1200 0.1

п 30 30 30 30 30 30 30 30 30 • 30 30

11-20% 2-4 М 60.7* 0.62 * 15 56* 18 93* 82.6* 1.78* 67.3 14744 * 18640* 86156* 5.71 *

т 0.7 0.04 0.9 0.9 2.6 0.1 0.2 2563 1500 1100 0.9

п 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40

7-10 М 59.8' 0.69* 13.5* 17.7* 74* 1.24* 74.3 8950* 12600* 80997 * 9.02 *

т 0.4 0.05 1.7 1.38 5.5 0.1 0.1 1300 1200 1000 0.7

п 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40

болееЗО м 58.1 * 0.73* 16.4* 22.7* 72' 1.686* 80.4 6343* 9063* 65294 * 10.31 *

т 0.3 0.03 0 35 0.3 4.8 0.1 0.15 1870 1300 1200 0.87

п 35 35 35 35 35 35 35 35 35 35 35

более21% 2-4 М 77.2 0.523 * 15.1 * 17.3* 85.4* 1.437* 69.83 19003 * 27780 * 115640* 6.98*

т 0.4 0.02 1.03 1 2.2 0.05 0.08 2500 23400 1200 0.7

п 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50.

7-10 М 65.9* 0.59* 12.4" 14.4* 81.3* 1.28* 77.47 15250' 18380 ' 115000* 7.5*

т 0.7 0.02 1.01 0 57 2 0.05 0.12 - 2100 1800 1000 0.2

л 45 45 45 45 45 45 45 45 45 45 45

болееЗО М 58,4 * 0.64 * 14.8* 21.6 * 68.5* 1.528* 84.3 11793* 22690* 114623* 9.1

т 06 0 05 03 0.4 2.04 0.09 0.1 2370 1450 1130 0.9

п 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40

Доноры М 57.2 1 2 2.92 4 45 57.3 3.975 60.9 3500 5000 67000 болееЮ

т 0.07 0.1 0.19 6.6 . 0.11 0.12 1500 1000 33000

п 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20

* — р < 0.05 — ______р____ь различии м ?к V. _ ..рами и групп й 6 ль ых.

Таблица 2: Показатели осмотической резистентности ожоговых больных

Площадь ожога Сутки 1 минута 5минута 15минута ЗОминута

менее10% -2-4 51.4* 49.1 * 44.3* 40.4*

1.1 1.02 0.9 0.7

35 35 35 35

7-10 54.4* 50.1* 46.4* 41.1 *

0.75 0.9 1.1 1.1

35 35 35 35

болееЗО 56.4* 52* 48.3* 44.1 *

0.8 1 1.1 0.9

30 30 30 30

11-20% 2-4 43.4* 39.9* 38.5* 35.4*

1.9 1.2 1.2 1.3

45 45 45 45

7-10 45.2* 42.7* 39.4* 36.3*

0.1 0.27 1.2 1.6

45 45 45 45

болееЗО 51.3* 46.7* 40.3 * 37.3 '

0.6 0.7 1.3 16

40 40 40 40

более21% 2-4 26.2* 26.05 * 24.3 * 23.7 *

1.1 1.2 1.1 1.05

50 50 50 50

7-10 39.85* 39.5* 37.8* 37.5*

1.05 0.7 1.4 1.7

45 45 45 45

болееЗО 48.1 * 43.1 * 42.1 * 40.7*

1.04 1.2 1.1 1.7

40 40 40 40

Доноры 75.49 55.7 44.5 42.3

0.8 0.7 1.5 1.2

20 20 20 20

1мин 5мин 15мин ЗОмин

2-4 51.4 49.1 44.3 40.4

7-10 54.4' 50.1 46.4 41.1

>30 56.4 52 48.3 44.-1

2-4 43.4 39.9 38.5 35.4

7-10 45.2 42.7 - 39.4 36.3

>30 51.3 46.7 40.3 37.3

2-4 26.2 26.05 24.3 23.7

7-10 39.85 39.5 37.8 37.5

>30 48.1 43.1 42.1 40.7

Доноры 75.49 55.7 44.5 42.3

* — р < 0.05 — достоверность различий между донорами и группой больных.

Таблица 3: Количество субпопуляций ПЯЛ, экспрессирующие рецепторы адгезии и активации

абс Р ОТН Р

С071 доноры М 7.1 59.37

т 0.15 3.52

п 20 20

больные М 5.02 41.98 <0.05

т 0.1 3.84

п 20 - 20

С016 доноры М 5.71 47.9

т 0.1 3.45

п 20 20

больные М 6.27 <0.05 52.6 <0.05

т 0.09 3.3

п 20 20

С011Ь доноры М 2.84 43.56

т 0.21 1.65

п 20 20

больные М 2.59 <0.05 39.76 <0.05

т 0.12 3.45

п 20 20

р — достоверность различий между донорами и группой больных.

Таблица N4. Показатели иммунологических показателей, характерных для благоприятного исхода ожоговой болезни.

Титр Р-белков Индекс адгезии Лизоцим секретируемый Лизоцим общий ПСАМ

< 1:34300 < 77,77% < 16,25 мг/мл < 17,9 мг/мл <87,5