Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Характеристика интерферон-альфа-индуцированных дендритных клеток у больных лимфопролиферативными заболеваниями

005050122

На правах рукописи

НАСОНОВА ГАЛИНА ВЛАДИМИРОВНА

ХАРАКТЕРИСТИКА ИНТЕРФЕРОН-АЛЬФА-ИНДУЦИРОВАННЫХ ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК У БОЛЬНЫХ ЛИМФОПРОЛИФЕРАТИВНЫМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ

14.03.09 - Клиническая иммунология, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

г 8 ФЕВ 2013

Новосибирск - 2013

005050122

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт клинической иммунологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Научный руководитель:

член-корреспондент РАМН,

доктор медицинских наук, профессор

Черных Елена Рэмовна

Официальные оппоненты:

Гайдуль Константин Валентинович, доктор медицинских наук, профессор руководитель лаборатории регуляции иммунопоэза, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт клинической иммунологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Шурлыгина Анна Вениаминовна, доктор медицинских наук, профессор, ведущий научный сотрудник лаборатории хронофизиологии, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт физиологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г.Томск

Защита состоится «14» марта 2013 г. в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 001.001.01. в ФГБУ «НИИКИ» СО РАМН по адресу: 630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИКИ» СО РАМН Автореферат разослан «/¿я февраля 2013г.

Ученый секретарь диссертационного совета Белогородцев С.Н.

кандидат медицинских наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Дендритные клетки (ДК) являются профессиональными антигенпрезеитирующими клетками и играют центральную роль в поддержании врожденного и приобретенного иммунитета как через прямое клеточно-опосредованное взаимодействие, так и за счет продукции цитокпнов. ДК обладают способностью примировать наивные Т-клстки и индуцировать иммунный ответ против различных, в том числе опухолевых, антигенов [Banchereau J.,1998 Steinman R.M.. 1991]. Несмотря на существование опухоль-асссоциированных антигенов (ОАД) и генерацию цитоюксических лимфоцитов, способных лизировать опухолевые клетки, продолжающийся рост опухоли у большинства пациентов в отсутствие противоопухолевой терапии свидетельствует о слабости иммунного ответа. Одна из причин дефектности противоопухолевого иммунитета связана с неадекватной презентацией ОАА. Ключевую роль в презентации ОАА и активации цитотокснческих Т-клегок играют дендритные клетки [Radford K.J., 2005]. Свойства ДК при опухолевых заболеваниях, в том числе при лимфопролнферативных заболеваниях (ЛПЗ), остаются недостаточно изученными.

В настоящее время имеется существенный прогресс в изучении механизмов развития лимфопролнферативных заболеваний. Но. несмотря на разработку новых медикаментозных препаратов и схем терапии достичь полных ремиссий удается менее чем в 40% случаев заболевания, а длительное безрецидивное выживание - в 30%.

По данным литературы большинство исследований проводится на ДК, генерируемых in vitro из моноцитов (CD14*) периферической крови в присутствии гранулонитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) и интсрлейкина-4 (ИЛ-4) с последующим добавлением дозревающих стимулов [Wang Y.H., 2009]. Кроме того, генерацию ДК можно индуцировать путем культивирования моноцитов с ГМ-КСФ и интерфероном-a (ИФН-а). Генерируемые в этом случае ДК (ИФН-ДК) характеризуются следующими особенностями: более высокой миграционной активностью, выраженной антнгенлрезентирующей функцией, большей стабильностью в условиях дефицита ростовых факторов, а также способностью стимулировать как Till-, так и Т1)2-ответ. Кроме того, ИФН-ДК являются более эффективными стимуляторами CD8' эффекторных Т-клеток и обладают выраженной цитотоксической/цптостатической активностью [Lapenta С., 2006, Santini S., 2003]. В литературе имеются отдельные сообщения о фенотипических и функциональных особенностях ДК, получаемых в присутствии ИЛ-4, у больных ЛПЗ, однако данные немногочисленны и зачастую

противоречивы. Свойства ДК у больных ЛПЗ, генерируемых в присутствии ИФН-а, практически не изучены.

Исходя из вышесказанного, была сформулирована цель исследования: Изучить фенотипические и функциональные свойства ИФН-ДК у больных лимфопролиферативными заболеваниями и разработать подходы к регуляции функциональной активности ДК in vitro. Задачи исследования:

1. Провести сравнительное исследование поверхностных маркеров, характеризующих дифференцировку и созревание ДК, в культурах ИФН-ДК у здоровых доноров и больных ЛПЗ.

2. Оценить продукцию цитокинов и аллостимуляторную активность ИФН-ДК у больных ЛПЗ в сравнении со здоровыми донорами.

3. Провести сравнительное исследование Thl/Th2 - стимуляторной активности ДК доноров и больных ЛПЗ.

4. Исследовать противоопухолевую цитотоксическую активность ИФН-ДК у больных ЛПЗ и здоровых доноров против опухолевых клеток НЕр-2 и Jurkat.

5. Оценить влияние иммуноактивных факторов (производных этиленпиперазина, двуцепочечной ДНК человека, рекомбинантного ИЛ-2) на функциональную активность ИФН-ДК больных ЛПЗ.

6. Оценить влияние ингибитора простагландина Е2 - индометацина на аллостимуляторную активность ИФН-ДК у пациентов ЛПЗ.

Научная новизна. В представленной работе впервые охарактеризованы фенотипические и функциональные свойства ИФН-ДК у больных с различными формами лимфопролиферативных заболеваний, получивших программную полихимиотерапию. Установлено, что в культурах ИФН-ДК больных преобладают клетки с фенотипом незрелых (CD83"CDla+) и промежуточных по степени зрелости (CD83+CDla+) ДК, культуры которых содержат меньшее количество терминально дифференцированных (CD83~CDla") и активированных (CD25") ДК. Впервые показано, что нарушение созревания/активации ИФН-ДК у больных ЛПЗ ассоциированы с нарушением цитокин-продуцирующей функции, в частности, снижением продукции ИФН-у и усилением продукции ИЛ-10. Установлено, что ИФН-ДК обладают сниженной способностью стимулировать пролиферацию Т-клеток в смешанной культуре лимфоцитов (СКЛ), что сопряжено не только с меньшей зрелостью ДК и повышенной продукцией ими ИЛ-10, но и достаточно высокой экспрессией лиганда к рецептору программированной клеточной смерти - В7-Н1. Кроме того, выявлено, что ИФН-ДК обладают повышенной Th2-

4

стимуляторной активностью, в частности, индуцируют более выраженный прирост ИЛ-4-экспрессирующих Т-клеток в СКЛ. Особенностью ИФН-ДК больных ЛПЗ является также снижение иитотоксической активности ДК против TRAIL-peiiicieHTnofi линии НЕр-2, при сохранной цнтотоксичностн против клеток TRAIL-чувствнтелыюй липни Jurkal. Фенотипнческие н функциональные изменения ИФН-ДК при ЛПЗ наиболее выражены у больных злокачественными лимфомами (ЗЛ) и в меньшей степени - у пациентов множественной миеломой (ММ).

Теоретическая и практическая значимость. Теоретическая значимость рабош заключается в расширении представлений о количественных и функциональных характеристиках ИФН-ДК при ЛПЗ. Выявленные при ЛПЗ (особенно у больных ЗЛ) фенотипнческие и функциональные изменения ИФН-ДК свидетельствуют о нарушении днфференцировкн/созревания ДК и снижении их способности индуцировать и опосредовать реакции клеточного иммунитета, лежащие в основе противоопухолевой защиты. При этом более выраженные нарушения ИФН-ДК у больных ЗЛ, чем у нацистов ММ, являются еще одним подтверждением патогенетической разнородности данных нозологических форм ЛПЗ. Практическая значимость работы заключается в установлении возможности генерации ИФН-ДК у больных ЛПЗ. Кроме того, показана принципиальная возможность коррекции нарушенных функций ИФН-ДК у больных ЗЛ путем культивирования ДК ш vitro с рядом иммуноактивных факторов - рекомбинантпого ИЛ-2 человека, двунепочечной ДНК человека и сополимера зтнленнпперазина, а также путем обработки ИФН-ДК (при выраженном снижении алдостимуляторной активности) индометаинном. Полученные данные диктуют необходимость тестирования свойств ДК при проведении иммунотерапии и обосновывают возможность использования ИФН-ДК для получения клеточных вакцин у пациентов с лимфопролнферагпвнымп заболеваниями.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. ИФН-ДК прн ЛПЗ характеризуются изменением феногнпическнх и функциональных свойств, которые проявляются задержкой созревания и нарушением функциональной активности в виде повышенной продукции ИЛ-10. снижения аллосгимулягорной, иитотоксической и усилении Т112-стимуляторной активности.

2. Изменение фенотипическнх и функциональных свойств ИФН-ДК более выражены у пациентов ЗЛ, чем у пациентов ММ.

3. Нарушения функциональной активности ИФН-ДК при ЗЛ корригируются in vitro путем культивирования ИФН-ДК с сополимером N-okcii-I .4-этиленпипсразина и (N-карбоксиэтил)-1,4-этиленинперазнннй бромида, двуцепочечной ДНК человека.

рекомбшшнтным ИЛ-2 и обработкой индометацином (при выраженном угнетении аллосгимуляторной активности ИФН-ДК).

Апробация работы. Основные результаты работы доложены и обсуждены на научно-практических конференциях XIII Международном конгрессе но приполярной медицине (Новосибирск. 2006). «Дни иммунологии в Сибири» (Омск. 2007). на 6-ой отчет пой конференции и межлабораторных семинарах ФГБУ НИИ Клинической иммунологии СО РАМН.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе 2 сгагьи в центральной печати в рецензируемых журналах.

Объем и структура диссертации. Диссертация написана в традиционном стиле и состоит пч введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, 6 глав собс1 венных результатов, обсуждения, заключения и выводов. Материал изложен на 97 страницах машинописного текста, включающего 4 таблицы и 16 рисунков. Прилагаемая библиография содержит ссылки на 123 литературных источника, в том числе 117 иностранных.

Благодарности

Автор выражает искреннюю благодарность научному руководителю член-корр. РАМН. проф. Н.Р.Черных за поддержку и помощь, оказанную при работе над диссертацией: сотрудникам лаборатории клеточной иммунотерапии за практическую помощь в проведении -жепернментальной части исследования.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Характеристика больных, включенных в исследование. Диссертационная работа основана на результатах клинико-иммунологического обследования 56 пациентов ЛТТЗ и 59 здоровых доноров крови. Пациенты распределялись по нозологическим группам следующим образом: неходжкипские лимфомы - 22 человека, лимфома Ходжкина - 21 человек, множественная мнелома 13 человек. Две трети пациентов имели нродвин>тые стадии заболевания, основная часть пациентов характеризовались длительностью течения заболевания до 5 лет, на момент обследования все пациенты имели в анамнезе 7 и более курсов химиотерапии. Диагностика лнмфопролнферативного заболевания основывалась на результатах клинических исследований (общий анализ крови, общий анализ мочи, биохимическое исследование крови, грепанобиопсия), инструментальных исследований (томографическое исследование, рентгенологическое).

Иммунологические исследования. Мононуклеарные клетки (МНК) из венозной гепаринизированной крови выделяли методом градиентного центрифугирования и в концентрации ОЛ'Ю'Улунку культивировали в %-лупочны.\ крупюдонных планшетах для иммунологических исследований в полной культуральнон среде RPM1-1640 при 37"С в ССЬ-инкубаторе.

Дендритные клетки генерированi путем культивирования прилипающей фракции МНК в присутствии ГМ-КСФ (Sigma-Altlrich, 40 нг/мл) и ИФН-а (Роферон-Л. Roche. Швейцария, 1000 Ед/'мл) в течение 3 сугок. На последующие 24 часа в качсс! подозревающего стимула вносили ЛПС (Е.еоШ 0114:B4, Sigma-Altlrich. 10 мкг'мл). В отдельной серии экспериментов в культуры ДК совместно с ЛПС добавляли препараты на основе производного этнленпиперазина (сЭП, 5 мкг/мл). двуцепочечной ДНК человека (дцДНК, 5 мкг/мл), а также рекомбинантного интерлейкнн-2 человека (рИЛ-2, 100 ЕД мл). В отдельной серии экспериментов ДК дополнительно инкубировали в течение 45 минут при 37"С с индометацином в дозе 50 мкг/мл.

Оценку поверхностных маркеров проводили методом проточной цитофлуориметрии, используя меченные фикоэритрииом (PH) aimi-CDla. anin-CD123. анти-В7-Н1 мАТ (BD PharMingen, США) и анти-С014 (Сорбент. Москва), меченные АРС анти-CDl Iс мАТ (BD PharMingen, США), меченные F1TC anTii-C'D25, анти-СОЯЗ (BD PharMingen, США).

Концентрацию цнтокинов ФНО-п, ИЛ-4. ИФН-у («Вектор-Бест», Новосибирск!. ИЛ-10 («Цитокнн», Санкт-Петербург) определяли в культуралышх сунериатантах ДК методом иммуноферментиого анализа.

Определение внутриклеточной экспрессии цнтокинов в CD3 -популяции лимфоцитов периферической крови проводили методом трехцветной проточной цитометрии (FACS Calibur. Becton Dickinson) с использованием АРС-мечениых моиоклональных анти-СОЗ-антител, FlTC-конъюгированных антп-ИФНа и РЕ-мечеппых анти-ИЛ-4-антнтел.

Аллостимуляторную активность ДК оценивали в реакции смешанной культуры лимфоцитов (СКЛ). В качестве отвечающих клегок использовали МНК допоров (0,1х10%унку), стимуляторами служили дендритные клетки в соотношении МНК:ДК 10:1. Пролпферативный ответ оценивался на 5 сут радиометрически по включению Н-тимидина (1 мкКю/лунку), вносимого за 18 ч до окончания культивирования.

Цитотоксичсскую активность ДК в отношении опухолевых клеток оценивали по лизису клеток-мишеней опухолевых линий НЕр-2 (клетки эпителиальной карциномы гортани человека) и Jurkat (Т-клеточная лимфома) дендритными клетками в соотношениях

7

40:1. 20:1 и 10:1 для клеточной линии НЕр-2 и 2:1. 1:1 и 1:2 для клеток линии ,1игка1. Процент цптотоксичности в тесте с 'Н-тимидином рассчитывали по формуле: [1 -(ими,мин в культурах с эффекторными клетками/имп/мин в контрольных культурах в отсутствие эффекторных клеток)] х 100%. Расчет цитотоксической активности ( % ) в МТТ-тссте проводили по формуле: [1 -(ОГЬ+м-ОПэ)/ОПм] х 100, где ОПэ+м - значение оптической плотности в опытных сериях: ОГЪ - значение оптической плотности в лунках с >ффекторами; ОПм - значение оптической плотности в лунках с мишенями.

Статистическая обработки полученных результатов проводилась методами описательной, параметрической и непараметрнческой статистики на персональном компьютере с использованием программы «ЗТАТ18Т1СА 6.0».

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Задачей первого тгапа явилось сравнительное исследование фенотипических маркеров в культурах ПФН-ДК у больных ЛГП в сравнении с культурами ИФН-ДК здоровых доноров (табл.1).

Таблица 1

Фенотипическая характеристика ИФН-ДК здоровых доноров и больных Л ПЗ

маркеры (%) доноры п=13 ЛПЗ n=20 ЗЛ n-10 MM n=10

CD14 М ± SE Ме min-max 8.6+1.4 9,0 2.0-18.0 23.6+3,3* 24,0 2,0-75.0 28,1+5,8* 27,0 5,0-75,0 19,1+3.04* 20,0 2,0-30,0

CD 1а" M + SE Ме min-max 10,4+2,07 10,0 1.6-32 13+2,7 8,0 0,34-39.0 21,1+3.88*," 20,5 5,2-39,0 5,05+1,34* 4.65 0,34-13.3

C"DX3~ М + SE Ме min-max 25.6+2.54 24,5 10,0-54.0 20,2+2,7 17,9 4.0-45,6 17,2+3.39* 15,6 4,0-37.0 23,1+4,1 23,2 5,0-45,6

CD25 Mi SE Ме min-max 25,0+3.49 26.0 9,0-44,0 11,06+2.36* 8,0 0,3-32.0 10,4+3.4* 5,5 1,0-28,0 1 1,7+3.4* 10,5 0,3-32.0

C'Dla'CDX3 M + SE Me min-max 19.0+2.35 16.5 9.0-32.7 13,3+2,58* 8.5 2.0-40,0 6,6+0.97* 6,05 2.0-12,0 19.9+4,1 22,0 2,9-40,0

CDIaTD8.V M + SE Me min-max 4,6+1.02 5.5 0,4-13.0 7.45+2,1 4,56 0.4-37,0 11,7+3,8 6,6 2,0-37,0 3,1+0.76 2,55 0,4-7,0

Примечание: представлены данные в виде средних значений М ± SE. %; Ме - медиана; min - max

значения минимум - максимум в исследуемых группах; п - число пациентов. * рг< 0.01-досговерпосгь различии между контрольной (доноры) и группой пациентов. # ри< 0.01-доетоверность различии между группами пациентов с ЗЛ и ММ.

Учитывая, что дифференцировка моноцитов в миелоидные ДК сопровождается потерей молекулы СШ4 и появлением С01а. а в последующем - снижением экспрессии СЭ1а и появлением СВХЗ. опенка указанных молекул позволяет оценить состояние дифференцированное ги/зрелости ДК. ДК больных отличались более высоким содержанием 01)14' клеток, причем у больных ЗЛ возрастание данной популяции было более выраженным, чем у пациентов ММ. У больных также отмечалось возрастание относительного числа незрелых СТМа" клеток и снижение зрелых СОХЗ клеток, преимущественно за счет пациентов ЗЛ. Снижение численности ДК с наличием активационного маркера С025 было характерно как для больных ЗЛ, так и для папистов ММ. Анализ совместной экспрессии С'В 1а и С083 молекул на поверхности ДК показал, что клетки больных ЗЛ отличались практически 3-кратным снижением числа терминально-дифференцированных (С083ТД}1а") и более чем двукратным возрастанием относительного содержания незрелых клеток(СШЗ С'Г)1а ). В то же время содержание указанных субпопуляций ДК в группе больных ММ не отличалось от таковых у доноров.

Одной из особенностей ИФН-ДК является экспрессия молекулы СО 123 (рис 1.)

Рисунок 1 Экспрессия С011с и СИ 123 в культурах ИФН-ДК больных Л ИЗ

Представлены средние значения (М ± Б.Е.. %) относительного содержания различных субпопуляций ДК. * - рг <0.05 достоверность различий по сравнению с донорами (и критерий Вилкоксона-Манна-Уитни). # - рг <0.05 - достоверность различий между группами пациентов ЗЛ и ММ (и критерий Вилкоксона-Манна-Уитни).

У доноров большая часть СО 123 ' клеток сосредоточена в популяции СГ)1 1с". тогда как у больных ЛПЗ данный маркер обнаруживался среди ОЗПс ДК. соответственно.

количество СОПсХЭШ" клеток было достоверно повышено, причем как у больных злокачественными лимфомами. так и множественной миеломой (рис.1).

Поскольку молекула С'П 123 экспрессируется па моноцитах и ее экспрессия снижается по мере дифферснцировки моноцитов в ДК, можно полагать, что возрастание СО!1с СО 123 клеток является еще одним свидетельством задержки дифференцировки ИФН-ДК п их менее зрелог о фенотипа.

Сравнительный анализ продукции цитокинов в культурах ДК больных и доноров показал, чго пациенты характеризовались сниженной продукцией ИФН-у за счет пациентов ЗЛ. Вторым ярким отличительным признаком было выраженное возрастание концентрации ИЛ-10, также наиболее характерное для больных ЗЛ (табл. 2).

Таблица 2

Продукция цитокинов дендритными клетками доноров и больных ЗЛ и ММ

показатели доноры n-17 ЛПЗ n~25 ЗЛ n=12 MM n=13

11ФН- V. пг/мл М + SE Me min-max 113 ±55,1 36 3.5-792.2 83,5 ±22,7 34.2 1.0-340.6 35,0 ± 17.2* 11.3 1,0-118.6 142.4± 35.4 150,3 1.0-340.6

11Л-4.пг/мл M ± SE Me min-max 3,6 ± 1.4 2.5 0.1-23.9 l.5± 0,46 0.8 0.1-6.9 2.0± 0.93 0.55 0.1-6.9 1.1 ±0,32 1.0 0.19-2.97

ФНО-и.пг/мл M ± SE Me min-max 745.4 ± 73.6 819.') 214,9-1102 794.7± 103.9 881.9 69.9-1130.6 813,3 ±93,6 867,3 197.4-1036,7 744,9± 338.6 1034.0 69,9-1130,6

IL'l-K).пк/мл M ± SE Me min-max 82.0 ± 13.6 98.8 38.8-131.2 266.2 ±48.2* 156.5 1.5-733.9 444,3 ± 59,3* 446,9 121.7-733,9 114,8 ±41,6 62,1 1.5-513.5

11 |jli .'iv ian>iv« I wiwi'-i*«' - i' — • — —-------------■

min - max - значения минимум - максимум в исследуемых группах концентрации цитокинов (пг/мл) в цельных супернатантах ДК больных злокачественной лимфомои и множественной миеломой. *. - Pi <0.05 -достоверность различий между ИФН-ДК доноров и пациентов ЛПЗ.

Учитывая данные фенотипического анализа о снижении экспрессии CD83 и CD25 п повышении CD 1а в культурах ДК больных, было высказано предположение, что задержка созревания и активации ДК" у больных может быть обусловлена повышенной продукцией ИЛ-10. Чтобы проверить это предположение, была исследована корреляционная зависимость данных показателей (рис.2).

Корреляционный анализ показал наличие сильной обратной зависимости между концентрацией ИЛ-10 и экспрессией дендритными клетками маркеров зрелых (CD83) и активированных (CD25) ДК в каждой группе больных. В то же время уровень продукции

ИЛ-10 прямо коррелировал с количеством СО!а - позитивных клеток, представляющих менее зрелые ДК.

Л.-Ю. пкг/мл

р=0.03

^ <........

Б ♦

11_-10, пкг/мл

|1_-1 О, пкг/мл

Рисунок 2 (А, Б, В). Корреляционная зависимость уровня экспрессии С083, СШ5, О) I а и продукции ИЛ-10

я -коэффициент корреляции по Спирмену; р достоверность различий по сравнению с донорами.

Выявленные выше нарушения созревания ДК и изменения их цитокинпродуцирующей функцин в сторону усиления продукции ИЛ-10 и снижения продукции ИФН-у позволили предположить, что ДК при лимфопролиферативных заболеваниях могут быть функционально дефектны. Одним из важных показателей функциональной активности ДК является аллостимуляторная активность, т.е. способность ДК индуцировать пролиферативный ответ аллогенных Т-клеток в СКЛ (рис. 3).

я мнк □ МНК+ИФН-ДК

16000 14000 12000 § 10000 4 8000

I 6000

4000 ■ 2000

0 - '

доноры (п=34) общая группа ЗЛ(п=22) ММ (п=8) ЛП? (11=30)

Рисунок 3. Аллостимуляторная активность ДК здоровых доноров и больных ЛГИ

Представлены средние значения (М ± Э.Е.) спонтанной пролиферативной активности МНК (МНК) и ответа в СКЛ. индуцированного ИФН-ДК (МНК+ИФН-ДК) пациентов ЛПЗ (общая группа), ЗЛ. ММ и здоровых доноров. Респондеры - МНК доноров (0,1 х Ю'Улунку). стимуляторы -аллогенные дендритные клетки здоровых доноров или больных ЛПЗ, ЗЛ, ММ в соотношении МНК:ДК 10:' (0.1 х Ю5/лунку). Уровень пролиферации (имп/мин) оценив;ши по включению Н-тимидина, вносимого за 1X ч до окончания культивирования. * - ри <0.05 - достоверность различий по сравнению с ДК доноров (и критерий Вилкоксона-Мана-Уитни).

Сравнительный анализ способности ДК доноров и больных стимулировать пролиферацию Т-клеток выявил снижение аллостимуляториой активности ДК пациентов по сравнению со здоровыми донорами. Интенсивность пролиферативного ответа в СКЛ, индуцированного ДК пациентов, была практически в 4 раза ниже по сравнению с уровнем пролиферативного ответа в СКЛ в присутствии ДК доноров. При анализе в подгруппах с различными нозологическими формами снижение способности стимулировать пролиферацию Т-клеток было характерно как для ДК больных ЗЛ, так и ММ.

Низкая аллостимуляторная активность ДК может быть обусловлена не только незрелостью ДК и изменением продукции цитокинов, но и их повышенной супресеорной или проапотогенной активностью. Недавние исследования показали, что важную роль в детерминировании функциональной активности ИФН-ДК против Т-лимфоцитов играет молекула В7-Н1. которая при взаимодействии с РО-1 рецептором на Т-клетках индуцирует анергию и апоптоз Т-клеток. Усиление экспрессии данной молекулы может обусловливать повышенную супрессорную активность ДК при онкологических и инфекционных заболеваниях. Сравнительный анализ показал, что ДК больных ЗЛ отличались практически двукратным увеличением относительного содержания клеток, экспрессирующих РО-1 лиганд (В7-НI) по сравнению со здоровыми донорами (рис. 4).

100 80

г?

а 60 I 40

ш

20 0

Ри—0.019

доноры больные ЗЛ

Рисунок 4. Экспрессия В7-Н1 на дендритных клетках больных ЗЛ

Представлены индивидуальные значения относительного содержания В7-Н 1 ДК. * - Р( <0,05 -достоверность различий по сравнению с донорами (и -критерий Вилкоксона-Манна-Уитни). Горизонтальные линии - средние значения в исследуемых группах.

Выявленные изменения продукции ци гокинов, стимулирующих ТЫ или ТЬ2 ответ,

в совокупности с нарушенной способностью стимулировать пролиферацию Т-клеток в

СКЛ позволили предположить, что ДК пациентов могуг характеризоваться измененной

ТЫ - или ТЫ-стимуляторной активностью. Поэтому следующим разделом работы явилось

исследование способности ДК активировать Т-хелперные клетки 1-го или 2-го типа. Для

этого исследовалось количество Т-клеток с внутриклеточным содержанием ИФН-у или

ИЛ-4 в СКЛ (табл. 3).

Таблица 3

Влияние ДК здоровых доноров и больных ЛПЗ на внутриклеточную экспрессию Т-клетками ИФН-у и ИЛ-4

Источник ДК СОЗ" ИФН-у" Т-клетки (%) СЭЗ" ИЛ-4" Т-клетки (%)

МНК,, МНК + ДК ИВдК МНК„ МНК + ДК ИВдк

Доноры (п=18) 1,83*0,3 6,35*0.6 1 5,4± 1,1 1,3*0.2 1.6*0,3 1.6*0,3

Больные ЛПЗ (п=22) 1,2*0,06 5,7±0,3 5,3*0,7 1,5*0,1 5,5*0,7 3,6*0,4*

Больные ЗЛ (п=10) 1,33±0,1 5.83*0,6 5.4*1,4 1,9*0,1 7,7*1,1* 4,2*0,6*

Больные ММ (п=12) 1,36*0,1 6,11 ±0.58 5,5,4 1,9*0,1 2.3*1,1 2,0*0.24

Примечание: представлено относительное содержание СОЗ+Т-клеток с внутриклеточной экспрессией ИФН-у и ИЛ-4 в культурах МНК, лишенных моноцитов (МНК(1), и активированных ДК (МНК * ДК) здоровых доноров и больных ЛПЗ. ИВд« - индекс влияния ДК. - ,.„ <0,05 -достоверность различий показателей по сравнению с донорами (и критерий Вилкоксона-Манна-Уитни).

ДК больных обладали сходной с донорскими значениями стимулирующей активностью в отношении генерации ИФН-у-продуцирующих клеток, однако отличались

более выраженной способностью активировать Т-клетки, продуцирующие ИЛ-4. Это проявлялось большим приростом количества СОЗИЛ-4* Т-клеток в культурах СКЛ. индуцированных ДК больных, по сравнению с аналогичными показателями в культурах СКЛ, индуцированных ДК доноров.

При анализе различных нозологии в общей группе больных ЛПЗ наибольшие изменения функциональной активности ДК наблюдались в группе пациентов ЭЛ. ДК этих пациентов достоверно сильнее стимулировали прирост СОЗ ИЛ-4 Т-клеток. В группе больных ММ ТЬ2-стимуляторная активность ДК была практически сходной с таковой для ДК здоровых доноров.

Одной из важных эффекторных функций дендритных клеток является цитотоксическая активность, играющая важную роль в элиминации опухолевых клеток. В связи с этим отдельный раздел был посвящен сравнительной оценке цитотоксической активности ИФН-ДК у здоровых доноров и больных ЛПЗ. Данная часть исследований проводилась в тругше пациентов ЗЛ. так как именно при этой нозологии выявлялись наиболее выраженные изменения фенотипических и функциональных свойств.

Сравнительная оценка показала, что ДК больных отличались сниженной цитотоксической активностью против ТЯА1Ъ-резистентной линии НЕр-2. В частности, цитотоксичность ДК больных была двукратно ниже, чем у ДК доноров (рис. 5).

Рисунок 5. Цитотоксическая активность ИФН-ДК здоровых доноров и больных ЗЛ против клеток линии НЕр-2

Представлены средние значения (М±ЗЕ) цитотоксической активности ИФН-ДК доноров (п=221 и больных (п=П) против опухолевой линии НЕр-2. Клетки-эффекторы (ДК) и меченные 'Н-тимидином клетки-мишени (ИЕр-24) культивировали в соотношении 40:1. 20:1 и 10:1 в течение IX ч. * - Р1 <0.05 - достоверность различий между донорами и больными.

Наряду с оценкой лизиса опухолевых клеток в тесте с 3Н-тимидином, для оценки цитотоксической активности ИФН-ДК был также использован МТТ-тест. В данной серии экспериментов цитотоксическая активность оценивалась не только против клеток ТНАГЬ-

резистентной линии НЕр-2, но и против ТИЛТЬ-чувствительной линии JLlrkat. Так же, как и в тесте с 3Н- тимидином, ИФН-ДК больных обладали сниженной цитотоксической активностью против клеток линии НЕр-2. В то же время цитотоксическая активность ДК больных против опухолевых клеток линии Дика! оставалась сохранной (рис. 6).

Рисунок 6. Цитотоксическая активность ИФН-ДК больных ЗЛ против клеток линии НЕр-2 и клеток линии ,1игка{

Представлены средние значения (М±5Е) цитотоксической активности ИФН-ДК больных ЗЛ против опухолевой линии НЕр-2 и Лшка!. Опенка цитотоксической активности ДК проводилась с помощью МТТ-теста. ДК и клетки НЕр-2 и ,1игка! культивировали в соотношении 1:1 в течение 24 ч. * - ру<0,05 - достоверность различий между донорами и больными.

Одним из важных аспектов, обусловливающих эффективность иммунотерапии, является полноценность генерируемых ДК. Поэтому выявленные изменения фенотипа и функциональной активности, генерируемых у больных ЛПЗ, побудили к поиску подходов, направленных на восстановление функциональной активности ДК. В качестве потенциальных иммунокорректоров были выбраны рекомбинангный интерлейкнн-2 человека (рИЛ-2). двуцепочечная ДНК человека (дцДНК) и сополимер производного этиленпиперазина (сЭП), обладающие выраженной иммуностимуляторной активностью.

В качестве интегрального показателя функциональной активности ДК в данной серии экспериментов исследовали способность ДК к стимуляции пролиферативного ответа Т-лимфоцитов в С'КЛ (рисунок 7).

Сравнение эффективности исследуемых соединений показало, что все три иммуноактивных фактора обладали способностью усиливать аллостимуля горную активность ДК. При этом наиболее выраженным стимулирующим эффектом обладал рИЛ-2, восстанавливающий способность ДК стимулировать пролиферативный ответ Т-клеток практически до уровня донорских значений.

Рисунок 7. Влияние иммуноактивных факторов на аллостимулягорную активность ДК пациентов злокачественными лимфомами

Представлены средние значения (М ± БЕ) алостимуляторной активности ЛПС'-етимулированных ИФН-ДК больных ЗЛ (11=20). * - Ри<0,05 -достоверность различий между интактными ИФН-ДК больных (0) и ИФН-ДК больных, культивированными в присутствии сЭГТ. дцДНК или рИЛ-2 (Ь'-критерий Вилкоксона-Манна-Уитни). Горизонтальная линия средний уровень значений аллостимуляторной активности ДК доноров.

Убедившись в способности исследованных иммуноактивных факторов оказывать позитивный эффект на аллостимуляторную активность ДК больных, на следующем этапе была исследована возможность стимуляции дефектной цитотоксической активности ДК с помощью указанных медиаторов. Цитотоксическую активность ИФН-ДК оценивали против клеток опухолевых линий НЕр-2 и 1игка1 в МТТ-тесте. Сравнение средних показателей цитотоксичности ингактных и модифицированных ДК показало (табл. 4). что все анализируемые иммуноактивные факторы достоверно усиливали исходно низкую цитотоксическую активность ДК больных ЗЛ против клеток НЕр-2. В то же время эти факторы не влияли на исходно сохранную цитотоксическую активность ДК против клеток линии .Гигка1.

Таблица 4

Влияние иммуноактивных факторов на цитотоксическую активность ДК _пациентов ЗЛ против клеток линии НЕр-2 и Лигка!_

НЕр-2 (%) .Гш-ка! (%)

ДК(0) (доноры) 31,3 ±6,6 37,65 ± 4,98

ДК (больные)

ДК(0) 10 ±4,4" 28,6 ± 8,4

ДК(+рИЛ-2, 1 ООЕД/мл) 36 ±5,3* 30 ±4,8

ДК (+ сЭП, 2нг/мл) 34 ± 4,9* 31 ±3,9

ДК (+ дцДНК, 5 мкг/мл) 21 ±2,8* 30 ±3,3

Примечание: представлены средние значения (М ± ЭК) цитотоксической активности ИФН-ДК доноров (п=22) и больных ЗЛ (п=7) против опухолевых клеток линии НЕр-2 и ,1игка(. ДК и клетки НЕр-2 и Лигка! культивировали в соотношении 1:1 в течение 24 ч. #- Ри<0,05- достоверность различий между интактными ЛПС-стимулированными ИФН-ДК здоровых доноров (ДК доноры) и больных (ДК(0)). * - Ри<0,05 -достоверность различий между интактными ИФН-ДК больных (0) и ИФН-ДК больных, культивированными в присутствии сЭП, дцДНК или рИЛ-2 (1!-критерий Вилкоксона-Манна-Уитни).

Согласно данным литературы, одним из универсальных медиаторов, способных опосредовать супрессорные свойства антигенпрезетирующих клеток, является простагландин Е2 (ПГЕ2). В этом случае можно предполагать, что подавление повышенной продукции ПГЕ2 будет способствовать усилению стимуляторных свойств ДК пациентов. Чтобы проверить это предположение, было проведено сравнительное исследование аллостимуляторной активности интактных ДК больных ЗЛ и ДК. предобработанных индометацином. В целом по группе обработка индометацином не влияла на средние показатели аллостимуляторной активности (рис. 8 А). Тем не менее, при анализе индивидуальных значений обращало внимание, что, несмотря на снижение аллостимуляторной активности ДК у всех обследованных больных, ДК существенно различались по величине данного показателя (рис.8 Б). В частности, выделялось две подгруппы пациентов с выраженным (п=6) и умеренным (п=5) угнетением аллостимуляторной активности. В группе пациентов с выраженным снижением аллостимуляторной активности ДК обработка индометацином повышала способность ДК стимулировать пролиферацию Т-лимфоцитов, а в группе пациентов с умеренным снижением аллостимуляторной активности эффект был противоположным, т.е. обработка индометацином приводила к подавлению аллостимуляторной активности.

общая группа ЗЛ (п= 11)

Е 2000

ШК -ДК(0)

мнк

-ДК(шшом)

« МНК -ДК(0) 8 МНК -ЛК(ННДОМ)

3500 3000 2500 |2000 | 1500 = 1000 500 0

группа с выраженным снижением (п=6)

группа с умеренным снижением (а=5)

Рисунок 8 Влияние иидометацина на аллостимуля горную активность ИФН-ДК пациентов ЗЛ

Представлены средние значения (М ± 5Е) пролиферативной активности в СКЛ. Респондеры аллогенные МНК, стимуляторы - ннтактные (ДК0) и предобработанные индометацином ДК ЗЛ. А данные по общей группе пациентов ЗЛ. Б данные по подгруппам в зависимости от исходного уровня пролиферативной активности пациентов ЗЛ. * - р, <0.05. достоверность различий между интактными ЛПС-стимулированными ИФН-ДК больных ЗЛ и обработанными индометацином (и критерий Вилкоксона-Мана-Уитни).

Таким образом, стимулирующий эффект иидометацина на способность ДК

индуцировать пролиферацию Т-клеток проявляется исключительно в культурах ДК с

выраженным угнетением аллостимуляторной активности.

ВЫВОДЫ

Культуры ИФН-ДК, генерированные от больных ЛПЗ, характеризуются большим содержанием незрелых и промежуточных по степени зрелости ДК (С'Э 14 . СЭ11с~С'0123~ и СТ)83 СТЛа ) и снижением относительного содержания терминально-дифференцированных (С1383 СЧЭГ) и активированных (С025") ДК. что в наибольшей степени выражено при злокачественной лимфоме и свидетельствует о задержке дифференцировки/созревания ДК.

По сравнению со здоровыми донорами. ИФН-ДК больных ЗЛ отличаются сниженным уровнем продукции ИФН-у и повышенной продукцией ИЛ-10 (содержание которого обратно коррелирует со степенью зрелостью ДК), что свидетельствует об изменении цитокиипродуцирующей функции ДК и роли ИЛ-10 в нарушении дифференцировкн и созревания ДК при ЗЛ.

3. При лимфопролиферативных заболеваниях ИФН-ДК характеризуются низкой способностью стимулировать пролиферацию аллогенных Т-клеток в культурах СКЛ, что указывает на снижение аллостимуляторной активности ИФН-ДК и в совокупности с выявленным возрастанием экспрессии В7-Н1 свидетельствует о повышенном проапоптогенном потенциале ДК.

4. ДК больных ЛПЗ обладают сходной с ДК доноров способностью индуцировать генерацию СГ)3+ИФН-у+ Т-клеток, но большей активностью (у больных ЗЛ) в отношении генерации СШ+ИЛ-4+ Т-клеток, что свидетельствует о доминировании ТЪ2-стимуляторной активности у больных ЗЛ.

5. ИФН-ДК больных злокачественными лимфомами характеризуются сниженной цитотоксической активностью против опухолевой линии НЕр-2, однако эффективно лизируют клетки линии Jurkat, что свидетельствует об избирательной дефектности цитотоксической активности против TRAIL-резистентных НЕр-2 - опухолевых клеток.

6. Культивирование ИФН-ДК больных ЗЛ с сополимером N-окси-1,4-этилснпнперазина и (N-карбоксиэтил)-1,4-этиленпиперазин бромида, двуцепочечной ДНК человека и интерлейкином-2, а также обработка индометацином (при выраженном угнетении аллостимуляторной активности) восстанавливают исходно низкую аллостимуляторную и цитотоксическую активность ДК, что демонстрирует принципиальную возможность коррекции функций ДК у больных злокачественными лимфомами.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Насонова Г.В., Лсплина О.Ю., Тихонова М.А., Крючкова И.В., Сергеевичева В.В., Лисуков И.А., Останин A.A., Черных Е.Р. Свойства IFN-a-индуцированных дендритных клеток у больных злокачественными лимфомами // (Материалы межрегиональной научно-практической конференции «Дни иммунологии в Сибири» Омский научный вестник - 2007 - №3 - С. 242

2. Леплина О.Ю., Насонова Г.В., Тихонова М.А., Крючкова И.В., Лисуков И.А., Останин A.A., Черных Е.Р. Характеристика IFN-a-индуцированных дендритных клеток у больных злокачественными лимфомами // Гематология и трансфузиология. - 2008 - №3 - С. 24-29.

3. Леплина О.Ю., Насонова Г.В., Тихонова М.А., Крючкова И.В., Лисуков И.А., Останин A.A., Черных Е.Р. IFN-a-индуцированные дендритные клетки у больных множественной миеломой // Сибирский онкологический журнал. - 2009. -№6(36).-С. 37-43.

4. Леплина О.Ю., Тихонова М.А., Насонова Г.В., Мишинов C.B., Ступак В.В., Крючкова И.В., Останин A.A., Черных Е.Р. Характеристика функциональной активности интерферон-индуцированных дендритных клеток у здоровых доноров и

больных злокачественными заболеваниями // Цитокины и воспаление. - 2010. -Т.9. - №3. - С. 78.

5. Насонова Г.В., Леплина О.Ю., Тихонова М.А., Крючкова И.В., Останин А.А., Черных Е.Р. Экспрессия В7-Н1 на IFN-a-индуцированных дендритных клетках у больных злокачественными лимфомами // Материалы всеросийской научно-практической конференции «Дни иммунологии в Сибири», Абакан. - 2011. - С. 101-103.

6. Насонова Г.В., Тихонова М.А. Возможность коррекции аллостимуляторной активности ИФНа-индуцированных дендритных клеток больных злокачественными лимфомами in vitro // Вестник Уральской медицинской академической науки.- 2011.- № 2/1 (35).- С. 49-50.

Подписано к печати 08.02.2013 формат - 60x84 1/8, Усл. печ. л. 1 Бумага: офсетная Печать: трафаретная Тираж: 100 экз. Номер заказа № 069 ООО " Типография ЮГУС", ИНН 5402548639, г. Новосибирск, ул. Залесского, 4, тел.: (383) 226-14-56,225-04-47