Автореферат и диссертация по медицине (14.03.08) на тему:Гистогенез костной ткани эмбрионов японского перепела в условиях невесомости

На правах рукописи

Комиссарова Дарья Валерьевна

ГИСТОГЕНЕЗ КОСТНОЙ ТКАНИ ЭМБРИОНОВ ЯПОНСКОГО ПЕРЕПЕЛА В УСЛОВИЯХ НЕВЕСОМОСТИ

14.03.08 - авиационная, космическая и морская медицина 03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

г 7 МАП 2015

Москва 2015

005569497

005569497

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Государственном научном центре Российской Федерации - Институте медико-биологических проблем Российской академии наук.

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, ведущий научный Лычаков Дмитрий Витальевич

сотрудник, Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки Институт эволюционной

физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова

Российской академии паук (ИЭФБ РАН)

кандидат сельскохозяйственных наук, доцент, Ссмак Анна Эдуардовна

ФГБОУ ВО Российский государственный аграрный

университет - Московская сельскохозяйственная

академия имени К. А. Тимирязева (РГАУ - МСХА

им. К. А. Тимирязева)

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Воронежская государственная медицинская академия имени H.H. Бурденко" Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита диссертации состоится "24" июня 2015 г. в 10-00 часов на заседании диссертационного совета Д 002.111.01, созданного на базе Федерального государственного бюджетного учреждения науки Государственного научного центра Российской Федерации - Института медико-биологических проблем Российской академии наук по адресу: 123007, г. Москва, Хорошевское шоссе, д. 76А.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Государственного научного центра Российской Федерации - Института медико-биологических проблем Российской академии наук по адресу: 123007, г. Москва, Хорошевское шоссе, д. 76А.

Автореферат разослан « /3» -¿(Q Д 2015 г.

доктор биологических наук кандидат биологических наук

Сычев Владимир Николаевич Гурьева Тамара Сергеевна

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Одной из важнейших задач при освоении космического пространства является медико-биологическое обеспечение жизнедеятельности человека в условиях, когда полностью отсутствуют факторы, обеспечивающие жизнь и развитие биологических существ. В круг вопросов медико-биологического обеспечения человека входят и вопросы создания систем жизнеобеспечения (СЖО), поэтому исследования в этом направлении являются не менее актуальными, чем создание соответствующих технических средств для освоения космического пространства [Газенко О.Г. с соавт., 1990, 1998, 2001; Григорьев А.И. с соавт., 2003].

Для планируемых длительных полетов человека в космосе в отрыве от биосферы Земли проблема жизнеобеспечения человека должна решаться за счет создания систем жизнеобеспечения регенеративного типа [Циолковский К.Э., 1954; Шепелев Е.Я, 1965, 1968, 1975; Ковров И.И. с соавт., 1975; Гительзон И.И. с соавт., 1978; Шепелев Е.Я., Мелешко Г.И., 1994; Gitelson I.I., 1994]. С самого начала возникновения проблемы разработки СЖО для пилотируемых космических аппаратов длительного функционирования наметилось два направления в разработке регенеративных систем -на основе физико-химических и на основе биологических процессов [Чижов C.B., Синяк Ю.Е., 1973; Синяк Ю.Е. с соавт., 1994; Гузенберг А.С., 1994; Kliss M. et al., 2000; Шепелев Е.Я., 1965, 1968, 1975; Barta D. et ai., 1999; Сычев B.H., 2000; Сычев B.H. с соавт., 2008].

Системы, основанные на физико-химических процессах, могут регенерировать лишь атмосферу и воду, но пища в таких системах должна находиться в запасах, поэтому существует только один путь создания вне биосферы Земли функционального аналога природной среды обитания человека — использование биогенных механизмов в форме биологических систем жизнеобеспечения (БСЖО).

Звено гетеротрофных организмов является обязательной составной частью любой экологической системы. В антропогенной системе жизнеобеспечения основной объем функций этого звена выполняет человек. Он является составной частью системы и играет одновременно роль задающего звена, определяет состав и структуру системы, способную удовлетворить его метаболические потребности. Однако полноценный

рацион питания человека требует включения в него до 40% животных белков. Поэтому в состав системы жизнеобеспечения необходимо включение животных, которые, помимо этого, необходимы и для более высокой степени замкнутости трофических связей в системе [Шепелев Е.Я., 1975; Шепелев Е.Я., Мелешко Г.И., 1994; Сычев В.Н., 2000].

Любое звено БСЖО, автотрофное или гетеротрофное, представляет собой популяцию организмов, неограниченно долго живущую в искусственных условиях в тесном взаимодействии с другими звеньями (популяциями организмов) системы. Устойчивое существование популяций во времени определяется тем, как полно обеспечены потребности каждого из организмов, входящих в популяцию, и могут ли организмы размножаться, чтобы поддерживать популяцию на стационарном уровне. Исходя из этого, первым шагом в исследованиях гетеротрофного звена БСЖО в условиях космического полета было исследование онтогенеза животных в агравитационной среде, а первой стадией онтогенетического развития организма является эмбриогенез [Шепелев Е.Я., 1975; Гурьева Т.С. с соавт., 1993; Сычев В.Н., 2000]. Именно поэтому в исследованиях гетеротрофного звена БСЖО в невесомости важную роль играет исследование эмбриогенеза и, в частности, развития в полете опорно-двигательного аппарата и костной ткани.

Результаты многочисленных исследований показывают, что факторы космического полета в целом оказывают негативное воздействие на костную систему взрослых животных [Атьков О.Ю., 1989; Оганов B.C., 2003; Григорьев А.И. 2007 с соавт.]. В проводимых ранее экспериментах на беременных самках крыс было доказано, что невесомость влияет и на эмбриональное развитие животных: вызывает отставание в развитии костной ткани крысят, которое, впрочем, впоследствии достаточно быстро нивелировалось [Alberts J.R. 1985; Серова Л.В., 1988]. Однако детального изучения развития костной ткани в невесомости у эмбрионов животных или птиц за весь период эмбрионального развития до сих пор не проводилось. Кроме того, в экспериментах на крысах показано значительное влияние материнского организма, стремившегося скомпенсировать негативное влияние невесомости на плод, что, возможно, и являлось причиной небольшого отставания полетной группы от группы лабораторного контроля [Серова Л.В., 1977; Ильин Е.А., 1979; Газенко О.Г., 1981]. Именно поэтому в качестве объекта исследования были выбраны эмбрионы птиц, которые развиваются вне материнского организма, что позволяет оценить влияние невесомости непосредственно

на остеогенез. По многим показателям наиболее удобным видом среди птиц с точки зрения перспективности включения в БСЖО является японский перепел (Coturnix coturnix japónica dorn.) [Мищенко В.Ф., 1988].

Первые исследования эмбрионального развития японского перепела в условиях невесомости были осуществлены в 1979 г. на биоспутнике «Космос-1129» в течение 12 суток. Результатом этого исследования явилось доказательство возможности успешного инкубирования яиц перепела в невесомости [Шепелев с соавт., 1982]

В полетах на биоспутниках невозможно осуществить исследование эмбриогенеза в динамике, поэтому следующим этапом в изучении влияния невесомости на развитие птиц стали эксперименты, проводимые на орбитальной станции, когда яйца фиксировались на разных сроках развития эмбрионов (на 4-е, 7-е, 10-е и 14-е сутки).

Цель исследования

Провести сравнительное изучение гистогенеза костной и хрящевой тканей нижних конечностей японского перепела в условиях невесомости и земной гравитации.

В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:

1. Изучить морфометрию опорных костей нижних конечностей (бедренной и большеберцовой) на 4, 7, 10, 14 и 16 сутки экспонирования эмбрионов перепела в невесомости.

2. Изучить гистологическое состояние костной ткани 2-х основных опорных костей нижних конечностей (бедренной и большеберцовой) на 4, 7, 10, 14 и 16 сутки экспонирования эмбрионов перепела в невесомости.

3. Исследовать метаболизм кальция (содержание кальция в костной ткани, золе скорлупы, а также зольность скорлупы) у эмбрионов японского перепела возраста 4, 7, 10, 14 и 16 суток, экспонированных в невесомости.

Научная новизна

Впервые было проведено исследование развития костной ткани птиц в невесомости в течение всего периода эмбрионального развития. Впервые доказано, что развитие костной ткани перепелов в невесомости проходит те же стадии, что и в условиях земной

гравитации, поэтому перепела могут рассматриваться как часть гетеротрофного звена БСЖО в будущих длительных космических миссиях. Было установлено, что критическими периодами, когда отставание в развитии костной ткани в полетной группе от контрольной было максимальным, являются 7-е и 10-е сутки. Это связано прежде всего с отставанием в развитием кровеносной системы эмбриона в невесомости, а также с недоразвитостью щитовидной и паращитовидной желез.

Впервые установлено, что костная ткань развивающихся эмбрионов японского перепела способна адаптироваться к измененным гравитационным условиям и таким образом компенсировать к моменту вылупления отставание от контрольной группы по большинству параметров, однако впервые было показано, что несмотря на то, что морфометрические показатели в полетной группе к моменту вылупления практически не отличаются от таковых в контрольной, внутреннее гистологическое развитие костной ткани отставало в полетной группе от контрольной на всех этапах развития эмбриона.

Теоретическая и практическая значимость

Полученные данные дали возможность оценить в динамике формирование и развитие костной ткани эмбрионов японского перепела в невесомости, а также выявить критические стадии развития в эмбриогенезе, когда влияние невесомости сказывается на процессах, происходящих в костной ткани, наиболее отчетливо. Эти стадии соответствуют 7-м и 10-м суткам развития и связаны с физиологическими процессами, происходящими в эмбрионе, а именно с развитием кровеносной системы и щитовидной и паращитовидной желез. Эти процессы в невесомости существенно отставали от аналогичных процессов в условиях земной гравитации, что повлекло за собой отставание в развитии и формировании костной ткани.

Было доказано, что в остеогенезе разновозрастных эмбрионов японского перепела в невесомости не имеется патологических отклонений, хотя на ранних стадиях отмечено существенное отставание у эмбрионов полетной группы по сравнению эмбрионами контрольной, которое впоследствии нивелировалось. Полученные результаты исследования имеют большую практическую значимость для разработки способов сохранения жизнеспособности птиц и животных, включенных в состав гетеротрофного звена БСЖО космических экипажей.

Положения, выносимые на защиту

1. На ранних (с 4-х по 10-е сутки) стадиях эмбриогенеза развитие костной ткани японского перепела в условиях невесомости отставало от развития костной ткани эмбрионов контрольной группы, развивавшихся в земной гравитации, значительно сильнее, чем на поздних стадиях (14-е, 16-е сутки). Причиной отставания является задержка в формировании кровеносной системы в яйце, а также отставание в развитии щитовидной и паращитовидной желез, наблюдавшееся с 4-х по 10-е сутки.

2. Уменьшение различий в морфометрических показателях у эмбрионов полетной и контрольной групп на завершающих стадиях эмбрионального развития при сохранении отставания во внутреннем гистологическом развитии костной ткани говорит о частичной адаптации растущей костной ткани эмбрионов к невесомости.

Апробация работы

Основные результаты и положения диссертации были представлены и обсуждены на 33-х, 34-х, 35-х и 37-х Академических чтениях по космонавтике, посвященных памяти академика С.П. Королева, а также на 10-й, 11-й и 12-й Конференциях молодых ученых, специалистов и студентов. Результаты работы были также представлены на Космическом форуме с международным участием, посвященном 50-летию полета в космос Ю.А. Гагарина. По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ в журнале «Авиакосмическая и экологическая медицина», входящем в Перечень российских рецензируемых научных журналов, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертаций на соискание ученых степеней доктора и кандидата наук.

Диссертация апробирована на секции «Космическая физиология и биология» Ученого Совета ГНЦ РФ - ИМБП РАН (протокол № 1 от 18 февраля 2015 г.).

Личный вклад автора

Гистологические исследования костной и хрящевой тканей; морфометрический анализ костей и участков окостенения бедренной и большеберцовой костей разновозрастных эмбрионов японского перепела, развившихся в условиях невесомости и в лабораторных условиях; измерение зольности скорлупы яиц разновозрастных

эмбрионов, а таюке содержания кальция в скорлупе и костях их нижних конечностей выполнено автором самостоятельно. Результаты научно обоснованы и обобщены.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из следующих частей: «Введение», «Литературный обзор», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение», «Выводы», «Список литературы», «Приложение».

Текст диссертации изложен на 94 страницах, содержит 15 рисунков и 12 таблиц. Список литературы состоит из 125 цитируемых источников, из которых 63 - на русском и 62 - на иностранном языке.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований

Методика проведения эксперимента по изучению эмбрионального развития японского перепела в условиях невесомости. В данной работе использовался биологический материал, полученный в 4 космических экспериментах, проводимых с 1995 по 1998 годы и призванных изучить эмбриональное развитие японского перепела (Coturnix coturnix japónica dorn.) в невесомости. Для проведения экспериментов на борт орбитальной станции (ОС) «Мир» был доставлен комплекс аппаратуры, позволяющий проводить инкубирование перепелиных яиц, и перепелиные яйца по 48 штук на каждый из 4 экспериментов. Режим инкубации яиц, как на Земле, так и на ОС «Мир», был постоянным и соответствовал заданным параметрам: температуре +37,5-Ю,5° С и влажности в пределах 65-80% при непрерывном режиме вентиляции. Во время одного эксперимента в инкубатор закладывали 40 яиц.

Яйца инкубировали в течение 16 суток, т.е. на 1 сутки меньше, чем это требовалось для выведения птенцов. Контролем служили эксперименты, проводимые на аналогичной аппаратуре в лабораторных условиях.

По программе эксперимента в течение всего периода инкубации проводили выемку яиц на 4, 7, 10, 14-е и 16-е сутки в каждом эксперименте с последующей их фиксацией в 4 %-ном параформальдегиде на фосфатном буфере (pH = 7,2).

Зафиксированный биоматериал укладывали в металлические контейнеры. По

окончании эксперимента укладки с биоматериалом хранили на борту ОС «Мир» до момента спуска на Землю.

В лаборатории на Земле проводилось инкубирование на аналогичной аппаратуре в аналогичных условиях. Полученный биоматериал фиксировался в те же сутки и в том же фиксаторе, что и образцы полетной группы, и служил контролем.

Методика общей обработки биологического материала. Полученный в полетном и лабораторном экспериментах биологический материал обрабатывали по следующей схеме:

1. Поочередно вскрывали контейнеры-фиксаторы яиц и извлекали яйцо.

2. Проводили внешний осмотр и взвешивание яйца.

3. Яйцо осторожно вскрывалось и его содержимое переносилось в чашку Петри. Отмечалось состояние желтка, белковых оболочек, сосудистого поля и определялась стадия развития эмбриона.

4. После внешнего осмотра эмбриона для выявления видимых аномалий развития и взвешивания проводились замеры тела и отдельных его частей, в том числе нижних конечностей.

Методика определения длин костей и участков окостенения, а также последующего гистологического исследования растущей и развивающейся кости. Для исследования развития процесса костеобразования нижних конечностей у разновозрастных эмбрионов японского перепела были выделены бедренная и большеберцовая кости как 2 основные опорные кости нижних конечностей. Измерение кости, а также участков окостенения производили в направлении наибольшего продольного размера костных закладок длинных трубчатых костей нижних конечностей с помощью окуляр-микрометра МБС-9 (страна-изготовитель: РФ). Поскольку в норме окостенение у эмбрионов японского перепела начинается после 4-х суток, 4-суточные эмбрионы не исследовались по данному параметру.

Процесс подготовки гистологических препаратов включал в себя следующие процедуры: 1) взятие образца ткани; 2) фиксацию образца (фиксатор - 4 %-ный раствор формальдегида); 3) промывание и обезвоживание (в спиртах восходящей концентрации, начиная с 70 до 100° по стандартной методике); 4) заливку в парафин; 5) приготовление срезов с последующей окраской. В качестве красителей на этом этапе использовались основной краситель гематоксилин, окрашивающий базофильные клеточные структуры

ярко-синим цветом, и спиртовой кислый краситель эозин У, окрашивающий эозинофильные структуры клетки красно-розовым цветом [Бойчук Н.В., 2008]. Расчет процента окостенения проводился по формуле:

Степень окостенения — с<->-а°пт-окостетж^ х 100%

( дни ня_ко cm и )

, где L-длина.

Гистологические препараты изучались под микроскопом, проводилось детальное описание состояния костной ткани, делались фотографии.

Методика определения зольности и содержания кальция в скорлупе перепелиных яиц и в выделенных костях нижних конечностей. Скорлупа перепелиных яиц промывалась в дистиллированной воде и высушивалась при комнатной температуре, с яйца снималась подскорлупная оболочка, а сама скорлупа измельчалась. Пробы сжигались в муфельной печи при температуре 450-500° С в течение б ч до получения однообразной золы пепельного цвета. При такой температуре происходило сгорание органической составляющей скорлупы, а в золе оставались только минеральные вещества.

Расчет зольности проводился по формуле:

Зольность = т"'"''лм 1"ла ~ х 100%

т _ т , где ш - масса.

1тигль+проба тигль

После сжигания в каждой пробе определялось содержание кальция (титриметрический метод, ГОСТ 26570-95). Определение проводилось на базе Университета прикладной биотехнологии, в лаборатории «Биотест».

В выделенных костях нижних конечностей разновозрастных эмбрионов (7, 10, 14 и 16 суток) также определяли содержание кальция с помощью масс-спектрометрического анализа (на базе МГТУ им. Баумана, прибор Thermo Finnigan Element 2, страна-изготовитель: Германия).

Статистический анализ всех полученных данных проводился с помощью непараметрического критерия Манна - Уитни с использованием программы Statistica Base.

Результаты исследований

Исследование длины и участков окостенения бедренной и болыиеберцовой костей в условиях космического полета. На ранних этапах развития (7-10-е сутки) наблюдалось значительно более существенное отставание в развитии обеих опорных костей, чем на более поздних этапах (14-16-е сутки), что подтверждает полученные в предыдущих экспериментах данные анализа общих морфометрических характеристик (массы и размера тела). [Гурьева Т.С., 1998]

Максимальная разница для обеих костей в полетной и контрольной группах отмечена на 10-е сутки развития эмбриона (табл. 1).

Таблица 1

Длина бедренной и болыиеберцовой костей эмбрионов японского перепела в полетной и контрольной группах, мм

Возраст эмбр., Бедренная кость Большеберцовая кость

Контрольная группа Полетная группа Контрольная группа Полетная группа

сутки Медиана Квар тили Медиана Квартили Медиана Квартили Медиана Квартили

С? 25 С2 75 а 25 <3 75 0 25 <2 75 <3 25 (2 75

7-е (п = 14) 3,52 3,50 3,62 (п=11) 3,02* 2,83 3,09 (п = 14) 3,62 3,57 3,76 (п=11) 3,01* 2,87 3,04

10-е (п = 14) 6,92 6,36 6,95 (п = 13) 5,84* 5,68 5,89 (п = 14) 8,00 7,95 8,22 (п = 13) 6,56* 6,52 6,75

14-е (п = 15) 10,64 10,52 10,69 (ч = И) 10,51 10,42 10,55 (п = 15) 13,85 13,67 13,89 (п=11) 13,59 13,47 13,64

16-е (п=16) 13,60 13,38 13,75 (п = 12) 13,13 12,94 13,23 (о = 16) 17,00 16,97 17,21 (■>=12) 16,29 16,22 16,57

Примечание. Здесь и в табл. 2-5 п - количество измерений; * статистически достоверные различия между эмбрионами полетной и контрольной групп, р < 0,05.

При морфометрии скелета конечностей эмбрионов, развившихся в условиях невесомости, также отмечена задержка процесса окостенения на ранних стадиях развития (7-10-е сутки). При сравнении длины участков окостенения болыиеберцовой кости у эмбрионов полетной и контрольной групп прослеживалась закономерность, которая наблюдалась и при измерении бедренной кости — максимальная разница отмечена на 7-е и 10-е сутки (табл. 2).

Таблица 2

Длина участков окостенения бедренной и большеберцовой костей разновозрастных эмбрионов японского перепела, мм

Возраст эмбр., сутки Бедренная кость Большеберцовая кость

Контрольная группа Полетная группа Контрольная группа Полетная группа

Медиана Квартили Медиана Квартили Медиана Квартили Медиана Квартили

0 25 0 75 0 25 0 75 025 0 75 0 25 0 75

7-е (п = 14) 1,80 1,78 1,93 (п=11) 1,41* 1,33 1,45 (п = 14) 2,10 1,99 2,15 (п= 11) 1,33* 1,21 1,40

10-е (п=14) 4,31 4,19 4,52 (п = 13) 2,42* 2,33 2,64 (п = 14) 5,10 5,05 5,31 (п = 13) 3,42* 3,27 3,50

14-е (п = 15) 8,53 8,32 8,63 (п= 11) 8,18 8,07 8,37 (п = 15) 11,51 11,35 11,88 (и =11) 10,63 10,42 11,05

16-е (п=16) 12,51 12,37 12,81 (п = 12) 11,97 11,89 12.20 (п=16) 14,32 14,12 14,45 (п = 12) 13,80 16,22 16,57

Для оценки процесса окостенения была определена степень окостенения на каждом этапе развития эмбрионов, отражающая степень замещения в процессе остеогенеза костной ткани хрящевой (табл. 3).

Таблица 3

Степень окостенения бедренной и большеберцовой костей эмбрионов японского перепела, %

Возраст эмбр., сутки Бедренная кость Большеберцовая кость

Контрольная группа Полетная группа Контрольная группа Полетная группа

Медиана Квартили Медиана Квартили Медиана Квартили Медиана Квартили

0 25 0 75 0 25 0 75 0 25 0 75 025 0 75

7-е (п = 14) 51,14 3,505 3,62 (п= 11) 46,69* 2,83 3,09 (п=14) 58,01 3,57 3,76 (п = 11) 44,19* 2,87 3,04

10-е (п=14) 62,28 6,36 6,95 > 11 5,68 5,89 (п = 14) 63,75 7,95 8,22 (п = 13) 52,13* 6,52 6,75

14-е (п = 15) 80,17 10,52 10,69 (п=11) 77,83 10,42 10.55 (п=15) 83,10 13,67 13,89 (п=И) 78,22 13,47 13,64

16-е (п = 16) 91,99 13,38 13,75 (ч = 12) 91,17 12,94 13,23 (п = 16) 84,24 16,97 17,21 (п = 12) 84,71 16,22 16,57

Как видно из полученных данных, на 7-е сутки различия в степени окостенения костей эмбрионов полетной и контрольной групп составили 9 и 11,6% для бедренной и большеберцовой костей соответственно. На 10-е сутки различие было особенно заметно для бедренной кости (20,84%). Однако уже к 14-16-м суткам процент новообразовавшейся кости у эмбрионов полетной группы становился практически

--—„—----„------- .„. ,,—............ ' п

равным проценту окостеневшей кости у эмбрионов контрольной группы, хотя отставание сохранялось почти до вылупления.

Гистологические исследования костной ткани эмбрионов полетной и контрольной групп. Исследование развития костей нижних конечностей как опорно-двигательного аппарата проводилось на эмбрионах японского перепела в возрасте 4, 7, 10, 14 и 16 суток.

На препаратах 4-суточных эмбрионов обеих групп отчетливо видно, что закладка бедренной кости хрящевая. В ней можно выделить несколько зон: центральную диафизную, 2 эпифизарные и 2 зоны пролиферации. В центре диафиза хондроциты округлой формы, со светлой цитоплазмой, крупным ядром с одним ядрышком. Клетки зон пролиферации уплощены, и имеются очаги дифференциации хрящевой ткани.

К 7-м суткам эмбриогенеза в образцах костей эмбрионов полетной и контрольной групп размеры хрящевой закладки увеличены, что связано с интенсивным размножением хондроцитов и приростом массы межклеточного вещества. Хондроциты в центре диафиза набухшие, отмечена деструкция их ядер. На периферии хряща - темно-базофильно окрашенные разрушенные хондроциты (рис. 1). Вдоль диафиза хрящевой закладки формируется перихондральная костная манжета, в области которой видны остеобласты. Остеогенные клетки периоста рассредоточиваются по внутренним извилинам трабекулярных конструкций диафизарной трубки, что полностью соответствует ранее полученным данным [МажугаП.М. и соавт., 1993].

Рис. 1. Бедренная кость эмбриона японского перепела, 7-е сутки, область диафиза, ув.хЮ. Хондроциты на разных стадиях деструкции, окруженные межклеточным веществом (1).

Манжета окостенения (2)

Отличительная особенность гистологической картины развития бедренной кости у эмбрионов перепела полетной группы заключается в том. что костная манжета у эмбрионов этой группы меньших размеров, а также отмечено замедление процесса размножения хондроцитов.

Начиная с 10-х суток развития масса тела и длина зародыша резко увеличиваются, что связано с переходом эмбрионов на внешнее дыхание за счет разросшихся сосудов хориоаллантоиса. В это время отмечается усиление активности остеогенеза, в область разрушенной хрящевой ткани вросли кровеносные сосуды, а образовавшаяся полость заполнена кроветворными и остеогенными клетками. Манжета остеогенеза доходит до метафиза бедренной закладки, хрящ кальцинирован. В зоне метафиза видны фигуры митоза на разных стадиях деления (рис. 2).

Рис. 2. Большеберцовая кость эмбриона японского перепела, 10-е сутки, область диафиза, ув.хЮ. Манжета окостенения (1). Скопления остеобластов (2)

У эмбрионов полетной группы процесс остеогенеза идет с отставанием по сравнению с эмбрионами контрольной группы: уменьшены количество кроветворных элементов в лакунах, число вросших в периост кровеносных сосудов, а также область костной манжеты.

К 14-м суткам развития перихондральное окостенение, образующее внешний каркас для кости, достигает в обеих группах метафиза. В полостях разрушенного хряща остеобласты строят костные пластины (трабекулы), которые анастомозируют друг с другом, образуя лакуны, заполненные клетками крови. Разрушение хрящевого диафиза распространяется в проксимально-дистальном направлении и по его периферии. Вдоль трабекул лежат остеобласты. Много их и на внутренней поверхности глубокого слоя периоста, что свидетельствует об активном образовании костной ткани. В средней трети диафиза хрящ резорбировался сплошным фронтом, ближе к метафизам его разрушение происходит в виде продольных глубоких ниш с разделительными вертикальными остаточными хрящевыми тяжами. На их основе строятся внутренние эндостальные костные балки, а в нишах и лакунах между ними образуются очаги миелогенеза. Области метафиза и эпифизов пронизаны кровеносными сосудами, врастающими со стороны диафиза (рис. 3).

Однако следует заметить, что хрящевой стержень большеберцовых и берцовых костей у эмбрионов полетной группы разрушается меньше, чем у эмбрионов контрольной.

Рис. 3. Большеберцовая кость эмбриона японского перепела, 14-е сутки, метафиз, ув.хЮ. Группы остеобластов (1), ниши окостенения (2). Процесс перихондрального окостенения

достиг метафиза (3)

К 16-м суткам у эмбрионов обеих групп перихондральное окостенение находится в

15

завершающей стадии и доходит до эпифиза. В области метафиза длинных костей создается высокая концентрация мономорфных клеток, которые являются ростовым резервом, сохраняющимся до вылупления и первую неделю после вылупления. Отмечена инвазия кровеносных сосудов в хрящевой эпифиз и со свободных его поверхностей, а также из диафизарной полости через толщу метафиза. По ходу этих проникающих сквозь метафиз сосудистых каналов в дальнейшем происходит распространение диафизарной резорбции на хрящевой эпифиз и последовательное замещение его костными структурами. В отличие от эмбрионов контрольной группы у эмбрионов полетной отсутствуют очаги остеогенеза в эпифизах длинных костей, что говорит об отставании процесса кальцификации хондроцитов этих участков, процесс окостенения у эмбрионов полетной группы отстает от такового у эмбрионов контрольной (рис. 4).

Контрольная группа

Полетная группа

Рис. 4. Большеберцовая кость эмбриона японского перепела, 16-е сутки, эпнфиз. ув.хЮ.

Скопление остеобластов вдоль костных пластин (1).

Внутренне окостенение в контрольной группе дошло до эпифиза (2)

Таким образом, отмечено снижение активности остеокластов, а следовательно, и скорости замещения хрящевой ткани костной у эмбрионов полетной группы по сравнению с эмбрионами контрольной, особенно на ранних стадиях развития, что обусловлено замедлением процесса минерализации хрящевой ткани.

Определение зольности и содержания кальция в скорлупе перепелиных яиц. Для

подтверждения отставания процесса потребления эмбрионами минеральных веществ из скорлупы яиц в невесомости и, следовательно, процесса окостенения на ранних стадиях в исследованных костях были определены зольность и содержание кальция в скорлупе перепелиных яиц. На рис. 5 представлены средние значения зольности в исследуемых пробах.

Максимальная разница в зольности скорлупы между группами отмечена на 10-е и 14-е сутки (12,95 и 16,71%, соответственно). Однако к моменту вылупления птенцов, на 16-е сутки эмбриогенеза, различие между зольностью скорлупы яиц в полетном и контрольном экспериментах было минимальным и равнялось всего 4.69%.

I Полетная группа

I Контрольная группа

4 7 10 14 16

Возраст эмбрионов, сутки

Рис. 5. Зольность скорлупы яиц японского перепела полетной и контрольной групп, % на массу сухого вещества.

*статистически достоверные различия между полетной и контрольной группами, р < 0,05

Таким образом, эти результаты подтверждают ранее полученные данные, что остеогенез у эмбрионов полетной группы шел с отставанием на ранних стадиях развития. Также в полетной группе процесс потребления минеральных веществ на

ранних стадиях был менее активным: с 4-е по 14-е сутки зольность уменьшилась всего на 2,19%. За аналогичный период (с 4-х по 14-е сутки) в контрольной группе (т.е. в норме) снижение зольности произошло на 8,6%. Это говорит о том, что на ранних этапах развития в невесомости имело место торможение остеогенеза в связи с измененными гравитационными условиями и подтверждает ранее полученные в гистологических исследованиях данные.

Кроме оценки зольности скорлупы яиц японского перепела также проводилось измерение содержания кальция в золе (табл. 4).

Таблица 4

Содержание кальция в золе скорлупы яиц японского перепела, мг на 100 мгзолы

Возраст эмбрионов, сутки Контрольная группа Полетная группа

Медиана Квартили Медиана Квартили

(225 0 75 <225 <2 75

4-е 29,01* (п=12) 28,79 29,47 37,95 (п=10) 37,62 38,52

7-е 28,16* (п=10) 27,93 28,25 29,86 (п=13) 29,79 30,12

10-е 27,52 (п=11) 27,36 27,57 27,78 (п=11) 27,61 28,03

14-е 25,75 (п=10) 25,59 25,78 26,01 (п=12) 25,91 26,22

16-е 24,37 (п=12) 24,16 24,44 25,01 (п=12) 24,74 25,13

Из данных табл. 4 видно, что максимальная разница в содержании кальция в скорлупе яиц полетного и контрольного экспериментов была отмечена на 4-е сутки эмбриогенеза и составляла 8,94 мг. Однако к 14-м суткам эмбриогенеза содержание кальция в золе скорлупы яиц из полетного эксперимента было практически равно содержанию кальция в золе скорлупы яиц из контрольного эксперимента. Эти данные говорят о том, что процесс потребления кальция эмбрионами из скорлупы яиц в условиях космического полета отставал только на начальных этапах развития.

Определение кальция в костях нижних конечностей эмбрионов японского перепела. Кроме оценки зольности и содержания кальция в скорлупе также были проведены исследования химического состава костей нижних конечностей эмбрионов японского перепела и, в частности, содержания кальция в большеберцовой кости. В табл. 5 представлено содержание кальция в костях нижних конечностей разновозрастных эмбрионов японского перепела полетной и контрольной групп.

Таблица 5

Содержание кальция в костях нижних конечностей разновозрастных эмбрионов японского

перепела, мг на 100 мг

Возраст Контрольная группа Полетная группа

эмбрионов, Медиана Квартили Медиана Квартили

сутки С? 25 С? 75 0 25 (3 75

7-е 37,42* (п=13) 37,10 37,99 33,25 (п=14) 33,09 33,29

10-е 55,94 (п=13) 55,78 56,31 55,74 (п=11) 55,35 56,36

14-е 63,56* (п=15) 63,49 63,78 60,47 (11=13) 59,51 60,50

16-е 68,89 (п=14) 68,63 69,23 67,85 (п=14) 67,84 68,73

Исследования показали, что у 7-суточных эмбрионов полетной группы содержание кальция в опорной кости нижних конечностей было меньше на 4,17%, чем у эмбрионов контрольной группы, что является максимальным различием между группами среди всех выбранных возрастов. Уже на 10-е сутки разница между группами составила 0,2%, на 14-е сутки она возросла до 3%, однако к 16-м суткам снова сократилась до 1%.

Таким образом, результаты проведенных исследований выявили закономерность, согласно которой наибольшее отставание полетной группы от контрольной по большинству оцениваемых параметров отмечалось на ранних стадиях развития (с 4-х по 10-е сутки). В то же время внутренне гистологическое развитие обеих костей в полетной группе отставало от контрольной на всех этапах развития, что доказывает в целом негативное влияние невесомости на развивающуюся костную ткань. При этом на более поздних стадиях развития, предшествующих вылуплению, все морфометрические параметры, такие как длины обеих костей, длины участков их окостенения, величина зольности скорлупы, а также количество кальция в костях и скорлупе в полетной группе практически не отличались от аналогичных параметров в контрольной группе, что говорит о частичной адаптации костной ткани в невесомости в процессе развития.

Обсуждение

Гетеротрофное звено является не только одним из самых важных звеньев БСЖО, но и самым затратным. Оценка способности организмов, составляющих основу гетеротрофного звена, размножаться в течение космического полета является критичной для поддержания численности популяции, необходимой для стабильности экосистемы. При

этом исследование эмбриогенеза животных в космическом полете является необходимым этапом для понимания и создания полноценной БСЖО [Сычев В.Н., 2000]. В данном эксперименте проводилась оценка состояния и развития костной ткани опорных костей нижних конечностей (бедренной и большеберцовой), а также потребления минеральных веществ в полетных условиях у эмбрионов японского перепела, прошедших весь эмбриональный цикл развития в невесомости.

Важно отметить, что впервые было доказано, что невесомость не является препятствием для нормального эмбрионального развития костной ткани. Как бедренная, так и большеберцовая кости развивались, проходя в невесомости те же этапы, что и в нормальных гравитационных условиях.

Полученные данные исследования гистогенеза костной ткани, длин бедренной и большеберцовой костей, участков окостенения, содержания зольности и кальция в скорлупе яиц, а также кальция в костях, полученных от разновозрастных эмбрионов японского перепела, выявили отставание эмбрионов полетной группы от эмбрионов контрольной на всех этапах развития. Однако наибольшее различие между группами по большинству оцениваемых параметров было отмечено на ранних стадиях развития. Для нормального течения процесса эмбрионального развития, а следовательно, и развития костной системы необходимо сочетание факторов, таких как температура, влажность, режим вентиляции. В обеих группах создавались аналогичные условия. Единственное различие, которое было между полетной и контрольной группами - гравитационные условия.

Известно, что в норме окостенение у птиц проходит ряд стадий:

1) образование перихондральной кости путем откладывания надхрящницей слоя кости на поверхности хряща;

2) разрушение сердцевины хряща путем размягчения хрящевой основы (матрик-са) до слизистого состояния;

3) кальцификация хряща путем откладывания извести в межклеточные пространства, после чего хрящевые клетки удаляются специальными клетками - разрушителями хряща;

4) внутрихрящевое окостенение путем откладывания кости остеобластами внутри костного мозга на внутреннюю поверхность перихондральной кости [Ниоэе 5. е1 а1., 2007; ВзввеИ-Ш. е1 а1„ 2010].

В костях нижних конечностей куриного эмбриона в норме вторая стадия (разрушение сердцевины хряща) начинается на 10-е сутки развития. В соответствии с данными литературы и проводимыми ранее исследованиями можно экстраполировать это на перепелиные эмбрионы и оценить их возраст как 7-8-е сутки развития [Binder B.J. et al., 2008].

Согласно данным литературы на 7-е сутки эмбрионального развития перепела в норме начинается быстрый рост всех органов, в том числе и костей [Гудин В.А., 2010]. В костной ткани происходит активное размягчение сердцевины хряща. Хондроциты гипертрофируются, создается критическая сила (по Эйлеру), которая приводит к локальному перенапряжению перихондрального футляра. На 10-е сутки развития эмбрион переходит на внешнее дыхание за счет разрастающихся сосудов хориоаллантоиса. Начинается активная инвазия кровеносных капилляров. Благодаря этому процессу глубокий слой перихондра перестраивается на функцию остеогенеза и таким образом стимулирует сооружение жесткой перихондральной муфты, которая противодействует возрастающему напряжению изнутри. Кальцификация хрящевого матрикса полностью изолирует хондроциты, что усиливает их деструкцию, поскольку приток питательных веществ в таких условиях затруднен. Процесс разрушения хряща провоцирует распространение кальцификации соседних, еще не тронутых участков хрящевого матрикса, стимулируя таким образом распространение процесса окостенения от центральной части диафиза к концам кости.

На данном этапе требуется активное потребление кальция и минеральных веществ, необходимых для нормального процесса кальцификации хрящевого матрикса, а следовательно, распространения процесса резорбции хряща и остеогенеза [Мажуга П.М., 1993]. Кроме того, на ранних стадиях развития (до 10-х суток) происходит активный органогенез и увеличение в размерах всех органов, что также провоцирует активное потребление минеральных веществ и, в частности, кальция, которое и было отмечено в контрольной группе при анализе зольности скорлупы. Так, например, в контрольной группе с 4-х по 14-е сутки зольность уменьшилась на 8,6%, в то время как процесс потребления минеральных веществ эмбрионами японского перепела в полетной группе за аналогичный период был менее активным: снижение зольности было всего на 2,19%.

Минеральные вещества, и в особенности кальций, которые потребляются из скорлупы в процессе эмбриогенеза, расходуются на построение скелета. Поскольку на ран-

них стадиях потребление минеральных веществ разновозрастных эмбрионов японского перепела, отраженное в величине зольности, было замедленным в полетной группе, это закономерно повлекло и существенные различия на ранних стадиях в содержании кальция в костях и скорлупе. В конечном счете это отразилось на длине обоих опорных костей, бедренной и большеберцовой, и длине их участков окостенения.

В соответствии с данными литературы, полученными в проводимых ранее исследованиях, было отмечено явное отставание в развитии капиллярной сети хориоаллан-тоиса эмбрионов, развившихся в невесомости. Количество сосудов на единицу площади было меньше, ветвление хуже, в отдельных случаях наблюдалась незамкнутость кровеносной системы желточной оболочки яйца на 10-е сутки. Таким образом, инвазия кровеносных капилляров и все последующие процессы в хрящевом матриксе эмбрионов полетной группы шли с отставанием, что проявилось в отставании процесса окостенения и роста кости на ранних этапах (7-е, 10-е сутки) [Гурьева Т.С. с соавт., 1998].

Недостаточное развитие кровеносной системы хориоаллантоиса также привело и к ухудшению транспорта минеральных компонентов из скорлупы с кровью к органам, что подтверждают данные, полученные при анализе зольности скорлупы разновозрастных эмбрионов японского перепела, содержания кальция в скорлупе и большеберцовой кости.

Согласно данным литературы баланс кальция в организме регулируется гормонами щитовидной и паращитовидной желез: кальцитонином и паратгормоном. [Porter G.A., 1997; Adler С.Р. 2000; Li X., 2007] В результате проведенных ранее экспериментов было выявлено существенное отставание в развитии этих желез у эмбрионов полетной группы на ранних стадиях развития [Гурьева Т.С. с соавт., 1998]. Недоразвитость щитовидной железы вызвала недостаток в организме гормона, регулирующего баланс кальция, а следовательно, и нарушение нормального течения метаболизма кальция в организме [Marks S.C. et al., 1988; Leblond С.Р. et al., 1989].

Результаты исследования зольности скорлупы яиц и содержания кальция в нижних конечностях выявили еще одну закономерность. Кроме очевидного различия между полетной и контрольной группами на ранних стадиях - 7-е, 10-е сутки, отмечается еще один пик, когда разница между полетной и контрольной группами максимальна - 14-е сутки. Это объясняется тем, что у эмбрионов этого возраста происходит ороговение чешуек ног и когтей, что вызывает повышение потребления минеральных веществ из

скорлупы [Sato К. et al., 1971; Габузов C.O., 2003; Гудин В.А., 2010], которое в условиях невесомости затруднено.

Явное отставание эмбрионов полетной группы от эмбрионов контрольной по длине костей, участков окостенения, а также зольности, содержанию кальция в костях и скорлупе подтверждают и гистологические исследования, однако, в отличие от зольности, длины кости и участка окостенения, а также содержания кальция в костях и в золе скорлупы, различия в гистологической картине развивающейся костной ткани эмбрионов полетной и контрольной групп отмечались на всех стадиях развития, вплоть до 16-х суток. В норме периферическая резорбция хрящевого стержня следует почти одновременно с ростом в длину костной диафизарной трубки (что подтверждают практически полностью совпадающие данные по длинам костей и участков окостенения) и немного опережает резорбцию осевой части стержня. Кроме обозначенных выше причин (недоразвитость кровеносной системы, щитовидной и паращитовидной желез), ускорение темпов увеличения длины участков окостенения и длины костей подопытных эмбрионов японского перепела подтверждают известную теорию, что рост и дифференцировка обладают свойством эквифинальности, подтвержденную данными общего морфогенеза [Sellier N. et al., 2006; Ruffins S.W., 2007]. В данном случае она выражается в том, что все биологические процессы в развивающемся эмбрионе перестраиваются таким образом, чтобы несмотря на измененные гравитационные условия к моменту вылупления все физиологические параметры птенца (длины костей, участков окостенения) соответствовали типичным видовым размерам. При этом, если внешний каркас кости успевает до 16-х суток дорасти до видовых размеров, то внутреннее строение кости явно отстает.

Следует отметить, что в норме у перепелов формирование скелета продолжается в течение некоторого времени после вылупления вплоть до репродуктивной зрелости. В области метафиза на поздних стадиях эмбриогенеза создается большая концентрация клеток с высоким митотическим индексом, которые представляют своего рода ростовой клеточный резерв, сохраняющийся до вылупления и в первое время после вылупления, таким образом обеспечивающий рост кости. Проведенные исследования на уже взрослых, вылупившихся в невесомости перепелах, показали, что даже несмотря на отставание во внутреннем развитии костной ткани в момент вылупления (17-е сутки), через несколько суток они нагоняли перепелов контрольной группы, а в отдельных случаях дли-

на костей эмбрионов полетной группы была даже немногим больше, чем у эмбрионов контрольной [Дадашева O.A. с соавт., 1993].

Полученные в результате экспериментов данные согласуются с проводимыми ранее исследованиями эмбриогенеза животных, в результате которых было выявлено отставание развития эмбрионов крыс полетной группы от лабораторного контроля. [Alberts J.R., 1985] Однако также было отмечено, что различия по таким показателям, как масса и длина тела, длина костей и участков окостенения между двумя группами новорожденных крысят были небольшими (в пределах 10%) и довольно быстро нивелировались. По некоторым параметрам (например, по длинам участков окостенения) крысята полетной группы даже опережали крысят группы лабораторного контроля. Это подтверждает теорию о том, что невесомость не является запретом для развития организма [Alberts et al., 1986; Серова с соавт., 1988; Оганов B.C., 2003].

Несмотря на то, что в данном эксперименте в полетной группе отмечалось большее количество аномалий развития, ранее было доказано, что причиной отставания развития, а также аномалий и повышенной смертности в полете не является невесомость как таковая. Среди возможных причин указываются вибрация и перегрузки, возникающие на этапе выхода корабля на орбиту, возникновение неравномерностей в температурном поле, галактическое излучение или общее радиационное воздействие и др. [Сычев В.Н., 2000]. При этом отставание в развитии костной системы после вылупления довольно быстро нивелируется, но отсутствие вектора гравитации приводило к полной дезориентации птенца, что не позволяло ему сохранить врожденные инстинкты, например, клевание корма [Сычев В.Н., 2000]. Частично решить проблему удалось благодаря плотной фиксации птенцов в пространстве (в лотке инкубатора или в руке космонавта). Одним из возможных решений проблемы адаптации нововылупленных птенцов японского перепела к невесомости является проведение экспериментов с созданием искусственной гравитации во время инкубирования при помощи центрифугировании, которая позволит включить японских перепелов как гетеротрофное звено в БСЖО.

выводы

1. Исследование длины бедренной и болынеберцовой костей у эмбрионов японского перепела показало, что на ранних стадиях (7-е, 10-е сутки) наблюдалось значительно большее отставание в развитии костной ткани, чем на поздних (14-е, 16-е сутки). Максимальное различие было выявлено на 10-е сутки. Длина бедренной и болынеберцовой костей эмбрионов полетной группы была соответственно на 15,60 % и 18,00 % короче по сравнению с длиной этих костей в контрольной группе. К моменту вылупления длина костей полетной группы была короче всего на 3,46 % для бедренной и 4,20% для большеберцовой, чем в контрольной группе.

2. Анализ длин участков окостенения выявил аналогичную тенденцию: максимальное различие между длинами участков окостенения костей полетной и контрольной групп для обеих костей отмечалось на 10-е сутки (на 43,85% короче в полетной группе - для бедренной и на 32,94% - для большеберцовой), в то время как к моменту вылупления кости нижних конечностей птенцов, развившихся в невесомости, практически не отличались от таковых у птенцов контрольной группы (длина костей в полетной группе была меньше, чем в контрольной, всего на 4,32% для бедренной кости, 3,63% - для большеберцовой).

3. Гистологические исследования развития костной и хрящевой тканей выявили отставание в развитии костной ткани на всех этапах эмбриогенеза вплоть до вылупления.

4. Исследования содержания кальция в скорлупе яиц японского перепела свидетельствуют о том, что наибольшее различие между полетной и контрольной группами наблюдалось на ранних стадиях развития (4-е, 7-е сутки). Количество кальция в скорлупе полетной группы было на 23,56% (4-е сутки) и 5,69% (7-е сутки) больше, чем в скорлупе яиц контрольной группы. Это доказывает, что потребление кальция из скорлупы эмбрионами в условиях невесомости происходит медленнее, чем в условиях земной гравитации.

5. Исследование зольности скорлупы японского перепела выявило замедленное потребление минеральных веществ из скорлупы в полетной группе в отличие от контрольной на всех этапах эмбрионального развития, при этом максимальное различие отмечено на 10-е и 14-е сутки и составляет 22,61% и 29,26% соответственно.

6. Исследование содержания кальция в костях нижних конечностей выявило, что наибольшее отставание по этому параметру полетной группы от контрольной отмечается на 7-е сутки и составляет 11,14%.

ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Гурьева Т.С., Дадашева O.A., Солдатов П.Э., Носовский A.M., Савина Н.В., Медникова Е.И., Смоленская Т.С., Комиссарова Д.В. Влияние гипероксической газовой среды на эмбриональное развитие японского перепела // Материалы XXXIII академических чтений по космонавтике. - М., 2009. - С. 558, 559.

2. Комиссарова Д.В., Гурьева Т.С., Сычев В.Н. Динамика потребления кальция для костеобразования в период эмбрионального развития японского перепела в условиях невесомости // Материалы XXXIV академических чтений по космонавтике. - М., 2010. -С. 584-586.

3. Комиссарова Д.В. Динамика использования кальция для построения скелета эмбрионами японского перепела в условиях невесомости // Материалы X Конференции молодых ученых, специалистов и студентов, посвященной 50-летию по дня первого полета человека в космос. - М., 2011. - С. 36-37.

4. Комиссарова Д.В., Гурьева Т.С., Дадашева O.A., Сычев В.Н. Динамика развития костной ткани у эмбрионов японского перепела, прошедших полный эмбриональный период в условиях невесомости// Материалы XXXV академических чтений по космонавтике. - М., 2011. - С. 599-600.

5. Комиссарова Д.В., Гурьева Т.С., Сычев В.Н. Динамика использования кальция для построения скелета эмбрионами японского перепела в условиях невесомости // Авиакосм, и эколог, мед. -2011. - Т. 45. - №5. - С. 52-54.

6. Комиссарова Д.В. Гистогенез костной и хрящевой ткани эмбрионов японского перепела в условиях невесомости на ранних стадиях развития// Материалы XI Конференции молодых ученых, специалистов и студентов, посвященной дню космонавтики. - М., 2012. - С. 24-25.

7. Комиссарова Д.В., Гурьева Т.С., Дадашева O.A., Сычев В.Н. Гистогенез костной и хрящевой ткани эмбрионов японского перепела в условиях невесомости на ранних стадиях развития // Авиакосм, и эколог, мед. - 2012. - Т. 46. - №5. - С. 64-67.

8. Комиссарова Д.В., Гурьева Т.С., Дадашева O.A., Сычев В.Н. Общая характеристика эмбриогенеза хрящевой и костной ткани у эмбрионов японского перепела в невесомости // Авиакосм, и эколог, мед. - 2013. - Т. 47. -№4. - С. 77, 78.

9. Дадашева O.A., Гурьева Т.С., Сычев В.Н., Медникова Е.И., Филатова A.B., Комиссарова Д.В. Особенности развития спинного мозга у эмбрионов и птенцов японского перепела в условиях космического полета // Авиакосм, и эколог, мед. - 2013. -Т. 48.-№5.-С. 3-6.

10. Дадашева O.A., Гурьева Т.С., Комиссарова Д.В., Медникова Е.И. Особенности развития костной системы у птенцов, развившихся и проживших в условиях невесомости // Материалы XXXVII академических чтений по космонавтике. - М., 2013. -С. 599-600.

11. Комиссарова Д.В. Гистогенез костной и хрящевой ткани эмбрионов японского перепела в условиях невесомости на завершающих стадиях эмбрионального развития // Материалы XII Конференции молодых ученых, специалистов и студентов, посвященной 50-летию ГНЦ РФ-ИМБП РАН. - М„ 2012

12. Комиссарова Д.В., Дадашева O.A., Гурьева Т.С., Сычев В.Н. Гистогенез костной и хрящевой ткани эмбрионов японского перепела в условиях невесомости на завершающих стадиях развития // Авиакосм, и эколог, мед. - 2013. - Т. 49 - №6. - С. 24— 28.

Подписано в печать:

29.04.2015

Заказ № 10743 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru