Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Гипотензивное действие 3-(3-[1,2,4-триазоло])-оксатриазолиум-5-олата: физиологический и биохимический анализ в экспериментах на крысах

На правах рукописи

Артемьева Марина Михайловна

ГИПОТЕНЗИВНОЕ ДЕЙСТВИЕ 3-(3- [ 1,2,4-ТРИАЗО Л О] )-ОКС АТРИ АЗО ЛИУ М-5-0 Л АТ А: ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЙ И БИОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ В ЭКСПЕРИМЕНТАХ НА КРЫСАХ

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология 03.03.01 - физиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

004615408

- 2 ДЕК 2010

Москва - 2010

004615408

Работа выполнена на факультете фундаментальной медицины и на биологическом факультете Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Научные руководители: Доктор медицинских наук,

профессор Медведев Олег Стефанович

Доктор биологических наук,

профессор Медведева Наталия Александровна

Официальные оппоненты: Доктор медицинских наук,

профессор Мирзоян Рубен Симонович

Доктор биологических наук,

профессор Кошелев Владимир Борисович

Ведущая организация: ГОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М.Сеченова Минздравсоцразвития России.

О

Защита диссертации состоится « »д £кси?|>£р 10 года в_часов на заседании

диссертационного совета Д 001.024.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН (НИИ фармакологии имени В.В.Закусова РАМН) по адресу! 125315 Москва, ул. Балтийская, д.8.

С диссертацией можно ознакомиться в Ученой части НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН.

Автореферат разослан « » ^ 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор Е.А.Вальдман

Актуальность темы. Оксид азота (N0) является одним из основных эндогенных сосудорасширительных факторов, регулирующих деятельность сердечно-сосудистой системы. Постоянный синтез N0 из L-аргинина обеспечивается каталитической активностью эндотелиальной формы NO-синтазы. N0 свободно диффундирует к гладкомышечным клеткам сосудов, где он активирует образование циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ) и вызывает реакцию эндотелий-зависимого расслабления (ЭЗР) (Lincoln et al., 1989, Hofmann et al., 2000).

Дисфункция NO-цГМФ-зависимого механизма расслабления сосудов, выражающаяся в уменьшении ЭЗР, является одним из механизмов патогенеза таких заболеваний, как эссенциальная и лёгочная гипертензия, сердечная недостаточность, ишемическая болезнь сердца и др. (Schiffrin et al., 2000, Park et al., 2001, Endemann et al., 2004, Monnink et al., 2002, Landmesser et al., 2001). Исследование регуляции центрального звена NO-цГМФ пути - активации гладкомышечного фермента растворимой гуанилатциклазы (рГЦ), - важно не только для фундаментального понимания механизмов расслабления гладких мышц сосудов, но и для клинической практики. Наиболее известный и широко применяемый способ снижения артериального давления (АД) путем модуляции активности рГЦ заключается в применении препаратов, способных генерировать NO, получивших название доноров NO (Wang P.G. et al., 2002). Такой способ активации рГЦ приводит к быстрому нарастанию концентрации цГМФ в гладкомышечных клетках сосудов на короткое время (действие большинства NO-доноров ограничивается несколькими минутами). В связи с этим NO-доноры используются в основном в тех случаях, когда необходимо быстро понизить АД на значительную величину. Однако при повторяющемся приеме NO-доноров наблюдается десенситизация NO-цГМФ-зависимого пути (Moncada et al., 1991, Waldman et al., 1986), что делает их неэффективными при хроническом применении. Таким образом, поиск препаратов, способных активировать рГЦ на длительный период, является одним из перспективных направлений в физиологии и фармакологии сердечно-сосудистой системы.

В 1966 году впервые появились данные о возможности регуляции АД производными оксатриазола (Kier LB et al., 1966). Механизм действия соединений этого класса оставался неизвестным.

В связи с вышеизложенным целью настоящего исследования явился анализ механизма гипотензивного действия одного из производных оксатриазола - 3-(3-[1,2,4]-триазоло)-оксатриазолиума-5-олата (далее азасиднона-6, АС-6) на АД в экспериментах на крысах.

Задачи исследования.

1. Произвести анализ величины и длительности эффектов АС-6 при внутривенном введении на среднюю величину системного артериального давления (САД) и частоту сердечных сокращений (ЧСС), а также барорефлекторную регуляцию САД у бодрствующих нормотензивных крыс линии Wistar и гипертензивных крыс линии SHR.

2. Изучить влияние хронического (21 день) введения АС-6 per os на динамику систолического АД (систАД), барорефлекторную регуляцию САД у бодрствующих гипертензивных крыс линии SHR и гипертрофию левого желудочка сердца.

3. Исследовать действие АС-6 при хроническом (21 день) введении препарата per os на реактивность изолированных перфузируемых сегментов хвостовых артерий крыс линии SHR.

4. Провести биохимический анализ механизма действия АС-6 и оценить способность АС-6 генерировать N0 в условиях in vitro.

Научная новизна работы

В настоящей работе впервые был выявлен длительный гипотензивный эффект АС-6 в острых опытах на крысах. Показано, что гипотензивное действие вещества не зависит от исходного уровня АД. При хроническом применении в течение 21 дня АС-6 вызывает уменьшение систолического АД (систАД) у гипертензивных крыс линии SHR. При этом развития толерантности к исследуемому препарату выявлено не было.

В экспериментах на изолированных сосудах было показано, что АС-6 расслабляет сегменты хвостовых артерий крыс линии SHR и данная сосудорасширительная реакция блокируется гем-зависимым ингибитором рГЦ ODQ (1Н-[1,2,4]оксадиазоло[4,3-а]хиноксалин-1-она). Таким образом, показана возможность реализации гипотензивной реакции АС-6 через регуляцию тонуса периферических сосудов, а также в условиях in vivo показано, что действие АС-6 зависит от состояния гема фермента рГЦ.

В серии биохимических экспериментов методом иммуноферментного анализа исследована способность 3-(3-[1,2,4]-триазоло)-оксатриазолиум-5-олата стимулировать синтез цГМФ с использованием как очищенного фермента рГЦ из легких свиньи, так и

рГЦ тканей аорты крыс линии Wistar. Как и в условиях физиологического эксперимента, активация рГЦ in vitro уменьшается в присутствии ингибитора рГЦ ODQ. Кроме этого в условиях in vitro показано, что 3-(3-[1,2,4]-триазоло)-оксатриазолиум-5-олат не способен выделять значительные количества N0 и не является NO-донором. То есть 3-(3-[1,2,4]-триазоло)-оксатриазолиум-5-олат активирует рГЦ гем-зависимо NO-независимо.

Научно-практическая значимость работы

Полученные экспериментальные данные расширяют список гипотензивных веществ-активаторов рГЦ. Согласно полученным результатам, 3-(3-[1,2,4]-триазоло)-оксатриазолиум-5-олат активирует рГЦ гем-зависимо NO-независимо и, в отличие от доноров N0, вызывает снижение артериального давления в течение длительного времени и к нему не развивается толерантность, что делает возможным его применение в качестве гипотензивного препарата для лечения гипертонии и других заболеваний. Данные, полученные автором в ходе выполнения диссертационного исследования, защищены патентом №2351328.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Азасиднон-6 вызывает длительный гипотензивный эффект при внутривенном и внутрижелудочном введении у крыс. Гипотензивный эффект азасиднона-6 в одинаковой степени выражен у крыс с исходно разным уровнем АД.

2. Гипотензивный эффект азасиднона-б связан с активацией фермента рГЦ гладкомышечных клеток сосудов.

3. Действие азасиднона-6 на рГЦ гем-зависимо NO-независимо.

Личный вклад автора

Автор работы является основным исполнителем проведенного исследования на всех этапах: анализа данных литературы по теме диссертационной работы, проведения экспериментальной части исследования и анализа полученных данных.

Публикации: основные положения диссертационной работы нашли отражение в семи опубликованных в печати научных работах: 2 статьях, опубликованных в журналах, входящих в список, рекомендованных ВАК РФ, и 5 тезисах, опубликованных в материалах российских и международных конференций. Результаты работы доложены на 21-ой ежегодной конференции Американского общества по изучению гипертензии, (США, Нью-Йорк, 2005); на IV Всероссийской школе-конференции по физиологии с

международным участием (31 января-3 февраля, Россия, Москва, 2007); IV Всероссийской конференции «Механизмы функционирования висцеральных систем» (4-6 октября, Санкт-Петербург, 2005); на 2-ой международной конференции по стимуляторам синтеза цГМФ, эффекторам цГМФ и их терапевтическому применению (Германия, Потсдам, 2005); на 5-ой международной конференции по фармакологии, биофармакологии и фармтехнологии (Швейцария, Женева, 2006); на заседаниях кафедры фармакологии факультета фундаментальной медицины МГУ.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, описания результатов, обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы (155 источников, в том числе 10 отечественных и 145 зарубежных) и приложения, иллюстрирована 46 рисунками и 77 таблицами.

Материалы и методы исследования

Животные. Исследования проводились в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (1977) на самцах крыс линий Wistar (п=72), полученных из вивария НИИ Общей патологии и патофизиологии (г. Москва) и вивария Института медико-биологических проблем РАН (г. Москва) и крысах линии SHR (spontaneously hypertensive rats, п=41), полученных из питомника филиала ИБХ в г. Пущино (Московская обл., Россия), весом 250-350 г.). Животных содержали в стандартных условиях, согласно требованиям европейской ассоциации FELASA-ICLAS [Guide for the care and use of laboratory animals, 1996]. Препарат азасиднон-б был синтезирован и предоставлен нам сотрудниками лаборатории ароматических азотосодержащих соединений Института органической химии им. Н.В. Зелинского РАН под руководством профессора С.А.Шевелева.

1. Изучение параметров гемодинамики у бодрствующих животных. Для введения веществ и измерения артериального давления (АД) и частоты сердечных сокращений (ЧСС) за сутки до эксперимента крысам под тиопенталовым наркозом (40 мг/кг, 20 мг/мл, внутрибрюшинно) в брюшную аорту и нижнюю полую вену имплантировали пластиковые катетеры через бедренную артерию и вену (Мурашев А.Н. и др., 1992). Бодрствующее животное подключали к экспериментальной установке, состоящей из датчика давления Statham (США) и аналого-цифрового преобразователя. Оцифрованный с частотой 512 Гц сигнал анализировали с помощью модифицированной

программы Bioshel (Кундузова O.P., Мурашев А.H. с соавт., 1997). Для изучения дозозависимого эффекта АС-б животным линии Wistar через венозный катетер с промежутком в 30 минут последовательно вводили АС-6 в возрастающих дозах 0,011 мкг/кг, 0,11 мкг/кг, 1,1 мкг/кг, 11 мкг/кг и 110 мкг/кг (группа Wistar-опыт, п=5) и соответствующие объёмы (15-20 мкл) растворителя дистиллированной воды контрольным животным (Wistar-контроль, п=6). Для сравнения эффектов внутривенного введения АС-6 на САД у крыс с разным исходным уровнем АД и возможного влияния на величину барорефлекса нормотензивным крысам линии Wistar и гипертензивным крысам линии SHR через вживленный артериальный катетер измеряли САД и ЧСС в покое. Далее производили тестирование барорефлекса в ответ на введение гипотензивного агента донора NO нитропруссида натрия (НП, 3 мкг/кг) и гипертензивного агента cii-адреномиметика фенилэфрина (ФЭ, 2 мкг/кг). После этого крысам опытных групп (Wistar-опыт, п=5 и SHR-опыт, п=5) последовательно через венозный катетер вводили растворы АС-6 в дозах 110 мкг/кг и 550 мкг/кг. Вторую дозу АС-6 вводили на максимуме действия первой дозы. На фоне действия АС-6 в дозе 550 мкг/кг производили повторное тестирование барорефлекса. Оценка эффективности барорефлекторной регуляции АД производилась по коэффициенту барорефлекса, который вычисляли как отношение максимального изменения ЧСС (ДЧСС) в ответ на введение НП или ФЭ к максимальному изменению САД (ДСАД). Контрольным животным (группы Wistar-контроль, п=5, и SHR-контроль, п=5) вместо АС-6 вводили растворитель (дистиллированную воду) в соответствующем объёме.

2. Изучение влияния хронического применения АС-6 на состояние сердечнососудистой системы крыс. Крысам линии SHR вводили АС-6 через желудочный зонд в течение 21 дня в дозе 5 мг/кг в объеме 1 мл два раза в день (группа SHR-опыт, п=18). Группа SHR-контроль (п=13) на протяжении 21 дня дважды в день получала растворитель - дистиллированную воду, в том же объеме через зонд. В течение всего курса введения АС-6 производился мониторинг систАД плетизмографическим методом. На 22 день эксперимента животным для изучения параметров гемодинамики вживляли пластиковые катетеры как описано выше (Мурашев А.Н и др., 1992). На следующий день бодрствующих животных подключали к экспериментальной установке и в течение 2030 мин регистрировали САД и ЧСС в покое. Затем проводили физиологический эксперимент по следующему протоколу: через венозный катетер вводили НП в дозе

1,5 мкг/кг для тестирования барорефлекторной функции сердечно-сосудистой системы, а также для изучения возможности возникновения толерантности к донорам N0. Далее для изучения возникновения толерантности к самому препарату крысам вводили внутривенно АС-6 в дозе 110 мкг/кг.

3. Эксперименты на изолированных сосудах. Для исследования влияния хронического введения АС-6 на реактивность изолированных сегментов периферических сосудов при проточной перфузии крыс линии SHR опытной (SHR-опыт, крысы в течение 21 дня получавшие АС-6 в дозе 5 мг/кг дважды в день через желудочный зонд) и контрольной групп (SHR-контроль, крысы в течение 21 дня получавшие растворитель дистиллированную воду дважды в день через желудочный зонд) декапитировали и выделяли у них сегмент вентральной хвостовой артерии (arteria caudalis ventralis) длиной 3-4 мм. Проксимальный конец сосуда закрепляли на стальной игле, дистальный конец сосуда присоединяли к пластиковому катетеру. Сосуды перфузировали с постоянным расходом, который составлял 2 мл/мин для внутреннего протока и 4 мл/мин для внешнего протока в термостатируемой камере объёмом 10 мл. Для перфузии использовали модифицированный физиологический раствор Кребса-Хенсляйта (содержание веществ в мМ: NaCl - 118, KCl - 4.7, СаС12 - 3.3, MgS04 - 2.4, KH2P04 - 1.18, глюкоза - 5.05, NaHC03 - 24.9; рН 7.4), раствор аэрировали карбогеном (5% С02, 95% 02) в течение 20-30 минут перед опытом; температуру раствора поддерживали на уровне 37,5°С (Nesterova М.А., Chuiko А.А., et al., 1999). О реакции сосуда судили по изменению перфузионного давления, измеренного с помощью тензодатчика (Statham, США) и АЦП. Сократительный тонус создавали перфузией раствором ФЭ (2,5-5-10"6 М). На фоне сократительного тонуса сосуда, составлявшего 80-90 мм рт.ст., сосуды последовательно перфузировали растворами АС-6 (6-Ю"5 М) и НП (МО"6 М). Далее сосуды в течение 10 минут перфузировали раствором ФЭ (5-10"6 М) с ингибитором фермента рГЦ ODQ (3-10"6 М) и на его фоне повторно перфузировали хвостовые артерии АС-6 (6-10'5 М) и НП (1 • 10'6 М).

Для количественной оценки гипертрофии левого желудочка сердца (ЛЖ) использовали соотношение веса ЛЖ к сумме весов ЛЖ, правого желудочка и межжелудочковой перегородки и предсердий, выраженное в процентах, а также отношение веса ЛЖ к сумме весов правого желудочка и межжелудочковой перегородки.

Для оценки гипертрофии сердца использовали отношение массы сердца к массе тела крысы, выраженное в процентах.

4. Биохимические эксперименты.

Для определения способности АС-6 активировать синтез цГМФ рГЦ применяли метод иммуноферментного анализа с использованием моноклональных антител к цГМФ. Метод основан на каталитическом превращении гуанозинтрифосфата (ГТФ) в цГМФ с последующим выделением цГМФ из реакционной смеси. В качестве источника очищенной рГЦ использовали фермент, выделенный из ткани легких свиньи и любезно предоставленный к.б.н. А.Б. Постниковым, ПНИЛ «Химии ферментов», кафедра Биоорганической химии Биологического факультета МГУ.

В реакционную смесь (РС), состоящую из 50 мМ Трис-НС1 (рН 7,4), 5 мМ MgCl2, 4 мМ креатинфосфата, 0,4 мг/мл креатинфосфокиназы, 0,2 мМ ГТФ, 5 мМ дитиотреитола и деионизированной воды (представлены конечные концентрации в пробе), размораживали и добавляли аликвоту фермента рГЦ. Реакцию начинали добавлением к РС водного раствора АС-6 (100 мкМ) или >Ю-донора - НП (10 мкМ). Пробы инкубировали 15 минут при температуре 37°С. Реакцию останавливали кипячением на водяной бане в течение 2 минут. К полученным пробам добавляли 148 мкл 101,4 мМ /п(СН3СОО)2 , 192 мкл 101,4 мМ №2С03, 10 мкл 100 мМ калийфосфатного буфера (рН 7,4) и 50 мкл 100 мМ N11411003, перемешивали и в течение 10 минут выдерживали на льду. Далее пробы центрифугировали 5 минут при 8800 g. Таким образом, удаляли избыток ГТФ, осаждающийся с карбонатом цинка, и денатурированный кипячением белок. Супернатант отбирали для исследования на содержание цГМФ методом ИФА. При необходимости супернатант разводили в отдельных пробирках-эппендорф 50 мкМ калийацетатным буфером (рН 6,8) для дальнейшего исследования. Для построения калибровочной кривой использовали растворы с известной концентрацией цГМФ на 50 мМ калийацетатном буфере, рН 6,8. В данной работе использовали 3,2 нМ, 6,4 нМ, 12,8 нМ, 25,6 нМ, 0,05 мкМ, 0,1 мкМ, 0,2 мкМ растворы цГМФ. Осажденные калибровочные и опытные пробы хранили при температуре -20°С.

Определение концентрации цГМФ в супернатанте происходило по следующей схеме: 96-луночный планшет предварительно сорбировали раствором белка А (1 мкг/мл протеина А в 50 мМ карбонатном буфере, рН= 9,0, 50 мкл/лунка) на протяжении 1,5 ч

при комнатной температуре при постоянном перемешивании; добавляли в каждую лунку планшета 125 мкл 0,5% раствора бычьего сывороточного альбумина (БСА) в 50 мМ Трис-HCl (рН 7,4), инкубировали 1,5 ч при температуре 20°С; промывали планшет 2 раза 25 мМ Трис-HCl (рН 7,4) с 0,05% Tween-20 и 150 мМ NaCl. Далее добавляли в каждую лунку 25 мкл калибровочной или опытной пробы и 25 мкл раствора антител к цГМФ, содержащего 1 мМ ЭДТА, 10 мкг/мл БСА, 50 мМ калийацетатный буфер, рН 6,8, и оставляли на 16 ч при 4°С при постоянном перемешивании. Затем на льду вносили в каждую лунку 25 мкл раствора пероксидазы хрена, конъюгированной с цГМФ, содержащего 10 мкг/мл БСА, 50 мМ калийацетатный буфер, рН 6,8, и инкубировали в течение 3 часов при постоянном перемешивании при 4°С. После этого 96-луночный планшет на льду промывали 4 раза раствором, содержащим 25 мМ Трис-HCl (рН 7,4) с 0,05% Tween-20 и 150 мМ NaCl и добавляли в каждую лунку 100 мкл раствора, содержащего субстрат пероксидазы о-фенилендиамин (2 мг/млл), 0,3% Н202 и 0,1 М цитрат-фосфатный буфер, рН 4,5, инкубировали в течение 10 минут при перемешивании при 20°С. Далее после добавления в лунки планшета 0,5 М серной кислоты (25 мкл/лунка) измеряли оптическую плотность при длине волны 492 нм на планшетном фотоколориметре.

Для изучения дозозависимости эффекта активации синтеза цГМФ азасидноном-б использовали пробы с возрастающей концентрацией АС-6 в пробе (100 мкМ, 150 мкМ, 200 мкМ, 250 мкМ). В качестве положительного контроля использовали пробы с возрастающими концентрациями известного NO-донора спермин-NONOaTa (1мкМ, 3 мкМ, 10 мкМ). Для изучения влияния оксигемоглобина на активацию рГЦ азасидноном-6 и спериин-NONOaTOM использовали концентрации АС-6 100 мкМ и спермин-NONOaTa 1 мкМ, вызывающие одинаковую активацию рГЦ, что было показано ранее в эксперименте по дозазависимой активации рГЦ под действием АС-6 и спермин-NONOaTa. Для демонстрации дозозависимого эффекта подавления активации синтеза цГМФ в присутствии оксигемоглобина в пробы с АС-6 и спермин-NONOaTOM, а также в контрольные пробы добавлялся оксигемоглобин в концентрациях 5 мкМ и 10 мкМ. В контрольные пробы вместо АС-6 и спермин-NONOaTa добавлялась деионизированная вода, в пробы без оксигемоглобина добавлялся калийацетатный буфер, рН 6,8. Для изучения возможности активации синтеза циклического ГМФ в тканях азасидноном-6 у крыс линии Wistar извлекали фрагмент

аорты длиной 5-8 мм наиболее близкий к сердцу. Аорту промывали 0,9% раствором NaCl, осушали с помощью фильтровальной бумаги, взвешивали и помещали в инкубационную смесь, содержащую 0,9% NaCl и 0,5 мМ IBMX (изобутилметилксантин, ингибитор фосфодиэстераз) на 15 минут при 37°С. Далее на 15-ой минуте в контрольные пробы вносили дистиллированную воду; в опытные пробы добавляли АС-6 в концентрации 500 мкМ, инкубация длилась 15 минут. В качестве положительного контроля в инкубационную смесь добавляли НП в концентрации 10 мкМ, инкубация длилась 3 минуты. Для того чтобы показать, что АС-6 действует через рГЦ, в часть проб перед добавлением АС-6 или НП добавляли 10 мкМ ODQ (ингибитор рГЦ). Конечный объём проб составил 500 мкл. Далее фрагменты аорты осушали с помощью фильтровальной бумаги, помещали в пробирки эппендорфы и замораживали в жидком азоте. Хранили пробы при -20°С.

В дальнейшем пробы гомогенизировали в жидком азоте в присутствии 10-кратного объёма 5% трихлоруксусной кислоты (ТХУ), количественно переносили в пробирки эппендорфы и в течение 40 минут экстрагировали цГМФ при постоянном перемешивании, далее пробы центрифугировали при 8800 g в течение 10 минут. Для экстракции остатков ТХУ из супернатанта использовали диэтиловый эфир, смешанный с водой. После этого пробы с открытыми крышками помещали в термостат, нагретый до 57°С, на 10 минут для удаления остатков эфира.

Для подготовки проб к ИФА из каждой пробы в отдельную пробирку отбирали 60 мкл раствора, к ним добавляли 6,7 мкл 500 мМ калийацетатного буфера, рН 6,8. Эти пробы использовали для нанесения на 96-луночный планшет.

Способность азасиднона-6 генерировать оксид азота изучали с помощью спектрофотометрического метода с использованием оксигемоглобина. Как известно, NO способен вступать в реакцию с оксигемоглобином с образованием метгемоглобина и нитрата (Lancaster et al., 1994), при этом происходит изменение поглощения при длинах волн 577 и 401 нм. Зная коэффициент экстинкции при данных длинах волн, можно рассчитать молярную концентрацию получившегося метгемоглобина по формуле: c=(l*d)/E, где I - длина оптического пути, d - поглощение при данной волне волны, Е -молярный коэффициент экстинкции при данной длине волны. При расчётах учитывалось то, что оксигемоглобин взаимодействует с оксидом азота в эквимолярном соотношении,

соответственно концентрация образующегося метгемоглобина равна концентрации выделяющегося N0.

Результаты исследования Изучение гипотензивного эффекта АС-6 на бодрствующих крысах линий

\Vistar и вНИ

Изучение гипотензивного эффект АС-6 у нормотензивных крыс линии \Yistar.

Введение АС-6 в дозах от 0,011 мкг/кг до 110 мкг/кг бодрствующим крысам линии

\Vistar вызывает уменьшение САД как относительно исходного уровня АД, так и

относительно группы \УЫаг-контроль (Табл. I). Максимальная статистически значимая

величина снижения САД наблюдалась при введении АС-6 в дозе 110 мкг/кг и составила

7,4% от исходного уровня САД, равного 113 мм рт.ст.

Таблица 1. Изменение САД при внутривенном введении азасиднона-6 в дозах от 11 нг/кг до 110 мкг/кг и растворителя (дистиллированной воды) в объеме 20 мкл

доза АС-6, мкг/кг 0,011 0,11 U _.. . И' 110

Группа Wistar-опыт

ДСАД, мм рт.ст. 2,80 3,00 5,00 5,40 8,40

ошибка среднего 1,20 1,26 1,38 2,16 1,40

ДСАД, % 2,5 2,6 4,4 4,7 7,4

объем растворителя, мкл 20 20 20 20 20

Группа Wistar контроль

ДСАД, мм рт.ст. 0,17 0,83 0,5С 0,00 0,67

ошибка среднего 0,48 0,87 0,76 0,58 *** 1,02 ***

ДСАД, % 0,1 0,7 0,4 0,0 0,6

*** - статистически значимые отличия от контрольной группы, р<0,005 Сравнительный анализ величины и длительности изменения САД у нормотензивных крыс линии Wistar и гипертензивных крыс линии SHR. Для

оценки зависимости гипотензивного эффекта АС-6 от величины исходного давления животных проводили изучение его действия на величину САД у гипертензивных крыс линии SHR и нормотензивных крыс линии Wistar. Согласно полученным данным, последовательное введение АС-6 в дозах 110 мкг/кг и 550 мкг/кг вызывает дозозависимое уменьшение САД у крыс линий Wistar и SHR (Табл. 2). В ответ на введение АС-6 в дозе 110 мкг/кг в группе Wistar-опыт САД статистически значимо (р<0,05) уменьшается на 5,9±0,6% от исходного уровня САД. При введении дозы 550 мкг/кг крысам линии Wistar происходит дальнейшее уменьшение САД (р<0,05), которое составляет 13,3±2,2%. В группе SHR-опыт в ответ на введение дозы АС-6 110 мкг/кг САД статистически значимо (р<0,05) уменьшается на 5,3±1,1% от исходного уровня САД. Введение АС-6 в дозе 550 мкг/кг вызывает статистически 12

значимое (р<0,05) уменьшение САД на 10,1±1,1%. Таким образом, гипотензивный эффект АС-6 не зависит от исходного уровня САД и в одинаковой степени выражен у крыс линий Wistar и SHR.

Влияние азасиднона-6 на частоту сердечных сокращений бодрствующих животных в группах нормотензивных и гипертензивных животных. В группе Wistar-опыт последовательное введение АС-6 в дозах 110 мкг/кг и 550 мкг/кг вызывает статистически значимое (р<0,05) уменьшение ЧСС на 14,5±6,6 уд/мин и 42,8±15,8 уд/мин соответственно относительно исходного уровня ЧСС 329±19 уд/мин (Табл. 2).

Таблица 2. Изменение САД и ЧСС в ответ на последовательное введение АС-6 в дозах 110 мкг/кг и 550 мкг/кг крысам линий Wistar и SHR. _

Норма Введение АС-6,110 мкг/кг Введение АС-6, 550 мкг/кг

Группа САД, мм рт.ст. ЧСС, уд/мнн САД, мм рт.ст. ЧСС, уд/мин САД. мм рт.ст. ЧСС, уд/мин

Wistar-опыт 107,5 329 101,1 * 314* 93,0 * # 286 *

Ошибка среднего 1,1 19 1,0 21,0 1,6 7

SHR-опыт 158,6 325 150,0 * 355 * 142,5 * # 274 *#

Ошибка среднего 6,2 14 5,4 16 5,8 4

* - статистически значимые отличия от значения САД до введения АС-6 (р<0,05);

# - статистически значимые отличия от действия предыдущей дозы АС-6 (р<0,05)

В группе SHR-опыт в ответ на введение АС-6 в дозе 110 мкг/кг происходит статистически значимое (р<0,05) увеличение ЧСС на 30,3±4,9 уд/мин относительно исходного уровня, который составил 325±14 уд/мин, тогда как введение АС-6 в дозе 550 мкг/кг вызвало статистически значимое (р<0,05) уменьшение ЧСС на 51,5±12,0 уд/мин. Факт уменьшения ЧСС при гипотензивном действии АС-6 является положительным фактором для возможности его дальнейшего использования в качестве медикаментозного средства для лечения гипертонии.

Введение нормотензивным и гипертензивным крысам внутривенно растворителя дистиллированной воды (группы Wistar-контроль и SHR-контроль) не приводит к статистически значимым изменениям САД и ЧСС.

Изучение времени достижения максимального гипотензивного действия АС-6. Достижение максимального гипотензивного эффекта при введении АС-6 в дозе 110 мкг/кг крысам линии Wistar и SHR одинаково и составляет 30,0±1,6 мин и 35,0±3,3 мин соответственно. У крыс линии SHR АС-6 в дозе 550 мкг/кг вызывает достоверно (р<0,05) более быстрое уменьшение САД (время достижения максимального эффекта составляет 29±3,3 мин), чем у крыс линии Wistar (40±1,6 мин). Однако общее время действия дозы

АС-6 550 мкг/кг не различается в группе Wistar-опыт (60±2,1 мин) и группе SHR-опыт (62±3,4 мин).

Изучение влияния АС-6 на величину барорефлекса. Одним из главных способов регуляции и стабилизации величины АД является барорефлекс. АС-6 не влияет на реакцию САД и коэффициент барорефлекса у нормотензивных и гипертензивных животных в ответ на введение ФЭ (Рис.1). У крыс линии Wistar также не выявлено влияния АС-6 на коэффициент барорефлекса в ответ на введение НП (в/в, 3 мкг/кг). У крыс линии SHR АС-6 увеличение чувствительности барорефлекса на НП за счёт увеличения реакции ЧСС (Рис.1).

КБР-ФЭ после КБР-НП после

введения АС-6 или введения АС-6 или КБР-ФЭ норма КБР-НП норма растворителя растворителя

-3 .....

Рисунок 1. Влияние АС-6 на КБР у нормотензивных крыс линии \Vistar и гипертензивных крыс линии 8НЯ. * - статистически значимые (р<0,05) различия между группами \¥;51аг-контроль и вНЯ-контроль/группами W¡star-oпыт и БНК-опыт. @ - статистически значимые (р<0,05) различия между значениями внутри группы до и после введения азасиднона-6. #- статистически значимые (р<0,05) различия между группами вНК-контроль и БЖ-опыт после введения АС-6.

I

Итак, азасиднон-6 при остром введении вызывает длительный гипотензивный эффект у бодрствующих нормотензивных и гипертензивных крыс. Гипотензивный эффект азасиднона-6 не зависит от исходного уровня АД. Азасиднон-6 не влияет на КБР , в ответ на введение ФЭ и увеличивает исходно сниженный КБР в ответ на введение НП у гипертензивных крыс линии вНЯ.

Изучение гипотензивного эффекта азасиднона-6 в условиях длительного введения препарата гипертензивным крысам линии БНИ Дальнейшее изучение вещества мы проводили в условиях курсового (3 недели) введения азасиднона-6 крысам линии вНИ. В эксперименте принимали участие )

2 группы животных: группа ЙНЯ-опыт на протяжении 3 недель получала АС-6 в дозе 5 мг/кг дважды в день через желудочный зонд, крысы группы 5Ш-контроль 2 раза в день получали растворитель - дистиллированную воду. На протяжении всего курса применения АС-6 у животных производился мониторинг систолического АД (Рис. 2).

Хроническое применение АС-6 вызывает уменьшение систАД к 5 дню эксперимента. К 15-му дню уровень АД не различаются в экспериментальных группах. Статистически значимые (р<0,05) различия вновь появляются на 21-ый день эксперимента. СистАД в опытной группе к концу 3-ей недели применения препарата составляет 218,6±4,1 мм рт.ст. При этом в группе 8НЯ-контроль, достоверных изменений систАД не происходит, и к 21-дню эксперимента систАД составляет 235,5±5,0 мм рт.ст., т.е. наблюдается тенденция к увеличению АД, что связано, по-видимому, с возрастными изменениями.

250 240 230 220 210 200 190 о 180 О 170

Г*1

5 5

5

ft]

fh

гЬ

-ь

□ SHR-контроль

□ SHR-опыт

10

15

18

21

День эксперимента

Рисунок 2. Динамика изменения систолического АД, измеренного плетизмографическим методом, у бодрствующих крыс линии SHR. * - статистически значимые (р<0,05) различия между группами SHR-контроль SHR-опыт. @ - статистически значимые (р<0,05) различия между значениями внутри группы SHR-опыт.

В данной серии опытов мы также изучили эффекты хронического применения

азасиднона-6 per os на барорефлекторную регуляцию АД в ответ на болюсное введение НП. Хроническое применение вещества АС-6 в течение 21 дня крысам линии SHR вызывает статистически значимое (р<0,05) увеличение реакции САД в ответ на в/в введение НП (1,5 мкг/кг). В группе SHR-контроль САД при в/в введении НП уменьшается на 15,3±2,1 мм рт.ст., в группе, длительно получавших АС-6, гипотензивная реакция на НП составляет 23,3±0,8 мм рт.ст. Достоверных различий в КБР между двумя группами обнаружено не было (Табл. 3).

Таблица 3. Изменение реакций сосудистой системы крыс линии БНЯ на нитропруссид натрия при курсовом введении азасиднона-6 в дозе 5 мг/кг.__

Группа САД(норма), мм рт.ст. САД(НП), мм рт.ст. ДСАД(НП), мм рт.ст. ЧСС(норма), уд/мин ЧСС(НП), уд/мин ЛЧСС(НП), уд/мин КБР

БЖ-контроль 168,7 153,3 -15,3 267,3 276,8 9,5 -0,3

Ошибка ср. 6,8 8,7 2,1 7,7 13,9 14,3 1,0

БЖ-опыт 159,7 136,4 -23,3 298,6 321,3 22,7 -1,0

Ошибка ср. 5,7 5,7 0,8 16,4 16,4 5,7 0,3

* - статистически значимые (р<0,05) различия между группами БЖ-контроль БЖ-опыт.

Для того чтобы проверить, меняется ли реакция на азасиднон-6 у крыс, получавших его хронически, мы внутривенно вводили препарат АС-6 в дозе 110 мкг/кг гипертензивным крысам групп 8НК-опыг и БНЯ-контроль. Уменьшение САД в ответ на болюсное внутривенное введение АС-6 в группе БЖ-опыт составляет 6,0±1,4 мм рт.ст. (или 3,8% от исходного уровня) и достоверно не отличается от реакции САД в контрольной группе (8,3±1,6 мм рт.ст. или 4,9% от исходного уровня) (Табл. 4).

Таблица 4. Реакция САД крыс линии в ответ на внутривенное введение азасиднона-6 в дозе 110 мкг/кг._

Группа САД(норма), мм рт.ст. САД(АС-б), мм рт.ст. ДСАД(АС-б) мм рт.ст.

5Ж-контроль 167,8 159,5 -8,3

Ошибка ср. 6,3 6,4 1,6

БЖ-опыт 158,5 152,5 -6,0

Ошибка ср. 6,2 5,2 1,4

Таким образом длительное введение АС-6 не вызывает развития толерантности к донору N0 нитропруссиду натрия и к самому азасиднону-6 при внутривенном введении в дозе 110 мкг/кг. Кроме того, он увеличивает чувствительность сосудов крыс линии БНЯ к НП.

При артериальной гипертензии у крыс линии БНК изменяется реактивность сосудистой стенки на сосудосуживающие и сосудорасширительные агенты. Для того чтобы оценить влияние длительного применения АС-6 на реакции сосудов большого круга кровообращения, у крыс групп БНН-опыт и БНЯ-опыт были проведены эксперименты по изучению реактивности изолированных сосудов в ответ на сосудорасширительные и сосудосуживающие факторы.

Изучение реактивности изолированных артериальных сосудов крыс линии БШЧ на фоне хронического применения АС-6. Опыты на изолированных сегментах хвостовой артерии крыс линии 8НЯ показали, что хроническое введение АС-6 не влияет на реактивность изолированных артерий крыс в ответ на перфузию а|-адреномиметиком ФЭ и гипотензивными агентами - донором N0 НП и веществом АС-6 (Табл. 5). 16

Таблица 5. Уменьшение перфузионного давления (в мм рт.ст. и в % от исходного уровня сократительной реакции) изолированных сегментов хвостовых артерий крыс линии 8Ш в ответ на перфузию АС-6 (6*10'5 М) и НП (1 *10"6 М)._

Группа Д перфузионного давления от исходного сократительного тонуса сегментов сосудов на фенилэфрин (3*10"' М)

Азасиднон-6, 6*10'3 М Натрия нитропруссид, 1*10"6 М

мм рт.ст. Д% мм рт.ст. Д%

SIIR-K-oinpo.ii. 37,8 48,2 55,1 73,4

Ошибка ср. 4,7 5,1 5,5 4,0

8П[(-о пыт 42,5 49,0 62,2 74,9

Ошибка ср. 4,5 4,7 5,4 3,3

Таким образом, мы не наблюдаем развития толерантности к АС-6 не только на уровне целого организма, но и на уровне гладкомышечной стенки сосудов.

Фермент рГЦ является важным звеном в >Ю-цГМФ-зависимой реакции расслабления ГМК сосудов. При связывании гема, входящего в состав рГЦ, с N0 происходит активация синтеза цГМФ, который опосредует дальнейшие процессы, приводящие, в конечном счете, к уменьшению концентрации кальция и чувствительности сократительного аппарата в ГМК, что в свою очередь приводит к расслаблению ГМК.

Оценка вклада рГЦ в сосудорасширительную реакцию АС-6 и НП. Мы

использовали блокатор рГЦ ООО (1Н-[1,2,4]оксадиазоло[4,3-а]хиноксалин-1-он) в концентрации 3 мкМ для оценки вклада рГЦ в сосудорасширительные реакции. 00(3 окисляет железо гема рГЦ, что ведет к потере ферментом способности активироваться N0 и уменьшению сродства гемовой группы к рГЦ.

ЭИР^-контроль

КНР-контроль

£

5 20

40

ч

о 60

80

100

■ ■

10,7 11,1 1 в

зт^.в 41.5 39;3

□ -ООО 6^,2

■ +000

Азасиднон-6

Нитропруссид натрия

Рисунок 3. Уменьшение перфузионного давления (в мм рт.ст. от исходного уровня сократительной реакции) изолированных сегментов хвостовых артерий крыс линии ЭИЛ в ответ на перфузию АС-6 (6*10"5 М) и НП (1*10"6 М) в присутствии и без ингибитора рГЦ 00<3 (3*10"6 М) в условиях проточной перфузии.

Нами было показано, что реакция расслабления сосудов в ответ на АС-6 и НП на фоне действия (Ю(3 уменьшается как в группе ЙНЯ-контроль, так и в опытной группе 8НЯ-опыт (Рис. 3). Реакция на АС-6 в группе БИР-контроль на фоне перфузии (ЮС) уменьшается на 71 %, а группе вНЯ-опыт - на 73 %. В группе БНЯ-опыт и БНИ-контроль степень уменьшения реакции расслабления на НП блокатором рГЦ составляет 51 % от исходного уровня сосудорасширительной реакции без ингибитора рГЦ ООО (Рис. 3). Достоверных различий между группами обнаружено не было.

Таким образом, нами было показано, что АС-6 вызывает уменьшение АД при в/в введении у бодрствующих нормотензивных и гипертензивных крыс. Этот эффект в одинаковой степени выражен у животных с исходно разным уровнем АД. Кроме этого АС-6 при в/в введении увеличивает чувствительность АД к донору N0 нитропруссиду натрия. При курсовом введении рег оя АС-6 гипертензивным животным линии БНЯ, АС-6 уменьшает величину систАД. При этом существенного влияния на барорефлекторную регуляцию АД отмечено не было. При в/в введении НП крысам, хронически получавшим АС-6, наблюдается увеличение реакции САД на НП. При этом при в/в введении АС-6 крысам, получавшим азасиднон-6 хронически рег оэ, не наблюдается уменьшения гипотензивной реакции, то есть толерантность к АС-6 в данном случае не наблюдается. Эксперименты на изолированных сосудах показали, что чувствительность хвостовых артерий гипертензивных крыс к АС-6 у животных, хронически получавших препарат, не изменилась по сравнению с контрольными животными. Также мы не наблюдали уменьшения реакции на перфузию донором N0 НП. Таким образом, в данном случае толерантности на уровне сосудистого русла к АС-6 и НП не возникает. Блокатор рГЦ ООР уменьшает расширительную реакцию на НП и АС-6 в одинаковой степени у крыс, получавших препарат, и контрольных крыс, получавших дистиллированную воду, что говорит о том, что для проявления действия азасиднона-6 необходим гем.

Следующая часть нашей работы посвящена изучению биохимического механизма гипотензивного действия АС-6. Учитывая тот факт, что данные с блокатором р ГЦ свидетельствую о гем-зависимом действии АС-6, основное внимание в биохимических экспериментах было уделено вопросу, является ли АС-6 донором N0. В экспериментах на животных и изолированных сосудах препарат проявил себя как не типичный МО-донор. Его действие было более длительное, чем у большинства известных доноров N0.

Кроме того, длительное введение АС-6 не вызывает развития толерантности, что также не характерно для доноров оксида азота.

Изучение способности АС-6 активировать рГЦ. В данной серии экспериментов было показано, что АС-6 (100 мкМ) увеличивает базальную активность рГЦ в 29 раз. Было также установлено, что 100 мкМ АС-6 активирует рГЦ так же, как и 10 мкМ донор N0 НП. Активация рГЦ АС-6, также как и НП, увеличивалась в присутствии 50 мкМ аллостерического регулятора рГЦ, УС-1 в одинаковой степени, что говорит о том, что действие АС-6, как и действие НП, по-видимому, гем-зависимо.

При изучении активации рГЦ азасидноном-6 по сравнению с донором N0 спермин-1ЧО>Юатом, было показано, что активация очищенной рГЦ из легких свиньи носит дозозависимый характер как при использовании в качестве активатора АС-6 (концентрации 100 мкМ, 150 мкМ, 200 мкМ, и 250 мкМ), так и в случае спермин-МОМОата (концентрации 1 мкМ, 3 мкМ, 10 мкМ). В концентрации 100 мкМ АС-6 активирует рГЦ в той же степени, что 1 мкМ раствор спермин-МСШОата, а 250 мкМ АС-6 активирует рГЦ также, как и 3 мкМ спермин-ТМОМОатом.

В следующей серии экспериментов проводилось изучение активации рГЦ АС-6 и спермин-Р*ЮГЮатом в зависимости от присутствия в реакционной смеси оксигемоглобина. Молекула N0 очень реакционноспособна, и в растворе быстро реагирует с гемом оксигемоглобина с образованием нитрата и метгемоглобина.

□ Базальная активность

□ Азасиднон-6

■ Спермин-МОМЭат

1,6

0 5 10

Концентрация оксигемоглобина, мкМ

Рисунок 4. Уменьшение степени активации рГЦ из легких свиньи под воздействием оксигемоглобина.

Таким образом, в случае, если АС-6 взаимодействует с гемом, то в присутствии оксигемоглобина его способность активировать рГЦ должна уменьшаться. Согласно полученным данным, присутствие оксигемоглобина в реакционной смеси уменьшает степень активации рГЦ как в контрольных пробах, так и в пробах с АС-6 и спермин-МСЖОатом, что также говорит о гем-зависмом действии АС-6 (Рис. 4).

Однако из результатов данной серии мы не можем сказать, является ли АС-6 донором N0, поскольку под воздействием оксигемоглобина изменилась и базальная активность очищенной рГЦ. Возможно, более значительное уменьшение активации рГЦ азасидноном-6 связано с изменениями самого фермента и уменьшением доступности гема рГЦ для АС-6.

Изучение способности азасиднона-6 и спермин-РЮМОата генерировать оксид азота. Использованный метод основан на том, что в растворе оксид азота связывается с гемом оксигемоглобина в эквимолярных соотношениях с образованием метгемоглобина. При этом происходят изменения в спектре поглощения оксигемоглобина при длине волны 401 нм. Зная коэффициент экстинкции метгемоглобина при данной длине волны, можно определить концентрацию получившегося метгемоглобина, а значит и концентрацию выделяющегося оксида азота. Согласно полученным данным, 1 моль азасиднона-6 генерирует 6,7±1,7 мкмоль ТЯО/мин, а 1 моль спермин-ЖЗМОата выделяет 1245,2±165,9 мкмоль 140/мин, что 186 раз больше, чем азасиднон-6 (Рис. 5). Таким образом, если азасиднон-6 и является донором N0, то очень слабым, и его МО-донорной активностью нельзя объяснить его гипотензивный эффект.

12' 5,2

6,7

Азасиднон-6 Спермин-ИОЫОат

Рисунок 5. Скорость образования N0 в пробах с азасидноном-6 и спермин-МОМОатом, рассчитанная на 1 моль вещества, измеренная с использованием спектрофотометрического метода в реакции с оксигемоглобином.

1600

с

1 1400

(С

1 1200 т

■2 1000 § а

I § 800 I

§ ™ 600 ш

£ 400

й

о

| 200

Изучение влияния азасиднона-6 на синтез цГМФ в тканях изолированных сегментов аорты белых крыс линии ЛУ^аг. Согласно полученным результатам, инкубация сегмента аорты крыс линии \Vistar в растворе АС-6 в концентрации 500 мкМ вызывает статистически значимое увеличение в 7,3 раза количества цГМФ по сравнению с базальным уровнем синтеза цГМФ (Рис. 6). При этом 10 мкМ НП активирует синтез цГМФ в той же степени.

Рисунок 6. Активация синтеза цГМФ в тканях аорты крыс линии \Vistar в эксперименте по изучению способности АС-6 стимулировать синтез цГМФ в тканях аорты крыс.* - статистически значимые отличия (р<0,05) от контроля; ** - статистически значимые (р<0,01) отличия от контроля; # - статистически значимые (р<0,05) отличия от точки НП, 10 мкМ.

Блокатор рГД СЮС? статистически значимо уменьшает активацию синтеза цГМФ в пробах с нитропруссидом натрия и значительно, но не достоверно в пробах с АС-6.

Таким образом, нами было показано, что АС-6 способен активировать синтез цГМФ не только очищенного фермента рГЦ, но и фермента тканей аорты крыс. Тот факт, что блокатор рГЦ СЮ(3 уменьшает эффекты АС-6 в меньшей степени, чем эффекты НП можно объяснить тем, что АС-6 действует на рГЦ не только гем-зависимо, но и, возможно, меняет конформацию фермента аллостерически, увеличивая его активность.

выводы

1 .Азасиднон-6 при внутривенном введении вызывает длительный гипотензивный эффект у бодрствующих нормотензивных крыс линии Wistar (60±2,1 мин) и у крыс с наследственной формой артериальной гипертензии SHR (62±3,4 мин), не зависящий от исходного уровня АД.

2.Хроническое применение per os препарата азасиднона-6 в течение 21 дня у крыс линии SHR вызывает статистически значимое уменьшение систолического АД на 5-ый, 10-ый и 20-ый дни введения препарата, что не сопровождается развитием толерантности к веществу азасиднону-6 и нитропруссиду натрия. Существенного влияния на барорефлекторную функцию длительное применение АС-6 не оказывает, однако у крыс, получавших АС-6 в течение 21, дня увеличивается чувствительность к NO-донору нитропруссиду натрия.

3.При перфузии изолированных сегментов хвостовой артерии крыс линии SHR азасидноном-6 вызывает их расширение, что свидетельствует о возможности периферического действия изучаемого вещества. Хроническое применение АС-6 у крыс линии SHR не приводит к изменению чувствительности изолированных сегментов хвостовой артерии к фенилэфрину, нитропруссиду натрия и АС-6.

4. Азасиднон-6 может выделять небольшие количества N0 в условиях in vitro, однако данная слабая NO-донорная активность азасиднона-6 не может объяснить его гипотензивный эффект.

5.Азасиднон-6 активирует синтез цГМФ очищенной рГЦ из легких свиньи и в тканях аорты крыс линии Wistar. Результаты биохимического анализа действия азасиднона-6 на очищенный фермент рГЦ и ткани аорты, а также эксперименты по изучению конкурентных взаимоотношений АС-6 и доноров N0, свидетельствуют о том, что азасиднон-6 является частичным агонистом рГЦ и действует гем-зависимо N0-независимо.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Postnikov А.В. Hypotensive effect of 3-(3-[l,2,4]triazolo)-oxatriazolium-5-olate is caused by NO-independent activation of soluble guanilate cyclase. [Текст] / А.В. Postnikov, M.M. Artemieva, A.P. Bonartsev, A.I. Simonova, N.A. Medvedeva // American Journal of Hypertension. - 2005. - Vol. 18. - Issue 5. - P. A71-A72.

2. Артемьева M.M. Длительная регуляция сосудистого тонуса активатором растворимой гуанилатциклазы азасидноном-6. [Текст] / М.М. Артемьева, А.Б. Постников, Н.А. Медведева // Сборник тезисов IV Всероссийской конференции «Механизмы функционирования висцеральных систем», Санкт-Петербург, 4-6 октября 2005. -СПб.,2005.-С. 29-30.

3. Bonartsev A. 3-(3-[l,2,4]triazolo)-oxatriazolium-5-olate causes vasodilatation by NO-independent activation of soluble guanylate cyclase. [Текст] / A.Bonartsev, M.Artemieva, A.Postnikov, N.Medvedeva // Abstractbook of 2nd International Conference of cGMP Generators, Effectors and Therapeutic Implications, 10-12 June, Potsdam, Germany, 2005. -BMC Pharmacology. - № 5(Suppl 1). - P. 6.

4. Artemieva M. A novel NO-independent heme-dependent activator of soluble guanilate cyclase: in vitro and in vivo results. [Текст] / M.Artemieva, A.Postnikov, A.Bonartsev, A.Simonova, N.Medvedeva, I.Daliger, T.Cherkasova, S.Shevelev // Abstractbook of 5th World Meeting on Pharmaceutics, Biopharmaceutics and Pharmaceutical Technology, Geneva, 27-30 March 2006. - Geneva, 2006. - P. 26.

5. Артемьева M.M. Длительный гипотензивный эффект NO-независимого активатора растворимой гуанилатциклазы. [Текст] / М.М. Артемьева, А.Б. Постников, А.П. Бонарцев, Н.А. Медведева // Тезисы докладов IV Всероссийской школы-конференции по физиологии с международным участием, Москва, 31 января-3 февраля

2007.-М„ 2007.-С. 41.

6. Артемьева М.М. Гипотензивный эффект производного оксатриазолиум-5-олата. [Текст] / М.М.Артемьева, А.Б.Постников, О.В.Акинфиева, И.Л.Далигер, С.А.Шевелев, О.С.Медведев, Н.А.Медведева // Экспериментальная и клиническая фармакология. -

2008.-Т. 71, №5.-С. 25-27.

7. Артемьева М.М. Гипотензивный эффект производного оксатриазоло-5-олата в хронических экспериментах на крысах линии SHR. [Текст] / М.М.Артемьева, А.Б.Постников, О.В.Акинфиева, И.Л.Далигер, С.А.Шевелев, О.С.Медведев, Н.А.Медведева // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2009. - Т. 72, №3. -С. 13-15.

Заказ № 20б-а/10/10 Подписано в печать 27.10.2010 Тираж 140 экз. Усл. п.л. 1

ч ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30

\ I « )) угчт. с/г. ги; е-таИ:т/о@с/г. ги

Актуальность темы. Оксид азота (N0) является одним из основных эндогенных сосудорасширительных факторов, регулирующих деятельность сердечно-сосудистой системы. Постоянный синтез N0 из L-аргинина обеспечивается каталитической активностью эндотелиальной формы NO-синтазы. N0 свободно диффундирует к гладкомышечным клеткам сосудов, где он активирует образование циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ) и вызывает реакцию эндотелий-зависимого расслабления (ЭЗР) (Lincoln Т.М., 1989, Hofmann F. et al., 2000).

Дисфункция NO-цГМФ-зависимого механизма расслабления сосудов, выражающаяся в уменьшении ЭЗР, является одним из механизмов патогенеза таких заболеваний, как эссенциальная и лёгочная гипертензия, сердечная недостаточность, ишемическая болезнь сердца и др. (Schiffrin E.L. et al., 2000, Park J.B., Schiffrin E.L., 2001, Endemann D. et al.„ 2004, Monnink S.H. et ai., 2002, Landmesser U. et al., 2001). Исследование регуляции центрального звена NO-цГМФ пути - активации гладкомышечного фермента растворимой гуанилатциклазы (рГЦ), - важно не только для фундаментального понимания механизмов расслабления гладких мышц сосудов, но и для клинической практики. Наиболее известный и широко применяемый способ снижения артериального давления (АД) путем модуляции активности рГЦ заключается в применении препаратов, способных генерировать NO, получивших название доноров NO (Wang P.G. et al., 2002). Такой способ активации рГЦ приводит к быстрому нарастанию концентрации цГМФ в гладкомышечных клетках сосудов на короткое время (действие большинства NO-доноров ограничивается несколькими минутами). В связи с этим NO-доноры используются в основном в тех случаях, когда необходимо быстро понизить АД на значительную величину. Однако при повторяющемся приеме NO-доноров наблюдается десенситизация NO-цГМФ-зависимого пути (Moneada S. et al., 1989, Waldman S.A. et al., 1986), что делает их неэффективными при хроническом применении. Таким образом, поиск препаратов, способных активировать рГЦ на длительный период, является одним из перспективных направлений в физиологии и фармакологии сердечно-сосудистой системы.

В 1966 году впервые появились данные о возможности регуляции АД производными оксатриазола (Kier L.B. et al., 1966). Механизм действия соединений этого класса оставался неизвестным.

В связи с вышеизложенным целью настоящего исследования явился анализ механизма гипотензивного действия одного из производных оксатриазола - 3-(3-[ 1,2,4]-триазоло)-оксатриазолиума-5-олата (далее азасиднона-6, АС-6) на АД в экспериментах на крысах.

Задачи исследования.

1. Произвести анализ величины и длительности эффектов АС-6 при внутривенном введении на среднюю величину системного артериального давления (САД) и частоту сердечных сокращений (ЧСС), а также барорефлекторную регуляцию САД у бодрствующих нормотензивных крыс линии Wistar и гипертензивных крыс линии SHR.

2. Изучить влияние хронического (21 день) введения АС-6 per os на динамику систолического АД (систАД), барорефлекторную регуляцию САД у бодрствующих гипертензивных крыс линии SHR и гипертрофию левого желудочка сердца.

3. Исследовать действие АС-6 при хроническом (21 день) введении препарата per os на реактивность изолированных перфузируемых сегментов хвостовых артерий крыс линии SHR.

4. Провести биохимический анализ механизма действия АС-6 и оценить способность АС-6 генерировать N0 в условиях in vitro.

Научная новизна работы

В настоящей работе впервые был выявлен длительный гипотензивный эффект АС-6 в острых опытах на крысах. Показано, что гипотензивное действие вещества не зависит от исходного уровня АД. При хроническом применении в течение 21 дня АС-6 вызывает уменьшение систолического АД (систАД) у гипертензивных крыс линии SHR. При этом развития толерантности к исследуемому препарату выявлено не было.

В экспериментах на изолированных сосудах было показано, что АС-6 расслабляет сегменты хвостовых артерий крыс линии SHR и данная сосудорасширительная реакция блокируется гем-зависимым ингибитором рГЦ ODQ (1Н-[1,2,4]оксадиазоло[4,3-а]хиноксалин-1-она). Таким образом, показана возможность реализации гипотензивной реакции АС-6 через регуляцию тонуса периферических сосудов, а также в условиях in vivo показано, что действие АС-6 зависит от состояния гема фермента рГЦ.

В серии биохимических экспериментов методом иммуноферментного анализа исследована способность 3-(3-[1,2,4]-триазоло)-оксатриазолиум-5-олата стимулировать синтез цГМФ с использованием как очищенного фермента рГЦ из легких свиньи, так и рГЦ тканей аорты крыс линии Wistar. Как и в условиях физиологического эксперимента, активация рГЦ in vitro уменьшается в присутствии ингибитора рГЦ ODQ. Кроме этого в условиях in vitro показано, что 3-(3-[1,2,4]-триазоло)-оксатриазолиум-5-олат не способен выделять значительные количества N0 и не является NO-донором. То есть 3-(3-[1,2,4]-триазоло)-оксатриазолиум-5-олат активирует рГЦ гем-зависимо NO-независимо.

Научно-практическая значимость работы

Полученные экспериментальные данные расширяют список гипотензивных веществ-активаторов рГЦ. Согласно полученным результатам, 3-(3-[1,2,4]-триазоло)-оксатриазолиум-5-олат активирует рГЦ гем-зависимо "МО-независимо и, в отличие от доноров N0, вызывает снижение артериального давления в течение длительного времени и к нему не развивается толерантность, что делает возможным его применение в качестве гипотензивного препарата для лечения гипертонии и других заболеваний. Данные, полученные автором в ходе выполнения диссертационного исследования, защищены патентом №2351328.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Азасиднон-6 вызывает длительный гипотензивный эффект при внутривенном и внутрижелудочном введении у крыс. Гипотензивный эффект азасиднона-6 в одинаковой степени выражен у крыс с исходно разным уровнем АД.

2. Гипотензивный эффект азасиднона-6 связан с активацией фермента рГЦ гладкомышечных клеток сосудов.

3. Действие азасиднона-6 на рГЦ гем-зависимо "ЫО-независимо.

Личный вклад автора

Автор работы является основным исполнителем проведенного исследования на всех этапах: анализа данных литературы по теме диссертационной работы, проведения экспериментальной части исследования и анализа полученных данных.

Публикации: основные положения диссертационной работы нашли отражение в семи опубликованных в печати научных работах: 2 статьях, опубликованных в журналах, входящих в список, рекомендованных ВАК РФ, и 5 тезисах, опубликованных в материалах российских и международных конференций. Результаты работы доложены на 21-ой ежегодной конференции Американского общества по изучению гипертензии, (США, Нью-Йорк, 2005); на IV Всероссийской школе-конференции по физиологии с международным участием (31 января-3 февраля, Россия, Москва, 2007); IV Всероссийской конференции «Механизмы функционирования висцеральных систем» (4-6 октября, Санкт-Петербург, 2005); на 2-ой международной конференции по стимуляторам синтеза цГМФ, эффекторам цГМФ и их терапевтическому применению (Германия, Потсдам, 2005); на 5-ой международной конференции по фармакологии, биофармакологии и фармтехнологии (Швейцария, Женева, 2006); на заседаниях кафедры фармакологии факультета фундаментальной медицины МГУ.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, описания результатов, обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы (155 источников, в том числе 10 отечественных и 145 зарубежных) и приложения, иллюстрирована 46 рисунками и 77 таблицами.

Выводы

1 .Азасиднон-6 при внутривенном введении вызывает длительный гипотензивный эффект у бодрствующих нормотензивных крыс линии Wistar (60±2,1 мин) и у крыс с наследственной формой артериальной гипертензии SHR (62±3,4 мин), не зависящий от исходного уровня АД.

2.Хроническое применение per os препарата азасиднона-6 в течение 21 дня у крыс линии SHR вызывает статистически значимое уменьшение систолического АД на 5-ый, 10-ый и 20-ый дни введения препарата, что не сопровождается развитием толерантности к веществу азасиднону-6 и нитропруссиду натрия. Существенного влияния на барорефлекторную функцию длительное применение АС-6 не оказывает, однако у крыс, получавших АС-6 в течение 21, дня увеличивается чувствительность к NO-донору нитропруссиду натрия.

3.При перфузии изолированных сегментов хвостовой артерии крыс линии SHR азасидноном-6 вызывает их расширение, что свидетельствует о возможности периферического действия изучаемого вещества. Хроническое применение АС-6 у крыс линии SHR не приводит к изменению чувствительности изолированных сегментов хвостовой артерии к фенилэфрину, нитропруссиду натрия и АС-6.

4. Азасиднон-6 может выделять небольшие количества N0 в условиях in vitro, однако данная слабая NO-донорная активность азасиднона-6 не может объяснить его гипотензивный эффект.

5.Азасиднон-6 активирует синтез цГМФ очищенной рГЦ из легких свиньи и в тканях аорты крыс линии Wistar. Результаты биохимического анализа действия азасиднона-6 на очищенный фермент рГЦ и ткани аорты, а также эксперименты по изучению конкурентных взаимоотношений АС-6 и доноров NO, свидетельствуют о том, что азасиднон-6 является частичным агонистом рГЦ и действует гем-зависимо N0-независимо.