Автореферат и диссертация по медицине (14.00.07) на тему:Гигиеническое обоснование прогнозирующей способности альтернативного метода при оценке опасности моющих и чистящих средств

На правах рукописи

ФЕДОСЕЕВА Татьяна Алексеевна

ГИГИЕНИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПРОГНОЗИРУЮЩЕЙ СПОСОБНОСТИ АЛЬТЕРНАТИВНОГО МЕТОДА ПРИ ОЦЕНКЕ ОПАСНОСТИ МОЮЩИХ И ЧИСТЯЩИХ СРЕДСТВ

14.00.07— Гигиена

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва • 2007

003052787

Работа выполнена в Федеральном научном центре гигиены им. Ф. Ф. Эрисмана Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека и Федеральном центре гигиены и эпидемиологии Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Научные руководители:

член-корреспондент РАМН, профессор

доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук

Ведущая организация:

Российский государственный медицинский университет.

Защита состоится « 29 » марта 2007 г. в 12— часов на заседании Диссертационного совета Д.208.107.01 при Федеральном научном центре гигиены им. Ф. Ф. Эрисмана Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу: 141000, Московская область, г. Мытищи, ул. Семашко, д. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального научного центра гигиены им. Ф. Ф. Эрисмана Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Автореферат разослан « 28 » февраля 2007 г.

Беляев

Евгений Николаевич

Чхвиркия Елена Григорьевна

Аксенова

Людмила Петровна

Пичужкина Нина Михайловна

Ученый секретарь

Диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор

Шушкова Т. С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследований

В условиях постоянного увеличения количества новых химических веществ, поступающих в обращение, актуальной проблемой является их изучение в целях получения информации о потенциальной опасности веществ и разработки профилактических мероприятий, предусматривающих предотвращение неблагоприятного воздействия на организм человека и окружающую среду [Потапов А. И. и соавт., 2002 г.].

Среди комплекса факторов окружающей среды, подлежащих гигиеническому контролю, большого внимания заслуживают товары бытовой химии (ТБХ) в связи с их массовым производством и использованием, разнообразием компонентов, входящих в состав рецептур, а также с возможным прямым воздействием на организм человека [Воло-щенко О. И. и соавт., 1988]. Эти обстоятельства требуют гигиенического изучения современных моющих и чистящих средств на основе поверхностно-активных веществ (ПАВ).

Выявление и предотвращение неблагоприятного воздействия на организм токсического фактора является одной из главных задач профилактической токсикологии, основным приемом которой служат экспериментальные методы исследований. Применяя общепринятые методы токсикологических исследований для оценки опасности моющих и чистящих средств на лабораторных животных, токсикологи не имеют достаточных возможностей удовлетворить запросы практики, поэтому возникает необходимость оптимизации существующих методических подходов. Кроме того, этические аспекты, материальные и временные затраты ограничивают область применения лабораторных животных в токсикологических исследованиях, поэтому является актуальным поиск адекватных альтернативных тест-систем и научное обоснование их прогнозирующей способности.

Методы, альтернативные исследованиям на теплокровных животных, получили признание и широкое распространение в мире, где в соответствии с принятыми законодательными актами произошли изменения в подходах оценки безопасности продукции [Härtung Т., Bremer S., Casati S., Coecke S. et.al., 2003].

В отечественной практике активно развиваются исследования возможности применения альтернативных биологических моделей и

имеются положительные результаты использования альтернативных методов для оценки токсичности полимерных материалов, парфюмерно-косметической продукции, воды, почвы, воздуха и других объектов окружающей среды [Лаппо В. Г., Перова Н. М. и соавт., 2003; Кокшарева Н. В., Трахтенберг И. М. и соавт., 2003; ДядищевН. Р., Рыбалкин С. П., 2003].

В ходе накопления материала было показано, что результаты исследований скрининговой оценки токсичности на альтернативных биологических тест-объектах играют вспомогательную роль на этапе идентификации опасности потенциально вредных факторов [Кожевникова И. Ф., Морылев И. В. и соавт.; Завьялов Н. В., Клочкова С. И. и соавт., 2003]. Вместе с тем на данный период времени остаются нерешенными вопросы разработки методических подходов по оценке токсичности моющих и чистящих средств с применением суспензионной культуры подвижных клеток (спермы быка) и возможность прогнозирования их токсичности и опасности для теплокровных животных. Особую значимость эти исследования приобретают при проведении гигиенических и токсикологических оценок, а также сертификации соответствия продукции при осуществлении Госсанэпиднадзора в целях обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия населения.

Работа выполнялась в рамках отраслевой программы Минздрава России «Системная разработка мероприятий по гигиенической безопасности России (2001—2005 гг.)».

Цель работы: гигиеническое обоснование прогнозирования токсичности и опасности бытовых моющих и чистящих средств, поверхностно-активных веществ для теплокровных с применением альтернативного метода на суспензии сперматозоидов быка.

Задачи исследования:

1. Провести токсиколого-гигиенические исследования образцов моющих и чистящих средств на лабораторных животных по оценке острой перорапьной токсичности, местного раздражающего действия на кожу и слизистые оболочки глаза, кожно-резорбтивного и сенсибилизирующего действия.

2. Изучить цитотоксическое действие моющих и чистящих средств, ПАВ на суспензии подвижных клеток — сперматозоидах

быка. Провести оценку остаточных количеств ПАВ на обрабатываемых изделиях.

3. Выявить корреляционную связь показателей токсичности и опасности моющих и чистящих средств для изучаемой альтернативной биологической модели и теплокровных, разработать критерии оценки токсичности in vitro.

4. Установить воспроизводимость результатов исследований, полученных на суспензии сперматозоидов быка при скрининге моющих и чистящих средств в межлабораторных исследованиях.

5. Показать эффективность альтернативного метода с применением суспензии сперматозоидов быка при оценке токсичности моющих и чистящих средств и определить оптимальные регламенты применения препаратов бытовой химии.

Научная новизна. В результате проведенных исследований впервые:

-установлены параметры цитотоксического действия моющих, чистящих средств и ПАВ на суспензию сперматозоидов быка;

- выявлена достоверная корреляционная связь между показателями острой токсичности моющих и чистящих средств для теплокровных животных и для суспензии сперматозоидов быка;

- обоснована прогнозирующая способность альтернативного метода при оценке токсичности и опасности моющих и чистящих средств и его применение в качестве скрининга на предварительном этапе ток-сиколого-гигиенических исследований с целью сертификации соответствия продукции в целях обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия;

-установлен единый механизм формирования острой пер-оральной токсичности для теплокровных и суспензии сперматозоидов быка, что явилось научной основой для оценки степени их опасности по общему принципу согласно гигиенической классификации вредных веществ.

Практическая значимость работы:

Обоснованы с позиций гигиенической безопасности оптимальное содержание в рецептурах моющих и чистящих средств анионных и неионогенных ПАВ; регламенты применения изученных ТБХ (двукратный режим споласкивания, для применения в быту 1 % рабочий раствор), при которых остаточные количества ПАВ на посуде

ниже утвержденных ПДК; прогнозирующая способность суспензии подвижных клеток сперматозоидов быка для оценки токсичности и опасности моющих и чистящих средств в рамках токсиколого-гигиенических исследований;

Материалы выполненных исследований:

- использованы при разработке методических рекомендаций «Оценка токсичности товаров бытовой химии (ТБХ). Экспресс-метод оценки токсичности моющих и чистящих средств с использованием в качестве тест-объекта спермы крупного рогатого скота», МР № 29 ФЦ/4746 от 27.12.01 г.;

- внедрены в работу 38 токсикологических подразделений ФГУЗ ЦГиЭ Роспотребнадзора;

- внедрены и используются в учебном процессе медико-профилактического факультета последипломного профессионального образования ММА им. И. М. Сеченова на циклах повышения квалификации.

Результаты исследований использованы при подготовке материалов по токсиколого-гигиенической оценке 67 образцов моющих и чистящих средств, на основании которых выданы соответствующие санитарно-эпидемиологические заключения (заключения Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 2001—2006 гг.).

Проведенный выборочный анализ воспроизводимости результатов оценки моющих средств в 10 лабораториях центров гигиены и эпидемиологии подтвердил адекватность использования метода задачам токсиколого-гигиенического исследования.

Результаты работы доложены и обсуждены на:

Втором съезде токсикологов России 10—13 ноября 2003 г. (г. Москва);

Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье» (г. Суздаль, 2005 г.);

Научно-практической конференции «Гигиеническая наука и санитарная практика в творчестве молодых» (ФГУН ФНЦГ им. Ф. Ф. Эрис-мана, 2005 г.).

Апробация работы проведена на межотдельческой конференции Федерального научного центра гигиены им. Ф. Ф. Эрисмана 8 февраля 2007 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ в журналах, сборниках научных трудов, материалах научно-практических конференций.

Структура и объем диссертации: Работа изложена на 151 странице, состоит из введения, аналитического обзора литературы, характеристик объектов, методов и объемов исследований, 4 глав собственных исследований, обсуждения результатов исследований и выводов, указателя литературы, включающего 187 работ отечественных и зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 25 таблицами и 33 рисунками, включает 8 приложений.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Сравнительный анализ параметров острой токсичности моющих и чистящих средств для теплокровных и суспензии сперматозоидов быка.

2. Гигиеническое обоснование прогнозирования опасности моющих и чистящих средств для организма млекопитающих на основании альтернативного метода с применением суспензии сперматозоидов быка.

3. Зависимость уровня токсичности и опасности моющих и чистящих средств от процентного соотношения ПАВ в рецептуре, от их физико-химических свойств.

4. Обеспечение воспроизводимости результатов в межлабораторном эксперименте при скрининге моющих и чистящих средств.

ОБЪЕКТЫ, ОБЪЕМ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В соответствии с целью и задачами настоящей работы была разработана и реализована программа научного исследования по установлению возможности прогнозирования токсичности и опасности моющих и чистящих средств, ПАВ для теплокровных на основании скринингового тестирования на суспензии сперматозоидов быка. Для решения поставленных задач были проведены токсиколого-гигиенические, цитотоксические, санитарно-химические и аналитические исследования.

Направления, методы и объемы исследований представлены в табл. 1.

Таблица 1

Направления, методы и объемы исследований

Направление исследований Объекты исследований Методы исследований Количество исследований

1. Токсикологические: - острые опыты при пероральном и кожном пути поступления - 70 образцов моющих и чистящих средств; - лабораторные животные (мыши, морские свинки, кролики) токсикологические 1142

- кожно-резорбтивное и аллергенное действие - 3 экспериментальные рецептуры жидких чистящих средств; - лабораторные животные (крысы); - биосреды (кровь, сыворотка крови,внутренние органы) токсикологические, биохимические, физиологические, статистические 644

- изучение цитотокси-ческого действия - 67 образцов моющих и чистящих средств; - 6 анионных ПАВ (додецилсульфат натрия, линейный алкилбензо-сульфонат, альфа-олефин-сульфонаты, сульфоэток-силаты,); - 2 неионогенных ПАВ (неонол АФ 9-12, оксиэти-лированные жирные спирты); - суспензия сперматозоидов быка экспресс-метод с применением клеточного тест-объекта (суспензии сперматозоидов быка) 600 72

2. Аналитические корреляционный анализ связи показателей токсичности 67 образцов моющих и чистящих средств для изучаемой биологической модели и теплокровных животных статистические 1416

3. Гигиенические - 6 анионных ПАВ; 2 неионогенных ПАВ; - фаянсовая столовая посуда санитарно-химические 96

4. Межлабораторные исследования эксперимент с участием 10 лабораторий, количество контрольных образцов — 4; статистические показатели статистические 40

Токсиколого-гигиенические исследования образцов моющих и чистящих средств на животных проводились в общем плане работ по санитарно-эпидемиологической экспертизе товаров бытовой химии с целью сертификации соответствия продукции для обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия населения на базе ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в г. Москве» и ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Московской области».

Экспериментальные исследования воздействия моющих и чистящих средств на организм лабораторных животных проводили в остром опыте при однократном пероральном поступлении. Испытания выполнены на 606 половозрелых беспородных мышах в соответствии с МУ№ 1109-73 «Методические указания по гигиенической оценке и санитарному контролю за применением, хранением и продажей населению предметов бытовой химии».

Исследование местного раздражающего действия на кожу и слизистые оболочки глаз проводили на 536 морских свинках согласно МУ 2196-80 «Методические указания к постановке исследований по изучению раздражающих свойств и обоснованию предельно допустимых концентраций избирательно действующих раздражающих веществ в воздухе рабочей зоны».

Кожно-резорбтивное действие изучено на 32 беспородных белых крысах в соответствии с МУ №2102-79 «Оценка воздействия вредных химических соединений на кожные покровы и обоснование предельно допустимых уровней загрязнений кожи». О наличии кожно-резорбтив-ного действия судили по изменению интегральных показателей (внешние признаки интоксикации, динамика массы тела, коэффициенты внутренних органов) и показателей, характеризующих состояние различных систем и функций организма (поведенческие тесты — «норковый рефлекс», содержание БН-групп, холестерина, лейкоцитов, гемоглобина в крови, определение активности аланиновой и аспарагиновой аминотрансфераз в сыворотке крови). Содержание БН-групп определяли методом В. Ф. Фоломеева, холестерина методом Илька, лейкоцитов и гемоглобина — общепринятыми методами, активность аланиновой и аспарагиновой аминотрансфераз методом Райтмана и Френкеля.

Для выявления возможного сенсибилизирующего эффекта использовали метод постановки кожных проб и лабораторные специфические аллерготесты: реакцию специфического лизиса лейкоцитов

(PCJIJI), реакцию непрямой дегрануляции тучных клеток (РНДТК). Указанные исследования выполнены в соответствии с МУ 1.1.578-96 «Требования к постановке экспериментальных исследований по обоснованию предельно допустимых концентраций промышленных химических аллергенов в воздухе рабочей зоны и атмосферы».

Для изучения цитотоксического действия моющих, чистящих средств и ПАВ на суспензии сперматозоидов быка исследовались растворы образцов следующих экспериментально подобранных концентраций: 0,1%, 0,07%, 0,05%, 0,04%. С целью определения оптимального соотношения ПАВ в рецептурах моющих средств проводилась оценка цитоксичности модельных композиций с различной массовой долей ПАВ: 17 % АОС + 5 % Неонол АФ 9-10 и 15 % АОС + 3 % Неонол АФ 9-10; 17% ЛАБС+ 5% Неонол АФ 9-10 и 15 % ЛАБС + 3% Неонол АФ 9-10; 17 % ЛСЭ + 5 % Неонол АФ 9-10 и 15 % ЛСЭ + 3% Неонол АФ 9-10. Указанные модельные композиции составлены в соответствии с ГОСТ Р 51696-2000 «Товары бытовой химии. Общие технические требования».

Оценка цитотоксичности растворов исследуемых образцов проводилась по индексу токсичности Its на анализаторе изображений АТ-05. Индекс токсичности Is (в %) вычислялся для каждого раствора как отношение средней суммарной подвижности спермиев в опыте к средней суммарной подвижности суспензии спермиев в контроле:

Is = (Scponb7ScpK0HTp) • 100%,

где ScponbIT и ScpK0HTp — средние арифметические значения суммарной двигательной активности сперматозоидов в опыте и контроле.

Оптимальные регламенты применения препаратов бытовой химии на основе ПАВ установлены по величине остаточных количеств ПАВ на посуде при различных режимах споласкивания с применением фотоэлектроколориметрического метода (ГОСТ Р 51021-97 «Товары бытовой химии. Метод определения смываемости с посуды»).

Выявление зависимости степени цитотоксичности и адсорбционных свойств ПАВ от их физико-химических свойств выполнено с помощью математико-статистических методов на базе современных информационных технологий с применением программного обеспечения персональной компьютерной техники

Оценка качества результатов межлабораторных испытаний проводилась для каждой лаборатории по Z-индексу в соответствии с МИ

2417-97 «Оценка качества работы испытательных лабораторий продовольственного сырья и пищевых продуктов». Качество результата испытаний считают удовлетворительным, если абсолютная величина Z-индекса меньше 2. Знак Z-индекса указывает на завышение (+) или занижение (-) результата анализа относительного среднего значения. Качество результата испытаний считают сомнительным, если абсолютная величина Z-индекса находится между 2 и 3. Качество результата считают неудовлетворительным, если абсолютная величина Z-индекса больше 3.

Статистический анализ полученных в межлабораторном эксперименте данных проводился согласно ГОСТ Р ИСО 5725-2-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

Полученные результаты подвергались вариационно-статистической обработке, степень достоверности изучаемых показателей и сравниваемых величин оценивалась по критерию Стьюдента, статистическому изучению связи между двумя выборками с качественной изменчивостью, корреляционно-регрессионному статистическому анализу закономерностей содержания остаточных количеств ПАВ в смывах с посуды в зависимости от различных факторов проведен на компьютере с использованием прикладных программ с помощью Microsoft Excel-97 в среде Windows.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Исследования, выполненные в рамках настоящей работы, направлены на дальнейшее изучение альтернативных биологических моделей с целью применения их в токсикологических экспериментах, разработке и обоснованию методических подходов скрининга моющих и чистящих средств с использованием суспензии сперматозоидов быка.

На первом этапе исследований были определены токсикопара-метры острой токсичности образцов моющих и чистящих средств для лабораторных животных при пероральном и дермальном путях поступления.

Изучение пероральной токсичности позволило определить класс опасности моющих и чистящих средств согласно общепринятой классификации вредных веществ, при этом 55 образцов (82,1 %) отнесены к 4 классу опасности (ЛД50ас более 5000 мг/кг), 12 образцов (17,9 %) — к 3 классу опасности (ЛД50ас от 151 до 5000 мг/кг) — средства,

применяемые для посуды «Альфа-М», для мытья посуды в п/м машинах «Calgonit Ultra Pulver», чистки кухонных плит «Истра», ванных комнат и с/у «DanKlorix», чистки изделий из металла «Cillit Bang» и «Rorax», чистки п/м машин «Calgonit», любых поверхностей «РУСАН-Т» марки «Н» и «РУСАН-Т» марки «П», стиральный порошок «Оникс-универсал», «Оникс-автомат», «Оникс-с активным кислородом».

При оценке местного раздражающего действия на кожу лабораторных животных выявлено 14 образцов (21%), обладающих раздражающим эффектом. Из них 3 образца (4,5%) согласно действующим методическим указаниям отнесены к 3 классу опасности (выраженное раздражающее действие — ярко-красный тон кожи, слабый отек) — средство для чистки ванных комнат и с/у «DanKlorix», средства для изделий из металла «Cillit Bang» и «Rorax»; 7 образцов (10,5%) отнесены к 2 классу опасности (умеренное раздражающее действие — красный тон кожи) — средство для посуды «Альфа-М», для применения в п/м машинах «Calgonit Ultra Pulver» и «Calgonit», для чистки кухонных плит «Истра», для любых поверхностей «РУСАН-Т» марки «Н» и «РУСАН-Т» марки «П», стиральный порошок «Оникс-автомат»; 4 образца (6 %) отнесены к 1 классу опасности (слабораздражающее действие — розовый тон кожи) — для уборки кухни «Mr Proper», для чистки кухонных плит «Help», для чистки п/м машин «Bluten Weiss — spezial», стиральный порошок «Оникс-универсал».

Все исследуемые препараты оказывали раздражающее действие на слизистые оболочки глаз.

В токсикологических исследованиях трех экспериментальных составов жидких чистящих средств установлено, что в нативном виде препараты при эпикутанном 14-дневном воздействии не проникают в организм и не оказывают влияния на гематологические, биохимические показатели и центральную нервную систему организма. С целью выявления возможного сенсибилизирующего эффекта исследуемых чистящих средств в 1 % концентрации ставили метод кожной капельной пробы на 21 день эксперимента, реакцию специфического лизиса лейкоцитов и непрямой дегрануляции тучных клеток. На основании проведенных исследований сделан вывод, что в изученной концентрации образцы не оказывают сенсибилизирующего действия на организм млекопитающих. Для исследованных трех рецептур жидких чистящих

средств, где содержание ПАВ составляет не более 15 %, раствор 1 % концентрации можно рекомендовать как рабочий.

Оценку цитотоксичности исследуемых образцов моющих и чистящих средств проводили по изменению двигательной активности сперматозоидов быка, которая зависит от нарушения клеточных структур и функций. Как критерий оценки цитотоксичности применялся индекс токсичности 1б. Доза моющих и чистящих средств, которая является недействующей для целостного организма млекопитающих, при прямом воздействии на клетку оказывает сильное цитотоксическое действие, поэтому для выявления цитотоксичности на сперматозоидах быка нами был подобран диапазон концентраций: 0,1 %—0,04 %, в пределах которого выявлена прямая зависимость подвижности сперматозоидов быка от концентрации действующих препаратов

Рис. 1. Зависимость индекса токсичности от концентрации растворов исследуемых образцов № 1—8.

Растворы моющих и чистящих средств в концентрациях 0,1 % и 0,067 % вызывали выраженный цитотоксический эффект, индекс токсичности составлял менее 70 %. Концентрация 0,05 % оказывала слабое цитотоксическое действие, индекс токсичности составлял более

70 %. При действии растворов в концентрации 0,04 % двигательная активность сперматозоидов сохранялась.

Результаты наших исследований по изучению цитотоксического действия моющих и чистящих средств на основе ПАВ с применением суспензии сперматозоидов быка согласуются с имеющимися в литературе данными о том, что механизм цитотоксического действия ПАВ основан на активном взаимодействии компонентов моющих средств с липидами клеточных мембран, в результате чего мембрана диссоциирует на смесь комплексов «липид-ПАВ», «белок-липид-ПАВ» и образуется комплекс «белок-ПАВ» (А.В.Кравцов, И.Р.Алексеенко, 1995 г.). Это приводит к нарушению клеточного метаболизма, проницаемости клеточных мембран, энергетического обмена.

Известно, что главным источником энергии для поступательного движения сперматозоидов является аденозинтрифостфат (АТФ), синтез которых осуществляют митохондрии. Двигательная функция сперматозоидов сохраняется до тех пор, пока в клетке митохондрии синтезируют АТФ (С.А. Бурнашева, 1960; Н.П. Шергин, 1967; И.И. Соколовская, Р. Ойвадис и др., 1981).

Таким образом, можно предположить, что действие изученных ксенобиотиков на сперматозоиды приводит к нарушению проницаемости мембран митохондрий, вызывая прекращение их работы, и тем самым нарушая энергетический обмен клетки, что приводит к изменению двигательной активности сперматозоидов.

Для установления возможности прогнозирования токсичности и опасности моющих и чистящих средств для теплокровных по результатам, полученным в эксперименте с применением суспензии сперматозоидов быка был проведен корреляционный анализ данных и разработка методических подходов скрининга.

Установленные токсикопараметры моющих и чистящих средств для теплокровных животных при перорапьном и дермальном путях поступления сопоставлялись со значениями индекса токсичности Is, полученными при исследовании растворов испытуемых средств in vitro. Результаты математического моделирования позволили установить достоверную сильную корреляционную связь между величинами ЛД50ас и индексом токсичности Is, максимальные значения коэффициента корреляции выявлены при исследовании растворов в концентрации 0,04% в интервале значений индекса токсичности 70—

130 % (для нижней границы интервала г= 0,75, верхней границы г= 0,95), данные представлены в табл. 2. Для изученных 67 образцов установлена также достоверная корреляционная связь между раздражающим действием на кожу и индексом токсичности (для нижней границы интервала г= 0,59; верхней границы г=0,31).

Результаты корреляционного анализа позволили разработать и обосновать методические подходы скрининга моющих и чистящих средств с применением суспензии сперматозоидов быка: концентрация испытуемого раствора - 0,04 %, интервал значений индекса токсичности Ь 70- 132 %%.

Таблица 2.

Коэффициент корреляции при различных концентрациях растворов изученных моющих и чистящих средств между значениями индекса токсичности и установленными токсикопараметрами для теплокровных животных

Концентрация МСиЧС Интервал значений индекса токсичности Is (%) Коэффициент корреляции

Острая токсичность при пероральном поступлении (ЛД50) 0,067 % 65-130 0,38-0,1

0,05 % 60-128 0,59-0,85

0,04 % 70-132 0,75 - 0,92

Местное раздражающее действие 0,067 % 40-150 0,32- -0,07

0,05 % 70-130 0,42-0,19

0,04 % 70— 130 0,59-0,31

Экспериментально установленные критерии оценки цито-токсичности позволили установить, что из изученных 67 образцов чистящих и моющих средств для 17 образцов (25,4%) значение индекса токсичности лежат вне интервала 70—132%, из них 12 образцов (17,9%) относятся к умеренно опасным веществам при

пероральном введении и/или обладают умеренным или выраженным кожно-раздражающим эффектом.

Для 5 образцов (7,5 %) при исследованиях на суспензии сперматозоидах быка были получены ложноположительные результаты (выявлено цитотоксическое действие), а в экспериментах на лабораторных животных ЛД50 составляла более 5000 мг/кг и не выявлено раздражающего действия на кожу. Анализ рецептур указанных 5 образцов моющих и чистящих средств показал, что в состав включены натрия гидроокись или органические кислоты, которые возможно вызывают изменение рН раствора, тем самым, оказывая цитотоксическое действие на суспензию сперматозоидов быка, для которой характерна среда рН 5,9—7,3. Таким образом, при оценке токсичности моющих и чистящих средств на суспензии сперматозоидов быка рН рабочего раствора в концентрации 0,04 % должен быть в пределах 5,0—7,0.

Для 3 образцов (4,5 %) моющих и чистящих средств на суспензии сперматозоидов быка были получены ложноотрицательные результаты, то есть цитотоксичность при установленных условиях эксперимента не была выявлена, однако при однократном нанесении на кожу животных выявлено слабое раздражающее действие, ЛД50 при этом составляла более 5000 мг/кг. Таким образом, применение суспензии сперматозоидов быка уместно для интегральной оценки наличия раздражающего действия (есть/нет), а для определения выраженности раздражающих свойств и классификации по данному эффекту не представляется возможным.

Моющие и чистящие средства представляют собой многокомпонентные продукты, основой которых являются поверхностно-активные вещества. Санитарно-химические исследования и изучение параметров цитотоксичности ПАВ были включены в следующий этап работы.

Для чистящих средств на основе ПАВ одним из критериев их безопасности в быту является содержание допустимых остаточных количеств (ДОК) после обработки ими изделий на уровне, не превышающем ПДК ПАВ для воды водоемов хозяйственно-питьевого и культурно-бытового водопользования. Допустимые концентрации оста-

точных количеств на посуде анионных (0,5 мг/л) и неионогенных (0,1мг/л) ПАВ установлены на уровне ПДК для воды водоемов хозяйственно-питьевого и культурно-бытового водопользования.

В эксперименте установлено, что двукратный режим ополаскивания посуды после ее обработки ПАВ является оптимальным: при данном режиме все исследованные ПАВ имели остаточные количества на посуде менее ПДК для водоемов (0,5 мг/ дм3). Самые минимальные количества определены у додецилсульфата натрия (0,033 ± 0,02 мг/дм3) и неонола АФ 9-12 (0,001 ± 0,0007 мг/дм3) — рис. 2.

1,2 1 г 5 0,8 ■ 51" 0'6' 1" 0,4 - а X 0,2 0

Л 1 л Г

Додецил-супьфат натрия Сульфонол й-олефин-сульфаты Лаур ил-су льфо-этоксилат Неонол АФ 9-12 1лиепзо1 А07

□ двукратное ополаскивание 0,033 0,1855 0,23 0,209 0,001 0,101

И однократное ополаскивание 0,17 1,102 0,294 0,251 0,298 1,084

Рис. 2. Остаточные количества ПАВ на посуде при различных режимах

споласкивания.

Наибольшей сорбцией на посуде без споласкивания водой обладают неионогенные ПАВ (Неонол АФ 9-12 — 28,118 ± 7,03 мг/дм3; Ьи1епБо1 А07 — 23,393 ± 5,85 мг/дм3), из анионных ПАВ наибольшей сорбционной способностью без споласкивания посуды после ее обработки ПАВ обладает сульфонол (4,763 ±1,191 мг/дм3).

В эксперименте показано, что степень адсорбции ПАВ на посуде зависит от физико-химических свойств ПАВ, в том числе и от молекулярной массы. На основании проведенного регрессионного анализа ус-

тановлено, что с увеличением молекулярной массы увеличивается сорбционная способность ПАВ (г=0,98), при двукратном режиме ополаскивания посуды в воду с ее поверхности лучше всего переходят ПАВ с большой молекулярной массой (г=0,78).

Биологическая активность химических веществ зависит от их физико-химических свойств. В результате корреляционно-регрессионного анализа выявлена достоверная прямая зависимость между цитотоксическим действием ПАВ и их молекулярной массой (г=0,73), а также температурой кипения (г=0,85).

По результатам исследования действия на суспензию сперматозоидов быка изучаемые ПАВ можно расположить следующим образом в порядке убывания их цитотоксичности: неонол АФ 9—12 > ЬЩепэо! АО 70 > сульфонол > додецилсульфат натрия > лаурилсульфоэтокси-латы > альфа-олефинсульфонаты.

Таким образом, наиболее приемлемыми с позиций гигиенической безопасности для включения в состав препаратов являются: из неоногенных ПАВ — неонол АФ 9—12, из анионных ПАВ —лаурилсульфоэтоксилаты, альфа-олефинсульфонаты.

Изучение цитотоксичности композиций моющих и чистящих средств на стадии их разработки, при выборе компонентов рецептур и их оптимальных соотношений является одним из основных критериев гигиенического прогнозирования, направленного на создание безвредных для здоровья человека товаров бытовой химии на основе ПАВ. В эксперименте с применением суспензии сперматозоидов быка установлено, что при содержании в композиции анионных ПАВ до 15 %, неио-ногенных ПАВ до 3 % цитотоксическое действие отсутствует, значение индекса токсичности Ь выше 70 % и ниже 132 %, что может быть положено в основу гигиенических требований к безопасности при изготовлении моющих и чистящих средств.

Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о возможности применения суспензии сперматозоидов быка для прогнозирования токсичности моющих и чистящих средств для теплокровных животных по показателям острой пероральной токсичности и/или кожно-раздражающего действия при скрининге данного вида продукции и для оценки общей цитотоксичности ПАВ и их композиций.

Использование на практике экспресс-метода с применением клеточного тест-объекта для оценки моющих и чистящих средств позволяет оптимизировать токсикологические исследования на этапе острого эксперимента. Данный метод эффективен на предварительном этапе токсикологических исследований продукции с известными токсическими свойствами при проведении токсикологических оценок, а так же при сертификации соответствия продукции при осуществлении Госсанэпиднадзора.

С целью апробации разработанного метода в межлабораторных сравнительных испытаниях и установления объективности, достоверности и воспроизводимости результатов исследования токсичности моющих и чистящих средств с применением суспензии сперматозоидов быка были привлечены 10 токсикологических лабораторий центров гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора. В программу исследований было включено: выбор и подготовка контрольных образцов; статистическая обработка результатов эксперимента; рекомендации по оформлению отчетных данных; анализ, обобщение и оценка качества результатов эксперимента.

По результатам межлабораторного эксперимента установлены меры прецизионности для данного метода измерений, которые имеют следующие значения:

- стандартное отклонение повторяемости зг= 19,7%;

- стандартное отклонение воспроизводимости Бя = 25,2%;

- относительное стандартное отклонение воспроизводимости 1,3%.

Стандартные отклонения повторяемости и воспроизводимости, служат основанием для принятия решения о приемлемости результатов измерений индекса токсичности при скрининге чистящих и моющих средств, полученных в условиях воспроизводимости в разных лабораториях.

Оценка качества результатов испытаний для каждой лаборатории проведена по г-индексу (рис. 3).

Рис. 3. Оценка качества результатов испытаний моющих и чистящих средств в межлабораторном эксперименте.

86,8 % результатов оценки токсичности моющих и чистящих средств при скрининге, полученных в межлабораторном эксперименте, признаны удовлетворительными.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что суспензия сперматозоидов быка обладает высокой чувствительностью к действию моющих и чистящих средств при установлении их цитотоксического действия. Выраженное цитотоксическое действие выявлено при 0,1 и 0,067 % концентрациях рабочих растворов моющих и чистящих средств (индекс токсичности менее 70 %), слабовыраженное — при 0,05 и 0,04 % концентрациях (индекс токсичности более 70 %).

2. Установлено, что из 67 исследованных образцов моющих и чистящих средств по острой пероральной токсичности к умеренно опасным веществам относятся 17,9%, малоопасным — 82,1 %. По степени выраженности раздражающего действия на кожу: 79 % не обладали раздражающим действием (0 класс), 6 % оказывали слабораздражающее

действие (1 класс), 10,4% — умеренное раздражающее действие (2 класс), 4,5 % — выраженное раздражающее действие (3 класс).

3. С токсиколого-гигиенических позиций с использованием данного альтернативного метода разработаны и обоснованы оптимальные параметры оценки токсичности моющих и чистящих средств: концентрация рабочего раствора — 0,04 %, границы значений индекса токсичности, находящиеся в интервале, 70—132 %.

4. Выявлено цитотоксическое действие у 25,4 % образцов. Для изученных 67 образцов установлена сильная корреляционная зависимость между величинами ЛД50ас и индексом токсичности (для нижней границы интервала г= 0,75, верхней границы г= 0,95), а также достоверная корреляционная связь между раздражающим действием на кожу и индексом токсичности (для нижней границы интервала г= 0,59; верхней границы г=0,31).

5. Повторяемость и воспроизводимость результатов, полученных при скрининге моющих и чистящих средств, установленных в межлабораторном сравнительном эксперименте, имеют следующие значения: стандартное отклонение повторяемости 5Г= 19,7; стандартное отклонение воспроизводимости = 25,2; относительное стандартное отклонение воспроизводимости Я50к= 1,3.

6. Уровень токсичности и опасности моющих и чистящих средств определяется физико-химическими свойствами содержащихся в них ПАВ. Установлена достоверная корреляционная связь между цитотоксическим действием ПАВ и их молекулярной массой (г=0,73), а также температурой кипения (г=0,85). По цитотоксичности исследованные ПАВ располагаются в следующем порядке: неонол АФ 912 > Ьи1епБо1 АО 70 > сульфонол > додецилсульфат натрия > лаурил-сульфоэтоксилаты > альфа-олефинсульфонаты.

7. Оптимальным с гигиенической точки зрения следует считать совместное содержание в рецептурах моющих и чистящих средств анионных ПАВ — не более 15 %, неионогенных — 3 %.

8. С гигиенических позиций обоснованы оптимальные регламенты применения моющих и чистящих средств, при которых остаточные количества ПАВ на посуде были ниже утвержденных ПДК: концентрация анионных ПАВ от 0,033±0,02 до 0,230±0,115 мг/дм3;

неионогенных ПАВ - от 0,001±0,0007 до 0,Ю1±0,05 мг/дм3. На основании выявленных достоверных корреляционно-регрессионных зависимостей показано, что с увеличением молекулярной массы ПАВ повышается степень их адсорбции на посуде (г=0,98).

9. Научно обоснована возможность применения данной альтернативной модели для определения стартовых доз в остром эксперименте на лабораторных животных на предварительном этапе токсиколого-гигиенических исследований.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Двоскин Я. Г., Меньшикова Т. А, Ерофеева Л. Ф., Федосеева Т.А. Деятельность токсикологических отделений (лабораторий) центров Госсанэпиднадзора в 2001 г. / Инф. сборник статист, и аналит. материалов.— М., 2002.— 10 с.

2. Двоскин Я. Г., Меньшикова Т. А, Ерофеева Л. Ф, Федосеева Т. А. Деятельность токсикологических отделений (лабораторий) центров Госсанэпиднадзора в 2002 г. / Инф. сборник статист, и аналит. материалов.— М., 2003.— 10 с.

3. Двоскин Я. Г., Меньшикова Т. А., Федосеева Т. А., Завьялов Н. В., Халепо А. И., Еськов А. П. Оценка токсичности товаров бытовой химии. Метод in vitro на кратковременной суспензионной культуре подвижных клеток — сперме быка // Тезисы докладов. 2 съезд токсикологов России 10—13 ноября 2003 г.— М., 2003,— С. 86—87.

4. Федосеева Т. А. Экспресс-метод оценки токсичности чистящих и моющих средств. // Здоровье населения и среда обитания. Инф. бюллетень,— 2004,— С. 39—43.

5. Меньшикова Т. А., Федосеева Т. А. Оценка токсичности чистящих и моющих средств методом in vitro на кратковременной суспензионной культуре подвижных клеток — сперме быка.// Токсикологический вестник,— 2004,— № 6.— С. 17—20.

6. Федосеева Т. А. Применение альтернативных биологических тест-объектов для прогнозирования токсичности и опасности товаров бытовой химии. // Окружающая среда и здоровье./ Сб. мат. Всероссий-

ской научно-практ. конференции молодых ученых и специалистов.— Суздаль, 2005,—С. 537.

7. Федосеева Т. А. Использование методов, альтернативных испытаниям на животных, в токсикологических подразделениях центров Госсанэпиднадзора // Здоровье населения и среда обитания. Инф. бюллетень,— 2005,— № 9,— С. 27—31.

8. Федосеева Т. А. Альтернативные биологические модели в работе токсикологических подразделений центров гигиены и эпидемиологии//Гигиеническая наука и санитарная практика./ Сб.мат. научно-практической конференции.— М.— 2005.— С. 127—129.

ЛР № 021232 от 23.06.1997 г.

Подписано к печати 26.02.2007 г. Формат 60x84/16 Тираж 100 экз. Усл. печ. л. 1,5

117105, Москва, Варшавское шоссе, 19а Телефон: (095) 954-45-36, факс: (095) 952-03-10; (095) 952-65-54 e-mail: gsen@fcgsen.ru Ризограф Федерального центра гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора