Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Гены иммунного ответа и их комбинации в качестве предиктовых маркеров потенциального риска развития активного туберкулеза легких и его клинических фенотипов у представителей русской популяции Челябинской области

Наградах рукописи

Беляева Светлана Валерьевна

ГЕНЫ ИММУННОГО ОТВЕТА И ИХ КОМБИНАЦИИ В КАЧЕСТВЕ ПРЕДИКТОВЫХ МАРКЕРОВ ПОТЕНЦИАЛЬНОГО РИСКА РАЗВИТИЯ АКТИВНОГО ТУБЕРКУЛЕЗА ЛЕГ КИХ И ЕГО КЛИНИЧЕСКИХ ФЕНОТИПОВ У ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РУССКОЙ ПОПУЛЯЦИИ ЧЕЛЯБИНСКОЙ ОБЛАСТИ

14.03.09 - Клиническая иммунология, аллергология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Челябинск-2014

Работа выполнена на кафедре микробиологии, иммунологии и общей биологии федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Челябинский государственный университет»

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор

Бурмистровв Александра Леонидовна

Официальные оппоненты:

Гусев Евгений Юрьевич доктор медицинских наук, профессор, Институт иммунологии и физиологии Уральского отделения Российской академии наук, лаборатория иммунологии воспаления, заведующий

Заморина Светлана Анатольевна доктор биологических наук, Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии паук (ИЭГМ УрО РАН), г. Пермь, лаборатория иммунорегуляции, старший научный сотрудник

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение

«Государственный научный центр «Институт иммунологии» Федерального медико-биологического агентства России, г. Москва

Защита диссертации состоится « /9 » 2014 года в _ часов на

заседании Диссертационного совета Д 208.117.03 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, по адресу: 454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «ЮжноУральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации и на сайте www.chelsma.ru.

Автореферат диссертации разослан "_"_2014 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор медицинских наук

Ю.С. Шишкова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности

Туберкулез (ТБ) является одной из постоянных глобальных проблем здоровья населения планеты. Несмотря на широкомасштабную вакцинацию, использование современных лекарственных препаратов и осуществление национальных и межнациональных программ контроля за туберкулезом (Borgdorff MW. et al. The re-emergence of tuberculosis: what have we leamt from molecular epidemiology? European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 2013. Vol. 19, Is. 10. P. 889-901) ежегодно в мире регистрируется 10 млн. новых случаев первичного туберкулеза и около 1,7 млн. смертей в год (Walzl G. et al. Immunological Biomarkers of tuberculosis. Nature Reviews Immunology. 2011. Vol. 11, Is.5. P. 43-54). Более того, по данным статистических исследований, 1/3 населения Земли инфицирована М. tuberculosis, но только 10% от всех инфицированных демонстрируют прогрессию к активным формам туберкулеза (Schuijt TJ. et al. The intestinal microbiota and host immune interactions in the critically ill. Trends in Microbiology. 2013. Vol. 21, Is.5. P.221-9, Walzl G. et al. Immunological Biomarkers of tuberculosis. Nature Reviews Immunology. 2011. Vol. 11, Is.5. P. 43-54, Vannberg FO. et al. Human genetic susceptibility to intracellular pathogens. Immunological Reviews. 2011. Vol. 240, Is. I. P. 105-16).

Представленные статистические данные порождают предположения о причинах и механизмах разнообразия в реализации ответа хозяина на возбудитель туберкулеза: 1) протективный иммунный ответ против М. tuberculosis с элиминацией возбудителя; 2) персистенция возбудителя на фоне клинического здоровья в течение нескольких лет (и даже в течение жизни); 3) конверсия асимптоматической инфекции в высоко контагиозную, клинически активную и потенциально смертельную форму заболевания (реактивацию) (Monack DM. Persistent bacterial infections: the interface of the pathogen and the host immune system. Nature Reviews Microbiology. 2004. Vol. 2, Is. 9- P. 747-65).

Характерной чертой персистентных инфекций, обусловленных высокоадаптированными к человеку возбудителями (в частности МБТ), является состояние динамического баланса между партнерами - возбудителем и «хозяином», изменения в котором могут потенциально обладать риском манифестации активного туберкулеза и трансмиссии возбудителя (Blaser MJ. et al. The equilibria that allow bacterial persistence in human hosts. Nature. 2007. Vol. 449. P. 843-9).

В свете сказанного, важным направлением исследований является поиск информативных биомаркеров персистентной инфекции и маркеров прогрессии заболевания к клинической форме, т.е. маркеров доклинического прогнозирования заболевания, использование которых позволит своевременно осуществлять профилактические эпидемиологические мероприятия.

В настоящее время широкие возможности для изучения гомеостаза человека в норме и при патологии представляют современные технологии, особенно в области геномики. Изучение генома человека складывается из 2 основных направлений, каждое из которых имеет положительные стороны и, в тоже время, для каждого существует множество требований и ограничений. 1. Оценка транскриптомной активности широко используется при изучении патогенеза заболеваний, в том числе инфекционной этиологии, и для идентификации биомаркеров конкретных состояний организма человека или динамических процессов. Однако, активность транскриптома во многом зависит от

окружающих факторов, от изменений, не имеющих отношения к изучаемой патологии, и может описываться профилями транскрипции генов, общими для многих заболеваний (Chaussabel D. et al. Assessing the human immune system through blood transcriptomics. BMC Biology. 2010. Vol. 8, Is. 84. P. 1-14). 2. Изучение структуры генома - идентификация общих полиморфизмов или редких мутаций, ассоциированных с заболеваниями. Параметры, измеряемые этими исследованиями, в частности частоты распределения полиморфных генов, генотипов, гаплотипов генов иммунного ответа, детерминируются наследованием и не изменяются в течение жизни, поэтому могут выступать в качестве маркеров потенциального риска развития заболевания и конкретных клинических фенотипов с учетом этногеографических характеристик. Ассоциации между общими вариантами генов, входящими и не входящими в ГКГС, и чувствительностью к ряду инфекционных заболеваний установлены (Vannberg FO. et al. Human genetic susceptibility to intracellular pathogens. Immunological Reviews. 2011. Vol. 240, Is. 1. P. 105-16). Дальнейшие исследования по изучению полиморфизма генов региона HLA и других, участвующих в развитии воспалительных ответов, позволят выделить прогностические маркеры конверсии асимптоматической инфекции в клинически активную форму туберкулеза; на их основе сформировать группы потенциального риска и определить подходы к персонализированной профилактике и терапии с использованием новых биотехнологий; выделить мишени для трансформации воспалительно-иммунных ответов хозяина на МБТ: от гиперпродуктивных к толерогенным, что даст возможность снизить деструкцию пораженного органа.

Цель исследования

Оценить особенности распределения вариантов и комбинаций генов, продукты которых участвуют в реализации иммунного ответа хозяина на встречу с возбудителем туберкулеза в русской популяции Челябинской области, у больных и здоровых лиц, с целью выделения маркеров потенциального риска развития активного туберкулеза легких и его клинических фенотипов.

Задачи исследования

1. Провести анализ связи аллелей и гаплотипов генов системы HLA с развитием клинически активного туберкулеза легких.

2. Определить варианты генов системы HLA и их гаплотипов, ассоциированные с клиническими фенотипами туберкулеза легких.

3. Оценить ассоциацию генов TLR2 и TLR4 и цитокинов ILlß, IL1RA, ILIO, TN FA, а также их генотипов и гаплотипов с клинически активным туберкулезом легких и его клиническими формами.

4. Установить распределение гаплотипов генов HLADRB l-TNFA(-308) у больных с активным туберкулезом и в контрольной группе.

5. Установить паттерны генов, включающие совокупность генов и их комбинаций системы HLA, цитокинов и TLR, соответствующие разным клиническим фенотипам.

Методология и методы исследования Данное исследование проведено в рамках научной проблемы «Популяционная иммуногенетика», раздел «Гены иммунного ответа и болезни». При выполнении экспериментальной части мы использовали традиционный подход к изучению иммуногенетики инфекционных заболеваний:

I. Оценили частоты распределения аллелей, генотипов и гаплотипов генов, продукты которых участвуют

1.1. в развитии воспаления:

-TLR - узнают микроорганизмы, их PAMPs (паттерны патоген-ассоциированных молекул), и вызывают ответ на них клеток воспаления,

- цитокины - организаторы межклеточных взаимодействий, регуляторы иммунного ответа;

1.2. в презентации микробных антигенов - молекулы HLA I и II классов АПК (антиген представляющих клеток).

Гены перечисленных компонентов иммунной системы обладают высокой полиморфностью, особенно система HLA, и для них характерны как межиндивидуальные, так и популяционно-географические различия в частотах аллелей, генотипов и гаплотипов (Селицкая Р.П. О полиморфизме DRBl-локуса системы HLA и восприимчивости к туберкулезу. Иммунология. 2009. № 6. С. 338341).

Учитывая данный факт, мы провели исследование на уровне:

внутрипопуляционной биологической гетерогенности. Для выделения иммуногенетических маркеров потенциального риска развития активного туберкулеза и его клинических форм проводили сравнительный анализ распределения генов и их комбинаций между здоровыми лицами и больными активными формами ТБ с использованием подхода случай-контроль.

- популяции - изучали популяцию русских, проживающих в Челябинске и Челябинской области и имеющих наибольшее представительство среди других народов на этой территории (84%) (Итоги Всероссийской переписи населения [электронный ресурс]. Москва, 2010. Режим доступа: http://www.gks.ru).

Методы исследования В работе применен комплекс современных молекулярно-генетических методов исследования: ПДРФ-анализ (анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов) и аллель-специфическая ПЦР (полимеразно-цепная реакция).

Степень достоверности, апробация результатов, личное участие автора Для оценки статистической значимости рассчитывали показатели непараметрической статистики: критерий Пирсона, критерий Пирсона с поправкой Йейтса для значений более, либо равных 5 и менее 10, точный критерий Фишера для значений менее S с применением пакета прикладных программ «Statistics 8.0». Для попарного сравнения трех групп больных использовали поправку Бонферрони (рс). Поправку на количество аллелей не применяли. Различающие возможности методов оценивали по критерию отношения шансов (OR) и их доверительным интервалам (CI) с помощью программы Ms Excel пакета Ms Office 2010. Для расчета величины неравновесного сцепления и частот гаплотипов методом максимального правдоподобия использовали программу Arlequin 3.S. Для графического представления распределения генотипов генов воспалительного ответа и пола больных относительно клинических фенотипов туберкулеза легких был использован метод канонического анализа соответствий (CCA - Canonical Correspondence Analysis) с помощью программного пакета PAST 2.17с.

Основные материалы диссертации представлены и обсуждены на конференции зональной лаборатории иммунологического типирования тканей «Фундаментальное и прикладное значение оценки генов иммунного ответа» (г. Челябинск, 2008), Международной конференции «Физиология и патология

иммунной системы» (г. Москва, 2008), Всероссийском научном форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (г. Санкт-Петербург, 2009), IX конференции Иммунологов Урала (г. Челябинск, 2011), X конференции Иммунологов Урала (г. Тюмень, 2012), научно-практической конференции, посвященной 15-летию биологического факультета ФГБОУ ВПО «ЧелГУ» (г. Челябинск, 2013).

Основные цели, задачи, положения, выносимые на защиту, и выводы сформулированы автором совместно с руководителем Бурмистровой А.Л. Разработка дизайна исследования, научно-информационный поиск, анализ и обобщение данных специальной литературы, определение необходимых методологических подходов исследования, выполнение большей части лабораторных исследований, математическая обработка полученных результатов выполнены лично автором. Набор материала для исследования проводился на базе ГБУЗ «Челябинский областной клинический противотуберкулезный диспансер» под руководством заведующей 3-его стационарного фтизиатрического отделения Ананьевой И.П. Обследование контрольной группы осуществлялось совместно с коллективом отделения молекулярно-биологической диагностики ОГУП «Челябинская областная станция переливания крови» (М.С. Чернова, М.Н. Вавилов, Д.С. Сташкевич, Е.О. Кошель) под руководством заведующей Сусловой Т.Д.

Положения, выносимые на защиту

1. В качестве этногеографических маркеров потенциального риска развития активных форм туберкулеза у русских Челябинской области могут использоваться комбинации генов (в терминах изменения аллельных частот) системы НЬА: А*02, А*24, ВИВ!* 16, и гаплотипов А*24-ОЯВ1»16, 1*16-0<5А1 »01:02-О0В1 «4)5:02.

2. Гены ОЯВ1*16 и 011В 1*03, находящиеся в неравновесном сцеплении с аллелем ТЫРА(-308)*А, и расширенный анцестральный европеоидный гаплотип АН 8.1., в состав которого входит высокопродуктивный аллель ПМРА(-308)ФА, могут рассматриваться у русских Челябинской области в качестве маркеров потенциального риска развития активного туберкулеза легких и его тяжелых клинических форм (фиброэно-кавернозный, инфильтративный в фазе распада, экссудативный плеврит).

3. Варианты клинических фенотипов туберкулеза ассоциированы у русских Челябинской области с определенной совокупностью комбинаций генов, генотипов и гаплотипов системы НЬА, цитокинов, и, в меньшей степени, ТЬЛ, что позволяет установить паттерны генов иммунно-воспалительного ответа хозяина, реализованного в конкретных клинических фенотипах с различным потенциалом поражения легких: фиброзно-кавернозном, инфильтративном и очаговом, которые можно использовать в качестве прогностических маркеров предрасположенности индивидуума к развитию тяжелой прогрессирующей или легкой формы заболевания.

Научная новизна

Впервые проведен анализ частот распределения генов системы НЬА и их сочетаний у больных активным туберкулезом легких русских Челябинской области и установлено, что комбинации генов системы НЬА - А*02, А*24, БЯВ1 + 16, и гаплотипов А*24-ОЯВ1*16, ОЯВ1*16-ОдА1«01:02-ОдВ1*05:02, можно

использовать в качестве этногеографических маркеров потенциального риска развития активной формы заболевания.

Впервые показано, что гаплотипы генов системы HLA, в составе которых присутствует высокопродуктивный аллель TNFA(-308)*A: HLADRB1*16-TNFA(-308)*А, HLADRB1 *03-TNFA(-308)*A и анцестральный европеоидный АН 8.1., могут рассматриваться у русских Челябинской области в качестве маркеров потенциального риска развития активного туберкулеза и его тяжелых клинических форм: фиброзно-кавернозной, инфильтративной в фазе распада и экссудативного плеврита.

Впервые установлены особенности распределения у больных туберкулезом русских Челябинской области генов и их комбинаций: системы HLA, цитокинов и TLR, что позволило описать паттерны генов иммунно-воспапительного ответа хозяина, реализованного в конкретных клинических формах: фиброзно-кавернозной, инфильтративной и очаговой, и предложить их в качестве маркеров прогноза предрасположенности к тяжелому прогрессирующему или легкому течению заболевания, которые могут быть использованы при разработке новых направлений в создании основ персонализированной профилактики и лечения.

Теоретическая и практическая значимость работы

Полученные данные могут быть использованы в научных исследованиях по направлениям биологии и медицины: «Молекулярная медицина», «HLA и болезни», «Инфекционные болезни». На основе полученных данных можно оценить индивидуальный риск развития активного туберкулеза легких и осуществить прогнозирование тяжести течения заболевания, что позволит разработать новые подходы к персонализированной профилактике и лечению.

Внедрение результатов исследования в практику

Результаты работы внедрены в учебный процесс: используются при преподавании отдельных тем курса иммунологии на биологическом факультете ФГБОУ ВПО «Челябинский государственный университет». Полученные данные о распределении аллелей и гаплотипов HLA в контрольной группе русских Челябинской области внесены в международную базу данных Allele Frequency Net Database (AFND).

Публикации

Автор имеет 28 опубликованных работ, из них по теме диссертации опубликовано 14 работ общим объемом 1,9 печатных листа, в том числе 9 работ в научных журналах, которые включены в перечень российских рецензируемых научных журналов и изданий для опубликования основных научных результатов диссертаций (3 статьи) и 4 работы в научных журналах, входящих в базу РИНЦ. Соискателем опубликовано 7 работ в материалах конференций.

Объем н структура диссертации

Диссертация изложена на 104 страницах компьютерного текста, проиллюстрирована 18 таблицами, 3 рисунками, состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием клинического материала и методов исследования, глав собственных исследований, обсуждения, заключения, выводов, указателя литературы, включающего 156 источников, в том числе 28 отечественных и 127 зарубежных.

в

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИОННОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа проводилась на базе ФГБОУ ВПО «Челябинский государственный университет» в рамках комплексной темы НИР «Популяционная иммуногенетика. Исследование полиморфизма генов иммунного ответа: генов гистосовместимости, генов стресса и генов цитокинов этнических групп Южного Урала» (№ государственной регистрации 01201257623).

Материалы и методы Группа исследования. Исследуемую группу составили 86 больных туберкулезом легких русской национальности, находящихся на стационарном лечении в Государственном бюджетном учреждении здравоохранения «Челябинский областной клинический противотуберкулезный диспансер». Постановка диагноза проводилась на основе клинико-рентгенологических показателей врачами-фггизиатрами ГБУЗ «ЧОКПТД». В исследование включены больные из русской популяции, проживающие на территории Челябинской области. Характеристика обследованных лиц представлена в таблице 1.

Таблица 1- Характеристика обследованных лиц

Обследованные лица Больные туберкулезом Группа контроля

НЬА-типирование Исследование БИР

Общее количество 86 239 85

женщины 29 109 36

мужчины 57 130 49

Средний возраст 47.38±1,22 39±0.75 34.06±0.75

Среди больных, согласно российской клинической классификации (Приказ МЗ РФ от 21.03.2003 N 109), выделены группы, представленные в таблице 2.

Таблица 2 - Клиническая характеристика больных туберкулезом легких

Диагноз Количество больных Количество больных, %

Инфильтративный туберкулез 53 61,63

Очаговый туберкулез легких 13 15,12

Фиброзно-кавернозный 11 12,79

Цирротический туберкулез 1 1,16

Экссудативный плеврит легких 2 2,33

Туберкулема легких 3 3,49

Диссеминированный 3 3,49

Бактериовыделение зафиксировано у 73% больных.

Мы проводили сравнение иммуногенетических показателей только в трех группах больных с различной степенью поражения органа-мишени: с

инфильтративной (ИФ), очаговой (ОФ) и фиброзно-кавернозной (ФКФ) формами туберкулеза легких, в связи с малым количеством больных с другими клиническими фенотипами заболевания.

Группу с очаговой формой составили больные с наличием очагов, локализующихся на ограниченном участке (< 1 см) одного легкого и малосимптомным клиническим течением.

Группу с инфильтративной формой составили больные с инфильтратами более 1 см. в одном или в двух легких и малосимптомным течением заболевания (32,08%), а также распространенными инфильтратами в фазе распада (67,92%) с бактериовыделением и клиническими проявлениями.

Группу с фиброзно-кавернозной формой составили больные с хроническим течением, характеризующиеся наличием в легких каверны или каверн с выраженной фиброзной капсулой и фиброзными изменениями в окружающей каверну легочной ткани, наличием очагов бронхогенного отсева и постоянным бактериовыделением.

Группы контроля. В качестве контрольных групп использовали популяционные выборки, сформированные случайным образом на основе ДНК-банка потенциальных доноров стволовой клетки ОГУП «Челябинская областная станция переливания крови»: 239 для HLA-типирования и 85 для определения SNP полиморфизмов представителей русской популяционной группы, проживающих в г. Челябинске и Челябинской области (таблица 1). Популяционная принадлежность определялась по данным генеалогического анамнеза до третьего поколения (согласно рекомендациям 8-го Международного Симпозиума в 1980г., Лос-Анджелес, США).

Группы больных и контроля имели одинаковый социоэкономический статус (социально-адаптированные слои населения).

Экспериментальную часть работы можно представить в виде схемы: Схема эксперимента

Выделение ДНК

Постановка ПЦР, амплификация рестрикция для полиморфизма tnfa.ilip генов ILlß, TNFA, TLR2 и TLR4*ti.R2 tlri

hla il1ra ilio

"Детекция результатов (электрофорез)

Статистическ1я обработка Частота аллеля %, частота гена, критерий х2, Х2° поправкой Йейтса, Фишера,

критерий OR, HF, D

Генотипирование генов системы HLA, цитокинов и TLR осуществляли путем ПДРФ-анализа и аллель-специфической ПЦР (таблица 3). Выделение ДНК

проводили с использованием реагентов PROTRANS DNA Box 500 согласно инструкции производителя. Метод детекции результатов - электрофорез в 3% агарозном геле и 8% ПААГе. Для амплификации использовали приборы 9700 GeneAmp Applied Biosystems (США) и «Терцик» НПФ «ДНК-Технология».

Таблица 3 - Характеристика полиморфных сайтов исследуемых генов

Ген Исследуемый локус Характеристика, рестриктазы, аллели, размеры после рестрикции

HLA HLAI(A,B) Наборы реагентов Protrans (Protrans, Germany), локус HLAA-24, HLAB-48 праймеров По статье Downing J.: HLAA- 30 праймеров, HLAB-46 праймеров

HLAII (DRB1, DQA1, DQBI) Наборы реагентов «HLA-ДНК-ТЕХ» (НПФ «ДНК-Технология», Москва), HLADRB1-11 праймеров, HLADQA1-8, HLADQB1-15. По статье Olerup О.: HLA*DRBI-19 праймеров, HLA*DQA1-12 праймеров, HLA*DQBl-26 праймеров.

IL-lß +3953 C/T Экзон 5: Taq 1 (65°С), Редкий Т: 550 п.н., частый С: 404, 146 п.н.

TN FA -238 G/A Промоторная часть: Bamlí I (37°С) Редкий А: 128 п.н., частый G: 109; 19 п.н.

-308 G/A Neo 1 (37°С) Редкий А: 126 п.н., частый G: 104; 22 п.н.

TLR4 Asp299Gly Neo I (37°С) Редкий G: 168; 20 п.н., частый А: 188 п.н.

Thr399Ile Hinf I (37°С) Редкий Т: 98; 26 п.н., частый С: 124 п.н.

TLR2 Arg753Gln Msp I (37°С) Редкий А: 104; 25 п.н., частый G: 129 п.н.

Arg677Trp MwoI(37°C) Редкий Т: 152п.н., частый С: 130+22 п.н.

ILIO -1082 G/A -819 C/T -592 C/A Промоторная часть: Наборы для аллель-специфической ПЦР ("Литех") Редкий А, частый G Редкий Т, частый С Редкий А, частый С

IL-IRa VNTR Variable Number of Tandem Repeats - вариабельное число тандемных повторов с участком 86 п.н. Интрон 2: аллели с 2-х, 3-х, 4-мя и 5-ти кратными повторами (2R, 3R, 4R, 5R)

Результаты собственных исследований

Решение I и 2 задач исследования было направлено на оценку вариантов генов и гаплотипов системы HLA I и II классов, способных внести вклад в реализацию ответа хозяина на возбудитель М.tuberculosis.

Сравнительный анализ частот распределения вариантов генов и гаплотипов генов I и II классов системы HLA больных активным туберкулезом легких и условно здоровых лиц

Установлено, что в геноме больных ТБ русских, проживающих в Челябинской области, чаще по сравнению со здоровыми лицами присутствуют специфичности HLA А*24 (30,2% и 17,6% соответственно, р=0,001, QR=2,03 и 95%

CI 1,15-3,58), DRB1*16 (13,9% и 6,3% соответственно, p=0,024, OR=2,45 и 95% CI 1,10-5,46) и гаплотип DRB1*16-DQA1*01:02-DQB1*05:02 (0,070 и 0,031, соответственно, р=0,027, OR=2,42 и 95% CI 1,08-5,39) и реже - А*02 (37,2% и 52,7% соответственно, р=0,01, OR=0,53 и 95% CI 0,32-0,88). Обнаружено, что аллели А*24 и DRB1*I6 образуют гаплотип A*24-DRBI*16, который чаще встречается у больных по сравнению с контрольной группой (HF 0,023 и 0,002 соответственно, р=0,016, OR=7,31 и 95% С1 1,39-38,23) и неравновесное сцепление между этими генами у больных выше (D'=0,192 и D-0,048 соответственно). Комбинации указанных генов и гаплотипов, вероятно, можно рассматривать как этногеографические маркеры, определяющие группы риска по развитию активного ТБ легких. Известно, что носители DRBI*16 характеризуются выраженным дисбалансом иммунологических показателей при туберкулезе (Кондакова М.Н. и соавт. Современные принципы лечения туберкулеза органов дыхания у подростков. Педиатрия. 2010. Т. 89, № 4. С. 58-62): у них снижена секреция IFNy и повышена секреция противовоспалительного ILIO, что ведет к преобладанию второго типа цитокинового ответа, поляризующего иммунный ответ в сторону гуморального (Dheenadhayalan V. et al. Association of interleukin-10 cytokine expression status with HLA non-DRBl*02 and Mycobacterium Bovis BCG scar-negative status in south Indian pulmonary tuberculosis patients. Infection and Immunity. 2001. Vol. 69, Is. 9. P. 5635-42). Гаплотип HLADRB1 *16-DQA 1*01:02-DQBl*05:02/04 с высокой частотой встречается у больных лепрой (Сароянц J1.B. Иммуногенетика лепры. Межпопуляционный аспект: автореф. дис. ...д-ра мед. наук / J1.B. Сароянц. - Москва, 2011. - 48 е.), которая имеет родственную этиологическую природу с туберкулезом. Для больных лепрой с данным гаплотипом установлен низкий уровень фагоцитоза, пролиферативной активности лимфоцитов и активности ЕК (Хаитов P.M. и соавт. Полиморфизм генов иммунного ответа и его роль в противоинфекционной защите. Иммунология. 2013. №3. С. 132-144). Учитывая тот факт, что с одним и тем же гаплотипом ассоциирована чувствительность к развитию активных форм туберкулеза и лепры, логично предположить, что для него характерна связь с генетически обусловленной отвечаемостью на конкретный инфекционный агент -микобактерии.

Анализ распределения вариантов генов и гаплотипов системы HLA у больных с разными клиническими фенотипами туберкулеза легких

При рассмотрении возможности выделения генов и их комбинаций системы HLA I и II класса в качестве биомаркеров клинических фенотипов туберкулеза, мы провели сравнительный анализ частот вариантов генов и гаплотипов системы HLA А, В, DRB1, DQA1, DQB1 у больных с разными клиническими вариантами течения (фиброзно-кавернозная (ФКФ), инфильтративная (ИФ) и очаговая (ОФ) формы туберкулеза легких) и установили следующие различия (таблица 4).

Таблица 4 - Частота генов HLA I и (I классов - В, DRB1, DQA1 и DQB1 в

группах больных с разными клиническими фенотипами туберкулеза легких

HLA Фиброшо-кавернозный (п=11) Инфильтративный (п=53) Очаговый (п=13)

Ах,% Ах,% Ах,%

В* 08 45,5 АВ 13,2* о"

В*15 18,2 3,8е 23,1е

DRB1 *03 54,5ав 20,8a 7,7"

DRB1*07 о" 28,3 38,5"

DRB1*15 18,2 13,2е 38,5е

DQA 1*02:01 0й 28,3 38,5В

DOB 1*06:02-8 36,4 20,8е 53,9е

Примечание - А - рс <0,05 для групп с фиброзно-кавернозным и инфильтративным туберкулезом В - рс <0,05 для групп с фиброзно-кавернозным и очаговым туберкулезом С - рс <0,05 для групп с инфильтративным и очаговым туберкулезом

Для больных тяжелой деструктивной ФКФ формой туберкулеза в отличие от ОФ (более легкое благоприятное течение) и ИФ характерна высокая частота встречаемости гена DRBI *03: по сравнению с ОФ (54% и 8% соответственно, р,.= 0,023, OR=14,4 и 95% CI 1,36-151,39) и ИФ (54% и 21% соответственно, рс=0,050, OR=4,58 и 95% CI 1,18-17,77). Более того, при ФКФ отмечена повышенная частота встречаемости гена HLA В*08 в сравнении с ИФ (45% и 13% соответственно, рс = 0,025, OR=5,47 и 95% CI 1,03-22,74). Этот ген отсутствовал в группе больных с ОФ. Гены HLA В*08 и DRBI*03 находятся в неравновесном сцеплении (D'= 1,000), составляя основу «классического» европеоидного анцестралыюго гаплотипа АН 8.1., который является мощным протектором против многих инфекционных заболеваний, но в тоже время известен своей ассоциацией с целым спектром аутоиммунных патологий. Предположительно, их механизм развития связан с гиперпродукцией TNFa и дефицитом С4 компонента комплемента (Candore G. et al. Pathogenesis of autoimmune diseases associated with 8.1 ancestral haplotype: effect of multiple gene interactions. Autoimmunity Reviews. 2002. Vol. 1, Is. 1-2. P. 29-35).

Гаплотип HLA A*01-B*08-DRB1*03-DQA1*05:01-DQB1*02:01 был определен только в группах больных с тяжелыми формами туберкулеза - с фиброзно-кавернозным туберкулезом легких, инфильтративным туберкулезом в фазе распада и экссудативным плевритом.

Заслуживает внимания и тот факт, что у больных с ФКФ не встречались специфичности HLA DRB1*07 и DQA 1*02:01 (после коррекции Бонферрони различия достоверны только в сравнении ФКФ и ОФ: рс=0,041). Установлено, что у всех носителей генов DRBI'I'07 и DQAI*02:0I наблюдалось закрытие полости и абациллирование (больные с ОФ и ИФ), что может свидетельствовать об их ассоциации с благоприятным течением инфильтративной и очаговой форм.

ОФ имела не только отличия с ФКФ, но и ИФ: у больных с ОФ определена достоверно высокая частота специфичностей HLA В* 15 (23% и 4% соответственно, рс =0,049, OR=7,65 и 95% CI 1,013-51,53), DRB1*15 (54% и 8% соответственно, рс = 0,023, OR=14,4 и 95% CI 1,36-151,39) и DQBl*06:02-8 (53,8% и 20,8% соответственно, рс=0,040, OR=4,45 и 95% CI 1,24-15,90) по сравнению с ИФ (у

больных ФКФ обнаружена тенденция к снижению частот данных генов после коррекции). Вероятно, для их носителей характерна форма иммунного ответа, позволяющая сформировать ограниченные локусы поражения без агрессивного развития деструкции ткани и экстрапульмонарного распространения.

Анализ распределения аллелей, генотипов и гаплотипов генов цитокинов /LIRA, lLlß, ILIO, TN FA у больных с клиническим туберкулезом легких

Мы установили, что для больных с клиническим туберкулезом легких по сравнению с контрольной группой характерны особенности распределения частот встречаемости аллелей, генотипов и гаплотипов renaTNFA:

- более высокие частоты - TNFA(-238)*A (9,30% и 3,53% соответственно, р=0,050, OR=2,80 95% CI 1,07-7,33), TNFA(-238)*G/A (18,60% и 7,06% соответственно, р=0,043, C)R=3,010 95% С1 1,12-8,09) и TNFA(-308)*G-TNFA(-238)*A (0,093 и 0,027 соответственно, р=0,030, OR=2.80, 95% CI 1,07-7,33), связанные с низкой продукцией цитокина;

- более низкие частоты - TNFA(-238)*G (90,70% и 96,47% соответственно, р=0,029 OR=0,36 и 95% CI 0,14-0,94) и TNFA(-238)*G/G (81,40% и 92,94%, р=0,024, OR=3,01 и 95% CI 1,12-8,09), связанные со средней продукцией TNFa. Результаты распределения представлены на рисунках 1 и 2.

□ больные ТБ В Контрольная группа

90,0

D больные ТБ р=0,015

■ контрольная группа

.......75.7 еа.з

- р =0,030 18,0

гЧ^, Г и

•G 'A "G/G "G/A (-308)-G-J-238)"G (-308l'G-(-23S)'A !-308)'G-t-238)'A

Рисунок 1 - Распределение аллелей и Рисунок 2 - Распределение гаплотипов гена

генотипов гена TNFA(-238)+G/A у больных TNFA(-380)-TNFA(-238) у больных туберкулезом легких и здоровых лиц туберкулезом легких и здоровых лиц

русской популяции русской популяции

Частоты полиморфных вариантов генов lljp(+3953); IL1RA; 1Ы0(-1082), -819, -592; TNFA(-308) в группе больных не имели статистически достоверных различий с группой доноров.

Анализ распределения аллелей, генотипов и гаплотипов генов цитокинов IURA, ILI/I, ILIO, TN FA у больных с разными клиническими фенотипами туберкулеза легких

При оценке ассоциации генов и генотипов цитокинов у больных с различными клиническими фенотипами туберкулеза были получены следующие результаты: частоты полиморфных вариантов генов ILIRA; TNFA(-238); 11Л0(-1082), -819, -592 не имели статистически достоверных различий. Распределение аллелей и генотипов генов lLlß(+3953) и TNFA(-308) представлено на рисунках 3 и 4.

0 фчброзно-какрнозный Я инфи/тьтративный □ очаговый

И фиброзно-каверноэмый tS инфильтра □ очаговый 2-0.022

!,0 -(----- RJWUV . *«<*

*G/A »G/G «G *4

Рисунок 4 - Распределение аллелей.

Рисунок 3 - Распределение аЖ.ейгена биотипов гена TOFA(-308) в группах

IL1 Р(+3953) в группах больных больных тувЧ*5™эом ле™!х с

. различными клиническими формами

туберкулезом легких с различными заболевания

клиническими формами заболевания

Сравнение генов и генотипов цитокинов при разных клинических формах туберкулеза легких.

1. При ФКФ в сравнении с ИФ у больных наблюдается высокая частота встречаемости вЕлсокопродуктивното аллеля ILip(+3953)*T (рисунок 3) (45,5% и 23,6% соответственно. рс=0,036, OR=2,7 и 95% CI 1,04-6,97) и низкая частота среднепродуктивного аллеля 1ЫР(+3953)*С (54,55% и 79,25% соответственно, рс=0,015, OR=0,31 и 95% CI 0.12-0,82). Генотип 1ЫР(+3953)*'Г/Т обнаружен только у больных с фиброзно-кавернозной формой.

2. Для больных очаговой формой по сравнению с фиброзно-кавернозной и инфильтративной формами характерны:

- низкая частота встречаемости высокопродуктивного гена TNFA(-308)*A (при сравнении с ФКФ (3,85% и 27,27% соответственно, рс= 0,023, OR =0,11 и 95% CI 0,01 -0,97 и ИФ (3,85% и 20,8% соответственно. рс=0,045, OR =0,15 и 95% CI 0,02 -0,99) и его гетерозиготного генотипа TNFA(-308)*G/A (в сравнении с ФКФ (7,7% и 54,6%, рс=0,023, OR=0,069 и 95% CI 0,01-0,74) и ИФ (7,7% и 37.7%, рс=0,048, OR =0.138 и 95% CI 0.02-0,99). Генотип TNFA(-308)*A/A обнаружен в единичном случае у больного с ИФ туберкулеза в фазе распада;

- высокая частота встречаемости аллеля со средней продукцией TNFA(-308)*G (при сравнении с ФКФ (96,2% и 72,73% соответственно, рс=0,050, OR =9,38 и 95% CI 1,03 -84,73) и ИФ(96,2% и 79,2% соответственно, рс=0,050, OR =6.55 и 95% CI 1,01-50,72) и генотипа TNFA(-308)*G/G при сравнении с теми же клиническими формами (с ФКФ (92,3% и 45,5% соответственно, рс=0,039, OR =14,4 и 95% CI 1,36 -151,39) и ИФ (92,3% и 60,4% соответственно, рс=0,050, OR =7,88 и 95% CI 1.01 -64,74).

Таким образом, показано, что для фиброзно-кавернозной и инфильтративной (распространенной) форм характерен провоспалительный цитокиновый генотип -частоты специфичносгей ILlf) (только у ФКФ) и TNFA выше, чем при очаговой форме. Известно, что гены этих цитокинов не только детерминируют защиту хозяина, но и кодируют основные провоспалительные медиаторы двух наиболее значимых классов нарушений при системном воспалении (Dinarello СА. Interlcukin-Ibeta and the autoinflammatory diseases. The New England Journal of Medicine. 2009. Vol. 360, Is. 23. P. 2467-70):

-аутовоспалительные заболевания, в которых развитие воспаления главным образом обусловлено цитокинами семейства IL);

-аутоиммунные заболевания, в развитии которых центральную роль играют цитокины семейства TNFa и комплемент.

Анализ распределения гаплотипов генов HLADRBl-TNFA(-308) у здоровых лиц и больных с активным туберкулезом легких и с разными клиническими формами

Мы изучили распределение гаплотипов HLADRBl-TNFA(-308) у здоровых и больных активным туберкулезом легких для выявления их ассоциации с развитием активного туберкулеза.

В ходе проведенного анализа установлено:

1) у больных специфичность DRB1*16 (частота его достоверно выше у больных по сравнению с контрольной группой) образует гаплотип с аплелем TNFA, кодирующим высокую продукцию фактора некроза опухолей: DRB1*16-TNFA(-308)*A (р=0,0075), в то время как в контроле встречается только гаплотип DRBI * 16-TNFA(-308)*G. У больных DRBI*16 находится в неравновесном сцеплении с аллелем TNFA(-308)*A (D'=0,072), а в контрольной группе они не сцеплены (D'=-1,000);

2) для больных по сравнению с контрольной группой характерна более высокая частота гаплотипа DRB1*03-TNFA(-308)*A (HF 0,09 и 0,04 соответственно, р=0,038, OR=2,61 95% CI 1,05-6,48).

Ген DRB1*03, как мы указывали ранее, с высокой частотой встречается у больных фиброзно-кавернозной формой и входит в гаплотип A*01-B*08-DRB1*03-DQA1*05:01-DQBI*02:01, который определен нами только у больных с тяжелыми формами туберкулеза. В состав шестилокусного гаплотипа A*01-B*08-TNFA(-308)*A-DRB 1 *03-DQA 1 *05:01 -DQB 1*02:01 входил только высокопродуктивный аллель TNFA. Данный гаплотип является частью расширенного анцестрального гаплотипа АН 8.1. (HLAA*01, В*08, TNFA(-308)*A, BfS, C4AQ0, С4В1, DRB 1*03, DQA1*05:01, DQB 1*02:01).

Известно, что высокоактивный аллель TNFA может обусловить тяжелое течение туберкулеза у человека. В основе такого процесса лежит бимодальный механизм работы высокого уровня TNFa, способный выступать промотором ранней резистентности макрофагов к МВТ (повышенная микробицидная активность), которая сменяется быстрым лизисом макрофагов вследствие активации программированного некроза (некроптоза) через индукцию продукции митохондриальных реактивных кислородных радикалов. Итогом этих событий является освобождение микобактерий в экстраклеточное окружение, их репликация и создание общей бактериальной нагрузки на организм (Roca FJ. et al. TNF Dually Mediates Resistance and Susceptibility to Mycobacteria via Mitochondrial Reactive Oxygen Species. Cell. 2013. Vol. 153. P. 521-534).

Анализ распределения аллелей, генотипов генов TLR4 и TLR2 у больных с различными клиническими формами туберкулеза легких

При оценке особенностей распределения вариантов генов TLR4 и TLR2 и их генотипов не установлены различия у больных активным туберкулезом и условно здоровых лиц.

В нашем исследовании в группах контроля и больных мы обнаружили только аллели дикого типа гена TLR2(Arg677Trp)*C, что согласуется с

литературными данными о низкой частоте встречаемости редкого аллеля TLR2(Arg677Trp)*T у европеоидов (Schröder NW. el al. High frequency of polymorphism Arg753Gln of the Toll-like receptor-2 gene detected by a novel allele-specific PCR. Journal of Molecular Medicine. 2003. Vol. 81. P. 368-372), в то время как в популяциях Африки он играет важную роль в развитии активного туберкулеза (Ben-Ali М. et al. Toll-like receptor 2 Arg677Trp polymorphism is associated with susceptibility to tuberculosis in Tunisian patients. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 2004. Vol. 11. P. 625-626).

При сравнении больных с различными фенотипами заболевания не обнаружены достоверные различия в распределении аллелей и генотипов гена TLR4, в то время как частота встречаемости аллеля TLR2(Arg753Gln)*G достоверно снижена у больных с ФКФ в сравнении с ИФ (86,4% и 99,06% соответственно, рс=0,018, OR=0,06 и 95% С1 0,01+0,61). Как мы предполагаем, наличие в генотипе больного с инфильгративной формой туберкулеза легких частого аллеля TLR2(Arg753Gln)*G можно считать маркером относительно благоприятного течения инфильтративных форм туберкулеза легких.

Анализ генетических комбинаций, участвующих в формировании воспалительного ответа, методом канонического анализа соответствий

Хорошо известно, что клетки врожденного иммунного ответа первыми реагируют на встречу хозяина с патогеном (Черешнев В.А и соавт. Иммунологические механизмы локального воспаления. Медицинская иммунология. 2011. Т. 13, № 6. С. 557-568). С помощью рецепторов, предназначенных для узнавания патогенов, в том числе TLR, они узнают и отвечают на PAMPs (паттерны патоген-ассоциированных молекул), а именно, выделяют цитокины, хемокины и другие активные молекулы и руководят иммунным ответом не только через презентацию антигена, но, как считают в последние годы, обеспечивают ключевыми сигналами Т-лимфоциты: сигналами дифференцировки наивных CD4+ Т-лимфоцитов в функциональные субтипы Т-хелперов (Walzl G. et al. Immunological Biomarkers of tuberculosis. Nature Reviews Immunology. 2011. Vol. 11, Is. 5. P. 43-54). В свете сказанного, для выявления комбинаций генов воспалительного ответа (IL 1 RA, ILIß, ILIO, TNFA, TLR2 и TLR4), формирующих паттерны, ассоциированные с клиническими фенотипами туберкулеза легких, мы использовали канонический анализ соответствий, который позволил результаты, полученные эмпирическим путем, представить графически в виде точек в пространстве низкой размерности, образованном двумя осями. На рисунке 5 представлен график с нанесенными на него клиническими фенотипами туберкулеза, полом больных и генотипами генов воспалительного ответа.

Дискретные переменные, имеющие сходное распределение, представлены точками, лежащими близко друг к другу, а с сильно различающимися распределениями - точками, далеко лежащими друг от друга по векторам. Векторы выделяют наиболее значимые факторы: показатели клинических форм и пола больных. Мерой качества полученного решения выступает процент инерции, объясненной двумя осями. График построен по первым двум осям инерции, наиболее полно описывающим информацию, заключенную в распределении генотипов генов и тендерных характеристик относительно клинических фенотипов туберкулеза (более 50% информации). Первая ось описывает 33,34% информации об ассоциации клинических фенотипов с определенными генотипами воспалительного ответа и полом больных, вторая ось - 22,17% инерции.

Рисунок 5 - График клинических фенотипов туберкулеза легких, генотипов генов цитокинов, TLR и тендерных различий по результатам ССА. Точками обозначены генотипы: 11Л0(-592)-серый, 11Л0(-819) - синий. IL10(-1082)-бордовый, IL1 Р(+3953) - фиолетовый, 1L1RA - черный, TLR2(Arg753Gln)-голубой, TLR4Thr399Ile - малиновый, TLR4Asp299Gly - зеленый, TNFA(-308)-красный, TNFA(-238) - оранжевый. Зеленый вектор - вектор формы туберкулеза, черный вектор - вектор пола.

Первая каноническая ось разделяет потенциальные факторы риска развития очаговой и инфильтративной форм: для ИФ - частоты встречаемости генотипов TNFA(-308)*G/A и TLR2(Arg753Gln)*G/G, для ОФ - TNFA(-308)*G/G и TLR4(TLR4Asp299Gly и TI,R4Thr399IIe).

Вторая ось - позволяет определить различия по потенциальным факторам риска развития ФКФ и ОФ: для ФК - частоты 1ЫР(+3953)*Т/Т, для очаговой -TNFA(-308)*G/G и TLR4(TLR4Asp299Gly и TLR4Thr39911e). Данная ось также отражает тендерные различия: для мужчин характерна фиброзно-кавернозная форма, для женщин - очаговая.

В целом полученные результаты согласуются с результатами анализа с использованием критерия Фишера: различия достоверны для распределения генотипов генов TNFA(-308)*G/A, TNFA(-308)*G/G, IL1[H+3953)*T/T (см, выше). Данные по распределению других генотипов генов (TLR2(Arg753Gln)*G/G и TNFA(-308)*A/A у больных с ИФ, TLR4(Asp299Gly)*A/G и TLR4(Thr399Ile)*C/T у больных с ОФ) не достигают статистической достоверности при использовании критерия Фишера. Генотипы TLR4(Asp299Gly)*A/G и TLR4(Thr399Ile)*C/T,

lb*T/T

фиброзно-кавернозный

/ Мужч>ий|.

туберкулами ¿TLR2(Arg753Gln)*G/G

экс.плеврю*Q/q ecJC™^ :еминированный

........ / f G/Ci ___

, _---—/ SC/C

/^^.TWyjefrGfaKsmmu i4r/5r*G/A ¡С/С инфильтративный f очаговый \ V

ТА *СП ,2г/\г у

•TLR4(Thr399Ile)*C/T I L \ .TNFA(-308)*AM/

|TLR4(Asp299Gly)*A/G J \ У

,TNFA(-308)*G/A

-2,4 -1,6 -0,8 0,0 0,8 1,6 каноническая ось 1 (33, 34% инерции)

которые на ординационной диаграмме расположены в направлении вектора ОФ, не обнаружены у больных с ФКФ. Подобные результаты были получены при изучении генов TLR4 при другом микобактериозе - лепре, где данные генотипы TLR4, несмотря на то, что приводят к нарушению функции рецептора, ассоциированы с устойчивостью к развитию заболевания (Hart В. et al. Genetic Diversity of Toll-Like Receptors and Immunity to M. leprae infection. Journal of Tropical Medicine. 2012. Vol. 2012. P. 1-12).

Анализируя результаты экспериментальной оценки распределения генов воспалительного ответа и их генотипов: рецепторов TLR2, TLR4 и цитокинов IL1RA, ILlß, ILIO, TNFA, ассоциированных с клиническими формами туберкулеза легких, и данные, полученные при использовании канонического анализа соответствий, можно предположить.

Для фиброзно-кавернозной формы туберкулеза наиболее характерным являются высокие частоты высокопродуктивного генотипа ILlß(+3953)*T/T (определен только у больных с фиброзно-кавернозной формой), гена TNFA(-308)*А и генотипа TNFA(-308)*G/A, ассоциированных с высокой продукцией TNFa, что позволяет говорить о провоспалительном цитокиновом генотипе. Вероятно, паттерн генов воспалительного ответа, способен модифицировать реализацию иммунного ответа хозяина на возбудитель в направлении неадекватного гипервоспалительного ответа, сопровождающегося периодами ремиссий/активаций, в итоге приводя к прогрессии и развитию тяжелой фиброзно-кавернозной формы.

Для очаговой формы - высокая частота (по сравнению с фиброзно-кавернозной и инфильтративной формами) аллеля TNFA(-308)*G и его генотипа TNFA(-308)*G/G, отличительным признаком которых является средняя продукция одного из самых ярких представителей провоспалительных цитокинов - TNFa. Вероятно, паттерн генов воспаления, ассоциированный с очаговой формой поражения, демонстрирует, при прочих равных условиях, наиболее благоприятный исход в реализации иммунного ответа хозяина на наличие инфекции.

Для инфильтративной формы (с распространенными инфильтратами) -провоспалительный цитокиновый генотип: высокие частоты аллеля TNFA(-308)*A и генотипов TNFA(-308)*G/A и TNFA(-308)*A/A, практически повторяет присущий ФКФ (за исключением ILlß). Можно предположить, что больные с таким генотипом могут представлять группу риска в отношении прогрессии заболевания к более тяжелой форме, в частности фиброзно-кавернозной, при наличии других гено-фенотипических особенностей организма больного.

Таким образом, можно допустить, что представленные паттерны генов воспаления демонстрируют возможные варианты воспалительного ответа хозяина на М.tuberculosis, ассоциированные с различными клиническими фенотипами туберкулеза легких у русских Челябинской области.

В завершении работы мы провели анализ результатов эмпирического исследования частот распределения всех изученных нами генов иммунного ответа, их генотипов и гаплотипов - HLA, ILlß, TNFA, у больных с различными клиническими фенотипами туберкулеза легких и сформировали паттерны генов и их комбинаций (в терминах изменения аллельных частот у больных) (рисунок 6), наличие которых в генетическом паспорте индивидуума, как мы предполагаем, в будущем позволит прогнозировать предрасположенность к развитию тяжелого прогрессирующего или легкого течения туберкулеза, а, следовательно, может

использоваться для разработки стратегий персонализированной профилактики и терапии.

Рисунок 6 - Профили паттернов генов иммунно-воспалительного ответа в качестве потенциальных факторов риска развития активных форм туберкулеза. Цветами обозначены: зеленый - частоты генов, характерные только для конкретной формы, красный - частоты генов, характеризующие только тяжелые формы (фиброзно-кавернозную, инфильтративную в фазе распада, экссудативный плеврит).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В основу проведенного исследования положен комплексный подход, при котором осуществлен анализ распределения полиморфных вариантов генов HLA, IL lß, IL IRA, ILIO, TNF A, TLR2 и TLR4 среди условно здоровых лиц и больных туберкулезом легких с различными клиническими фенотипами в русской популяции Челябинской области. Установлено:

- для больных характерна положительная ассоциация развития клинически активного туберкулеза с частотой носительства генов HLA и TNF А, что, вероятно, можно использовать в оценке потенциального индивидуального риска развития активных форм туберкулеза;

- определенная комбинация генов системы HLA, цитокинов TNF А и IL lß, и, в меньшей степени TLR2, ассоциирована с конкретными клиническими фенотипами туберкулеза легких, что, как мы предполагаем, позволяет прогнозировать течение заболевания (благоприятное или прогрессия развития тяжелых форм) и определять тактику дифференцированного подхода к лечению.

ВЫВОДЫ

I. Активная форма туберкулеза легких у русских Челябинской области ассоциирована с комбинацией генов HLA, в терминах изменения аллельных

частот: А*02, А*24, DRB1*16, и гаплотипов A*24-DRB1*I6, DRB1*16-DQA1 *01.02-DQB1 *05:02.

2. Основные отличия комбинаций генов системы HLA наблюдаются между фиброзно-кавернозной и очаговой клиническими формами туберкулеза легких: при фиброзно-каверноэной - высокая частота В*08 и DRBI*03 по сравнению с очаговой и отсутствие генов DRB1*07 и DQA1*02:01, при очаговой -отсутствие В*08. Кроме того, при очаговой форме установлена высокая частота В* 15, DRB1*I5, DQB 1*06:02-8 по сравнению с инфильтративной.

3. У больных с активным туберкулезом легких установлена высокая частота низкопродуктивного аллеля TNFA(-238)*A, генотипа TNFA(-238)*G/A и гаплотипа TNFA(-308)*G-TNFA(-238)*A, и низкая частота среднепродуктивного аллеля -TNFA(-238)*G и его гомозиготного генотипа TNFA(-238)*G/G по сравнению с контрольной группой.

4. Наличие провоспалительных цитокиновых генотипов является отличительной чертой фиброзно-кавернозной и инфильтративной (распросграненный вариант) клинических форм: высокие частоты высокопродуктивных гена TNFA(-308)*A, генотипа TNFA(-308)*G/A и генотипа ILip(+3953)*T/T (только для фиброзно-кавернозной формы).

5. Гаплотипы, в состав которых входит высокопродуктивный аллель TNFA(-308)*А, могут рассматриваться у русских Челябинской области в качестве маркеров потенциального риска развития активного туберкулеза легких -DRB1 * 16-TNFA(-308)*A и DRBI *03-TNFA(-308)*A, а также его тяжелых клинических форм (фиброзпо-кавериозный, инфильтративный в фазе распада, экссудативный плеврит) - анцестральный европеоидный АН 8.1.

6. Установлены паттерны генов, состоящие из совокупности комбинаций генов, их генотипов и гаплотипов: системы HLA, цитокинов, в меньшей степени, TLR, у больных русских Челябинской области, ассоциированные с конкретными клиническими формами туберкулеза, имеющими различный потенциал поражения легких: фиброзно-кавернозной, очаговой и инфильтративной.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ Полученные сведения об иммуногенетическом профиле больных с различными формами туберкулеза легких позволят использовать генетические биомаркеры, обладающие досимптоматическим диагностическим и прогностическим потенциалом, для персонализированной профилактики и лечения активного туберкулеза, а также разработать методы ранней доклинической диаг ностики туберкулеза легких у русских на Южном Урале.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Бурмистрова, АЛ. Иммуногенетический профиль больных туберкулезом и здоровых представителей русской этнической группы Челябинской области/ АЛ. Бурмистрова, C.B. Тимофеева, И.П. Ананьева, Т.А. Суслова // Аллергология и иммунология. - 2008. - Т. 9, № 3. - С. 288.

2. Тимофеева, C.B. Распределение антигенов системы HLA у больных туберкулезом и здоровых представителей русской этнической группы Челябинской области/ C.B. Тимофеева, И.П.Ананьева, Е.О. Кошель, А.Л. Бурмистрова//Вестник Челябинского государственного университета. Биология. -2008. - Вып. 1, №4,-С.38.

3. Бурмистрова, А. Л. Полиморфизм HLA В у больных туберкулезом легких представителей русской этнической группы Челябинской области/A.JI. Бурмистрова, С.В.Тимофеева, М.С.Чернова, И.П. Ананьева// Аллергология и иммунология. - 2009. - Т. 10, № 2. - С. 213-214.

4. Тимофеева, C.B. Анализ VNTR полиморфизма гена IL1RA у больных туберкулезом легких представителей русской этнической группы Челябинской области / С.В.Тимофеева, AJ1.Бурмистрова, Т.А.Суслова, Д.С. Сташкевич, И.ГЬАнаньева // Материалы Всероссийского научного форума с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге». Медицинская иммунология.- 2009. - Т. 11, Л» 4-5. - С. 397398.

5. Тимофеева, C.B. Полиморфизм HLA А у больных туберкулезом легких представителей русской этнической группы Челябинской области/ С. В.Тимофеева, Т.А.Суслова, М.Н.Вавилов, И.П. Ананьева, A.J1. Бурмистрова // Вестник гематологии. - 2009. - Т. 5, № 4. - С. 57-58.

6. Бурмистрова, А.Л. Анализ полиморфизма гена фактора некроза опухолей альфа у больных туберкулезом легких представителей русской популяции Челябинской области/ А.Л. Бурмистрова, Т.А.Суслова, C.B. Тимофеева, Д.С. Сташкевич, И.П. Ананьева// Материалы Национальной конференции « Аллергология и клиническая иммунология - практическому здравохранению» (г. Москва). Российский аллергологический журнал. - 2010. -№ 1, Вып.1. - С. 32-33.

7. Бурмистрова, А.Л. Ассоциация генов иммунного ответа и системы воспаления с туберкулезом легких/ А.Л. Бурмистрова, C.B. Тимофеева, Т.А. Суслова, И.П. Ананьева // Материалы межрегиональной научно-практической конференции, посвященной 75-летию службы крови Челябинской области (г. Челябинск). Актуальные вопросы клинической и производственной трансфузиологии. - 2010. - С. 129-132.

8. Тимофеева, C.B. Полиморфизм DRBI-локуса системы HLA у больных туберкулезом легких русской популяции Челябинской области/ C.B. Тимофеева, И.П. Ананьева// Вестник Уральской медицинской академической науки.- 2010. - Т. 2/1 (29). - С. 211.

9. Тимофеева, C.B. Полиморфизм HLA II у больных туберкулезом легких русской популяции челябинской области/ C.B. Тимофеева, АЛ. Бурмистрова, Т.А. Суслова, И.П. Ананьева // Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2011. - Т. 2. - С. 117-118.

10. Тимофеева, C.B. Функциональный полиморфизм гена IL10 у больных туберкулезом легких русских Челябинской области/ C.B. Тимофеева, А.Л. Бурмистрова, Д.С. Сташкевич, Т.А.Суслова, И.П. Ананьева // Труды национальной конференции «Клиническая иммунология и аллергология -практическому здравоохранению» (г. Москва). Российский аллергологический журнал. - 2012. - №1, вып.1. - С.308-309

11. Тимофеева, C.B. Распределение двухлокусных гаилотипов HLA-DRBI-TNFA(-308) у больных туберкулезом легких/ C.B. Тимофеева, Д.С. Сташкевич, Т.А. Суслова, И.П. Ананьева // Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2012. - Т. 4 (41). - С. 247-248.

12. Беляева, C.B. Анализ тендерных различий в распределении генов HLA у больных туберкулезом легких представителей русской популяции Челябинской

области/ С. В. Беляева, А. Л. Бурмистрова, Т. А. Суслова, И. П. Ананьева// Вестник Челябинского государственного университета. Биология. -2013 .- С. 29-30.

13. Беляева, C.B. Анализ двух полиморфизмов гена TLR4 у больных туберкулезом легких представителей русской популяции Челябинской области/ C.B. Беляева, AJ1. Бурмистрова, Т.А. Суслова, И.П. Ананьева // Материалы объединенного иммунологического форума (г. Нижний Новгород). Российский иммунологический журнал/Russian Journal of Immunology. - 2013. -T. 7(16),№2-3.-С. 159.

14. Беляева, C.B. Полиморфизмы гена TNFa(-308 и -238)у больных туберкулезом легких представителей русской популяции Челябинской области/ C.B. Беляева, Л.Л. Бурмистрова, Д.С. Сташкевич, Т.А. Суслова, И.П. Ананьева// Вестник Карагандинского университета. Серия: Биология. Медицина. География. -2013.-№3 (71).-С. 72-77.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АПК Антиген представляющие клетки

ГБУЗ Государственное бюджетное учреждение здравоохранения

ГКБ Городская клиническая больница

ГКГС Главный комплекс гистосовместимости

ЕК Естественные киллеры

ИФ Инфильтративная форма туберкулеза легких

МБТ Микобактерии туберкулеза

ОФ Очаговая форма туберкулеза легких

ПААГ Полиакриламидный гель

ПДРФ Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов

ПЦР Полимеразнал цепная реакция

ТБ Туберкулез

ФКФ Фиброэно-кавернозная форма туберкулеза легких

ЧОКПТД Челябинский областной клинический противотуберкулезный

CD диспансер

HF Маркер Т-хелперов

HLA Частота гаплотипа

IL Человеческий лейкоцитарный антиген

PAMPs Интерлейкин

Паттерны патоген-ассоциированных молекул

SNP Single Nucleotide Polymorphism/ полиморфизм по одному нуклеотиду

TLR Toll-like receptor/Толл-подобный рецептор

TNF Tumor necrosis factor/фактор некроза опухоли

VNTR variable number of tandem repeats/варьирующее число тандемных

повторов

На правах рукописи

Беляева Светлана Валерьевна

ГЕНЫ ИММУННОГО ОТВЕТА И ИХ КОМБИНАЦИИ В КАЧЕСТВЕ ПРЕДИКТОВЫХ МАРКЕРОВ ПОТЕНЦИАЛЬНОГО РИСКА РАЗВИТИЯ АКТИВНОГО ТУБЕРКУЛЕЗА ЛЕГКИХ И ЕГО КЛИНИЧЕСКИХ ФЕНОТИПОВ У ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РУССКОЙ ПОПУЛЯЦИИ ЧЕЛЯБИНСКОЙ ОБЛАСТИ

14.03.09 - Клиническая иммунология, аллергология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать 20.07.2014 Усл.печ.л. 1,4 Формат 60x88 1/8 Тираж 100 Заказ 248 Типогрефи» Сити-Принт ИП Мякотин И В. 454080, г. Челябинск, ул. Энгельса, 61

Челябинск-2014

-12159

2014157066