Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Гематологические механизмы адаптации к гипоксии и их фармакокоррекция

На правах рукописи

I

Зюзьков Глеб Николаевич

ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ АДАПТАЦИИ К ГИПОКСИИ И ИХ ФАРМАКОКОРРЕКЦИЯ

14.00.16 - Патологическая физиология

14.00.25 - Фармакология, клиническая фармакология

I

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Томск - 2006

Работа выполнена в ГУ научно-исследовательском институте фармакологии Томского научного центра СО РАМН

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор,

академик РАМН Гольдберг Евгений Данилович

доктор медицинских наук, профессор,

академик РАМН Дыгай Александр Михайлович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН

доктор медицинских наук

доктор медицинских наук

Новицкий Вячеслав Викторович Алиев Олег Ибрагимович Маслов Леонид Николаевич

Ведущая организация: ГУ научно-исследовательский институт физиологии Сибирского отделения РАМН

Защита состоится «_»_2006 г. в_часов на заседании

диссертационного совета Д 001.031.01 при НИИ фармакологии Томского научного центра СО РАМН (634028, г. Томск, пр. Ленина, 3)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ фармакологии Томского научного центра СО РАМН (634028, г. Томск, пр. Ленина, 3)

Афтореферат разослан «_»_2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Амосова Е.Н.

2 Мб - * 30034

2 ШУ2Э

1

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ГА - гемолитическая анемия

ГАМК - гамма-аминомасляная кислота

ГТО - гипоксия гермообъема

ГИМ - гемопоэзиндуцирующее микроокружение

Г-КСФ - гранулоцитарный колониестимулирующий фактор

ГО - гемопоэтический островок

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

КОЕ - колониеобразующая единица

КОЕ-ГМ - колониеобразующая единица гранулоцитарно-макрофагальная КОЕ-Э - колониеобразующая единица эритроидная КР - кровопотеря

КСА - колониестимулирующая активность

КСФ - колониестимулирующий фактор

МСК - мезенхимальная стволовая клетка

НСК - нейральная стволовая клетка

ОЦК - объем циркулирующей крови

ПСКК - полипотентная стволовая кроветворная клетка

САС - симпатоадреналовая система

СМФ - система мононуклеарных фагоцитов

ЦНС - центральная нервная система

ЭПА - эритропоэтическая активность

ЭПО - эритропоэтин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Гипоксия как типовой патологический процесс сопровождает практически все известные заболевания. Дефицит кислорода, нарушая энергетический обмен, вызывает повреждение, в первую очередь структур ЦНС, определяемое спецификой функционирования ее клеточных элементов. Основной особенностью последних является сочетание высокого уровня метаболической активности, сопряженной с интенсивным потреблением кислорода и большой скоростью обновления фонда макроэргичесьсих веществ [Girotti A.W., 1985; Рябов ГА., 1988; Алексеева A.B., Гурвич A.M., Семченко В.В., 2003; Лукьянова Л.Д., 2002; 2004; Гусев Е.И., Скворцова В.И., 2004]. Угнетение аэробного окисления в тканях головного мозга существенно реорганизует центральную нервную систему, изменяет интегративно-пусковую деятельность нейронов и приводит к формированию качественно нового паттерна взаимодействия отдельных мозговых структур, а в случае декомпенсации механизмов адаптации, запускает цепь патологических процессов, приводящих как к прогрессирующим неврологическим нарушениям (развитию энцефалопатии), так и расстройствам деятельности многих внутренних органов [Неговский В.А., Гурвич А.М., Золотокрылина Е.С., 1987; Krause G.S., White B.C., Aust S.D. e.a., 1988; Неговский B.A., 1991; Мороз B.B., 2002; Крыжановский Г.Н., 2002; Алексеева A.B., Гурвич А.М., Семченко В.В., 2003]. В то же время при гипоксии мозг сам становится объектом патогенных влияний органной патологии: нарушений гемодинамики, иммунного статуса, гемостаза и пр. [Неговский В.А., 1991; Negovsky V., 1995; Шевченко Ю.Л., 2000; Мороз В.В., 2002; Алексеева A.B., Гурвич А.М., Семченко В.В., 2003].

Система крови играет одну из ключевых ролей в поддержании гомео-стаза и формировании адекватных компенсаторно-приспособительных реакций организма при экстремальных воздействиях [Гольдберг Е.Д., 1992; Hasan М.М., 1996; Ястребов А.П., 1999]. С другой стороны, согласно имеющимся представлениям регуляция кроветворения осуществляется тесным взаимодействием локальных и дистантных контролирующих механизмов [Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Жданов В.В., 1999; Юшков Б.Г., Климин В.Г., Северин М.В., 1999; Захаров Ю.М., Рассохин А.Г., 2002]. При этом координирующая функция в развитии ответа гемопоэтической ткани на воздействия неблагоприятных факторов внешней и внутренней среды принадлежит именно центральному (нейроэндок-

ринному) звену регуляции [Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Хлусов И.А., 1997; Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Провалова Н.В. и др., 2004]. Вместе с тем до настоящего времени во многом остается не изучена роль как локальных, так и дальноранговых механизмов регуляции гемопоэза в формировании гематологических сдвигов при гипоксии различного генеза и степени тяжести. В частности, не существует данных о секреторной активности отдельных компонентов ГИМ при гипоксии, а также о роли межклеточной кооперации различных элементов микроокружения с кроветворными прекурсорами. К настоящему времени не решены многие вопросы, связанные со значимостью различных гуморальных факторов сыворотки крови в регуляции гемопоэза при гипоксических состояниях. Остается абсолютно не исследованным влияние энцефалопатии на формирование реакций системы крови при окислительной недостаточности, хотя считается доказанным важное значение нарушения деятельности ЦНС в развитии постреанимационной патологии других органов и систем, обеспечивающих постоянство внутренней среды [Krause G.S., White B.C., Aust S.D. e.a., 1988; Неговский B.A., 1991; Мороз B.B., 2002; Крыжановский Г.Н., 2002; Алексеева A.B., Гурвич A.M., Семченко В.В., 2003; Лукьянова Л.Д., 2004].

Развитие биомедицинской науки в области клеточных технологий в XX веке привело к обнаружению в костном мозге не только кроветворных полипо-тентных клеток [Maximow A.A., 1924; Хлопин Н.Г., 1927; Till J.E., McCullough Е.А., 1961; Чертков И.Л., Гуревич O.A., 1984], являющихся родоначальниками всех элементов крови, но и истинных (мезенхимальных) стволовых клеток [Friendenstein A.J., 1973; Owen M., Friedenstein A.J., 1988; Kopen G.C., Prockop D.J., Phinney DG., 1999; Kuznetsov S.A., Robey P.G., 2000; Reading L., Still K., Bishop N. e.a., 2000], обладающих уникальной способностью к самоподдержанию, а в случае необходимости к миграции и хомингу в отдаленные органы и дифференцировке во многие специализированные клеточные типы. При этом назначением данных элементов является регенерация тканей в ответ на физиологическую убыль клеток либо их гибель, вызванную повреждающим фактором [Holtzer H., 1978; Kuznetsov S.A., Friendenstein A.J., Robey P.G., 1997; Сухих Г.Т., Малайцев B.B., 2001; 2002]. В то же время на сегодняшний день не вызывает сомнения факт существования стволовых клеток в головном мозге взрослого организма [Gussoni Е., Soneoka Y., Strickland C.D. e.a., 1999; Александрова M.A., Полтавцева P.A., Марей M.B. и др., 2001; Gritti A., Luca

Bonfanti, Doetsch F. e.a., 2002; Сосунов A.A., Челышев Ю.А., 2002], во многом, по современным представлениям, обеспечивающих пластичность ЦНС при различного рода повреждающих воздействиях [Lindval О., 1991; Kondziolka D., Wechler L., Goldstein S. e.a., 2000; Сухих Г.Т., Малайцев В.В., 2001; Степанов Г.А., Карпенко Д.О., Александрова М.А. и др., 2003; Корочкин Л.И., Ревищин A.B., Охотин В.Е., 2005].

Тем не менее, в мировой литературе не существует данных об участии компенсаторно-приспосабительных механизмов «глубокого резерва» - мезен-химальных стволовых клеток - в развитии ответа гемопоэтической ткани на гипоксию, а также в восстановлении нарушений функций ЦНС, вызванных дефицитом кислорода.

Вместе с тем полученные в последние годы сведения о свойствах и закономерностях жизнедеятельности мультипотентных клеток-предшественников организма открыли возможность развития нового направления в лечении многих заболеваний с помощью стволовых клеток [Ema H., Та-kano H., Sudo К., Nacauchi H., 2000; Cossu G., Mavilio F., 2000; Horwitz E.M., Prockoo D.J., Gordon P.L., 2001; in t'Anker P.S., Noort W.A., Kruisselbrink A.B., 2002]. Однако отсутствие надежных клеточных технологий на сегодняшний день делает введение в организм недифференцированных и низкоочищенных клеточных элементов далеко не безопасным делом [Damjanov 1., 1993; Almqvist P.M., 2002; Pallera A.M., Schwartzberg L.S., 2004; Serakinci N., 2004; Uchida K., 2004]. В то же время, существует другая стратегия клеточной терапии, основанная на возможности мобилизации эндогенных стволовых клеток с помощью фармакологических агентов [Yano T., Katayama Y., Sunami К., Deguchi S. e.a., 1997; Scagni P., Saracco P., Timeus F., 1998], одним из которых, по мнению ряда исследователей, может выступать гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ) [Haas R., Murea S., 1996; Norol F., Bonin P., Charpentier F., 1998; Kawada H., Sasao T., Yonekura S., Hotta T., 1998; Orlic D., Kajstura J.,Chimenti S e.a..,2001].

Гипоксическое поражение головного мозга и, как следствие, развитие энцефалопатии в постреанимационном периоде является одним из наиболее опасных и часто встречаемых осложнений в реаниматологической практике [Мороз В.В., 2002; Крыжановский Г.Н., 2002; Алексеева A.B., Гурвич A.M., Семченко В.В., 2003]. Тем не менее, несмотря на имеющийся для лечения дан-

ной патологии широкий арсенал медикаментозных средств с разнонаправленными механизмами действия, зачастую все же не удается добиться не только «полного» излечения пациентов, перенесших критическое состояние, но и достичь даже частичного восстановления утерянных функций. При этом к настоящему времени не предпринималась попытка фармакологической коррекции (активации) репаративных процессов в головном мозге, поврежденном гипоксией, с помощью модификации функциональной активности эндогенных стволовых клеток.

В связи с вышеизложенным весьма актуальным является исследование механизмов регуляции и дизадаптации системы крови при кислородной недостаточности. Кроме того, несомненный интерес представляет поиск новых патогенетически обоснованных методов фармакологической коррекции нарушений кроветворения при гипоксии, а также способов терапии болезней реанимированного организма, в том числе энцефалопатии, основанных на изменении про-лиферативно-дифференцировочного баланса стволовых клеток in situ, детерминировании их миграционных свойств и включении определенной заданной программы дифференцировки.

Цель исследования: изучить механизмы регуляции и дизадаптации системы крови при кислородной недостаточности различного генеза. Разработать патогенетически обоснованные методы фармакологической коррекции гематологических нарушений при гипоксии.

Задачи исследования:

1. Выявить закономерности развития изменений показателей периферической крови, костномозгового кроветворения и структурно-функциональной организации костного мозга при гипоксической гипоксии, гемолитической анемии и кровопотере различных степеней тяжести.

2. Оценить процессы пролиферации и дифференцировки кроветворных прекурсоров при различного рода гипоксических воздействиях.

3. Изучить роль гемопоэзиндуцирующего микроокружения в формировании гематологических сдвигов при кислородной недостаточности различного генеза и степени тяжести.

4. Выявить изменения гемопоэза, сопутствующие развитию энцефалопатии при гипоксии различной этиологии, и показать возможность их фармакологической коррекции.

5. Вскрыть роль адренергических механизмов регуляции кроветворения при гипоксических воздействиях высокой степени тяжести.

6. Исследовать состояние пула мезенхимальных стволовых клеток в костном мозге и их содержание в периферической крови при гипоксической гипоксии, гемолитической анемии и кровопотере разных степеней тяжести.

7. Изучить динамику содержания нейральных клеток-предшественников в головном мозге при кислородной недостаточности различного генеза.

8. Исследовать влияние гранулоцитарного колониестимулирующего фактора на психоневрологический статус, содержание мезенхимальных стволовых клеток в костном мозге и периферической крови, а также на содержание нейральных клеток-предшественников в головном мозге при кислородной недостаточности высокой степени тяжести.

Положения, выносимые на защиту:

1. В основе адаптивного ответа кроветворной ткани на гипоксию различного генеза, заключающегося в развитии гиперплазии эритроидного, и в меньшей мере грануломоноцитарного ростков миелопоэза, лежит повышение функциональной активности коммитированных клеток-предшественников, являющееся следствием миграции Т-клеток-регуляторов гемопоэза в костный мозг, их кооперации со стромальными элементами, повышение фидерной активности клеточных компонентов гемопоэзиндуцирующего микроокружения, образование de novo гемопоэтических островков, преимущественно эритроидного типа, и увеличение содержания гемопоэтически активных субстанций в сыворотке крови.

2. Существенную роль в формировании суммарной эритропоэтической активности сыворотки крови in vivo при кислородной недостаточности, помимо эритропоэтина, играют иные гуморальные факторы. При этом возрастание эритропоэтической активности сыворотки крови на фоне отсутствия выраженных изменений концентрации в ней эритропоэтина по срокам совпадает с увеличением уровня гемолиза.

3. Развитие энцефалопатии при гипоксичееких воздействиях сопровождается дизадаптацией кроветворной ткани, проявляющейся в снижении уровня гиперплазии костномозгового эритропоэза, падении содержания коммитиро-ванных клеток-предшественников и повышении продукции патологических форм эритроцитов. При этом указанные нарушения эритропоэза развиваются несмотря на увеличение количества мезенхимальных стволовых клеток в костном мозге, возрастание фидерных свойств Т-клеток-регуляторов в отношении кроветворных прекурсоров во взаимодействии их с адгезирующими компонентами ГИМ и повышение функциональной активности прилипающих элементов костного мозга. Осуществление фармакологической «защиты» мозга при гипоксии высокой степени тяжести с помощью оксибутирата натрия предотвращает развитие дизадаптации гемопоэтической ткани, практически не влияя на Т-лимфоцитарные механизмы регуляции кроветворения.

4. Негативное влияние гипоксического повреждения ЦНС на кроветворение реализуется через изменение активности симпатоадреналовой системы организма. Введение неселективного антагониста бета-адренорецепторов (про-пранолола) после воздействия повышает содержание клеток-предшественников эритропоэза в костном мозге, нивелирует снижение уровня гиперплазии эрит-роидного ростка кроветворения, увеличивает количество эритроцитов в периферической крови и уменьшает продукцию их патологических форм.

5. Гипоксия, сопровождающаяся развитием энцефалопатии, приводит к ускорению созревания предшественников грануломоноцитопоэза и развитию нейтрофильного лейкоцитоза в результате повышения секреторной функции прилипающих миелокариоцитов, увеличения как прямых, так и опосредованных через взаимодействие с адгезирующими элементами гемопоэзиндуцирую-щего микроокружения фидерных свойств ТЪу-1,2+-клеток в отношении КОЕ-ГМ, повышения продукции гемопоэтически активных факторов неприлипаю-щими компонентами ГИМ и возрастания колониестимулирующей активности сыворотки крови.

6. Гипоксические воздействия различного генеза приводят к активации механизмов адаптации «глубокого резерва»: увеличению содержания мезенхимальных стволовых клеток в костном мозге и повышению количества регионарных нейральных клеток-предшественников в головном мозге, которые, однако, на фоне отсутствия мобилизации МСК в периферическую кровь оказы-

ваются недостаточными и несостоятельными при гипоксии высокой степени тяжести, что, в конечном итоге проявляется в развитии энцефалопатии и диза-даптации гемопоэтической ткани.

7. Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор обладает выраженным нейропротективным эффектом при гипоксии различного генеза. При этом механизмами специфического действия Г-КСФ являются: стимуляция, мобилизация и миграция мезенхимальных стволовых клеток костного мозга, сопровождающаяся увеличением содержания нейральных клеток-предшественников в ЦНС, а также активация эритропоэза, способствующая оптимизации газового гомеостаза в организме.

Научная новизна. В работе впервые на современном методическом уровне охарактеризовано состояние системы крови при гипоксической гипоксии, гемолитической анемии и кровопотере различных степеней тяжести. Выявлена значительная гиперплазия эритроидного, и в меньшей мере грануломо-ноцитарного ростков миелопоэза при кислородной недостаточности разной этиологии, не вызывающей «грубых» нарушений психоневрологического статуса. Показано, что в основе данных изменений во всех случаях лежит повышение функциональной активности коммитированных клеток-предшественников гемопоэза, связанное с миграцией Т-клеток-регуляторов гемопоэза в костный мозг, их кооперацией со стромальными элементами, увеличением продукции гуморальных регуляторов клеточными компонентами гемопоэзиндуцирующего микроокружения, стимуляцией образования de novo гемопотгических островков, преимущественно эритроидного типа, и возрастанием содержания гемопо-этически активных субстанций в сыворотке крови. При этом на разных моделях гипоксии выявлено несоответствие динамики эритропоэтической активности сыворотки крови с содержанием в ней эритропоэтина. Впервые показана существенная роль гемолиза в формировании in vivo суммарной эритропоэтической активности сыворотки крови при гипоксии.

Впервые выявлена возможность развития дизадаптации гемопоэтической ткани при гипоксической гипоксии, гемолитической анемии и кровопоте-ри высоких степеней тяжести. Обнаружено негативное влияние энцефалопатии различного происхождения на формирование гематологических сдвигов. Установлено, что поражение мозговых структур при гипоксии любой этиологии со-

провождается падением содержания коммитированных клеток-предшественников в костном мозге, в первую очередь, прекурсоров эритропо-эза, снижением уровня гиперплазии эритроидного ростка и продукцией патологических форм эритроцитов, а также развитием нейтрофильного лейкоцитоза.

Впервые показано отрицательное влияние адренергических механизмов регуляции кроветворения на гемопоэз при тяжелых гипоксических воздействиях. Выявлено, что чрезмерная активация симпатоадреналовой системы организма, являющаяся следствием гипоксического поражения ЦНС, представляет собой непосредственную причину возникновения нарушений кроветворения при гипоксической и гемической окислительной недостаточности высокой степени тяжести. На разных моделях гипоксии показана возможность коррекции нарушений в системе крови с помощью фармакологической «защиты» мозга, предотвращающей развитие энцефалопатии, и при введении неселективного антагониста бета-адренорецепторов после воздействия.

Впервые показано, что при гипоксии различного генеза высокой степени тяжести, сопровождающейся развитием энцефалопатии, происходит нарушение миграции ТЪу-1,2+-клеток регуляторов-гемопоэза в костный мозг. В то же время при этом наблюдается повышение их фидерных свойств в отношении эритроидных прекурсоров исключительно во взаимодействии с элементами ад-гезирующей фракции костного мозга, и увеличение как опосредованной, так и прямой их стимулирующей активности в отношении грануломоноцитарных клеток-предшественников. Установлено, что описанные изменения со стороны Т-клеточных механизмов регуляции гемопоэза при развитии энцефалопатии оказываются связанными непосредственно с тяжестью кислородной недостаточности и не зависят от повреждения структур ЦНС (практически не корреги-руются при осуществлении фармакологической «защиты» мозга). Тем не менее, в случаях гипоксической гипоксии и гемолитической анемии высоких степеней тяжести показана возможность непродолжительной активации прямого стимулирующею эффекта ТЬу-1,2+-клеток в отношении эритроидных прекурсоров с помощью антигипоксанта - оксибутирата натрия.

Впервые исследовано состояние пула мезенхимальных стволовых клеток в костном мозге, их содержание в периферической крови и динамика содержания нейральных клеток-предшественников в головном мозге при гипоксии различного генеза и степени тяжести. Показано участие мезенхимальных

стволовых клеток костного мозга в формировании гематологических сдвигов при кислородной недостаточности, особенно ее тяжелых формах. Выявлено увеличение количества регионарных стволовых клеток в головном мозге при гипоксии, связанное со стимуляцией непосредственно регионарных нейраль-ных клеток-предшественников в условиях дефицита кислорода, и не зависящее от состояния пула костномозговых МСК. Полученные результаты показали, что гипоксические воздействия различной этиологии приводят к активации механизмов «глубокого резерва» (стволовых клеток), которые, однако оказываются недостаточными и несостоятельными при гипоксии высокой степени тяжести, что, в конечном итоге, проявляется в развитии энцефалопатии и дизадаптации кроветворной ткани.

Установлена принципиальная возможность фармакологической коррекции (активации) репаративных процессов в головном мозге, поврежденном гипоксией, с помощью модификатора функциональной активности эндогенных стволовых клеток - гранулоцитарного колониестимулирующего фактора. Показан высокий нейропротективный эффект данного цитокина при кислородной недостаточности различного генеза, связанный с мобилизацией мезенхималь-ных стволовых клеток костного мозга в периферическую кровь, сопровождающийся повышением содержания регионарных нейральных клеток предшественников в ЦНС, а также с активацией эритропоэза, способствующей оптимизации газового гомеостаза в организме.

Практическая значимость. В ходе исследований разработано три новых способа моделирования патологии головного мозга: способ моделирования по-стгипоксической энцефалопатии, способ моделирования гипоксической энцефалопатии и способ моделирования постгеморрагической энцефалопатии (получены 3 патента на изобретение). Кроме того, разработан новый патогенетически обоснованный метод фармакологической коррекции нарушений эритропоэза, возникающих при кислородной недостаточности высокой степени тяжести, способ экспериментальной терапии энцефалопатии и способ коррекции нарушений эритропоэза при экспериментальной энцефалопатии (поданы 3 заявки на изобретение). 11ри этом выявленная нейропротективная активность гранулоцитарного колониестимулирующего фактора при гипоксии высокой степени тяжести характеризует препарат как эффективный и позволяет рекомендовать

и

проведение клинических испытаний его в качестве средства для лечения и профилактики развития энцефалопатии.

Полученные новые теоретические знания могут быть использованы в педагогическом процессе, а также явиться базой для дальнейшего развития подхода к лечению болезней реанимированного организма, основанного на стимуляции гематологических механизмов адаптации к гипоксии «глубокого резерва» - мезенхимальных стволовых клеток костного мозга.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на IV конференции молодых ученых СО РАМН «Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины» (Новосибирск, 2002), на III Российской конференции (с международным участием) «1 'ипоксия: механизмы, адаптация, коррекция» (Москва, 2002), на II конференции молодых ученых ГУ НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии» (Томск, 2002), на конференции, посвященной 20-летию НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН, «Актуальные проблемы фармакологии» (Томск, 2004), на III Российском конгрессе по патофизиологии (с международным участием) (Москва, 2004), на IV Российской конференции (с международным участием) «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция» (Москва, 2005), на III конференции молодых ученых ГУ НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии» (Томск, 2005), на конференции «Фармакологическая регуляция стволовых клеток» (Томск, 2005).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 33 печатные работы, из них 18 в центральных журналах, 1 из которых за рубежом; получены 3 патента на изобретения: патент (1Ш) № 2240604 «Способ моделирования постги-поксической энцефалопатии и связанных с ней нарушений в системе крови» (опубл. 20.11.2004г., Бюл. № 32), патент (Я1!) № 2253152 «Способ моделирования гипоксической энцефалопатии» (опубл. 27.05.2005г., Бюл. № 15), патент (Яи) № 2257620 «Способ моделирования постгеморрагической энцефалопатии» (опубл. 27.06.2005г., Бюл. № 21); и поданы 3 заявки на изобретения (1Ш): «Способ экспериментальной терапии энцефалопатии» (заявка № 2004139157, приоритет от 31.12.2004г.), «Способ коррекции нарушений эритропоэза при

экспериментальной гипоксии» (заявка № 2005102549, приоритет от 02.02.2005г.), «Способ коррекции нарушений эритропоэза при экспериментальной энцефалопатии» (заявка № 2005130286, приоритет от 28.09.2005г.).

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 451 странице машинописного текста и состоит из введения, четырех глав, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 38 рисунками и 99 таблицами. Библиографический указатель включает 552 источника, из них 283 отечественных и 269 иностранных.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Работа выполнена на 2962 мышах линии CBA/CaLac и 180 мышах-гибридах F1 CBA/CaLac х С57В1/6 массой 18-20 г в возрасте 2-2,5 мес. Животные 1-й категории (конвенциональные линейные мыши) получены из коллекционного фонда лаборатории экспериментального биомедицинского моделирования НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН (сертификат имеется).

Для моделирования гипоксических состояний использовались гипокси-ческая гипоксия, гемолитическая и постгеморрагическая анемии (гемическая гипоксия). Гипоксическая гипоксия моделировалась путем однократного и двукратного (с промежутком перед повторным воздействием в 10 мин) помещения животных в термокамеру объемом 500 мл.. Мыши из термокамеры извлекались после окончания генерализованных судорог и\или остановки дыхания (определяемой визуально) в течение 10-15 сек.. Гемолитическую анемию моделировали с помощью однократного внутрибрюшинного введения солянокислого фе-нилгидразина в дозах 30 мг/кг и 150 мг/кг. Постгеморрагическую анемию моделировали путем кровопотери, осуществляемой пункцией ретроорбитального синуса и выпусканием через промытую раствором гепарина градуированную пастеровскую пипетку, в первом случае - одномоментно 30% объема циркулирующей крови (ОЦК), и 70% от ОЦК в течение 2-3-х часов дробно, за 3 раза -во втором. Расчет необходимого для забора количества крови производили из предположения, что у грызунов ОЦК составляет 1/13 часть от массы тела животного. Наличие энцефалопатии регистрировали по развитию амнезии при воспроизведении условного рефлекса пассивного избегания и нарушению ориентировочно-исследовательского поведения животных в открытом поле [Walsh

R.N., Cummins R.A., 1976; Буреш Я., Бурешова О., Хьюстон Дж. П., 1991]. Для коррекции нарушений функций ЦНС мышам сразу после воздействия (при двукратной гипоксии гермообъема) либо на фоне моделирования кислородной недостаточности высокой степени тяжести (при обоих вариантах гемической гипоксии) внутрибрюшинно однократно вводили оксибутират натрия в дозе 500 мг/кг. С целью исследования адренергических механизмов регуляции кроветворения при гипоксии высокой степени тяжести мышам на 2-е сут после тяжелого гипоксического воздействия однократно подкожно вводили пропранолол («Arzneimittelwerk», Германия) в дозе 5 мг/кг. Для изучения нейропротектор-ных (психофармакологических) свойств гранулоцитарного колониестимули-рующего фактора при гипоксии экспериментальным животным сразу после моделирования тяжелой гипоксии различного генеза 1 раз в день в течение 5 дней подкожно вводили 125 мкг/кг нейпогена («Hoflfman-la Roche», Швейцария) -растворенного в 0,2 мл растворителя. Контрольным животным по той же схеме вводили физиологический раствор в эквивалентном объеме (0,2 мл). Умерщвление подопытных животных производили на 1-10-е сут после воздействия методом дислокации шейных позвонков. Перед началом и в период исследования мыши находились в виварии при температуре воздуха 20-22°С на обычном пищевом рационе, в пластиковых клетках (10-15 мышей). Для исключения сезонных колебаний изучаемых показателей все эксперименты были проведены в осенне-зимний период.

Оценку показателей периферического звена системы эритрона осуществляли с помощью автоматического гематологического анализатора ABACUS, в ветеринарном режиме. Изучение количества различных форм лейкоцитов в периферической крови и показатели костного мозга осуществляли стандартными гематологическими методами [Кост Е.А., 1975; Меньшиков В.В., 1987; Голованов М.В., 1991]. Содержание коммитированных клеток-предшественников эритро- (КОЕ-Э) и грануломоноцитопоэза (КОЕ-ГМ) в костном мозге изучали in vitro методом клонирования неприлипающей фракции миелокариоцитов в полувязкой культуралыюй среде [Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.11., 1992]. Пролиферативную активность гемопоэтических прекурсоров определяли с помощью метода «клеточного самоубийства» путем поглощения гидроксимо-чевины в культуре ткани [Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П., 1992]. Интенсивность созревания эритроидных и грануломоноцитарных клеток-

предшественников оценивали по величине индекса созревания (отношение числа кластеров к количеству колоний, выросших в одной лунке) [Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П., 1992]. Эритропоэтическую (ЭПА) и колоние-стимулирующую (КСА) активности кондиционных сред прилипающих и не-прилипающихъ миелокариоцитов, а также сыворотки крови тестировали микрометодом в 96-луночных планшетах. ЭПА и КСА выражали количеством выросших эритроидных и грануломоноцитарных колоний (на 105 миелокариоцитов) [Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Шахов В.П., 1992]. Содержание эритропо-этина в сыворотке крови изучали методом иммуноферментного анализа с помощью наборов фирмы Biomerica, Inc. (США), согласно прилагаемым методическим указаниям. Структурно-функциональную организацию костного мозга исследовали путем ферментативного выделения гемопоэтических островков (ГО) с последующей оценкой их количественного и качественного состава [Сгосег P.R., Gordon S., 1985; Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П., 1992]. Определение количества Thy-1,2+-клеток в костном мозге проводили с помощью комплементзависимого цитотоксического теста с использованием моно-клональных антител анти-ТЬу-1,2+ (клон 5А-8 CL 8600А, "Sigma", США) [Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П., 1992]. Изучение роли Thy-1,2+-клеток в регуляции гемопоэза осуществляли с помощью культуральных методик, основанных на определении разницы уровней колониеобразования в культурах клеток неадгезирующей фракции костного мозга и при культивировании неадгезирующей фракции на прилипающем подслое, содержащих в обоих случаях Thy-1,2+-лимфоциты и лишенных их с помощью моноклональных антител анти-ТЬу-1,2+ (клон 5А-8 CL 8600А, "Sigma", США) [Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П., 1992]. Содержание регионарных нейральных клеток-предшественников в паравентрикулярной области больших полушарий головного мозга исследовали с помощью метода клонирования клеточного материала [Gritti A., Bonfanti L., Doetsch F. е.а., 2002] в собственной модификации. При этом количество нейральных клеток-предшественников определяли по уровню нейросферообразования в специальной культуральной среде (на 105 нуклеаров). Для изучения прямого влияния Г-КСФ на нейральные клетки-предшественники in vitro в культуру клеток головного мозга интактных животных и мышей с постгеморрагической энцефалопатией добавляли нейпоген («Hoffman-la Roche», Швейцария) в дозе 5 мкг/л. Количество мезенхимальных стволовых клеток в

костном мозге и периферической крови определяли с помощью метода лимитирующих разведений при длительном культивировании клеточного материала [in 't Anker P.S., Noort W.A., Scheijon S.A. e.a., 2003] в собственной модификации. Частоту встречаемости МСК определяли с помощью обобщенной линейной модели для распределения Пуассона. Соответствие данных лимитирующих разведений одномерной модели Пуассона оценивали посредством линейной log-log регрессии. При этом теоретическая фракция отрицательных лунок определялась как //, = ехр(-/г(), где/- частота встречаемости МСК, х, - количество клеток высаженных в лунку [Bonnefoix Т., Bonnefoix P., Callanan М. е.а., 2001; t'Anker P.S., Noort W.A., Scherjon S.A. е.а., 2003]. Статистическую обработку полученных результатов производили на персональном компьютере с использованием пакета статистических программ «Statistica 6.0» [Лакин Г.Ф., 1973; Урбах В.Ю., 1975; Зайцев Г.Н., 1984].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ В ходе исследований гипоксия различного генеза приводила к развитию гиперплазии эритроиднош ростка кроветворения. Так, на протяжении всего эксперимента во всех случаях наблюдалось значительное увеличение количества эритрокариоцитов в гемопоэтической ткани, наиболее выраженное при гипоксии гермообъема (ГТО) (до 438,8% от фона на 5-е сут опыта). Отражением активации костномозгового компартмента системы эритрона в периферической крови являлось возрастание количества ретикулоцитов на 1-3, 5, 8, 9-е сут после гипоксической гипоксии и во все сроки наблюдения при обоих вариантах кислородной недостаточности гемического типа, достигающее максимальных значений после введения гемолитического яда на 10-е сут (671,5% от фона). Динамика содержания эритроцитов при этом, во многом, определялась спецификой воздействия и характеризовалась падением числа эритроцитов и гема-токрита после эксфузии 30% объема циркулирующей крови (1-5-е сут) и введения фенилшдразина (1-10-е сут) и, напротив, развитием эритроцитоза после гипоксической гипоксии на 1-6-е сут после воздействия. При этом качественный анализ форменных элементов, во всех трех группах, показал не значительное увеличение объема зрелых клеток красной крови, вероятно, являющееся следствием поступления большого количества молодых форм эритроцитов в кровь [Гольдберг Е.Д., 1989; Захаров Ю.М., Рассохин А.Г., 2002]. В то же время при

гемолитической анемии (ГА) в начальные сроки (1-3-и сут) имело место снижение значения данного показателя, очевидно, вызванное разрушением под влиянием повреждающего агента, в первую очередь, наиболее крупных клеток при прохождении их по микроциркуляторному руслу. А после гематоэксфузии, помимо изменения размеров эритроцитов, на 1, 3-е сут отмечалось еще и повышение средней корпускулярной концентрации гемоглобина, вероятно, связанное с тем обстоятельством, что после кровопотери (КР) высокую долю гематокрита составляли эритроциты, вышедшие из депо, и образование которых происходило в условиях сбалансированного гемопоэза при достаточно высокой активности гемоглобин-синтетических процессов на фоне относительно низкой скорости созревания эритроидных прекурсоров. Кроме того, во всех группах отмечалось снижение осмотической резистентности эритроцитов (на 3, 5-е; 1-10-е и 4, 6-е сут при ГТО, ГА и КР соответственно), достигающее наиболее низких величин на 1-е сут после введения гемолитического агента.

Со стороны гранулоцитопоэза при моделировании гипоксии любой этиологии имело место, в разной мере выраженное повышение содержания незрелых и зрелых нейтрофильных гранулоцитов в гемопоэтической ткани (достигающее максимальных значений при кровопотере до 180,0% и 146,7% от фона на 10-е сут соответственно), сопровождаемое увеличением числа палочкоядер-ных нейтрофилов в периферической крови на 1-3, 5, 7, 9-е сут ; 4, 5-е сут и 1, 4, 6, 7-е сут при гипоксической гипоксии, введении фенилгидразина и кровопотере соответственно.

Указанным изменениям гемопоэза предшествовало усиление колоние-образующей способности костного мозга. Кислородная недостаточность независимо от вида воздействия сопровождалась увеличением выхода как эритроидных, так и гранулоцито-макрофагальных КОЕ в метилцеллюлозной среде: соответственно на 1-6, 9-е и на 1-5-е сут опыта при ГТО; 3-9-е (КОЕ-Э) и 1-4,69-е сут (КОЕ-ГМ) при введении фенилгидразина и на 1-7-е сут (КОЕ-Э) и 1, 2, 4, 6-е сут (КОЕ-ГМ) после моделирования кровопотери. При этом во всех случаях отмечалось возрастание пролиферативной активности коммитированных клеток-предшественников обоих типов и ускорение созревания эритроидных прекурсоров практически во все сроки исследования, а при гемической гипоксии также повышение реализации дифференцировочных потенций клеток-

предшественников гранул омоноцитопоэза (5, 8-10-е сут) и, напротив, снижение данного параметра при гипоксии гермообъема на 3-6, 8, 9-е сут наблюдения.

Состояние пула клоногенных клеток, как известно, во многом определяется способностью клеточных компонентов ГИМ к продукции широкого спектра гуморальных гемопоэтических факторов - цитокинов [Gordon M.Y., 1988; Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Жданов В.В., 1999]. Последние участвуют в локальном контроле процессов пролиферации и дифференцировки клеток-предшественников и являются наиболее мощными, среди гормоноподобных веществ, регуляторами гемопоэза [Натан Д.Г., Зифф К.А., 1994; Lau A.S., Lehman D., Geertsma F.R., Yeung M.C., 1996; Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шерстобоев Е.Ю., 2000], суммарный эффект которых регистрируется в качестве эри-тропоэтической и колониестимулирующей активностей [Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П., 1992].

Изучение секреторной функции отдельных фракций костного мозга при моделировании кислородной недостаточности во всех группах выявило возрастание эритропоэтической активности кондиционных сред прилипающих и неприлипающих нуклеаров практически во все сроки наблюдения, и повышение колониестимулирующей активности супернатантов от адгезирующих элементов (на 1, 3-10-е; 3, 5, 8-е и 3, 4, 6, 8-е сут опыта при ГТО, ГА и KP соответственно), а после введения гемолитического яда и от неадгезирующих миелока-риоцитов (1, 2, 5-е сут). В то время как гипоксическая гипоксия (7, 8-е сут) и эксфузия крови (4-е сут), напротив, снижали продукцию КСА неприлипающей фракцией костного мозга.

В то же время важное значение в регуляции кроветворения, особенно, при экстремальных воздействиях принадлежит гуморальным факторам сыворотки крови, в частности, гормонам коркового и мозгового вещества надпочечников, опиоидным пептидам (стресс-реализующие и стресс-лимитирующие гормоны), эйказаноидам и другим эндогенным биологически активным веществам [Зак К.П., 1982; Дыгай A.M., Шахов В.П., 1989; Lau A.S., Lehman D., Geertsma F.R. e.a., 1996; Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Хлусов И.А., 1997]. Данные соединения, вырабатываемые различными органами и тканями организма, поступая в кровь, способны оказывать как прямое, так и опосредованное (через элементы ГИМ) влияние на гемопоэтические клетки [Балицкий К.П., Шмалько Ю.П., 1987; Дыгай A.M., Клименко H.A., 1992]

В ходе эксперимента было обнаружено, что гипоксия, не зависимо от вызвавшей ее причины, приводила к возрастанию колониестимулирующей активности сыворотки крови. Отмечалось увеличение значений данного показателя на 1-3, 5, 6, 9, 10-е сут эксперимента у животных, перенесших гипоксию гермообъема, на 1-5-е сут у мышей после моделирования гемолитической анемии и на 2, 7-е сут опыта после кровопотери, что во всех случаях свидетельствует о развитии общего адаптационного синдрома и значительном влиянии стресс-реализующих систем на состояние системы крови при гипоксии.

Вместе с тем развертывание адаптивных реакций кроветворной ткани при окислительной недостаточности различного происхождения во многом определяется повышением функциональной активности эритропоэтин-продуцирующего аппарата почек [Гольдберг Е.Д., 1989; Sakata S., Enoki Y., Ueda M., 1992; Шевченко Ю.Л., 2000]. В то же время считается доказанным факт стимуляции эритроидного ростка кроветворения продуктами деградации эритроцитов [Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Жданов В.В., 1999]. При этом известно, что гипоксические воздействия приводят к возрастанию активности эритродиеретических процессов [Ужанский Я.Г., 1964; Шевченко Ю.Л., 2000].

При изучении значимости гуморальных факторов в формировании гематологических сдвигов при кислородной недостаточности in vivo во всех моделях было выявлено повышение концентрации эритропоэтически активных субстанций в сыворотке крови. Однако если динамика ЭПА во всех случаях носила однотипный характер, то в содержании эритропоэтина (ЭПО) при моделировании гипоксических состояний отмечались существенные различия, заключающиеся как в сроках, так и в уровне возрастания данного показателя. При этом ни в одном из вариантов гипоксии не наблюдалось полного соответствия динамики ЭПА и концентрации эритропоэтина, что свидетельствовало о далеко не исключительной роли последнего в определении уровня «суммарной» эри-тропоэтической активности сыворотки.

Так, в условиях гипоксическоЙ гипоксии увеличение уровня колоние-образования в тест-системе (ЭПА) наблюдалось на 1-5, 9, 10-е сут эксперимента (до 299,7% от фона на 3-й сут), а содержания эритропоэтина (ЭПО) через 12 ч и на 1,2, 6-9-е сут (с наибольшим значением до 363,3% на 12 ч после воздействия). При гемолитической анемии имела место иная картина: на протяжении всего эксперимента отмечалось возрастание эритропоэтической активности сы-

воротки крови, со статистически значимым повышением содержания в ней ЭПО лишь на 7-е сут опыта. Эксфузия 30% объема циркулирующей крови приводила к увеличению ЭПА сыворотки крови и количества эритропоэтина в ней, практически в одни и те же сроки, на 1-3,7, 9-е сут опыта в первом случае и через 12 ч и на 1-3, 9-е сут во втором. Однако, уровни подъема указанных показателей существенно отличались друг от друга.

При этом исследование степени выраженности гемолиза во всех моделях выявило значительное возрастание величины данного показателя в те сроки, когда не наблюдалось соответствия между ЭПА и концентрацией ЭПО в сыворотке крови (на 3, 5-е; 1-10-е и 4, 6-е сут опыта при ГТО, ГА и КР соответственно), что указывало на существенный вклад продуктов деградации эритроцитов в формирование сывороточной эритропоэтической активности.

Взаимодействие стромальных компонентов ГИМ с кроветворными клетками осуществляется так же посредством образования прямых межклеточных контактов и формирования гемопоэтических островков, в составе которых и происходит размножение и созревание коммитированных клеток-предшественников [Crocker P.R., Gordon S., 1985; Gordon M.Y., 1988; Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., ТТТахов В.П., 1992; Науменко О.И., 1992; Blazsek I., Liu X.H., Anjo A. e. a., 1995]. Межмембранное связывание при этом служит для сообщения регуляторной информации, передачи необходимых веществ, миграции и последующего хоминга прекурсоров в специфических участках кроветворной ткани и предоставления гемопоэтических ростовых факторов в биологически доступной форме [Науменко О.И., 1992; Hardy С.L., Minguell J.J., 1993].

При исследовании кооперации стромальных компонентов гемопоэзин-дуцирующего микроокружения с кроветворными клетками на разных моделях кислородной недостаточности было обнаружено увеличение способности стромальных элементов к формированию клеточных комплексов. В частности, гипоксия гермообъема приводила к повышению количества макрофагпозитивных (2, 3, 7, 9-е сут) и макрофагнегативных (2, 3, 8, 9-е сут) ассоциаций. При этом их качественный анализ показал повышение числа эритроидных ГО на 2, 3, 5, 6, 8-10-е сут при достоверном возрастании количества их смешанных и грануло-цитарных типов лишь на 2, 3-й сутки эксперимента (до 127-137% и 154-156% соответственно).

Подобные изменения структурно-функциональной организации костного мозга отмечались и при гемической гипоксии. В обоих случаях имело место увеличение связывающей способности как макрофагальных элементов (на 1-10-е сут опыта при введении фенилгидразина и на 1, 3, 4, 6-8-е сут после кро-вопотери), так и фибробластов (3-8-е сут эксперимента при ГА). Указанные изменения активности прилипающих миелокариоцитов закономерно сопровождались существенным возрастанием содержания эритроидных ГО на протяжении практически всего периода наблюдения (с максимумом до 386,2% на 7-е сут после введения гемолитического яда и до 359,0% на 5-е сут после эксфузии крови) при значительно менее выраженном повышении гранулоцитарных (на 7, 9, 10-е сут при ГА и 1, 5-е сут эксперимента при КР) и смешанных (2, 3-е и 7, 9, 10-е сут при ГА и КР соответственно) клеточных комплексов.

Согласно имеющимся представлениям одними из наиболее активных и мобильных элементов ГИМ являются Т-лимфоциты. Их популяция легко изменяет свой качественный и количественный состав в гемопоэтической ткани при чрезвычайных ситуациях и посредством выделения гуморальных регуляторов и межклеточного взаимодействия с другими элементами микроокружения контролирует процессы пролиферации и дифференцировки кроветворных прекурсоров. При этом миграция Т-клеток, экспрессирующих на своей мембране антигены Thy-1,2+, в гемопоэтическую ткань зачастую является пусковым механизмом развития феномена гиперплазии костномозгового кроветворения при воздействии экстремальных факторов [Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Карпова Г.В., 1983; Дыгай А.М., Шахов В.П., 1989].

В ходе исследования значения ТЬу-1,2+-клеток в условиях равновесного гемопоэза, было обнаружено отсутствие их значимого влияния на функционирование кроветворных прекурсоров, поскольку удаление данной фракции клеток практически не изменяло уровень колониеобразующей способности клеток интактнош костного мозга. В отличие от этого изучение роли Thy-1,2+-клеток в регуляции гемопоэза при кислородной недостаточности показало, что различные по своей природе воздействия приводили к развитию выраженных однонаправленных изменений со стороны содержания Т11у-1,2+-клеток в костном мозге. Во всех случаях отмечалось существенное возрастание их числа в гемопоэтической ткани: со 2-х по 4-е сут при гипоксической гипоксии и крово-потере (с максимумом до 320,3% от фона на 3-й сут после ГТО и до 434,3% на

4-е сут после эксфузии крови) и с1-х по 4-е сут при гемолитической анемии (с наибольшими значениями до 410,0% от исходного уровня па 4-е сут). При этом на фоне описанного увеличения количества Т-клеток в костном мозге во всех моделях под влиянием данных клеточных элементов отмечалась и значительная стимуляция функциональной активности кроветворных прекурсоров (2, 4-е сут). Особенно выраженными оказались фидерные свойства 7Ъу-1,2+-клеток в отношении клеток-предшественников гемопоэза при их реализации во взаимодействии с элементами адгезирующей фракции ГИМ. Причем при ГТО и КР указанное активирующее действие данных клеточных элементов в большей степени влияло на пролиферативно-дифференцировочный статус эритроидных прекурсоров, чем грануломоноцитарных колониеобразующих единиц.

11олученные результаты доказывают важную роль Т-клеток, имеющих фенотип ТЬу-1,2+, в развитии гиперплазии кроветворной ткани при гипоксии различного генеза. При этом проведенные исследования показали, что свое стимулирующее действие на коммитированные клетки-предшественники эри-тропоэза Т11у-1,2+-клетки оказывали как за счет непосредственного влияния, так и при их взаимодействии с адгезирующими элементами, а в отношении грану-лоцито-макрофагальных прекурсоров они проявляли свою фидерную активность только опосредованно через кооперацию со стромальными элементами.

Дополнительная математическая обработка данных с помощью анализа значимых коэффициентов корреляции рангов (г) при различных гипоксических воздействиях показала во всех случаях существенное увеличение количества сигнальных связей между отдельными компартментами системы эритрона, отражающее высокую сопряженность эритропоэзстимулирующей деятельности различных регуляторных систем (система эритропоэтина, гемопоэзидуцирую-щее микроокружение). При этом координирующая функция в развитии ответа гемопоэтической ткани, очевидно, принадлежала центральному (нейроэндок-ринному) звену регуляции. Кроме того, обращало на себя внимание наличие при гемолитической анемии прямой зависимости уровня эритропоэтической активности сыворотки крови от степени гемолиза. В то же время редукция связей с помощью факторного анализа при моделировании гипоксии различного генеза во всех случаях выявила преимущественную зависимость картины крови от образования дополнительных структурно-функциональных единиц костного мозга - эритроидных гемопоэтических островков. Наряду с этим ни в одной из

моделей гипоксии не наблюдалось значимых изменений корреляционной матрицы данных, характеризующих процессы грануломоноцитопоэза. Однако анализ факторных нагрузок показал существенное повышение значения КСА сыворотки крови в развитии ответа грануломоноцитарного ростка кроветворения, указывающее на возрастание роли дальноранговых гуморальных механизмов в регуляции грануломоноцитопоэза при кислородной недостаточности различного генеза на фоне сохранения исходного (низкого) уровня координации между деятельностью отдельных элементов ГИМ.

Таким образом, кислородное голодание различного генеза, не вызывающее поражение ЦНС, приводило к развитию ярко выраженных компенсаторно-приспособительных реакций со стороны системы крови, заключающихся в выраженной гиперплазии эритроидного ростка кроветворения, отвечающего за окислительное обеспечение тканей, и стимуляции гранулоцитопоэза, как проявления активации стресс-реализующих систем [Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Хлусов И.А., 1999]. При этом данные изменения определялись миграцией Т-клеток-регуляторов гемопоэза в костный мозг, их кооперацией со стромаль-ными элементами гемопоэтической ткани и повышением фидерной активности клеточных компонентов ГИМ, а также возрастанием содержания гемопоэтиче-ски активных субстанций в сыворотке крови. Причем, полученные результаты свидетельствуют о существенной роли не только эритропоэтина, но и других веществ в формировании «общей» эритропоэтической активности сыворотки крови и, как следствие, ответа системы эритрона на гипоксию (рис. 1).

Сравнительный анализ гематологических сдвигов при используемых вариантах кислородной недостаточности показал значительно большую эффективность эритропоэза в случае гемической гипоксии, связанную с наиболее высокой скоростью созревания эритроидных прекурсоров и более быстрым выходом эритроцитов из органов гемопоэза. Определенные различия наблюдались и в реакциях грануломоноцитарного ростка. Во всех случаях имело место возрастание пролиферативной способности прекурсоров, которое, однако, не сопровождалось либо сопровождалось незначительной активацией их дифференци-ровки при гипоксии гермообъема и кровопотере соответственно. В то время как при гемолитической анемии разобщения указанных процессов не отмечалось, что, по-видимому, также являлось следствием более высокой степени тяжести

^^сйстсма КСА"^^ ^^"система

Фн6ро6.|;к'|Ы

Ч

Макрофаг»

^ / / Периферическая и»" кровь

Рис. 1. Схема регуляции кроветворения при гипоксии различного генеза, не вызывающей нарушение психоневрологического статуса

Здесь и на рисунке 2, 3: КС А - колониестимулирующая активность, ЭПА- эри-тропоэтическая активность, КОЕ-ГМ - гранулоцито-макрофагальные колоние-образующие единицы, КОЕ-Э - эритроидные колониеобразующие единицы, ПСКК - полипотентные стволовые кроветворные клетки, МСК - мезенхималь-ные стволовые клетки;

тонкие линии - изменения практически отсутствуют; толстые - активация; пунктирные - ингибиция.

окислительной недостаточности при данном виде воздействия, и образованием значительного количества флогогенных веществ в поврежденных гипоксией тканях [Li С., Jackson R.M., 2002; Захаров Ю.М., 2004].

Учитывая важную роль ЦНС в регуляции жизнедеятельности кроветворной ткани при экстремальных воздействиях [Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Хлусов И.А., 1997; Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Жданов В.В., 1999], дальнейшим этапом нашей работы явилось изучение возможного влияния энцефалопатии, как механизма дизрегуляции кроветворения, на формирование гематологических сдвигов при гипоксии высокой степени тяжести.

Исследования реакций гемопоэтической ткани у животных с патологией мозга, вызванной дефицитом кислорода, позволили выявить ряд особенностей. Наличие энцефалопатии, не зависимо от вызвавшей ее причины, сопровождалось отсроченным снижением уровня гиперплазии эритроидного ростка кроветворения (5, 6, 9-е; 3-5, 7-е и 4, 7-10-е сут опыта при ГГО, ГА и КР соответственно), являющимся результатом падения содержания предшественников эритропоэза при снижении их пролиферативной активности. В частности, при постгипоксической (ГГО) гипоксии уменьшение количества КОЕ-Э регистрировалось на 4, 5, 8, 9-е сут исследования, в то время как число митотически активных прекурсоров в данной группе снижалось уже с 1-х сут наблюдения (1,3, 5-е сут). Развитие патологии мозга вследствие воздействия гемолитического агента и потери 70% объема циркулирующей крови сопровождалось падением колониеобразующей способности костного мозга соответственно на 4, 6, 7, 9-е и 4, 9-е сут исследования при уменьшении интенсивности ДНК-синтезирующих процессов в КОЕ-Э на 5-7-е (ГА) и 3, 8, 9-е сут (КР) опыта относительно аналогичных параметров у животных без энцефалопатии.

В то же время во всех моделях на протяжении всего эксперимента наблюдалась компенсаторная активация процессов дифференцироки КОЕ-Э, связанная с усилением секреторной функции адгезирующих миелокариоцитов (2, 8-е; 1-3, 10-е и 7, 9-е сут опыта при ГГО, ГА и КР соответственно), повышением ЭПА сыворотки крови, а при введении 150 мг/кг фенилгидразина (2, 5, 8-е сут) и обильной кровопотери (4, 6, 8-е сут) еще и с увеличением способности стромальных элементов к формированию клеточных ассоциаций эритроидного типа.

Вместе с тем увеличение степени тяжести гипоксии оказывало весьма неоднозначное влияние на гуморальные механизмы регуляции эритропоэза. Так, если при гипоксической гипоксии и кровопотере повышение эритропоэти-ческой активности было более значительным, чем увеличение уровня содержания эритропоэтина, то при массивном гемолизе, напротив, на фоне выраженного возрастания концентрации последнего (практически во все сроки наблюдения), в позднем периоде эксперимента (7, 8-е сут) имело место падение эритро-поэтической активности сыворотки крови. При этом у всех животных с энцефалопатией, не зависимо от вызвавшей ее причины, отмечалось резкое увеличение степени гемолиза.

Исследование Т-клеточных механизмов регуляции в условиях тяжелого дефицита кислорода различного генеза выявило, что развитие патологии ЦНС во всех случаях приводило к резкому и продолжительному падению числа ТЪу-1,2+-клеток в костном мозге практически до уровня их содержания у интактных животных. В то же время на фоне указанного уменьшения содержания Т-клеток при развитии энцефалопатии различного происхождения было отмечено, что даже незначительное присутствие данных элементов в культуре оказывало выраженный стимулирующий эффект в отношении КОЕ-Э, но практически только при их взаимодействии с элементами адгезирующей фракции миелокариоци-тов. Исходя из этого, можно сделать вывод, что сохранение активности одного из пусковых звеньев стимуляции эритропоэза (миграции Г-клеток в костный мозг) при гипоксии различного генеза высокой степени тяжести связано не с количественными изменениями костномозговой популяции ТЬу-1,2+-клеток, а с их функциональным состоянием. При этом, однако, во всех случаях развития энцефалопатии (кроме 4-х сут при ГТО) следует отметить потерю способности ТЬу-1,2+-лимфоцитов непосредственно, без их кооперации с резидентными клетками ГИМ, влиять на пролиферативно-дифференцировочный статус эрит-роидных прекурсоров.

Изменения исследуемых параметров грануломоноцитарного ростка кроветворения во многом были аналогичны динамике показателей эритропоэза. В частности, отмечалось падение количества грануломоноцитарных клеток-предшественников в костном мозге на 4-е; 2, 4, 5, 7, 9-е и 9, 10-е сут опыта при ГТО, ГА и КР соответственно. При этом указанным изменениям во всех случаях предшествовало снижение темпа деления КОЕ-ГМ, наиболее выраженное

при введении 150 мг/кг фенилгидразина (до 54,4% от контрольных значений на 7-е сут), и возрастание скорости созревания грануломоноцитарных прекурсоров.

Последнее обстоятельство явилось следствием повышения уровня ко-лониестимулирующей активности в тестируемых биологических жидкостях. Тяжелое гипоксическое воздействие (ГГО) и возрастание объема кровопотери увеличивало выработку КСА прилипающими (7-е и 5-е сут) и неприлипающи-ми (8-е и 2-е сут соответственно) нуклеарами, а также повышало уровень содержания гемопоэтинов в сыворотке крови на 3, 4, 6, 8-е сут опыта при ГГО и на 3, 4, 6, 9, 10-е сут эксперимента при постгеморрагической энцефалопатии. Развитие же патологии мозга под влиянием гемолитического агента приводило к статистически значимому возрастанию КСА в кондиционных средах клеток костного мозга: на 6-е сут после воздействия от адгезирующей фракции миело-кариоцитов и на 3-е сут от неадгезирующей, не оказывая при этом заметного влияния на сывороточную колониестимулирующею активность.

Вместе с тем при увеличении степени тяжести гипоксии во всех случаях отмечалось значительное усиление способности ТЬу-1,2+-клеток стимулировать рост грануломоноцитарных прекурсоров как при культивировании клеток костного мозга на адгезирующем подслое (2, 4-е сут), так и (в отличие от воздействий, не сопровождающихся энцефалопатией) при выращивании одних не-прилипающих элементов (2, 4-е сут при ГТО и ГА и на 4-е сут при КР). Причем эффективность воздействия данных элементов на колониеобразование через их взаимодействие с прилипающими миелокариоцитами существенно превосходила таковую при аналогичных по своей природе гипоксических состояниях, не вызывающих нарушение психоневрологического статуса (особенно при гемолитической анемии). Кроме того, с учетом результатов исследований, можно сделать вывод о том, что высокая степень кислородной недостаточности предопределяла изменение вектора прямого фидерного влияния Т11у-1,2+-клеток: с преимущественного их действия на эритроидные прекурсоры (при компенсированной гипоксии) - в сторону стимуляции грануломоноцитопоэза при развитии энцефалопатии.

В то же время, несмотря на однотипность во всех моделях энцефалопатии сдвигов в состоянии пула гранулоцито-макрофагальных прекурсоров и значительную схожесть изменений в механизмах регуляции, между опытными

группами наблюдались существенные различия в содержании в гемопоэшче-ской ткани морфологически идентифицируемых клеток гранулоцитарного ряда. Так, если при массивном гемолизе и в постгеморрагическом периоде отмечалось снижение представительства незрелых (2-е и 4, 5-е сут опыта соответственно) и зрелых (5, 7-10-е сут при ГА и на 2-4, 6, 8, 9-е сут при КР) нейтро-фильных гранулоцитов в костном мозге относительно фоновых значений, то в случае гипоксии гермообъема на 3, 7, 8, 10-е сут после воздействия имело место, напротив, увеличение числа их зрелых форм. В периферической же крови во всех случаях наблюдалось развитие нейтрофилыюго лейкоцитоза, достигающего при энцефалопатии, вызванной введением гемолитического агента, максимально высоких значений (до 437,4% от фона на 1-е сут), что, по-видимому, было связано не столько с ускорением дифференцировки грануло-моноцитарных прекурсоров сколько с нарушением эфлюкса токсически поврежденных [Заугольникова С.Д., 1982; Гольдберг Е.Д., 1989] лейкоцитов в ткани.

Поражение центральной нервной системы, не зависимо от вызвавшей его причины, приводило к изменению показателей периферического звена системы эритрона. Во всех опытных группах отмечалось развитие (ГТО) либо усугубление тяжести анемии. Причем, при введении высокой дозы фенилгидразина и массивной кровопотери она была связана как со спецификой воздействия, в связи, с чем достигала наиболее низких значений (до 35,1% на 6-е сут и до 54,4% от фона на 3-е сут соответственно), так и, несмотря на наличие «ярко» выраженной ретикулоцитарной реакции (до 2231,9% от фона на 7-е сут эксперимента при ГА и до 828,0% на 5-е сут при КР), с нарушением динамики восстановления уровня эритроцитов в результате развития макроцитоза на 6-10-е и 3-7, 10-е сут опыта соответственно, снижения осмотической резистентности клеток практически во все сроки наблюдения, и как следствие быстрого диереза вновь образующихся крупных эритроцитов. При повреждении головного мозга гипоксической гипоксией анемия носила отсроченный и гипохромный характер (4, 5, 9-е сут), что, вероятно, являлось и следствием чрезмерного увеличения размеров зрелых клеток красной крови (3-5-е сут) и снижения степени их гемо-глобинизации (5, 9-е сут по сравнению с соответствующим контролем) в условиях напряженного эритропоэза.

Обработка данных с помощью корреляционного и факторного анализов во всех моделях энцефалопатии показала значительное уменьшение количества

причинно-следственных связей между феноменологическими данными эритро-поэза, состоянием пула клеток-предшественников и функциональной активностью эритропоэз-регулирующих систем на фоне изменения значений факторных нагрузок корреляционной матрицы, отражающем снижение роли межклеточных коопераций в реализации ответа системы эритрона и, напротив, ее повышение для ЭПА сыворотки крови. Данное обстоятельство, по-нашему мнению, однозначно свидетельствует о дизрегуляции кроветворения при кислородной недостаточности, вызывающей патологию ЦНС. Кроме того, при гипоксии высокой степени тяжести во всех случаях имела место прямая зависимость возрастания уровня эритропоэтической активности сыворотки крови от повышения интенсивности гемолиза.

Вместе с тем математический анализ процессов грануломоноцитопоэза показал увеличение числа сигнальных связей между отдельными компартмен-тами грануломоноцитарного ростка, отражающее повышение «напряжения» системы, только на модели энцефалопатии, вызванной введением фенилгидра-зина. В то же время редукция переменных (корреляционных связей) с помощью факторного анализа во всех используемых моделях патологии головного мозга выявила возрастание значения гуморальных регуляторов, продуцируемых стромальными компонентами ГИМ, а при гипоксии гермообъема и кровопотере еще и уменьшение роли гемопоэтинов сыворотки в формировании реакций белой крови. Указанные факты говорят об изменении характера регуляции грану-лоцитопоэза при тяжелом гипоксическом воздействии.

Полученные результаты в целом позволяют охарактеризовать состояние системы крови, являющееся следствием несостоятельности компенсаторно-приспособительных механизмов кроветворения при кислородной недостаточности, как «эритропоэтический дистресс», проявляющийся в дизадаптации ге-мопоэтической ткани и продукции патологических форм эритроцитов.

При этом падение содержания кроветворных прекурсоров на фоне повышения функциональной активности относительно резистентных стромаль-ных компонентов ГИМ, могло быть связано с их повреждением под влиянием чрезмерной активации симпатоадреналовой и гипофизарно-надпочечниковой систем. Такой извращенный (негативный) эффект избытка катехоламинов на клетки-предшественники гемопоэза был выявлен на модели цитостатической миелосупрессии, вызванной введением антиметаболита [Гольдберг Н.Д., Дыгай

A.M., Хлусов И.А., 1997]. Причиной же патологической импульсации симпато-адреналовой системы при гипоксии могла послужить декомпенсация тормозных медиаторных систем, так как в ряде случаев известна их наибольшая уязвимость к недостатку кислорода [Шевченко Ю.Л., 2000; Мороз В.В., 2002; Алексеева A.B., Гурвич A.M., Семченко В.В., 2003].

Для подтверждения предположений о центральном генезе выявленных гематологических феноменов при тяжелой окислительной недостаточности мышам на фоне моделирования гипоксии однократно вводили оксибутират натрия в дозе 500 мг/кг, что во всех случаях отменяло появление психоневрологических признаков энцефалопатии и существенно коррегировало проявления дизадаптации системы крови.

Фармакологическая «защита» мозга повышала количество предшественников эритропоэза в костномозговой ткани как при гипоксической гипоксии высокой степени тяжести (3-5, 8-е сут), так и при индуцированном гемолизе (6-е сут) и обильной кровопотере (3-й сут). Причем данные изменения во всех случаях отмечались на фоне возрастания пролиферативной способности прекурсоров до уровней аналогичных параметров у животных, подвергшихся соответствующим видам гипоксии, но не вызывающим «грубых» нарушений деятельности ЦНС. Компенсация нарушений состояния пула коммитированнык клеток-предшественников закономерно приводила к нивелированию снижения уровня гиперплазии эритроидного ростка кроветворения, а также отмене развития гипохромной анемии в постгипоксическом периоде при ГТО и увеличению количества эритроцитов в периферической крови при введении 150 мг/кг гемолитического яда (4-10-е сут) и эксфузии 70% объема циркулирующей крови (4, 5, 10-е сут). При этом имело место статистически достоверное снижение размеров зрелых клеток красной крови (4-е; 6-10-е и 5-10-е сут опыта при ГТО, ГА и KP соответственно) при отсутствии значительных изменений в поступлении в кровь ретикулоцитов.

Изучение секреторной функции отдельных компонентов ГИМ после моделирования тяжелой гипоксии на фоне нейропротекции выявило снижение продукции ЭПА прилипающими миелокариоцитами на 4-е сут при ГТО, на 1, 7, 10-е сут при ГА и на 7-е сут эксперимента при массивной KP. В то же время введение оксибутирата натрия практически не оказывало влияние на фидерную способность ТЬу-1,2+-клеток в отношении КОЕ-Э, за исключением ее прямой

стимуляции в ранние сроки после введения антигипоксанта (2-е сут при ГТО и ГЛ), выработку ЭПА неприлипающими клетками костного мозга и эритропо-этическую активность сыворотки, что, безусловно, свидетельствует об основном значении непосредственного воздействия именно гипоксии (а не ее влияния через структуры ЦНС) на мобильные элементы ГИМ, в том числе Т-клетки, и дистантные гуморальные механизмы регуляции эритропоэза в условиях глобального дефицита кислорода.

Введение оксибутирата натрия увеличивало также содержание прекурсоров грануломоноцитопоэза в гемопоэтической ткани на 4, 6-е; 5, 7-е и 10-е сут при ГГО, ГА и КР соответственно, и повышало скорость их деления. В то же время во всех случаях отмечалось падение индекса созревания КОЕ-ГМ. В частности, при гипоксии гермообъема данные изменения регистрировались на 1, 2, 4-6-е сут опыта, при тяжелой гемолитической анемии на 2-е сут после воздействия и при кровопотере на 5, 9-е сут эксперимента. Развитие указанных сдвигов было вызвано снижением во всех группах выработки КСА прилипающими нуклеарами костного мозга (2, 7, 8, 10-е; 1, 5-е и 5-е сут при ГТО, ГА и КР соответственно), а при гипоксической гипоксии (1, 4, 5-е сут) и кровопотере (1, 3-й сут) еще и с уменьшением содержания индукторов грануломоноцитопоэза в сыворотке крови. Тем не менее, интенсивность дифференцировки грану-ломоноцитарных прекурсоров при назначении антигипоксанта все же достоверно превосходила аналогичные показатели у животных, подвергшихся соответствующим видам гипоксии, не вызывающим поражение ЦНС. Такая сравнительно высокая скорость созревания клеток-предшественников грануломоноцитопоэза во всех случаях была связана с сохранением фидерной активности ТЬу-1,2+-клеток в отношении КОЕ-ГМ (2, 4-е сут), усиленной выработкой КСА не-адгезирующми миелокариоцитами в начальные сроки наблюдения и повышенным уровнем гемопоэтинов в сыворотке крови в позднем периоде. В конечном итоге, изменения пролиферативно-дифференцировочного статуса КОЕ-ГМ приводили к увеличению числа зрелых нейтрофильных гранулоцитов в костном мозге на 5, 7-е сут при гемолитической анемии и на 3, 4, 6-е сут при кровопотере, и не оказывали значимого влияния на количество морфологически идентифицируемых клеток гранулоцитопоэза при гипоксии гермообъема (относительно соответствующих показателей у животных, которым антигипоксант не вводили).

Отражением описанных неоднозначных изменений костномозговою гранулоцитопоэза при введении оксибутирата натрия в периферической крови во всех случаях явилось снижение количества сегментоядерных нейтрофилов (3-7-е; 1, 2, 6, 7-е и 7-9-е сут опыта при ГТО, ГА и KP соответственно) относительно контрольных значений на фоне все-таки повышенного уровня их содержания по сравнению с соответствующими показателями у животных после аналогичных по своей природе воздействий, не вызывающих энцефалопатию. При этом в основе сохранения высокого уровня продукции нейтрофилов, по-нашему мнению, лежит физиологически обусловленная необходимость «очищения» тканей от детрита [Дыгай A.M., Клименко H.A., 1992; Li С., Jackson R.M., 2002], образование которого существенно увеличивается при возрастании степени тяжести гипоксии.

Полученные экспериментальные данные однозначно свидетельствуют о связи патологии головного мозга, вызванной «глобальной» гипоксией различного генеза, со снижением количества кроветворных прекурсоров в гемопо-этической ткани, повышением фидерной активности стромальных компонентов ГИМ и продукцией патологических форм эритроцитов.

Вместе с тем, как уже было указано выше, непосредственной причиной дизадаптации системы крови, наиболее значимыми проявлениями которой, безусловно, являются нарушения эритропоэза, при гипоксии высокой степени тяжести могло быть повреждение гемопоэтических клеток под влиянием адренер-гических стимулов. При этом согласно литературным данным эффекты катехо-ламинов на эритропоэз реализуются преимущественно через бета-адренергические рецепторы [Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Хлусов И.А., 1997; Гольдберг Е.Д, Дыгай A.M., Провалова Н.В. и др., 2004].

Исследование роли адренергических механизмов регуляции гемопоэза в формировании гематологических сдвигов при гипоксии, сопровождающейся развитием энцефалопатии, показало, что блокада бета-адренорецепторов на 2-е сут после двукратной гипоксической гипоксии приводила к увеличению в периферической крови числа эритроцитов (4, 7, 9-е сут), содержания гемоглобина (5-е сут) и отмене развития гипохромной анемии в постгипоксическом периоде. Введение пропранолола так же существенно улучшало динамику восстановления показателей красной крови после моделирования гемолитической и геморрагической анемий высокой степени тяжести. Отмечалось повышение количе-

ства эритроцитов на 6-9-е и 5, 6, 9-е сут и гематокрита на 6-8-е и 4-е сут наблюдения при введении 150 мг/кг гемолитического яда и обильной кровопотере соответственно. При этом качественный анализ форменных элементов выявил значительное снижение размеров эритроцитов у мышей, получавших пропра-нолол, по сравнению с аналогичными показателями у контрольных животных (на 4-е; 7-10-е и 5-10-е сут после гипоксии гермообъема, введения фенилгидра-зина и кровопотери соответственно). Указанные изменения со стороны периферической крови явились закономерным отражением динамики костномозгового эритропоэза. Отмечалось увеличение количества эритрокариоцитов в костном мозге на 5-е; 6, 9-е и 6, 7-е сут опыта при назначении пропранолола после двукратной гипоксии гермообъема, введения 150 мг/кг солянокислого фенилгидра-зина и эксфузии 70% объема циркулирующей крови соответствено, по сравнению с животными, у которых активность адренергических механизмов не кор-регировалась.

Культуральные исследования роли адренергических стимулов на эри-тропоэз выявили зависимость описанных реакций крови от состояния пула ро-доначальных клеток в гемопоэтической ткани. Так, введение пропранолола достоверно повышало содержание эритроидных прекурсоров в костном мозге как при гипоксической гипоксии на 65,85% и массивном гемолизе на 57,14% на 4-е сут эксперимента, так и в постгеморрагическом периоде на 3-й и 4-е сут опыта (на 38,9% и 29,0% соответственно). Изучение пролиферативной активности клеток-предшественников эритропоэза показало возрастание во всех случаях темпа их деления, достигающее, однако, статистической значимости только при гипоксии гермообъема на 3-й сут после воздействия. В то же время ни в одной группе не наблюдалось существенных изменений скорости дифференци-ровки КОЕ-Э, несмотря на снижение продукции эритропоэтически активных субстанций прилипающей фракцией костного мозга на 4-е сут при гипоксии гермообъема и кровопотере. При этом применение антагониста бета-адренорецепторов не влияло на секреторную функцию неадгезирующих элементов ГИМ и эритропоэтическую активность сыворотки крови.

Вместе с тем со стороны грануломоноцитарного ростка кроветворения при введении бета-адреноблокатора изменения носили, в основном, перераспределительный характер и заключались в нарушении поступления молодых нейтрофилов в кровь, что вполне согласуется и с данными литературы, полу-

ченными на других моделях патологии [Гольдберг Н.Д., Дыгай A.M., Хлусов И.А., 1997]. Действие данного фармакологического агента ограничивалось лишь незначительным накоплением зрелых нейтрофильных гранулоцитов в костном мозге при моделировании гемолитической анемии (7-е сут) и после массивной кровопотери (3, 4, 10-е сут), и снижением числа палочкоядерных ней-трофилов в периферической крови (3-й и 3, 4-е сут при ГГО и КР соответственно). Существенных различий в содержании других морфологически дифференцируемых клеточных элементов грануломоноцитарного ряда в костном мозге и периферической крови, а также в количестве и состоянии пула КОЕ-ГМ ни в одной из моделей энцефалопатии не наблюдалось. Пропранолол не оказывал влияния и на уровни КСА кондиционных сред неприлипающих миелокариоци-тов и сыворотки крови, хотя, при введении 150 мг/кг фенилгидразина и эксфу-зии 70% ОЦК на 5-е сут после воздействий снижал продукцию КСА адгези-рующими клетками ГИМ.

В целом, проведенные эксперименты позволили установить, что чрезмерная активация адренергических систем организма при гипоксии высокой степени тяжести оказывала негативное влияние на эритропоэз. При этом указанный «извращенный» эффект избытка катехоламинов был связан с повреждением измененных экстремальным фактором эритроидных прекурсоров и реализовался через бета-адренорецепторы, локализованные на их мембранах [Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Хлусов И.А., 1997; Гольдберг Ь.Д, Дыгай A.M., Провалова Н.В. и др., 2004].

Таким образом, поражение мозговых структур при кислородной недостаточности и, связанное с ним изменение активности адренергических механизмов регуляции гемопоэза, существенно нарушают развитие адекватных адаптивных реакций системы крови, что, в свою очередь, еще в большей мере ухудшает окислительное обеспечение тканей организма, подвергшегося гипоксии (рис. 2).

В связи с обнаружением в последние годы во взрослом организме, в том числе в костном мозге и ЦНС, различных пулов стволовых клеток, способных по мнению ряда авторов участвовать в развитии компенсагорно-приспособительных реакций при воздействии различных болезнетворных аген-

тов [Friendcnstein A.J., 1973; Owen М.,

.............. nth -1988-Lindval О., 1991;

РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ[ БИБЛИОТЕКА С. Петербург ) •эти* '

— J»

Рис. 2. Схема регуляции кроветворения при гипоксии высокой степени тяжести различного генеза, сопровождающейся развитием энцефалопатии.

Пятиугольные стрелки - изменения напрямую связаны с повреждением мозговых сгруктур; изогнутые стрелки - изменения вызваны непосредственно влиянием гипоксии.

Серые стрелки - активирующее; белые - ингибирующее влияние.

Kopen G.C.,Prockop D.J., Phinney D.G., 1999; Kuznetsov S.A., Robey P.G., 2000; Reading L., Still K., Bishop N. e.a., 2000; Kondziolka D., Wechler L., Goldstein S. e.a., 2000; Сухих Г.Т., Малайцев B.B., 2001; Степанов Г.А., Карпенко Д.О., Александрова М.А. и др., 2003] было изучено влияние гипоксии на состояние пулов костномозговых и циркулирующих мезенхимальных стволовых клеток, а так же на содержание регионарных клеток-предшественников в головном мозге.

В ходе эксперимента было обнаружено, что кислородная недостаточность, не вызывающая «грубых» нарушений психоневрологического статуса, приводила к увеличению содержания МСК в костном мозге на 1-е сут опыта (до 193,5%; 264,% и 309,7% от фона при гипоксии гермообъема (ГТО), гемолитической анемии (ГА) и кровопотере (Кр) соответственно), с быстрой последующей (на 3, 7-е сут) нормализацией величин данного показателя. При этом количество МСК в периферической крови сохранялось на уровне исходных значений. В то же время во всех моделях отмечалась тенденция к увеличению содержания нейральных клеток-предшественников в головном мозге. Причем при пшокси-ческой гипоксии и потере 30% объема циркулирующей крови данные изменения на 3-е сут опыта достигали статистической значимости (до 135,3% и 136,9% от фона соответственно).

Во многом схожие сдвиги исследуемых параметров наблюдались при кислородной недостаточности, вызывающей нарушение деятельности ЦНС. Так, развитие энцефалопатии практически не оказывало влияния на содержание МСК в костном мозге на 1-е сут после различных гипоксических воздействий, за исключением снижения их числа при моделировании постгеморрагической энцефалопатии. При гипоксической гипоксии и введении высокой дозы фенил-гидразина количество МСК значительно превосходило фоновые показатели и было на уровне аналогичных параметров при моделях гипоксии, не сопровождающихся формированием патологии головного мозга. В то же время увеличение степени тяжести воздействий существенно повышало содержание МСК в костном мозге на 3-й сут опыта: до 240,4% от фона при гипоксии гермообъема и гемолитической анемии и до 264,5% от исходного уровня при обильной кровопотере. Вместе с тем описанные изменения не приводили к росту числа МСК в периферической крови. Исследование содержания нейральных клеток-предшественников в паравентрикулярной области больших полушарий голов-

ного мозга у животных, подверппихся тяжелой гипоксии, выявило во всех случаях повышение их количества, достигающее статистической значимости на 3-е сут при ГТО; на 7-е сут при введении высокой дозы гемолитического яда и на 3, 7-е сут опыта при кровопотере. Вместе с тем на 1-е сут опыта при моделировании кислородной недостаточности с помощью солянокислого фенилгидразина имело место падение числа стволовых клеток в нервной ткани, вероятно, связанное с их повреждением, используемым токсическим агентом [Заугольникова С.Д., 1982].

Полученные результаты свидетельствуют в пользу участия мезенхи-мальных стволовых клеток костного мозга в формировании реакций системы крови при кислородной недостаточности различного генеза, особенно, при ее тяжелых формах. Вместе с тем даже выраженное повышение функциональной активности костномозговых МСК при гипоксии высокой степени тяжести оказывается не способным нивелировать падение числа коммитированых кроветворных прекурсоров в гемопоэтической ткани, являющееся причиной развития «эритропоэтического дистресса» в случаях развития энцефалопатии. Кроме того, исходя из данных исследования, следует, что увеличение количества стволовых клеток в головном мозге при гипоксии связанно со стимуляцией непосредственно регионарных нейральных клеток-предшественников и не зависит от состояния пула МСК в костном мозге.

Таким образом, гипоксические воздействия различной этиологии приводили к активации механизмов «глубокого резерва» - стволовых клеток, которые, однако, оказывались недостаточными и несостоятельными при гипоксии высокой степени тяжести, что, в конечном итоге, проявлялось в развитии энцефалопатии и дизадаптации кроветворной ткани.

Учитывая данные литературы, свидетельствующие о возможности мобилизации эндогенных стволовых клеток костного мозга с помощью различных фармакологических агентов - модификаторов их функциональной активности, в том числе гранулоцитарного колониестимулирующего фактора [Haas R., Murea S., 1996; Varas F., Bernad A., Bueren J.A., 1996; Erna H, Takano H., Sudo К. е.а., 2000; Audet J., Miller C.L., Rose-John S. е.а., 2001], сопровождающимся в ряде случаев ускорением регенерации поврежденных органов и тканей под их действием при различных заболеваниях [Burkhard R., Schanz U., Gmur J. е.а., 1996; Varas F., Bernad A., Bueren J.A., 1996; Scagni P., Saracco P., Timeus F., 1998; No-

roi F., Bonin P., Charpentier F., 1998; Kawada H., Sasao T., Yonekura S., Hotta T., 1998; Orlic D., Kajstura J.,Chimenti S. e.a., 2001] было проведено исследование влияния рчГ-КСФ на психоневрологический статус животных, подвергшихся гипоксии высокой степени тяжести.

Проведенные эксперименты показали, что курсовое введение рчГ-КСФ сразу после моделирования тяжелой кислородной недостаточности либо полностью отменяло появление признаков энцефалопатии (гипоксическая гипоксия, кровопотеря), либо значительно коррегировало их проявление (гемолитическая анемия) в зависимости от используемой модели.

Для выяснения возможных механизмов выявленного нейропротектив-ного действия данного препарата было изучено влияние рчГ-КСФ на состояние пулов регионарных нейральных, мезенхимальных костномозговых и циркулирующих СК, а также на показатели системы крови при гипоксии высокой степени тяжести.

Введение рчГ-КСФ при моделировании тяжелой окислительной недос-таточночсти различного генеза не оказывало существенного влияния на содержание МСК в костном мозге на 1-е сут после воздействий. Однако, в отличие от «чистых» моделей энцефалопатии, рчГ-КСФ приводил к значительному усилению выхода МСК в периферическую кровь на 1-е сут до 266,7%; 391,7% и 683,3% от фона при ГТО, ГА и Кр соответсвенно и не влиял на содержание СК в крови в более поздние сроки. В то же время на 3-е сут исследования количество МСК в костном мозге было существенно ниже, чем у животных с энцефалопатией, причем при ГТО и Кр указанные изменения оказывались статистически значимыми, а на 7-е сут при гемолитической анемии вновь наблюдалось возрастание числа костномозговых длительнорепопулирующих клеток по сравнению с исходным уровнем данного показателя. Вместе с тем сдвига в состоянии пула мезенхимальных стволовых клеток костного мозга, вызванные рчГ-КСФ, заключающиеся в выраженной мобилизации МСК в периферическую кровь приводили, очевидно, в конечном итоге, и к их детерминированному хомингу в ЦНС. При этом на сегодняшний день доказана возможность проникновения СК костного мозга через гематоэнцефалический барьер с их дальнейшей дифференцировкой в специализированные элементы нервной ткани, в том числе и нейроны [Mezey Е., Key S., Vogelsang G., Szalayova I. e.a., 2003]. В ходе исследования отмечалось существенное увеличение количества нейральных пре-

курсоров в головном мозге на 1, 3, 7-е сут эксперимента при гипоксии гермо-объема и кровопотере и на 1, 3-е сут при окислительной недостаточности, связанной с введением солянокислого фенилгидразина. В то же время прямого влияния на нейральные прекурсоры рчГ-КСФ при его добавлении in vitro в культуру клеток головного мозга интактных мышей и животных с постгеморрагической энцефалопатией не оказывал.

Исследование действия препарата на показатели системы крови позволило выявить, что во всех случаях при его введении имело место снижение числа кроветворных прекурсоров в костном мозге на 1-е сут, очевидно, связанное с их мобилизацией и миграцией в селезенку [De Haan G., Loeffler M., Nijhof W., 1992], с дальнейшим существенным увеличением количества гемопоэтиче-ских КОЕ на 3-е и 7-е сут опыта. 11ри этом на 3-е сут содержание в гемопоэти-ческой ткани КОЕ-Э во всех моделях, а КОЕ-ГМ при тяжелой гемолитической анемии и массивной кровопотере значительно превосходило даже уровни соответствующих показателей у животных, подвергшихся гипоксии, не вызывающей развитие патологии ЦНС. Учитывая, что данное повышение числа кроветворных предшественников происходило на фоне падения количества МСК в костном мозге при отсутствии их выхода в кровь (на 3-й сут), можно высказать предположение о стимуляции в данные сроки под влиянием рчГ-КСФ диффе-ренцировки МСК в элементы РИМ [Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Жданов В.В., 2005]. Описанные изменения со стороны пула коммитированных кроветворных клеток-предшественников закономерно приводили к увеличению содержания эритрокариоцитов в костном мозге на 7-е сут при ГТО и ГА и на 5, 7-е сут при Кр, а также накоплению незрелых на 5-е; 1, 5-е и 1, 3-е сут опыта и, в меньшей мере, зрелых нейтрофильных гранулоцитов на 5-е; 7-е и 1-е сут эксперимента при ГТО, ГА и Кр соответственно. Вместе с тем в периферической крови на 7-е сут исследования отмечалось достоверное повышение числа эритроцитов при фенилгидразин-индуцируемой анемии и потере 70% объема циркулирующей крови. В то время как количество нейтрофилов было увеличено лишь в началь ные сроки эксперимента (1-е сут), что, свидетельствует об их мобилизации при первом введении препарата и, по-видимому, неэффективном гранулоцитопоэзе под его влиянием при гипоксии в дальнейшем.

Нснрои

Г-КСФ

I О.ЮКИОЙ мои

Рис. 3. Схема механизмов нейропротективного действия гранулоцитарного колониесгимулирующего фактора (Г-КСФ) при гипоксии различного генеза. НСК - нейральные стволовые клетки.

Серые стрелки - эффект, связанный с мобилизацией, миграцией и хомингом

МСК в головной мозг, а также с активацией эритропоэза;

белая стрелка - снижение глутамат-зависимой эксайтотоксичности.

В целом, полученные результаты свидетельствуют о выраженном ней-ропротективном действии гранулоцитарного колониестимулирующего фактора при гипоксии различного генеза. При этом механизмами действия данного препарата, наряду со снижением под его влиянием глутамат-зависимой эксайто-токсичности [Schäbitz W.R., Kollmar R., Schwaninger M e.a..,2003], являются: стимуляция, мобилизация и детерминированный хоминг в пораженные зоны ЦНС эндогенных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга (а возможно МСК и других тканей), с их дальнейшей дифференцировкой в специализированные элементы, а также активация экстрамедулярного [De Haan G., Loef-fler M., Nijhof W. , 1992] и костномозгового эритропоэза, способствующего оптимизации газового гомеостаза в организме (рис. 3).

ВЫВОДЫ

1. Гипоксия гермообъема, гемолитическая анемия и кровопотеря приводят к увеличению количества мезенхимальных стволовых клеток в костном мозге и к стимуляции функциональной активности клеток-предшественников гемопоэза с последующим накоплением в костном мозге эритрокариоцитов, сопровождаемое увеличением количества ретикулоцитов в периферической крови, а также к повышению числа эритроцитов при гипоксии гермообъема и, напротив, развитию анемии при введении фенилгидразина и кровопотере.

2. В развитии гиперплазии кроветворной ткани при гипоксии гермообъема, гемолитической анемии и кровопотере важную роль играют миграция Г-клеток-регуляторов гемопоэза в костный мозг, их кооперация с адгезирую-щими элементами, увеличение образования гемопоэтических островков, преимущественно эритроидного типа, возрастание уровня индукторов гемопоэза в сыворотке крови, усиление секреции эритропоэтической активности клеточными компонентами гемопоэзиндуцирующего микроокружения, повышение продукции колониестимулирующей активности прилипающими миелокариоцита-ми, а при введении фенилгидразина еще и неприлипающими элементами костного мозга.

3. Существенную роль в формировании суммарной эритропоэтической активности сыворотки крови in vivo при кислородной недостаточности, помимо эритропоэтина, играют иные гуморальные факторы. При этом возрас-

тание эритропоэтической активности сыворотки крови на фоне отсутствия выраженных изменений концентрации в ней эритропоэтина по срокам совпадает с увеличением уровня гемолиза.

4 Гипоксическая гипоксия, не вызывающая развития энцефалопатии, сопровождается разобщением процессов пролиферации и дифференцировки грануломоноцитарных прекурсоров, что приводит к неэффективному грануло-моноцитопоэзу и снижению числа сегментоядерных нейтрофилов в периферической крови.

5. Развитие энцефалопатии при гипоксии различного генеза сопровождается: падением содержания коммутированных клеток-предшественников эритропоэза, снижением уровня гиперплазии эритроидного ростка кроветворения и повышением продукции патологических форм эритроцитов, приводящим к развитию отсроченной гипохромной анемии при гипоксии гермообъема и нарушению динамики восстановления уровня эритроцитов в периферической крови при гемолитической анемии и кровопотере.

6. Нарушения эритропоэза при энцефалопатии различного генеза развиваются на фоне увеличения количества мезенхимальных стволовых клеток в костном мозге, возрастания фидерных свойств ТЬу-1,2+-клеток в отношении кроветворных прекурсоров во взаимодействии их с адгезирующими компонентами гемопоэзиндуцирующего микроокружения (несмотря на снижение числа Т-клеток в гемопоэтической ткани) и повышения функциональной акшвности прилипающих элементов костного мозга.

7. Развитие энцефалопатии при гипоксических воздействиях сопровождается снижением количества грануломоноцитарных клеток-предшественников в костном мозге и ускорением их созревания на фоне усиления как прямого, так и опосредованного стимулирующего действия ТЬу-1,2+-клеток в отношении КОЕ-ГМ, повышения секреции короткодистантных гуморальных факторов клеточными элементами гемопоэзиндуцирующего микроокружения и возрастания колониестимулирующей активности сыворотки крови, вызывающим при гипоксической гипоксии расширение плацдарма грануломо-ноцитопоэза и снижение содержания нейтрофильных гранулоцитов в костном мозге при гемолитической анемии и кровопотере, и во всех случаях развитие нейтрофильного лейкоцитоза.

8. Гипоксия различного генеза, особенно, высокой степени тяжести, сопровождающаяся развитием энцефалопатии, приводит к увеличению содержания регионарных нейральных клеток-предшественников в паравентрикуляр-ной области головного мозга при отсутствии изменений со стороны пула ме-зенхимальных стволовых клеток периферической крови.

9. Коррекция развития патологии мозга при моделировании тяжелых гипоксической гипоксии, гемолитической анемии и кровопотере, осуществляемая введением оксибутирата натрия, предупреждает снижение уровня гиперплазии эритроидного ростка кроветворения, падение содержания клеток-предшественников эритропоэза, уменьшение их пролиферативной активности, повышает фидерные свойства Т-клеток, снижает продукцию патологических форм эритроцитов, отменяет развитие гипохромной анемии после гипоксии гермообъема и улучшает динамику восстановления количества эритроцитов в периферической крови после введения гемолитического агента и в постгеморрагическом периоде.

10. Применение оксибутирата натрия на фоне моделирования гипоксической и гемической гипоксии (гемолитической анемии и кровопотери) высоких степеней тяжести приводит во всех случаях к возрастанию числа грануло-цито-макрофагальных прекурсоров в костном мозге при снижении интенсивности их созревания за счет уменьшения продукции колониестимулирующей активности прилипающими клетками костного мозга, сопровождающимся, в конечном итоге, уменьшением количества сегментоядерных нейтрофилов в периферической крови.

11. Введение неселективного бета-адреноблокатора (пропранолола) после моделирования тяжелой кислородной недостаточности различного генеза (гипоксическая гипоксия, гемолитическая анемия и кровопотеря) повышает содержание прекурсоров эритропоэза в костном мозге, нивелирует снижение уровня гиперплазии эритроидного ростка кроветворения и увеличивает количество эритроцитов в периферической крови за счет уменьшения продукции их патологических форм.

12. Курсовое введение рекомбинантпого гранулоцитарного колоние-стимулирующего фактора после моделирования тяжелой кислородной недостаточности предотвращает появление нарушений психоневрологического статуса (гипоксическая гипоксия, кровопотеря), либо существенно коррегирует (гемо-

литическая анемия) их проявления на фоне мобилизации мезенхимальных стволовых клеток костного мозга в периферическую кровь, сопровождающейся повышением содержания регионарных нейральных клеток-предшественников в головном мозге, а также активацией эритропоэза.

ПЕРЕЧЕНЬ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Реакции гранулоцитарного ростка кроветворения в условиях невротических воздействий / В соавт. с Дыгаем А.М., Скурихиным Е.Г., Сусловым Н.И., Проваловой Н.В., Боровик Ю А., Гольдбергом Е.Д. // Бюл. эксперим. биологии и медицины. - 1998. -№ 12. - С.628-630.

2. О роли центральных адренергических структур в регуляции кроветворения в условиях невротических воздействий / В соавт. с Скурихиным Е.Г., Сусловым Н.И., Проваловой Н.В., Минаковой М.Ю., Дыгаем A.M. // Бюл. эксперим. биологии и медицины. - 1999. Приложение 1. - С. 7-9.

3. Роль центральных адренергических структур в регуляции кроветворения в условиях экспериментальных невротических воздействий // Актуальные проблемы фармакологии и поиска новых лекарственных препаратов (сборник научных работ молодых ученых). - Томск, 1999. - С. 168-169.

4. Модулирующее влияние на гранулоцитопоэз при невротических воздействиях фармакологических антагонистов симпатической нервной системы // Современные проблемы фундаментальной и клинической медицины (сборник научных работ молодых ученых). - Томск, 1999. - С.31-32.

5. Роль центральной нервной системы в регуляции кроветворения в условиях экспериментальных невротических воздействий / В соавт. с Скурихиным Е.Г., Дыгаем A.M., Сусловым Н.И., Проваловой Н.В., Пахомовой A.B., Гольдбергом Е.Д.//Бюл. эксперим. биологии и медицины,-2001,-№ 1.-С. 134-136.

6. Коррекция адаптогенами изменений в системе крови при экспериментальных невротических воздействиях // Проблемы экспериментальной и клинической фармакологии (сборник научных работ молодых ученых). -Томск, 2000. - С. 34-35.

7. Роль дофамин- и серотонинергических структур в регуляции кроветворения в условиях экспериментальных невротических воздействий // Проблемы

экспериментальной и клинической фармакологии (сборник научных работ молодых ученых). - Томск, 2000. - С.39-40.

8. Коррекция резерпином, дигидротамином и пропранололом изменений в поведении мышей при экспериментальных невротических воздействиях / В соавт. с Скурихиным Е.Г., Проваловой Н.В., Першиной О.В. // Проблемы экспериментальной и клинической фармакологии (сборник научных работ молодых ученых). - Томск, 2000. - С.41^12.

9. Механизмы регуляции гемопоэза в условиях невротических реакций / В соавт. с Дыгаем A.M., Скурихиным Е.Г., Проваловой Н.В., Сусловым Н.И. // Второй Российский конгресс по патофизиологии (с международным участием). Тезисы докладов - Москва, 2000. - С.91.

10. Адренергические механизмы влияния препаратов природного происхождения на систему крови в условиях иммобилизационного стресса // Материалы международной конференции. - Поиск, разработка и внедрение новых лекарственных средств и организационных форм фармацевтической деятельности. - Томск, 2000. - С. 186-187.

11. Значение индивидуальных особенностей когнитивной деятельности для проявления ноотропных свойств адаптогенных препаратов / В соавт. с Сусловым Н.И., Скурихиным Е.Г., Проваловой Н.В., Першиной О.В., Дыгаем A.M., Гольдбергом Е.Д. // Материалы 3-ей международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам». -Суздаль, 2001,-С.142.

12. О влиянии постгипоксической энцефалопатии на гематологические сдвиги в постгипоксическом периоде // Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии. - Томск, 2002. - С. 65-68.

13. Реакции системы крови и механизмы их развития в постгипоксическом периоде // Материалы IV Молодежной конференции СО РАМН. - Новосибирск, 2002.-С. 19.

14. Реакции эритроидного ростка кроветворения и механизмы их развития при гипоксии различной степени тяжести / В соавт. с Гольдбергом Е.Д., Дыгаем A.M., Гурьянцевой Л.А., Сусловым Н.И.// Бюл. эксперим. биол. и медицины. -2002,-№8.-С. 142-145.

15. Влияние препаратов природного происхождения на систему крови и когнитивные функции при гипоксическом воздействии / В соавт. с Першиной О.В.,

Сусловым Н.И., Проваловой Н.В., Скурихиным Е.1., Минаковой М.Ю // Бюл. эксперим. биол. и мед. - 2002. - Приложение 1. - С. 27-30.

16. Реакции системы крови и механизмы их развития в постгипоксическом периоде / В соавт. с Гольдбергом Е.Д., Дыгаем A.M., // Материалы III-й Всероссийской конференции (с международным участием): Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция. - Москва, 2002. - С. 41.

17. Реакции гранулоцитарного ростка кроветворения при гипоксии различной степени тяжести / В соавт. с Гурьянцевой Л.А., Сусловым Н.И., Дыгаем A.M., Гольдбергом ЕД. // Бюл. эксперим. биол. и мед. - 2002. -№10.-С. 379-382.

18. Механизмы гематологических сдвигов в постгипоксическом периоде // Бюл. СО РАМН. - 2003. - №1. - С. 20 -23.

19. Механизмы регуляции кроветворения в постгипоксическом периоде / В соавт. с Гольдбергом Е.Д., Дыгаем A.M.// Бюл. эксперим. биол. и медицины. -2003. Приложение 2. - С. 17-23.

20. Механизмы регуляции гемопоэза в постгипоксическом периоде / В соавт. с Гольдбергом Е.Д., Дыгаем A.M.// Експериментальна i клшчна медицина. -XapKiB (Украша), 2003. - №2. - С. 30-35.

21. Механизмы регуляции гемопоэза в постгипоксическом периоде // Материалы конференции «Актуальные проблемы фармакологии». - Томск, 2004. -С. 65-67.

22. Механизмы регуляции эритропоэза при гемолитической анемии / В соавт. с Абрамовой Е.В., Дыгаем А.М., Гольдбергом Е.Д..// Бюл. эксперим. биол. и медицины. - 2004. - №10. - С. 378-381.

23. Дизрегуляция гемопоэза при гипоксии различного генеза / В соавт. с Гольдбергом Е.Д., Дыгаем A.M.// Матер. 3-го Российского конгресса по патофизиологии. - Москва, 2004. - С. 66.

24. Реакции эритроидного ростка кроветворения и механизмы их развития при кровопотере / В соавт. с Абрамовой Е.В., Дыгаем A.M., Гольдбергом Е.Д..// Бюл. эксперим. биол. и медицины. - 2005. - №1. - С. 32-37.

25. Гуморальные механизмы регуляции эритропоэза при гипоксии / В соавт. с Дыгаем A.M., Гольдбергом Е.Д. // Бюл. эксперим. биол. и медицины. - 2005. -№2.-С. 133-137.

26. Реакции гранулоцитарного ростка кроветворения и механизмы их развития при гипоксии разного генеза / В соавт. с Дыгаем A.M., Гольдбергом Е.Д..// Бюл. эксперим. биол. и медицины. - 2005. - №3. - С. 254-258.

27. Психофармакологические эффекты гранулоцитарного колониестимули-рующего фактора и их механизмы при гипоксии высокой степени тяжести / В соавт. с Гольдбергом Е.Д., Дыгаем A.M., Ждановым В.В., Сусловым Н.И., Ставровой JI.A., Сотниковой Н.В. // Бюл. эксперим. биол. и медицины. - 2005. -№4. - С. 367-370.

28. Роль адренергических механизмов регуляции эритропоэза при гипоксии высокой степени тяжести / В соавт. с Абрамовой Е.В., Дыгаем A.M., Гольдбергом Е.Д. // Бюл. эксперим. биол. и медицины. -2005,- №7.- С.18-23.

29. Гематологические механизмы адаптации к гипоксии и их фармакокор-рекция / В соавт. с Гольдбергом Е.Д., Дыгаем А.М. // Материалы IV-й Всероссийской конференции (с международным участием): Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция. - Москва, 2005. - С. 29.

30. Механизмы психофармакологических эффектов гранулоцитарного коло-ниестимулирующего фактора // Материалы конференции «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии». - Томск, 2005 - С. 17-19.

31. Механизмы гепатопротекторного эффекта препарата сверхмалых доз антител к гранулоцитарному колониестимулирующему фактору / В соавт. с Эп-пггейном О.И., Сотниковой Н.В., Ставровой J1.A., Фоминой Т.Н., Ветоппсиной Т.В., Сергеевой С.А., Дубской Т.Ю., Дыгаем A.M., Гольдбергом Е.Д. // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2005. - №4. - С. 194-198.

32. Фармакологическая регуляция функциональной активности стволовых клеток при восстановлении миокарда в постинфарктном периоде / В соавт. с Ставровой JI.A., Фоминой Т.И., Плотниковым М.Б., Сотниковой Н.В., Эпштей-ном О.И., Сергеевой С.А., Гурьянцевой JI.A., Ждановым В.В., Дыгаем A.M., Гольдбергом Е.Д. // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2005. -№4.-С. 189-193.

33. Роль стволовых клеток в адаптации к гипоксии и механизмы нейропро-тективного действия гранулоцитарного колониестимулируютцего фактора / В соавт. с Сусловым Н.И., Дыгаем А.М., Ждановым В.В., Гольдбергом И.Д. // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2005. - №4. - С. 202-208.

47

»

I

i

»26 02«

РНБ Русский фонд

2006-4 30034

и

Актуальность проблемы. Гипоксия как типовой патологический процесс, сопровождает практически все известные заболевания. Дефицит кислорода, нарушая энергетический обмен, вызывает повреждение, в первую очередь структур ЦНС, определяемое спецификой функционирования ее клеточных элементов. Основной особенностью последних является сочетание высокого уровня метаболической активности, сопряженной с интенсивным потреблением кислорода и большой скоростью обновления фонда макроэр-гических веществ [Girotti A.W., 1985; Рябов Г.А., 1988; Алексеева A.B., Гур-вич А.М., Семченко В.В., 2003; Лукьянова Л.Д., 2002; 2004; Гусев Е.И., Скворцова В.И., 2004]. Угнетение аэробного окисления в тканях головного мозга существенно реорганизует центральную нервную систему, изменяет интегративно-пусковую деятельность нейронов и приводит к формированию качественно нового паттерна взаимодействия отдельных мозговых структур, а в случае декомпенсации механизмов адаптации, запускает цепь патологических процессов, приводящих как к прогрёссирующим неврологическим нарушениям (развитию энцефалопатии), так и расстройствам деятельности многих внутренних органов [Неговский В.А., Гурвич A.M., Золотокрылина Е.С., 1987; Krause G.S., White B.C., Aust S.D. e.a., 1988; Неговский B.A., 1991; Мороз B.B., 2002; Крыжановский Г.Н., 2002; Алексеева A.B., Гурвич А.М., Семченко В.В., 2003]. В то же время при гипоксии мозг сам становится объектом патогенных влияний органной патологии: нарушений гемодинамики, иммунного статуса, гемостаза и пр. [Неговский В.А., 1991; Negovsky V., 1995; Шевченко Ю.Л., 2000; Мороз В.В., 2002; Алексеева A.B., Гурвич A.M., Семченко В.В., 2003].

Система крови играет одну из ключевых ролей в поддержании го-меостаза и формировании адекватных компенсаторно-приспособительных реакций организма при экстремальных воздействиях [Гольдберг Е.Д., 1992;

Hasan M.M., 1996; Ястребов А.П., 1999]. С другой стороны, согласно имеющимся представлениям регуляция кроветворения осуществляется тесным взаимодействием локальных и дистантных контролирующих механизмов [Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Жданов В.В., 1999; Юшков Б.Г., Климин В.Г., Северин М.В., 1999; Захаров Ю.М., Рассохин А.Г., 2002]. При этом координирующая функция в развитии ответа гемопоэтической ткани на воздействия неблагоприятных факторов внешней и внутренней среды принадлежит именно центральному (нейроэндокринному) звену регуляции [Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Хлусов И.А., 1997; Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Провалова Н.В. и др., 2004].

Вместе с тем до настоящего времени во многом остается не изучена роль как локальных, так и дальноранговых механизмов регуляции гемопоэза в формировании гематологических сдвигов при гипоксии различного генеза и степени тяжести. В частности, не существует данных о секреторной активности отдельных компонентов ГИМ при гипоксии, а также о роли межклеточной кооперации различных элементов микроокружения с кроветворными прекурсорами. К настоящему времени не решены многие вопросы, связанные со значимостью различных гуморальных факторов сыворотки крови в регуляции гемопоэза при гипоксических состояниях. Остается абсолютно не исследованным влияние энцефалопатии на формирование реакций системы крови при окислительной недостаточности, хотя считается доказанным важное значение нарушения деятельности ЦНС в развитии постреанимационной патологии других органов и систем, обеспечивающих постоянство внутренней среды [Krause G.S., White B.C., Aust S.D. e.a., 1988; Неговский B.A., 1991; Мороз B.B., 2002; Крыжановский Г.Н., 2002; Алексеева A.B., Гурвич A.M., Семченко В.В., 2003; Лукьянова Л.Д., 2004].

Развитие биомедицинской науки в области клеточных технологий в XX веке привело к обнаружению в костном мозге не только кроветворных полипотентных клеток [Maximow A.A., 1924; Хлопин Н.Г., 1927; Till J.E.,

McCullough E.A., 1961; Чертков И.Л., Гуревич O.A., 1984], являющихся родоначальниками всех элементов крови, но и истинных (мезенхимальных) стволовых клеток [Friendenstein A.J., 1973; Owen М., Friedenstein A.J., 1988; Kopen G.C., Prockop D.J., Phinney D.G., 1999; Kuznetsov S.A., Robey P.G., 2000; Reading L., Still K., Bishop N. e.a., 2000], обладающих уникальной способностью к самоподдержанию, а в случае необходимости к миграции и хомингу в отдаленные органы и дифференцировке во многие специализированные клеточные типы. При этом назначением данных элементов является регенерация тканей в ответ на физиологическую убыль клеток либо их гибель, вызванную повреждающим фактором [Holtzer Н., 1978; Kuznetsov S.A., Friendenstein A.J., Robey P.G., 1997; Сухих Г.Т., Малайцев В.В., 2001; 2002]. В то же время на сегодняшний день не вызывает сомнения факт существования стволовых клеток в головном мозге взрослого организма [Gussoni Е., Soneoka Y., Strickland C.D. e.a., 1999; Александрова M.A., Полтавцева P.A., Марей M.B. и др., 2001; Gritti A., Luca Bonfanti, Doetsch F. e.a., 2002; Сосунов A.A., Челышев Ю.А., 2002], во многом, по современным представлениям, обеспечивающих пластичность ЦНС при различного рода повреждающих воздействиях [Lindval О., 1991; Kondziolka D., Wechler L., Goldstein S. e.a., 2000; Сухих Г.Т., Малайцев B.B., 2001; Степанов Г.А., Карпенко Д.О., Александрова М.А. и др., 2003; Корочкин Л.И., Ревищин A.B., Охотин В.Е., 2005].

Тем не менее, в мировой литературе не существует данных об участии компенсаторно-приспосабительных механизмов «глубокого резерва» -мезенхимальных стволовых клеток - в развитии ответа гемопоэтической ткани на гипоксию, а также в восстановлении нарушений функций ЦНС, вызванных дефицитом кислорода.

Вместе с тем полученные в последние годы сведения о свойствах и закономерностях жизнедеятельности мультипотентных клеток-предшественников организма открыли возможность развития нового направления в лечении многих заболеваний с помощью стволовых клеток [Erna Н.,

Takano H., Sudo К., Nacauchi H., 2000; Cossu G., Mavilio F., 2000; Horwitz E.M., Prockoo D J., Gordon P.L., 2001 ; in t'Anker P.S., Noort W.A., Kruisselbrink A.B., 2002]. Однако отсутствие надежных клеточных технологий на сегодняшний день делает введение в организм недифференцированных и низко-очищенных клеточных элементов далеко не безопасным делом [Damjanov I., 1993; Almqvist P.M., 2002; Pallera A.M., Schwartzberg L.S., 2004; Serakinci N., 2004; Uchida K., 2004]. В то же время, существует другая стратегия клеточной терапии, основанная на возможности мобилизации эндогенных стволовых клеток с помощью фармакологических агентов [Yano T., Katayama Y., Sunami К., Deguchi S. e.a., 1997; Scagni P., Saracco P., Timeus F., 1998], одним из которых, по мнению ряда исследователей, может выступать гранулоци-тарный колониестимулирующий фактор [Haas R., Murea S., 1996; Norol F., Bonin P., Charpentier F., 1998; Kavvada H., Sasao T., Yonekura S., Hotta T., 1998; Orlic D., Kajstura J.,Chimenti S e.a.,2001].

Гипоксическое поражение головного мозга и, как следствие, развитие энцефалопатии в постреанимационном периоде является одним из наиболее опасных и часто встречаемых осложнений в реаниматологической практике [Мороз В.В., 2002; Крыжановский Г.Н., 2002; Алексеева A.B., Гур-вич А.М., Семченко В.В., 2003]. Тем не менее, несмотря на имеющийся для лечения данной патологии широкий арсенал медикаментозных средств с разнонаправленными механизмами действия, зачастую все же не удается добиться не только «полного» излечения пациентов, перенесших критическое состояние, но и достичь даже частичного восстановления утерянных функций. При этом к настоящему времени не предпринималась попытка фармакологической коррекции (активации) репаративных процессов в головном мозге, поврежденном гипоксией, с помощью модификации функциональной активности эндогенных стволовых клеток.

В связи с вышеизложенным весьма актуальным является исследование механизмов регуляции и дизадаптации системы крови при кислородной недостаточности. Кроме того, несомненный интерес представляет поиск новых патогенетически обоснованных методов фармакологической коррекции нарушений кроветворения при гипоксии, а также способов терапии болезней реанимированного организма, в том числе, энцефалопатии, основанных на изменении пролиферативно-дифференцировочного баланса стволовых клеток in situ, детерминировании их миграционных свойств и включении определенной заданной программы дифференцировки.

Цель исследования: изучить механизмы регуляции и дизадаптации системы крови при кислородной недостаточности различного генеза. Разработать патогенетически обоснованные методы фармакологической коррекции гематологических нарушений при гипоксии.

Задачи исследования:

1. Выявить закономерности развития изменений показателей периферической крови, костномозгового кроветворения и структурно-функциональной организации костного мозга при гипоксической гипоксии, гемолитической анемии и кровопотере различных степеней тяжести.

2. Оценить процессы пролиферации и дифференцировки кроветворных прекурсоров при различного рода гипоксических воздействиях.

3. Изучить роль гемопоэзиндуцирующего микроокружения в формировании гематологических сдвигов при кислородной недостаточности различного генеза и степени тяжести.

4. Выявить изменения гемопоэза, сопутствующие развитию энцефалопатии при гипоксии различной этиологии, и показать возможность их фармакологической коррекции.

5. Вскрыть роль адренергических механизмов регуляции кроветворения при гипоксических воздействиях высокой степени тяжести.

6. Исследовать состояние пула мезенхимальных стволовых клеток в костном мозге и их содержание в периферической крови при гипоксической гипоксии, гемолитической анемии и кровопотере разных степеней тяжести.

7. Изучить динамику содержания нейральных клеток-предшественников в головном мозге при кислородной недостаточности различного генеза.

8. Исследовать влияние гранулоцитарного колониестимулирующего фактора на психоневрологический статус, содержание мезенхимальных стволовых клеток в костном мозге и периферической крови, а также на содержание нейральных клеток-предшественников в головном мозге при кислородной недостаточности высокой степени тяжести.

Положения, выносимые на защиту:

1. В основе адаптивного ответа кроветворной ткани на гипоксию различного генеза, заключающегося в развитии гиперплазии эритроидного, и в меньшей мере грануломоноцитарного ростков миелопоэза, лежит повышение функциональной активности коммитированных клеток-предшественников, являющееся следствием миграции Т-клеток-регуляторов гемопоэза в костный мозг, их кооперации со стромальными элементами, повышение фидерной активности клеточных компонентов гемопоэзиндуци-рующего микроокружения, образование de novo гемопоэтических островков, преимущественно эритроидного типа, и увеличение содержания гемопоэти-чески активных субстанций в сыворотке крови.

2. Существенную роль в формировании суммарной эритропоэтиче-ской активности сыворотки крови in vivo при кислородной недостаточности, помимо эритропоэтина, играют иные гуморальные факторы. При этом возрастание эритропоэтической активности сыворотки крови на фоне отсутствия выраженных изменений концентрации в ней эритропоэтина по срокам совпадает с увеличением уровня гемолиза.

3. Развитие энцефалопатии при гипоксических воздействиях сопровождается дизадаптацией кроветворной ткани, проявляющейся в снижении уровня гиперплазии костномозгового эритропоэза, падении содержания ком-митированных клеток-предшественников и повышении продукции патологических форм эритроцитов. При этом указанные нарушения эритропоэза развиваются несмотря на увеличение количества мезенхимальных стволовых клеток в костном мозге, возрастание фидерных свойств Т-клеток-регуляторов в отношении кроветворных прекурсоров во взаимодействии их с адгезирую-щими компонентами ГИМ и повышение функциональной активности прилипающих элементов костного мозга. Осуществление фармакологической «защиты» мозга при гипоксии высокой степени тяжести с помощью оксибути-рата натрия предотвращает развитие дизадаптации гемопоэтической ткани, практически не влияя на Т-лимфоцитарные механизмы регуляции кроветворения.

4. Негативное влияние гипоксического повреждения ЦНС на кроветворение реализуется через изменение активности симпатоадреналовой системы организма. Введение неселективного антагониста бета-адренорецепторов (пропранолола) после воздействия повышает содержание клеток-предшественников эритропоэза в костном мозге, нивелирует снижение уровня гиперплазии эритроидного ростка кроветворения, увеличивает количество эритроцитов в периферической крови и уменьшает продукцию их патологических форм.

5. Гипоксия, сопровождающаяся развитием энцефалопатии, приводит к ускорению созревания предшественников грануломоноцитопоэза и развитию нейтрофильного лейкоцитоза в результате повышения секреторной функции прилипающих миелокариоцитов, увеличения как прямых, так и опосредованных через взаимодействие с адгезирующими элементами гемопоэзиндуцирующего микроокружения фидерных свойств ТЬу-1,2+-клеток в отношении КОЕ-ГМ, повышения продукции гемопоэтически активных факторов неприлипающими компонентами ГИМ и возрастания колониестимули-рующей активности сыворотки крови.

6. Гипоксические воздействия различного генеза приводят к активации механизмов адаптации «глубокого резерва»: увеличению содержания ме-зенхимальных стволовых клеток в костном мозге и повышению количества регионарных нейральных клеток-предшественников в головном мозге, которые, однако, на фоне отсутствия мобилизации МСК в периферическую кровь оказываются недостаточными и несостоятельными при гипоксии высокой степени тяжести, что, в конечном итоге проявляется в развитии энцефалопатии и дизадаптации гемопоэтической ткани.

7. Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор обладает выраженным нейропротективным эффектом при гипоксии различного генеза. При этом механизмами специфического действия Г-КСФ являются: стимуляция, мобилизация и миграция мезенхимальных стволовых клеток костного мозга, сопровождающаяся увеличением содержания нейральных клеток-предшественников в ЦНС, а также активация эритропоэза, способствующая оптимизации газового гомеостаза в организме.

Научная новизна. В работе впервые на современном методическом уровне охарактеризовано состояние системы крови при гипоксической гипоксии, гемолитической анемии и кровопотере различных степеней тяжести. Выявлена значительная гиперплазия эритроидного, и в меньшей мере грану-ломоноцитарного ростков миелопоэза при кислородной недостаточности разной этиологии, не вызывающей «грубых» нарушений психоневрологического статуса. Показано, что в основе данных изменений во всех случаях лежит повышение функциональной активности коммутированных клетокпредшественников гемопоэза, связанное с миграцией Т-клеток-регуляторов гемопоэза в костный мозг, их кооперацией со стромальными элементами, увеличением продукции гуморальных регуляторов клеточными компонентами гемопоэзиндуцирующего микроокружения, стимуляцией образования de novo гемопоэтических островков, преимущественно эритроидного типа, и возрастанием содержания гемопоэтически активных субстанций в сыворотке крови. При этом на разных моделях гипоксии выявлено несоответствие динамики эритропоэтической активности сыворотки крови с содержанием в ней эритропоэтина. Впервые показана существенная роль гемолиза в формировании in vivo суммарной эритропоэтической активности сыворотки крови при гипоксии.

Впервые выявлена возможность развития дизадаптации гемопоэти-ческой ткани при гипоксической гипоксии, гемолитической анемии и крово-потери высоких степеней тяжести. Обнаружено негативное влияние энцефалопатии различного происхождения на формирование гематологических сдвигов. Установлено, что поражение мозговых структур при гипоксии любой этиологии сопровождается падением содержания коммитированных клеток-предшественников в костном мозге, в первую очередь, прекурсоров эри-тропоэза, снижением уровня гиперплазии эритроидного ростка и продукцией патологических форм эритроцитов, а таюке развитием нейтрофильного лейкоцитоза.

Впервые показано отрицательное влияние адренергических механизмов регуляции кроветворения на гемопоэз при тяжелых гипоксических воздействиях. Выявлено, что чрезмерная активация симпатоадреналовой системы организма, являющаяся следствием гипоксического поражения ЦНС, представляет собой непосредственную причину возникновения нарушений кроветворения при гипоксической и гемической окислительной недостаточности высокой степени тяжести. На разных моделях гипоксии показана возможность коррекции нарушений в системе крови с помощью фармакологической «зашиты» мозга, предотвращающей развитие энцефалопатии, и при введении неселективного антагониста бета-адренорецепторов после воздействия.

Впервые показано, что при гипоксии различного генеза высокой степени тяжести, сопровождающейся развитием энцефалопатии, происходит нарушение миграции ТЬу-1,2т-клеток регуляторов-гемопоэза в костный мозг. В то же время при этом наблюдается повышение их фидерных свойств в отношении эритроидных прекурсоров исключительно во взаимодействии с элементами адгезирующей фракции костного мозга, и увеличение как опосредованной, так и прямой их стимулирующей активности в отношении грануло-моноцитарных клеток-предшественников. Установлено, что описанные изменения со стороны Т-клеточных механизмов регуляции гемопоэза при развитии энцефалопатии оказываются связанными непосредственно с тяжестью кислородной недостаточности и не зависят от повреждения структур ЦНС (практически не коррегируются при осуществлении фармакологической «защиты» мозга). Тем не менее, в случаях гипоксической гипоксии и гемолитической анемии высоких степеней тяжести показана возможность непродолжительной активации прямого стимулирующего эффекта ТЬу-1,2+-клеток в отношении эритроидных прекурсоров с помощью антигипоксанта - оксибу-тирата натрия.

Впервые исследовано состояние пула мезенхимальных стволовых клеток в костном мозге, их содержание в периферической крови и динамика содержания нейтральных клеток-предшественников в головном мозге при гипоксии различного генеза и степени тяжести. Показано участие мезенхимальных стволовых клеток костного мозга в формировании гематологических сдвигов при кислородной недостаточности, особенно ее тяжелых формах. Выявлено увеличение количества регионарных стволовых клеток в головном мозге при гипоксии, связанное со стимуляцией непосредственно регионарных нейральных клеток-предшественников в условиях дефицита кислорода, и не зависящее от состояния пула костномозговых МСК. Полученные результаты показали, что гипоксические воздействия различной этиологии приводят к активации механизмов «глубокого резерва» (стволовых клеток), которые, однако оказываются недостаточными и несостоятельными при гипоксии высокой степени тяжести, что, в конечном итоге, проявляется в развитии энцефалопатии и дизадаптации кроветворной ткани.

Установлена принципиальная возможность фармакологической коррекции (активации) репаративных процессов в головном мозге, поврежденном гипоксией, с помощью модификатора функциональной активности эндогенных стволовых клеток - гранулоцитарного колониестимулирующего фактора. Показан высокий нейропротективный эффект данного цитокина при кислородной недостаточности различного генеза, связанный с мобилизацией мезенхимальных стволовых клеток костного мозга в периферическую кровь, сопровождающийся повышением содержания регионарных нейральных клеток предшественников в ЦНС, а также с активацией эритропоэза, способствующей оптимизации газового гомеостаза в организме.

Практическая значимость. В ходе исследований разработано три новых способа моделирования патологии головного мозга: способ моделирования постгипоксической энцефалопатии, способ моделирования гипоксиче-ской энцефалопатии и способ моделирования постгеморрагической энцефалопатии (получены 3 патента на изобретение). Кроме того, разработан новый патогенетически обоснованный метод фармакологической коррекции нарушений эритропоэза, возникающих при кислородной недостаточности высокой степени тяжести, способ экспериментальной терапии энцефалопатии и способ коррекции нарушений эритропоэза при экспериментальной энцефалопатии (поданы 3 заявки на изобретение). При этом выявленная нейропро-тективная активность гранулоцитарного колониестимулирующего фактора при гипоксии высокой степени тяжести характеризует препарат как эффективный и позволяет рекомендовать проведение клинических испытаний его в качестве средства для лечения и профилактики развития энцефалопатии.

Полученные новые теоретические знания могут быть использованы в педагогическом процессе, а также явиться базой для дальнейшего развития подхода к лечению болезней реанимированного организма, основанного на стимуляции гематологических механизмов адаптации к гипоксии «глубокого резерва» - мезенхимальных стволовых клеток костного мозга.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на IV конференции молодых ученых СО РАМН «Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины» (Новосибирск, 2002), на Ш Российской конференции (с международным участием) «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция» (Москва, 2002), на II конференции молодых ученых НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии» (Томск, 2002), на конференции, посвященной 20-летию НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН, «Актуальные проблемы фармакологии» (Томск, 2004), на Ш Российском конгрессе по патофизиологии (с международным участием) (Москва, 2004), на IV Российской конференции (с международным участием) «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция» (Москва, 2005), на Ш конференции молодых ученых НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии» (Томск, 2005), на региональной конференции «Фармакологическая регуляция стволовых клеток» (Томск, 2005).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 33 печатные работы, из них 18 в центральных журналах, 1 из которых за рубежом; получены 3 патента на изобретения: патент (1Ш) № 2240604 «Способ моделирования по-стгипоксической энцефалопатии и связанных с ней нарушений в системе крови» (опубл. 20.11.2004г., Бюл. № 32), патент (Щ) № 2253152 «Способ моделирования гипоксической энцефалопатии» (опубл. 27.05.2005г., Бюл. № 15), патент (ГШ) № 2257620 «Способ моделирования постгеморрагической энцефалопатии» (опубл. 27.06.2005г., Бюл. № 21); и поданы 3 заявки на изобретения (ЕШ): «Способ экспериментальной терапии энцефалопатии» (заявка № 2004139157, приоритет от 31.12.2004 г.), «Способ коррекции нарушений эритропоэза при экспериментальной гипоксии» (заявка № 2005102549, приоритет от 2.02.2005 г.), «Способ коррекции нарушений эритропоэза при экспериментальной энцефалопатии» (заявка № 2005130286, приоритет от 28.09.2005 г.).

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 451 страницы машинописного текста и состоит из введения, четырех глав, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 38 рисунками и 99 таблицами. Библиографический указатель включает 552 источника, из них 283 отечественных и 269 иностранных.

выводы

1. Гипоксия гермообъема, гемолитическая анемия и кровопотеря приводят к увеличению количества мезенхимальных стволовых клеток в костном мозге и к стимуляции функциональной активности клеток-предшественников гемопоэза с последующим накоплением в костном мозге эритрокариоцитов, сопровождаемое увеличением количества ретикулоцитов в периферической крови, а также к повышению числа эритроцитов при гипоксии гермообъема и, напротив, развитию анемии при введении фенилгидразина и кровопотере.

2. В развитии гиперплазии кроветворной ткани при гипоксии гермообъема, гемолитической анемии и кровопотере важную роль играют миграция Т-клеток-регуляторов гемопоэза в костный мозг, их кооперация с ад-гезирующими элементами, увеличение образования гемопоэтических островков, преимущественно эритроидного типа, возрастание уровня индукторов гемопоэза в сыворотке крови, усиление секреции эритропоэтической активности клеточными компонентами гемопоэзиндуцирующего микроокружения, повышение продукции колониестимулирующей активности прилипающими миелокариоцитами, а при введении фенилгидразина еще и непри-липающими элементами костного мозга.

3. Существенную роль в формировании суммарной эритропоэтической активности сыворотки крови in vivo при кислородной недостаточности, помимо эритропоэтина, играют иные гуморальные факторы. При этом возрастание эритропоэтической активности сыворотки крови на фоне отсутствия выраженных изменений концентрации в ней эритропоэтина по срокам совпадает с увеличением уровня гемолиза.

4. Гипоксическая гипоксия, не вызывающая развития энцефалопатии, сопровождается разобщением процессов пролиферации и дифференци-ровки грануломоноцитарных прекурсоров, что приводит к неэффективному грануломоноцитопоэзу и снижению числа сегментоядерных нейтрофилов в периферической крови.

5. Развитие энцефалопатии при гипоксии различного генеза сопровождается: падением содержания коммитированных клеток-предшественников эритропоэза, снижением уровня гиперплазии эритроидно-го ростка кроветворения и повышением продукции патологических форм эритроцитов, приводящим к развитию отсроченной гипохромной анемии при гипоксии гермообъема и нарушению динамики восстановления уровня эритроцитов в периферической крови при гемолитической анемии и кровопотере.

6. Нарушения эритропоэза при энцефалопатии различного генеза развиваются на фоне увеличения количества мезенхимальных стволовых клеток в костном мозге, возрастания фидерных свойств ТЪу-1,2+-клеток в отношении кроветворных прекурсоров во взаимодействии их с адгезирующими компонентами гемопоэзиндуцирующего микроокружения (несмотря на снижение числа Т-клеток в гемопоэтической ткани) и повышения функциональной активности прилипающих элементов костного мозга.

7. Развитие энцефалопатии при гипоксических воздействиях сопровождается снижением количества грануломоноцитарных клеток-предшественников в костном мозге и ускорением их созревания на фоне усиления как прямого, так и опосредованного стимулирующего действия ТЪу-1,2+-клеток в отношении КОЕ-ГМ, повышения секреции короткодистантных гуморальных факторов клеточными элементами гемопоэзиндуцирующего микроокружения и возрастания колониестимулирующей активности сыворотки крови, вызывающим при гипоксической гипоксии расширение плацдарма грануломоноцитопоэза и снижение содержания нейтрофильных грану-лоцитов в костном мозге при гемолитической анемии и кровопотере, и во всех случаях развитие нейтрофильного лейкоцитоза.

8. Гипоксия различного генеза, особенно, высокой степени тяжести, сопровождающаяся развитием энцефалопатии, приводит к увеличению содержания регионарных нейральных клеток-предшественников в паравентри-кулярной области головного мозга при отсутствии изменений со стороны пула мезенхимальных стволовых клеток периферической крови.

9. Коррекция развития патологии мозга при моделировании тяжелых гипокеичеекой гипоксии, гемолитической анемии и кровопотере, осуществляемая введением оксибутирата натрия, предупреждает снижение уровня гиперплазии эритроидного ростка кроветворения, падение содержания клеток-предшественников эритропоэза, уменьшение их пролиферативной активности, повышает фидерные свойства Т-клеток, снижает продукцию патологических форм эритроцитов, отменяет развитие гипохромной анемии после гипоксии гермообъема и улучшает динамику восстановления количества эритроцитов в периферической крови после введения гемолитического агента и в постгеморрагическом периоде.

10. Применение оксибутирата натрия на фоне моделирования гипокеичеекой и гемической гипоксии (гемолитической анемии и кровопотери) высоких степеней тяжести приводит во всех случаях к возрастанию числа гранулоцито-макрофагальных прекурсоров в костном мозге при снижении интенсивности их созревания за счет уменьшения продукции колониестиму-лирующей активности прилипающими клетками костного мозга, сопровождающимся, в конечном итоге, уменьшением количества сегментоядерных нейтрофилов в периферической крови.

11. Введение неселективного бета-адреноблокатора (пропранолола) после моделирования тяжелой кислородной недостаточности различного ге-неза (гипоксическая гипоксия, гемолитическая анемия и кровопотеря) повышает содержание прекурсоров эритропоэза в костном мозге, нивелирует снижение уровня гиперплазии эритроидного ростка кроветворения и увеличивает количество эритроцитов в периферической крови за счет уменьшения продукции их патологических форм.

12. Курсовое введение рекомбинантного гранулоцитарного колоние-стимулирующего фактора после моделирования тяжелой кислородной недостаточности предотвращает появление нарушений психоневрологического статуса (гипоксическая гипоксия, кровопотеря), либо существенно корреги-рует (гемолитическая анемия) их проявления на фоне мобилизации мезенхимальных стволовых клеток костного мозга в периферическую кровь, сопровождающейся повышением содержания регионарных нейральных клеток-предшественников в головном мозге, а также активацией эритропоэза.

1.7. Заключение.

Система крови самым непосредственным образом участвует в адаптации организма к условиям, возникающим при воздействии различного рода экстремальных факторов, в том числе и при гипоксии. В литературе достаточно подробно описаны изменения со стороны периферической крови и костномозгового кроветворения в условиях кислородной недостаточности. Однако до сих пор, во многом еще не изучена роль как локальных, так и дистантных механизмов регуляции гемопоэза в формировании гематологических сдвигов при гипоксии различного генеза и степени тяжести. В частности, не существует данных о секреторной активности отдельных компонентов ГИМ при гипоксии, а также о роли межклеточной кооперации различных элементов микроокружения с кроветворными прекурсорами. Вместе с тем до настоящего времени не решены многие вопросы, связанные со значимостью различных гуморальных факторов сыворотки крови в регуляции гемопоэза при гипоксических состояниях. До сегодняшнего дня остается абсолютно не исследовано влияние энцефалопатии на формирование изменений в системе крови при окислительной недостаточности, хотя считается доказанным важное значение нарушения деятельности ЦНС в развитии постреанимационной патологии многих других органов и систем, обеспечивающих постоянство внутренней среды. В мировой литературе не существует сведений об участии компенсаторно-приспосабительных механизмов «глубокого резерва» костного мозга - мультипотентных (мезенхимальных) стволовых клеток - в развитии ответа гемопоэтичеекой ткани на гипоксию, а также в восстановлении нарушений жизнедеятельности организма, вызванных дефицитом кислорода, в целом. Кроме того, на сегодня не известна принципиальная возможность фармакологической коррекции (активации) репаративных процессов в головном мозге, поврежденном гипоксией, с помощью модификации функциональной активности эндогенных как регионарных, так и костномозговых стволовых клеток.

Таким образом, весьма интересным представляется изучение механизмов регуляции и дизадаптации системы крови при гипоксии различного генеза и степени тяжести. Вместе с тем учитывая единство механизмов управления деятельностью органов и систем, работы в данном направлении помогут в решении общебиологической проблемы адаптогенеза, а также в создании новых патогенетически обоснованных методов фармакотерапии болезней реанимированного организма, основанных на изменении пролифе-ративно-дифференцировочного баланса стволовых клеток in situ, детерминировании их миграционных свойств и включении определенной заданной программы дифференцировки.

ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ Работа выполнена на 2962 мышах линии СВА/СаЬас и 180 мышах-гибридах И СВА/СаЬас х С57В1/6 массой 18-20 г в возрасте 2-2,5 мес. Животные 1 категории (конвенциональные линейные мыши) получены из коллекционного фонда лаборатории экспериментального биомедицинского моделирования НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН (сертификат имеется).

Распределение животных по сериям экс пер и ментов в соответствии с поставленными задачами представлено в таблице 1.

Для моделирования гипоксических состояний использовались гипок-сическая гипоксия, гемолитическая и постгеморрагическая анемии (гемиче-ская гипоксия). Гипоксическая гипоксия моделировалась путем однократного и двукратного (с промежутком перед повторным воздействием в 10 мин) помещения животных в термокамеру объемом 500 мл. Мыши из термокамеры извлекались после окончания генерализованных судорог и\или остановки дыхания (определяемой визуально) в течение 10-15 сек.

Гемолитическую анемию моделировали с помощью однократного внутрибрюшинного введения солянокислого фенилгидразина в дозах 30 мг/кг и 150 мг/кг.

Постгеморрагическую анемию моделировали путем кровопотери, осуществляемой пункцией ретроорбитального синуса и выпусканием через промытую раствором гепарина градуированную пастеровскую пипетку: в первом случае - одномоментно 30% объема циркулирующей крови (ОЦК), и 70% от ОЦК в течение 2-3-х часов дробно, за 3 раза - во втором. Расчет необходимого для забора количества крови производили из предположения, что у грызунов ОЦК составляет 1/13 часть от массы тела животного.

Наличие энцефалопатии регистрировали по развитию амнезии при воспроизведении условного рефлекса пассивного избегания и нарушению ориентировочно-исследовательского поведения животных в открытом поле

Walsh R.N., Cummins R.A., 1976; Буреш Я., Бурешова О., Хьюстон Дж.П., 1991].

Для коррекции нарушений функций ЦНС мышам сразу после воздействия (при гипоксии гермообъема) либо на фоне моделирования кислородной недостаточности высокой степени тяжести (при обоих вариантах ге-мической гипоксии) внутрибрюшинно однократно вводили оксибутират натрия в дозе 500 мг/кг. Контрольной группе в аналогичных условиях вводили физиологический раствор в эквивалентном объеме (0,2 мл). Умерщвление подопытных животных производили на 1-10-е сут после воздействия методом дислокации шейных позвонков.

С целью исследования адренергических механизмов регуляции кроветворения при гипоксии высокой степени тяжести мышам на 2-е сут после тяжелого гипоксического воздействия подкожно вводили пропранолол («Arzneimittelwerk», Германия) в дозе 5 мг/кг. Контрольной группе в аналогичных условиях вводили физиологический раствор в эквивалентном объеме (0,2 мл). Умерщвление животных производили на 3-10-е сут после воздействия методом дислокации шейных позвонков.

Для изучения нейропротекторных (психофармакологических) свойств гранулоцитарного колониестимулирующего фактора при гипоксии экспериментальным животным сразу после моделирования тяжелой гипоксии различного генеза 1 раз в день в течение 5 дней подкожно вводили 125 мкг/кг нейпогена («Hoffman-la Roche», Швейцария) - растворенного в 0,2 мл растворителя. Контрольной группе по той же схеме вводили физиологический раствор в эквивалентном объеме (0,2 мл). Умерщвление животных производили на 1-10-е сут после воздействия методом дислокации шейных позвонков.

Перед началом эксперимента и в период исследования мыши находились в виварии при температуре воздуха 20-22°С на обычном пищевом рационе, в пластиковых клетках (10-15 мышей). Для исключения сезонных колебаний изучаемых показателей все эксперименты были проведены в осенне-зимний период.