Автореферат и диссертация по медицине (14.00.32) на тему:Физиолого-экологические характеристики одноклеточной водоросли Closteriopsis acicularis var. Africana hind. применительно к биологической системе жизнеобеспечения человека

Идея создания системы жизнеобеспечения человека на основе биологического круговорота веществ принадлежит К.Э.Циолковокому (1954). В современной биоценологии она трактуется как идея формирования динамически устойчивой многокомпонентной системы, обладающей основными свойствами естественных биоценозов (Шепелев, Мелешко, 1973; Одум, 1975). Ее реализация во многом связана с рациональным выбором видовой структуры сообщества включаемых в систему организмов, и, в частности, с видовой структурой звена фотоавтотрофных организмов - определяющего звена системы.

Как известно, первые теоретические и экспериментальные исследования биорегенеративных систем проведены на одноклеточных водорослях рода Chlorella. Выбор этого объекта был обусловлен хорошей изученностью и высокими урожаями водорослей, получаемыми при массовом производственном культивировании, и был сведен лишь к селекции термофильных и устойчивых к неблагоприятным условиям среды штаммов (Sorokin, Myers, 1953; Владимирова, 1966; Кордш, 1966).

Детальное изучение хлореллы позволило выявить и решить ряд проблем, связанных со специфическими требованиями биологических систем жизнеобеспечения (БСЖО) человека. Общими усилиями советских ученых (Ничипорович и др., 1962; Семененко и др., 1962; Мелешко, 1964; Терсков и др., 1964) и зарубежных (Myers, Brown, 1961; Sorokin, Krauss, 1965 и др.) были решены вопросы получения высокой продуктивности водорослей и заложены основы создания высокопродуктивных реакторов, разработана технология непрерывного культивирования водорослей с возвратом питательной ср'еды фЛелешко и др., 1967; Лебедева и др., 1968), исследованы функциональные характеристики высокопродуктивной популяции водорослей и рассчитан материальный баланс (Мелешко и др., 1967). Все это явилось основой для создания функционального звена системы замкнутого круговорота веществ на основе хлореллы и позволило перейти к этапу моделирования систем.

Исследования разработанных к настоящему времени экспериментальных моделей систем, где фотосинтетическое звено представлено одновидовой популяцией хлореллы, показали, что в таких моделях за счет регенерации веществ полностью обеспечивается потребность человека в кислороде и воде и-на. 8% - в пище. Общий коэффициент регенерации веществ в системе составляет около 83% (Шепелев и др., 1974). Помимо этого, водоросли выполняют в системе роль гидробиологического фильтра очистки атмосферы от всех водорастворимых примесей, которые не только поглощаются в водной среде, но и утилизируются водорослями и сопутствующей микрофлорой.

В результате изучения функциональных характеристик созданных моделей БОШ) человека выявлены основные требования к фото-автотрофному звену системы и определены пути возможной оптимизации его. Одним из наиболее реальных путей расширения функций звена в системе является увеличение доли биомассы водорослей в пищевом рационе человека (Шепелев и.др., 1972).

Использование биомассы одноклеточных водорослей, как и высших растений, в рационе питания человека в значительной степени зависит от разнообразия их видового состава и, следовательно, пищевых свойств. Исследования в области одноклеточных водорослей до последнего времени ограничивались 2-3 представителями рода Chlorella, не обладающих сколько-нибудь существенными различиями в их пищевых свойствах. Возможность широкого использования биомассы хлореллы в моделируемых системах ограничена, из-за низкого содержания углеводов и трудно разрушаемой клеточной оболочки и связанной с этим низкой перевариваемостью биомассы. Кроме того, возможности одного какого-либо вида всегда ограничены, особенно если речь идет об обеспечении человека. Расширение видового разнообразия фотоавтотрофного звена за счет видов, различающихся по биохимическому составу, позволит увеличить объем биомассы водорослей в пищевом рационе космонавтов. Это в свою очередь увеличит эффективность фотоавтотрофиого звена и системы в целом. Отсюда вытекает необходимость поиска, селекции и введения в интенсивную культуру новых форм одноклеточных водорослей.

В последние годы идет систематическое и планомерное освоение новых объектов с целью их дальнейшей практической реализации в замкнутых экологических системах и для промышленного фотосинтеза. Внимание исследователей стаж привлекать некоторые представители сине-зеленых водорослей: анацистис (Галкина и др., 1967), анабена, (Антонин, 1969), спирулина (Пиневич и др., 1970), синехококкус (Трубачев и др., 1977). Были предприняты попытки использования для интенсивного культивирования и некоторых жгутиковых водорослей. Особый интерес представляют природные формы жгутиковых, не имеющие клеточной стенки, такие как дуналиелла (Абдуллаев, Семе-ненко, 1974), эвглена (Мелешко и др., 1933) и безоболочные мутанты жгутиковых (Владимирова и др., 1933). Следует отметить большое разнообразие химического состава их биомассы, в особенности запасаемых веществ, а с ледова,1тельно, и ее пищевой ценности.

Исследования, проведенных в ИМБП МЗ СССР в последние годы, показа,ли, что среди водорослей разных таксономических групп имеются формы, удовлетворяющие требованиям БСЖО человека. Ранее в ШБП были введены в интенсивную культуру и исследованы до уровня функционального звена системы такие формы водорослей, как хламидомонада, спирулина и эвглена. Продуктивность их несколько ниже, чем у хлореллы, но, по-видимому, может быть повышена по мере их дальнейшего изучения. Потенциальные возможности новых форм водорослей хорошо иллюстрируются на примере хламидомонады. Детальные исследования этой водоросли позволили выявить до сих пор неизвестную зависимость продуктивности от количества фосфора в клетках водорослей. Эта зависимость была реализована в условиях непрерывной культуры и позволила получить устойчивую продуктивность хламидомонады, вполне соизмеримую с продуктивностью наиболее перспективных штаммов хлореллы (Мелешко и др., 1977).

Было з^становлено, что исследованные формы водорослей обладают большими различиями в составе биомассы. Например, в составе биомассы хламидомонады содержится до 50% углеводов на сухое вещество, среди которых основное место занимают крахмалоподобные вещества (Антонян и др., 1973 ). Клетки спирулины и эвглены характеризуются высоким содержанием бежа (до 55%) с оптимальным аминокислотным составом (Антонян и др., 1983).

Полученные результаты позволяют оценить перспективность поиска и введения в интенсивную культуру новых ранее не исследованных форм водорослей. Следует отметить, что отбор видов для БСЖО человека по специальным критериям как самостоятельный этап исследований отсутствовал, а природный материал изучен еще недостаточно. Эта проблема актуальна не только в космической биологии, ее успешное решение оказывает положительное влияние на разработку всей проблемы производственного фотобиосинтеза для пополнения пищевых и кормовых ресурсов на нашей планете.

Перед нами была поставлена задача ввести в интенсивную культуру новую форму хлорококковых водорослей - Closteriopsis acicularis var. africana Hind. - и изучить ее балансовые характеристики применительно к БСЖО человека. Эта форма водорослей была отобрана в нашей лаборатории в результате сравнительного изучения 10 различных видов водорослей, полученных из коллекции Прата (ЧССР). Она привлекла внимание наличием легко разрушаемой клеточной оболочки,более высоким по сравнению с хлореллой содержанием углеводов в биомассе и большими размерами клеток (Сычев, 1980). Ранее эта форма не была предметом лабораторных исследований.

При изучении клостериопсис нами были использованы общие методические подходы и основные этапы исследований, разработанные ранее для хлореллы (Мелешко, 1976).

В задачу наших исследований входили следующие вопросы:

1. Исследование фвиолого-экологических оптимумов среды для плотных популяций клостериопсис, культивируемых в конкретных биокультиваторах со свойственными им биотехническими параметрами;

2. Разработка метода непрерывного культивирования, удовлетворяющего требованиям замкнутого массообмена;

3. Исследование основных функциональных характеристик высокопродуктивной культуры клостериопсис и их динамики во времени;

4. Расчет материального баланса высокопродуктивной популяции как возможного функционального звена системы с замкнутым круговоротом веществ.

Настоящая работа выполнена под руководством доктора биологических наук Ганны Иосиповны Мелешко, которой автор горячо благодарен за постоянную помощь и ценные советы. Автор также благодарен д.тл.н. Шепелеву Е.Я., к.б.н. Литонян А.А., к.х.н. Лебедевой Е.К., Сычеву В.Н., консультациями которых он многократно пользовался при выполнении работы. Автор признателен всем сотрудникам лаборатории за помощь в проведении экспериментов.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Систематическое положение и распространение. Представители хлорококковых водорослей, ставшие в настоящее время объектами массовых культур и различного рода физиологических исследований, относятся к числу наиболее простых форм, утративших способность к половому процессу и образованию зооспор и размножающихся только автоспорами. Все это сводит к минимуму количество морфологических признаков, служащих у'них для разграничения родов и видов. Значительно затрудняет исследования систематического плана и чрезвычайно сильная изменчивость формы и размеров клеток у хлорококковых водорослей.

В связи с этим в литературе имеются различные толкования систематического положения многих родов и видов хлорококковых. Именно так обстоит дело с систематикой морфологически сходных водорослей p.p.Ankistrodesmus, Closteriopsis и др. Эти водоросли относятся к отд. Chlorophyta, кл. Chlorococcophyceae, пор. Chlorococcales, сем. AnkistrocLesmaceae.

Семейство Ankistrodesmaceae Korsch. 1953 объединяет 13 родов (Legnerova, 1965; Hindak, 1970, 1977).В последние годы большую работу по изучению данного семейства провел чехословацкий ученый Ф.Хиндак. В его работе (1977) приведен ключ для определения родов сем. Ankistrodesmaceae, а также описание отдельных родов и видов.

К роду Closteriopsis Lemmerman 1899 относятся водоросли, имеющие свободно-плавающие, одиночные, узко-веретеновидные или слегка дуговидно-изогнутые клетки. Водоросли размножаются автоспорами, образующимися в количестве 2-16. Наиболее характерным признаком, отличающим этот род от p.Ankistrodesmus является отсутствие у клеток оболочки из слизи. В зависимости от наличия и числа пиреноидов морфологически похожие водоросли разделяются на три рода: p. Monoraphidium - пиреноиды отсутствуют, p. Keratococcus - I пиреноид, p. Closteriopsis - 2 и более пиреноидов (Hindak, 1977).

В состав p. Closteriopsis входят три вида: C.acicularis, С.longissima - и С.pehri.

На территории СССР виды p. Closteriopsis и их разновидности отмечены в озерах Болыиеземельной тундры (Гецен и др., 1978), в водоемах Череповецкого района Вологодской области (Полянский, 1950), в озерах Полесья (Сретенская, I960), в рыбоводных прудах Латвийской ССР (Киселев, 1959), в водоемах Винницкой области (Рад-зимовский, 1934), в p.p. Днепр, Припять, Десна (Кортиков, 1953); в Придунайских и Приднестровских районах северо-западной части Черного моря (Иванов, I960), в Днепровско-Бугском лимане (Прийма-ченко, 1956), в различных водоемах Молдавии (Обух, 1978), в прудах Северного Прикаспия (Фокина, 1977), Разновидности C.acicularis и С.longissima широко распространены в водоемах различного типа -каналах, в водах рисовых полей, прудах рыбхозов - на территории Средней Азии (Эргашев, 1977, 1979 и др.), также они отмечены в дельтовых протоках р. Селенги и в заливе Провал о. Байкал (Поповская, I960, 19606), в различных водоемах Якутии (Комаренко, Васильева, 1978), в озере Ханка (Журкина, 1959), в Кучулинском водоеме на Дальнем Востоке (Кухаренко, 1978). Следует отметить, что в отечественной литературе виды этого рода часто относят к роду Ankistrodesmus, указывая название "Closteriopsis" как синоним (Коришков, 1953; Эргашев, 1977, 1979 и др.). Иностранные авторы сообщают об обнаружении этих водорослей в Чехословакии (Hindak, 1977), Венгрии (Hajdu, 1975), Австрии (Wawrik, 1977), ГДР (Heynig, 1980).

Водоросли p. Closteriopsis являются обычными в водоемах США (Smith., 1933; Whitford, Schumacher, 1969) и Индии (Pandey et al, I981 и др.).

- 12

Таким образом, виды p. Closteriopsis - широко распространенные водоросли пресноводно-солоноватоводных прудов, водохранилищ, медленно текущих рек. В водоемах постоянно встречаются в планктоне, иногда достигая доминирующего положения (Догадина., 1973; Фокина, 1977; Elder et al., 1979).

C.acicularis и С.longissima в природе развиваются преимущественно в воде гидрокарбонатного класса со слабощелочной реакцией и, как следствие этого, низкой концентрацией железа, при Т=Ю-31°С (Поповская, 1980а; Фокина, 1977; Гецен и др., 1978; Ку-хареико, 1978;.Эргашев, 1977, 1979). Эти водоросли способны переносить большую мутность воды (Иванов, I960; Нуркина, 1959), повышение рН до 10 и высокую концентрацию солей (Приймаченко, 1956 ; Kiss, 1964).

Водоросли как фотоавтотрофные организмы нуждаются для своего развития в наличии в первую очередь световой энергии, источников углерода и необходимых минеральных веществ. Кроме того, на. жизнедеятельность водорослей оказывают влияние такие физико-химические факторы внешней среды, как температура, рН среды и ее химический состав, концентрация углекислоты и кислорода в воздухе и некоторые другие. При искусственном культивировании требуется детальное изучение зависимости роста и развития водорослей от этих факторов.

Минеральное питание. Данные по составу питательных сред для культивирования водорослей p. Closteriopsis в литературе отсутствуют .

При сравнительном изучении роста водорослей p. Ankistrodesms на различных минеральных средах показано, что оптимальными для разных видов являются среды Ягужинского (Смирнов, 1953; Музафаров и др., 1977),Бенеке (Алеев, 1932; Русина, 1961), Тамиыя (Шоякубов,

1980), Чо-IO (Подсосный, Малышева, 1981), модифицированная среда Бристоля (Kobayashi, 1974; Prat et al., 1972).

Эти среды различаются по составу и концентрации питательны}: элементов. Общим для них является использование в качестве источника азота нитратов. Культивируются водоросли p.Ankistrodesmus и на средах, содержащих в качестве источника азота аммонийный ион (Паламарь-Мордвинцева, 1969; Бердыкулов, Нуриева, 1980).

Азот - важнейший биогенный элемент. Хлорококковые водоросли способны усваивать азот как из неорганических, так и из органических соединений. Они могут использовать в качестве источника азота нитраты, нитриты, аммонийный неорганический азот и гидроксиламин (Syrett, 1955, 1956). Изучая отношение различных одноклеточных водорослей к источникам азота Проктор (1957) показал, что Chlorella и Scenedesnrus отдают известное предпочтение аммонийному иону. Преимущественное поглощение аммонийного иона перед нитратным при их совместном присутствии в питательной среде установлено рядом авторов (Myers, Cramer, 1948; Schuler et al., 1953). При использовании в качестве источника азота азотнокислого аммония наблюдается сначала быстрое усвоение аммонийного иона, после полного поглощения которого водоросли начинают интенсивно использовать нитраты. Более того, клетки водорослей, уже прекратившие ассимиляцию нитратов, еще могут поглощать ажюнийный азот ( Syrett, 1955).

Хлорококковые водоросли усваивают и различные формы органического азота (Algeus, 1948, 1950; KirkD., Kirk М., 1978).

Изучено влияние различных источников азота на рост, развитие и накопление белка у A.falcatus (Алеев, 1932) и у A.braunii (Пала-марь-Мордвинцева, Костлан, 1965; Палагларь-Мордвинцева, 1969). Было установлено, что эти водоросли лучше всего растут при использовании в качестве источника азота органических и фосфорнокислых солей аммония, пептона, мочевины и гликокола. Минеральные соли аммония оказывают на исследованные водоросли резко угнетающее действие в результате подкисления среды при поглощении nhJ иона. При сравнении влияния нитратов калия и кальция установлено, что они способствуют примерно одинаковому приросту числа клеток и биомассы. Битритные формы азота в условиях проведенных опытов оказались токсичными для обоих видов.

Особое внимание, уделено изучению скорости роста, развития и биохимического состава водорослей при использовании в качестве источника азота мочевины.

Интенсивность роста на мочевине у большинства хлорококковых водорослей выше, чем на нитратном и аммонийных фонах питания (Пи-невич и др., ISSI; Тагеева и др., 1967 и др.).

Цикл развития хлорококковых водорослей также зависит от формы азотного питания. Длительность цикла развития Chi.pyrenoidosa (Спекторов, Никольская, 1971) на аммонийном и амидном источниках азота составляла, 7-8 часов, а на нитратном-9-10 часов. Эти авторы указывают, что число автоспор, образующихся в материнской клетке, на аглмошшном и амидном фоне всегда было низке, чем на нитратном. При этом размер образующихся автоспор также различался: автоспоры при аммонийной и амидной форме азотного питания были крупнее, чем при нитратной. Однако большинством авторов получены противоположные данные. Длительность цикла развития в вариантах с мочевиной и нитратами была одинаковой, но на среде с мочевиной происходило увеличение числа автоспор, выходящих из одной материнской клетки (Тагеева и др., I9S7; Kitoh, Hori, 1968; Галкина, 1969;Максимов, 1969).

Многими исследованиями доказано, что и биохимический состав меток зависит от использованного источника азота. Шампиньи (1958) показала, что введение в питательную среду мочевины ведет к накоплению в клетке водорослей лизина и аргинина и к значительному общему увеличению органического азота,. Азот лизина, аргинина и лейцина составляет при этом до QQ% от общего азота. При ассишляции нитратов, в отличие от этого, накапливается глютаминовая кислота.

Увеличение содержания органического азота в клетке при выращивании хлорококковых водорослей на мочевине отмечают многие авторы (Баславская, Феофарова, 1959; Ласка, 1965; Тагеева. и др., 1967 и др.). В то же время имеются сведения об одинаковом накоплении азота клетками хлореллы в условиях непрерывного культивирования на средах с мочевиной и нитратами (Гительзон и др., 1954).

Содержание общего и белкового азота у A.braunii, выращиваемого на средах с мочевиной, на, 1,5-3$ выше, чем на среде с нитратным азотом (Паламарь-Мордвинцева, Костлан, 1965; Максимов, 1969). Содержание белков у A.braunii на нитратном фоне достигает 32,5/о, а, на карбамидном 49,3$. Форма источника азота существенно не влияет на уровень водорастворимых углеводов и направленность его изменения yA.braunii. Содержание общего фосфора всегда несколько повышено в клетках A.braunii на средах с мочевиной по сравнению с культурой на нитратном азоте (Максимов, 1969).

Следует отметить, что водоросли p. Ankistrode sinus, как и другие хлорококковые, способны утилизировать продукты жизнедеятельности человека и животных (Рерберг, Воробьева., 1964; Берды-кулОв и др., 1977; Шоякубов и др., 1930).

В литературе по физиологии и биохимии водорослей имеется небольшое количество работ, характеризующих влияние фосфора на продуктивность и обмен веществ одноклеточных водорослей (Згуровская, 1970; Мелешко и др., 1977). Влияние различных концентраций фосфора в среде на рост, интенсивность фотосинтеза, биохимический состав A.braunii изучено Максимовым (1968). Показано, что оптимальной концентрацией фосфора для роста и развития A.braunii в экстенсивных условиях является 47,8 мг/л. Исключение' из питательной среды фосфора не вызывает немедленного прекращения биосинтеза клеточного материала, но приводит к его постепенному замедлению. При удалении фосфора из среды внутриклеточных запасов его хватает для увеличения биомассы в 5,5 раз. При этом дефицит фосфора начинает сказываться, когда его концентрация в клетках падает до 0,2-0,3%. Аналогичные данные получены при изучении проявлении фосфорного голодания у водорослей p. Ankistrodesmus Пирсоном с сотрудниками (1952).

При выращивании A.braunii на среде, лишенной фосфора., уменьшается содержание как общего, так и белкового, азота, а также количество водорастворимых Сахаров (Максимов, 1968, 1969). Имеются данные о значительном накоплении астаксантина водорослями p. Ankistrodesmus в условиях длительного фосфорного голодания (Dersch, I960).

Оптимальной концентрацией калия для выращивания A.braunii на карбамидном источнике азота является 0,6-6,0 мг/л, а на нитратном - 499 мг/л. Дефицит калия существенно не влияет на уровень водорастворимых углеводов, при этом несколько ослабляется синтез белка и незначительно повышается содержание фосфора в биомассе (Максимов, 1969).

При изучении влияния магния на рост и развитие A.acicularis установлено, что размножение клеток требует больше магния, чем это необходимо дла нарастания биомассы (Величко, 1965). Наблюдалась прямая зависимость между продуктивностью культуры и содержанием магния в среде в диапазоне его концентраций от 48 до 243 мг/л.

В опытах Паламарь-Мордвинцевой Г.М. (1968) показано, что количество железа, необходимое для роста и развития A.braunii и повышающее его продуктивность, колеблется в пределах 0,5-3,0 мг/л FeSC>4-7H20. Концентрация 3 мг/л FeSO^• 7^0 является критической, начиная с которой повышение концентрации железа в растворе вызывает морфологические изменения клеток, свидетельствующие об избытке железа. Концентрация сульфата железа от 80 до 280 мг/л оказывает сильное ядовитое воздействие на A.braunii, которое проявляется в развитии опухолей, побледнении и отмирании клеток.

При купоросованш водоемов с целью рек дезинфекции, установлено, что водоросли p. Scenedesmus и p. Ankistrodesmus устойчивы против Си SO^ в концентрации 0,3-0,8 мг/л. Концентрация меда при этом несколько выше, чем концентрация меди, угнетающая рост других водорослей (Герасимов, 1937). При дальнейшем увеличении концентрации меди в растворе (10~4 м Си (Ш^)2) у A.braunii наблюдалось образование гигантских клеток с толстой стенкой и множеством ядер. Эти клетки содержали центриоли, которые не обнаружены в нормальных клетках (Kushner et al., 1981).

Образование гигантских многоядерных клеток у дводорослей p. Ankistrodesmus также может вызывать повышенная концентрация рубидия (Pirson, Lorenzen, 1966).

Анализ приведенных фактов показывает, что в известной нагл литературе практически отсутствуют данные по составу питательных сред для нормального роста и развития водорослей p. Closteriopsis. Вопросы минерального питания водорослей p. Ankistrodesmus изучены лучше, однако опыты проводились с экстенсивно растущими культурами. Тем не менее анализ этих данных позволил нам выбрать питательную среду для первых опытов по лабораторному выращиванию изучаемой формы водорослей. рН среды. Данные о влиянии кислотности среды на рост и развитие водорослей p. Closteriopsis в проанализированной нами литературе не обнаружены.

Работами Кесслера (Kessler, 1962, 1967) показано, что среди водорослей в пределах одних и тех же таксонов имеются формы с резко различным отношением к рН питательного раствора. Данным автором исследована нижняя граница рН для роста 22 штаммов, относящихся к 6 видам p. Ankistrodesmus, и показано, что она колеблется от 3,5 до 6,0 (Kessler, 1967).

Согласно исследованиям Алеева Б.С. (1932), работавшего с A.falcatus оптимальными значениями рН для роста этого вида являются значения от 6,9 до 7,3, при этом рН=5,0 угнетает рост водоросли. Аналогичные данные получены при изучении A.hraunii (Паламарь-Мордвинцева, Ко стлан, 1965). В данной ра.боте указывается, что при выращивании A.braunii на, среде с рН=4,5 наблюдалось обесцвечивание и увеличение зернистости содержимого клеток.

Литературные данные о морфогенетическом действии кислотности среды ра.зличны. Показано, что некоторые колониальные виды p.p. Ankistrodesmus и Scenedesmus на средах с высоким значением рН образуют большое количество одиночных клеток (Schlichting, Bruton, 1970; Trainor, 1970). Б то же время имеются сведения о сильной агрегации клеток Chlorella vulgaris под влиянием щелочной реакции среды (Malis-Arad et al., 1980). По мнению авторов, агрегация клеток при высоких значениях рН связана с тем, что автоспоры не могут отделиться от материнской клеточной стенки, что и приводит к образованию конгломератов, представляющих собой несколько поколений клеток.

Варна с соавторами (1974), изучавшие влияние рН на рост Sc.acutiformis в интенсивных условиях культивирования, указывают на отсутствие морфогенетического действия кислотности среды.

Имеются данные о влиянии рН среды на биохимический состав водорослей p. Ankistrodesmus. Показано, что низкие значения рН вызывают преобразования виолаксантина в зеаксантин у гетеротрофно растущей культуры Ankistrodesmus (Starosta, 1970; цит. по Soeder, Stengel, 1974). Уровень полифосфатов и других фосфоорганических соединений у водорослей p. Ankistrodesmus также зависит от кислотности среды (Ullrich., 1972).

В литературе имеются данные о существенном влиянии величины рН среды на. устойчивость солей в растворе. В щелочной среде обнаруживается недостаток железа, что связано с химическим осаждением его из раствора и адсорбцией на аморфных осадках фосфатов кальция и магния (Hopkins, Warn - 1925; Минеева, 1963). При высоком значении рН в неусвояемую форму для водорослей переходит марганец, молибден, бор (iTakamura, 1964). Даже в слабощелочной среде имеет место образованием трехзамещенных фосфатов алюминия, марганца, железа, магния, меда и цинка (Лебедева и др., 1965; Упитис, Пакалне, 1965; Мелешко, 1966; Лебедева и др., 1968).

Величина рН среды имеет важное значение для углеродного fcolfoldy, 1962; Мелешко и др., 1975; Белянин, Болсуновский, 1980;

Richmond et al.,I982) и азотного питания водорослей ( Eisele, Ullrich, 1977) и для сохранения веществ в круговороте (Мелешко и др., 1975). Следовательно, стабилизация рН среды в диапазоне оптимальных значений является необходимым условием для получения воспроизводимых характеристик водорослей.

Таким образом, применительно к изучаемой нами форме водорослей мы не обнаружили в литературе данных по составу питательных сред, оптимальной концентрации биогенных элементов в средах и по возможному диапазону рН среды для обеспечения максимальной скорости роста водорослей. Все это исключало и наличие данных по потребности клеток в биогенных элементах, неообходимых при введении новой формы водорослей в фотоавтотрофное звено БОЛЮ человека.

Температура. При исследовании проблем фотоавтотрофного звена БСЕО на основе одноклеточных водорослей было установлено, что в его состав выгоднее включать термофильные штаммы. Это объясняется тем, что при выращивании культур больших'плотностей водоросли облучают светом высоких интенсивностей, но только 20-25$ поглощенной радиации идет на фотосинтез, остальная световая энергия трансформируется в тепловую. Также было показано, что использование термофилов удоб нее, так как они имеют более высокий темп размножения (Владимирова и др., 1962; Владимирова,, Семененко, 1962).

При изучении хлорококковых водорослей было установлено, что термофильные штаммы водорослей с температурным оптимумом порядка 32-34°С в природе распространены довольно широко (Трухин, 1964, 1966). Однако высокотермофильные штаммы, имеющие оптимум 36° и выше, были встречены только в условиях жаркого климата.

По данным Трухина Н.В. (1966), распределение тремофильных штаммов среди некоторых родов хлорококковых водорослей следующее: p. Ankistrodesmus - 32$, p. Chlorella - 40$, p. Scenedesmus - 69^. При изучении 22 штаммов, пршадлежащих к 6 видам p. Ankistrodesmus было установлено, что ни один из них неспособен к росту при Т=3£Рс (Kessler, 1977). Температура 38° вызывала прекращение роста у водорослей p.p. Ankistrodesmus и Monoraphidium при культивировании в лабораторных условиях (Payer et al., 1980). В опытах Смирнова Н.Н. (1953) показано, что A.acicularis нормально развивался после двухчасовой экспозиции при Т=40°С, но не выдерживая дальнейшего повышения температуры. Согласно данным Эргашева А.Э. (1977), клетки A.minutissimus прекращали рост и размножение при 30-35°С. В лабораторных условиях эти водоросли обычно выращиваются при температуре 25-28°С (Кондратьева, Громов, 1972; Бердыкулов и др., 1980).

Предварительные исследования показали, что и исследуемая нами форма водорослей не является высокотермофильной. При экстенсивном культивировании установлено, что температурный оптимум этого штамма лежит в пределах 35° (Сычев, 1980).

Влияние температуры на фотосинтез и рост водорослей в значительной степени модифицируется воздействием других факторов внешней среды. В частности имеется обширная литература, посвященная изучению взаимного влияния температуры и света на уровень фотосинтетической активности водорослей (Sorokin, Krauss, 1962; Федоров и др., 1968; Smayda, 1969; Guerri et al., 1981 и др.). Способность видоизменять реакцию на воздействие температуры в зависимости от уровня освещенности характерна И ДЛЯ водорослей p. Ankistrodesmus. По наблюдениям Бердыкулова Х.А. с соавторами (1977), оптимальной температурой для роста и развития A.angustus при интенсивности освещения в 10 клк является Т=20°С, при интенсивности в 15 клк -- 25°С, при интенсивности 18-20 клк - 30°С. Аналогичные данные получены при исследовании процессов роста четырех штаммов водорослей p. Anlistrodesmus (Bednarz, Novak, 1971).

Известно, что на фоне экстремальных температур интенсивный свет (оптимальный для роста культуры при оптимальной температуре) выступает как фактор, приводящий к фотоингибированию развития и роста числа клеток в культуре (Семененко и др., 1967). Таким образом, одновременное повышение интенсивности света и температуры не всегда способствует увеличению продуктивности культуры. 0 проявлении этой закономерности и у водорослей p. Ankistrodesmus говорят данные Бердыкулова Х.А. с соавторами (1980). При исследовании условий культивирования A.angustus и A.braunii установлено, что водоросли нормально растут и развиваются при Т=25°С и интенсивности освещения 10-15 клк. Одновременное повышение температуры до 30-35°С и освещенности до 30-40 клк вызывало пожелтение и прекращение роста культур этих микроводорослей.

Как показано рядом авторов (Sorokin, Myers, 1957; Trainor, Burg, 1965; Семененко и др., 1967 и др.), оптимальными и запретными для процессов роста и деления клеток водорослей являются более низкие температуры, чем для фотосинтеза. Так, в работе Семененко В.Е. с соавторами (1967) приведены характеристики верхней границы температуры для функций роста и фотосинтеза сы^р.к. Температура, способствующая максимальному накоплению биомассы, у этого штамма о «Щ. оказалась на 4 ниже, чем температура, обеспечивающая максийьный уровень фотосинтеза.

При изучении температурных и световых кривых роста культуры Chl.sp.K с целью определения взаимодействия и оптимальных сочетании этих факторов применительно к условиям интенсивной культуры было обнаружено, что при крайних высоких экстремальных температурах в сочетании с определенной освещенностью в культуре появляются гигантские клетки, в 5-6 раз превышающие их размеры в норме (Владимирова и др., 1966). Установлено, что этот эффект определяется разобщением согласованного взаимодействия функций клетки: блокированием процессов развития и деления при сохранении в течение определенного времени функциональной активности фотосинтетического аппарата и роста клетки (Оемененко и др., 1967). Указанный эффект разобщения клеточных функций развития и фотосинтеза под воздействием высоких температур наблюдался многими авторами (Спек-торова, 1966; Soeder, Stengel, 1974; Казаков и др., 1974).

Суммируя приведенные литературные данные, следует отметить, что изучение влияния температуры на рост, развитие и фотосинтез хлорококковых водорослей являлось темой многих исследований. Однако, данных о воздействии температурного фактора на процессы жизнедеятельности водорослей p. Closteriopsis нами в литературе не обнаружено .

Свет. Из большого разнообразия меняющихся факторов внешней среды свет, его интенсивность и спектральный состав являются наиболее действенными факторами, определяющими интенсивность процессов фотосинтеза и роста растений.

Каких-либо сведений о влиянии освещенности на продуктивность водорослей p. Closteriopsis в литературе нами не обнаружено.

Порог светового насыщения для клеток хлореллы оказался очень низким: для мезофильных форм от 5 до 10 клк, для термофильных от 15 до 20 клк (Myers, 1946, Sorokin, Myers, 1953; Sorokin, Krauss, 1958, 1961; Степанова, 1963; Минеева, 1963). При повышении интенсивности света до 50 клк наблюдается обесцвечивание клеток, а при освещенности 70 клк происходит быстрое разрушение пигментов (Sironwal, Kandler, 1958; Richardson et al., 1983). Следует отметить, что уменьшение количества фотосинтетических пигментов является способом адаптации водорослей p. Chlorella к высоким интенсивно стям света. Другим типом адаптации к свету является Cyclotella - тип. У водорослей этого типа адаптивная реакция выражается в изменении активности или концентрации фотосинтетических ферментов (Jorgensen , 1969). Водоросли p. Ankistrodesimis относятся к Chlorella-типу. Так, у A.falcatus var.acicularis при освещенности 3 клк содержание хлорофилла "а" составляет 1,42 мг на 10 клеток, а при освещенности 30 клк - 0,61 мг.

Низкая величина светового насыщения для клеток хлореллы оказалась серьезным препятствием для применения плотных суспензий водорослей в практике и использования мощных источников света, в том числе и солнечного. Поэтому существенным шагом при решении указанного вопроса являлось открытие возможности использования эффекта прерывистого света при культивировании водорослей (Кок, 1956). Изучая выход фотосинтеза на вспышку света разной длительности, исследователи показали, что чем выше интенсивность вспышки, тем длиннее могут быть темновые периоды. Отсюда был сделан вывод о том, что чем выше интенсивность освещения, тем плотнее может быть суспензия водорослей, если ее турбулентное перемешивание создает условия, эквивалентные прерывистому освещению. Действительно, на практике оказалось, что при интенсивном перемешивании плотных суспензий порог светового насыщения может быть значительно повышен. Величина светового насыщения для таких культур оказалась различной и колебалась в пределах от 40 до 150 клк; она была тесно связана с такими условиями культивирования как скорость перемешивания, плотность суспензии и толщина высвечиваемого слоя (оптическая плотность),

Gaucher et al., IS60; Терсков и др., I9S4; I9S5; Мележо, 1966; Семененко и др., 1966а; Беляшш и др., 1967, 1972).

Наиболее существенную роль для величины светового насыщения имеет плотность суспензии. Увеличение плотности приводит к повышению величины светового насыщения (Терсков и др., 1964; Мелешко, 1966). При исследовании физиологических особенностей A.angustus было показано, что световое насыщение зависит от плотности следующим образом: при плотности 15 млн клеток/мл - 8-10 клк, при 30 млн/мл - 15 клк, при 45-60 млн/мл - 18-20 клк (Бердыкулов и др., 1977; Цузашаров и др., 1977).

Установлено, что насыщающая интенсивность складывается как средняя величина из большого диапазона разных уровней освещенности в разных слоях суспензии от оптимальной до величин, значительно превышающих истинное насыщение для данного вида, и штамма (Мележо, 1966; Филипповскиы и др., 1967). Общая скорость фотосинтеза в таких культурах слагается из отдельных скоростей для разных клеток и является интегральной величиной. Таким образом, применение интенсивного перемешивания водорослей позволило значительно увеличить плотность суспензии с одновременным повышением освещенности далеко за пределы интенсивностей, призванных в физиологии насыщающими в суспензиях малой плотности.

Характер кривых зависимости фотосинтеза и роста от освещенности в значительной степени определяется помимо указанных факторов также температурой (Sorokin, Krauss, 1962; Семененко и др., 1967; Smayda, 1969), осмотическим давлением раствора. (Мс Comdie, I960; Smayda, 1969), концентрацией питательных элементов в среде (Maddux, Jones, 1964) и стадией жизненного цикла водорослей (letzher, Lorenzen, I960; Sorokin, 1960).

Анализ приведенных фактов. показал, что хотя влияние освещенности на рост и развитие водорослей изучено хорошо, данных по зависимости интенсивности фотосинтеза изучаемой формы водорослей от воздействия этого фактора среды нами в литературе не обнаружено.

Углеродное питание. Особое место в ряду факторов внешен среды, определяющих скорость роста водорослей, занимает обеспеченность культуры углекислотой, которая является основным источником углерода при фотосинтезе. Данных по зависимости скорости роста водорослей p.p. Closteriopsis и Ankistrodesmus от концентрации углекислоты нами в литературе не обнаружено.

Величина насыщающей концентрации углекислоты в воздухе при культивировании хлореллы, колеблется по определению различных исследователей от 0,02% (Emerson, Green, 1938) до 5-7% (Мелешко, Красотченко, 1965).

Данные по величине ингибирующей концентрации COg также различны: от 0,7% (Emerson, Green, 1938) до 20% (Мелешко, Красотченко, 1965).

Следует отметить, что не все указанные величины COg характеризуют физиологический оптимум клеток хлореллы по углекислоте. В одних случаях (Emerson, Green, 1938) данные получены при исследованиях суспензии хлореллы малой плотности, где градиенты среды отсутствовали или были очень малы. Они действительно характеризуют физиологические особенности клеток хлореллы по отношению к концентрации углекислоты. В других случаях (Мелешко, Красотченко, 1965; Семененко и др., 19666), исследования проводились с суспензиями большой плотности, и полученные данные характеризуют не столько физиологические особенности клеток хлореллы, сколько условия культивирования. В результате исследований плотных культур водорослей с использованием мощных световых потоков было установлено, что чем выше плотность суспензии и ее продуктивность, тем больше величина насыщающей концентрации углекислоты в воздухе (Мелешко, Красотченко, 1965; Мелешко, 1966). При этих условиях уменьшается удельный объем среды, приходящийся на каждую клетку. Это в свою очередь, приводит к сокращению наличного запаса растворенной углекислоты в зоне каждой клетки, что неизбежно сопряжено с уменьшением общей поверхности этой индивидуальной "сферы питания", через которую осуществляется приток новых молекул углекислоты.

Помимо плотности суспензии, величина насыщающей концентрации углекислоты определяется рядом внутренних и внешних факторов, а также их взаимодействием. К внутренним факторам относятся таксономическая принадлежность водорослей (Brown, Tregunna, 1967) и стадия развития клеток CDamija, 1966; Pirson, Lorenzen, 1966; Мещерякова, 1975).

Внешние факторы, определяющие скорость потребления углекислоты и ее насыщающую концентрацию, включают интенсивность освещения (Мелешко, 1966; Семененко и др., 19666; Мещерякова, 1975), температуру (Nakamura, Miyachi, 1980), рН суспензии (Brown, Tregunna, 1967; Kaven, 1970), концентрацию кислорода (Turner, Brittain, 1962).

Установлено также, что оптимальный реши углеродного питания каждой клетки может быть обеспечен не только за счет повышения парциального давления углекислоты в воздухе, но и путем увеличения удельной площади контакта суспензии с воздушной смесью (Мелешко, 1966; Семененко и др., 19666). Величина насыщающей концентрации СС^ зависит от способа выращивания водорослей и конструкции реактора. Так, скорость роста по числу клеток у A.pseudomirabilis увеличивалась в 3-4 раза при выращивании в колбах с барботажем воздуха (0,03^ СОо) против скорости роста без продувки (Подсосонный, Малышева, 1931).

Согласно исследованиям последних лет, концентрация СО2 определяет не только общую скорость ассимиляции углерода, но и играет существенную роль в формировании фотосинтетического аппарата. Комплексная оценка фотосинтетического аппарата клеток хлореллы (по содержанию хлорофилла, активности ферментных систем, скорости фотосинтеза) , адаптированных к различным концентрациям GOg - 0,02% и 2%, показала, что повышенные концентрации углекислоты способствуют формированию фотосинтезирующего аппарата, обеспечивающего более высокую энергетическую эффективность фотосинтеза (Мещерякова, 1975).

Имеются сведения о том, что у клеток Chl.emersonii адаптированных к 0,03% СО^, фиксация углекислоты происходит в цикле С^ -дикарбоновых кислот (цикл Хэтча - Слэка), а у клеток, адаптированных к Ъ% COg - в цшше Cg (Beardall, Raven, 1981). У клеток, адап-тировашых к 0,03% COg, увеличен мембранный потенциал и внутриклеточная концентрация углерода неорганических соединений. При исследовании A.braunii и других хлорококковых водорослей шжазано, что клетки, адаптированные к низким концентрациям COg, активно поглощают HGOg, а клетки, адаптированные к высоким концентрациям COg, поглощают только углекислоту (Findenegg, 198O).

Здесь следует отметить, что растворенная в питательной среде углекислота не является единственным источником углерода при авто-трофном питании водорослей. Как и другие водные растения, водоросли способны усваивать связанную углекислоту в виде бикарбонатных и карбонатных ионов. Способность к поглощению ионов угольной кислоты значительно различается у разных групп водорослей (Борш, 1970; Raven, 1970). Использование различных источников углеродного питания позволяет регулировать динамику водорослевого сообщества (Белянин, Болсуновский, 1980; Richmond et al., 1982).

Замена углекислоты бикарбонатами и карбонатами дает возможность выращивать водоросли без дополнительного барботирования, а это, в свою очередь, с шикает материальные за,траты при массовом культивировании водорослей. Однако, если молекулярная COg легко 2диффундирует через клеточную стенку, транспорт НСО3 и С0д связан с дополнительным привлечением энергии (Рабинович, 1953; Raven, 1970). Опытами Русиной О.Н. (1961) установлено, что КНСОд и NaHGO^ в концентрации 0,75 г/л могут частично заменить углекислоту для роста A.falcatus, но при этом наблюдается снижение продуктивности на 30%. Болгарские ученые установили, что при интенсивном режиме культивирования Scenedesmus acutus возможна замена С0^ на ион НСС§. При этом прирост биомассы уменьшался приблизительно на Q%, содержание белков и углеводов было неизменно, наблюдалась тенденция к увеличению длительности жизненного цикла (Георгиев, Аврамова, 1977;;Георгиев и др., 1977).

Таким образом, величины насыщающей и ингибирующей фотосинтез водорослей концентрации углекислоты зависят от ряда внутренних и внешних факторов. Оценку этих величин необходимо проводить применительно к конкретным условиям культивирования водорослей в биокультиваторах определенной конструкции.

Кислород. В природных экосистемах среди факторов внешней среды наибольшее регуляторное действие на фотосинтетический метаболизм углерода оказывают, очевидно, освещение и концентрация СОр, которые часто находятся при лимитирующих значениях. Особое место занимает кислород, концентрация которого не подвергается большим колебаниям, однако его действие на субстратном и энергетическом уровнях существенно модифицируется сдвигами в значениях двух вышеназванных факторов. 1

Влияние парциального давления кислорода на фотосинтез имеет большое значение при выращивании растений в замкнутых объемах, где возможны значительные колебания концентрации кислорода. Таким образом, и при культивировании водорослей в БСНО человека приходится учитывать этот фактор.

Впервые ингибирунцее влияние повышенного содержания кислорода в воздухе на фотосинтез хлореллы было отмечено Варбургом (1920).

Он наблюдал снижение фотосинтеза хлореллы при повышении парциального давления кислорода с 15 до 760 мм рт.ст. Эффект Варбурга затем неоднократно подтверждался в опытах с водорослями различных таксономических групп (ГУсев, 1962; Pope, 1975; Ogawa et al., 1980; Merrett, Armitage, 1982 и др.). В частности, для ряда штаммов хлореллы было показано, что интенсивность фотосинтеза находится в прямой зависимости от концентрации кислорода в газовой фазе (Turnen, Brittain, 1962; Мелешко и др., 1973; Shelp, Canvin, 1980). При этом, повышение концентрации кислорода в воздухе с 21 до 40% приводило к снижению фотосинтеза в среднем на 30% при интенсивном культивировании (Мелешко и др., 1973). Дальнейшее увеличение концентрации кислорода до 65% вызывало обесцвечивание культуры и ее гибель. Снижение содержания кислорода в атмосфере реактора с 21 до 5% способствовало усилению фотосинтеза на 20-25%. Согласно исследованиям других ученых, некоторые водоросли сохраняют неизменную продуктивность при увеличении парциального давления кислорода как в интервале от 3-5 до 21% (BearcLall, Morris, 1975; Merrett, Armitage, 1932 и др.), так и при более высоких величинах (Fedina, 1980; Watts Pirt, Pirt, 1980 и др.). Наконец, установлено, что процесс фотосинтеза штамма Chlorella sorokiniana ОКБ устойчив к концентрации кислорода в атмосфере около 100% (wagner, Welch, 1969; Pulich, Ward, 1973). По-видимому, реакция водорослей на различные концентрации кислорода в аэрируемой смеси существенным образом зависит от генотипических свойств штамма. Следует отметить, что повышенная устойчивость к воздействию этого фактора характерна не только для некоторых низших растений, но и для высших растений с фиксацией С02- в цикле С4-дикарбоновых кислот (Parkinson et al., 1973; Quebedeaux Hardy, 1973).

Ингибирующее влияние повышенного содержания кислорода в воздухе на фотосинтетическую продуктивность проявляется в различной о степени в зависимости от воздействия некоторых факторов внешней среды. Так, насыщающая фотосинтез концентрация СОр способствует снижению эффекта Варбурга в пределах концентрации от 5 до 21% (Бойченко, Ефимцев, 1879; Dohler, 1981). Наблюдаемое в этих условиях влияние 0^ на фотосинтез, по-видимому, может отражать его действие непосредственно на механизм этого процесса, ибо скорость фотодыхания значительно снижается при насыщающих концентрациях С02 (Wilson, Calvin, 1955; Вийль и др., 1972).

Имеются литературные данные о снижении эффекта Варбурга при высоких интенсивностях освещения (Кутюрин и др., 1964; Карабаев и др., 1977; Максимова и др., 1978). Значение света для фотосинтеза сводится главным образом к его энергетической роли; поэтому можно предположить, что действие кислорода в определенной степени зависит от энергообеспеченности клетки. Подтверждением этого, по-видимому , является факт снижения ингибирующего влияния под действием на клетки хлореллы экзогенной АТФ (Карабаев и др., 1977).

Как показали исследования болгарских ученых, эффект Варбурга может модифицироваться при использовании различных источников азота (Fedina, 1980; Вычкова-Радева, Ваклинова, 1981). Так, при культивировании Scenedesmus obli-quus на среде с нитратом калия его фотосинтез оказался гораздо устойчивее к воздействию 40% кислорода в газовой фазе, чем при выращивании на аммонийном источнике.

Установлено, что с увеличением парциального давления кислорода сильнее подавляется выделение 0^, чем поглощении COg (Карабаев и др., 1977). Таким образом, ассимилящгонный коэффициент культуры, выращиваемой при повышенных концентрациях кислорода, увеличивается.

В литературе имеются данные и о влиянии повышенного содергания кислорода в газовой смеси на восстановленность органического вещества клеток (Spoehr, Milner, 1949), а также на содержание биогенных элементов в клетках водорослей и концентрацию растворимых органических соединений (Мелешко и др., 1973). Это свидетельствует о том, что данный фактор оказывает влияние не только на уровень фотосинтетической активности клеток, но и на их метаболизм.

Таким образом, проведенный анализ литературы, посвященной изучению влияния различных концентраций кислорода на фотосинтетическую активность водорослей, показал, что несмотря на достаточную изученность вопроса в целом, данные по зависимости интенсивности фотосинтеза водорослей сем. Ankistrodesmaceae от концентрации Og в атмосфере отсутствуют.

Продуктивность. По имеющимся литературным данным, водоросли p.Closteriopsis не являлись объектами массового культивирования. Водоросли других родов сем.Ankistrodesmaceae выращивались как в лабораторных условиях, так и под открытым небом.

При культивировании водорослей p.Ankistrodesmus в лабораторных условиях (температура 25-28°С, освещенность 5-10 клк, барботаж воздухом с добавлением 0,3-5,0% СОр) показано, что продуктивность различных штаммов составляла от 0,1 до 1,0 г/л«сутки (Паламарь--Ыордвинцева., 1969; Bednarz, Novak, 1971; Кондратьева, Громов, 1972; Zahid et al., 1981} Genthrer, 1983).

При выращивании под открытым небом урожай водорослей p.Ankistrodesmus за сутки колебался от 8-10 г/м^ (Бердыкулов и др., 1980) до 54 т/ь? (Grobellaar, 1982) в зависимости от используемого штамма, установки и климатических условий.

Продуктивность Eirchneriella obesa 447, другого представителя сем.Ankistrodesmaceae, при культивировании под открытым небом в условиях Ленинградской области составила 10,7 г/м^.сутки, 2 в то время как в лабораторных условиях она была равна 36 г/м «сутки (Верзилин и др., 1979).

Таким образом, продуктивность водорослей во всех случаях экстенсивного культивирования была низкой и зависела от условий выращивания. Данных по интенсивному культивированию водорослей этого семейства нами в литературе не обнаружено.

Биохимиче ский с о с тав. Литературных данных по биохимическому составу водорослей из рода Closteriopsis нами не обнаружено. Состав биомассы водорослей p. Ankistrodesmus изучен достаточно хорошо применительно к условиям накопительных культур, выращиваемых в экстенсивных условиях.

Следует отметить, что биохимия водорослей изучается по многим направлениям. Основными являются исследование кормовой и пищевой ценности биомассы водорослей, сравнительное изучение биохимических свойств организмов различных таксономических групп и изучение фундаментальных вопросов биологического сздлорецулирования и биосинтеза фотосинтезирующих организмов. Водоросли p. Ankistrodesmus использовались в научно-исследовательских работах при решении вопросов по всем этим направлениям.

Одной из важных характеристик штамма является его кормовая ценность, определяющаяся количественным и качественным составом белка. Содержание бежа в биомассе водорослей p. Ankistrodesmus определяли только при выращивании культур в экстенсивных условиях. Так, уA.falcatus содержание белка составляло 64-69$$ от сухого веса (Русина, 1961; Пахомова, 1963), у A.angustusиA.braunii -51,0-54,9$$ (Бердыкулов и др., 1980), yA.septosus - 30,9$, у A.braunii- 30,5$, yA.sp. - 33,2$ (Кондратьева, Громов, 1972). Таким образом, содержание белка в биомассе этих водорослей колеблется от 30 до 69$$ от сухого веса в экстенсивных условиях выращивания.

Аминокислотный состав суммарного белка был исследован у A.falcatus. Согласно полученным данным, содержание в белке лизина составляло 5,28%, гиотидина - 3,38$ аргинина - 14,77$, аспараги-новой кислоты - 4,80$, серина - 4,16$, глицина - 7,34$, глютамино-вой кислоты - 7,04$, треонина - 5,27$, аланина - 10,77$, тирозина

- 1,21$, метионина - 0,98$, валина. - 4,10$, фенилаланина - 1,68$, изолейцина - 7,17$, цистина - 1,55$, а также в незначительных количествах обнаружены триптофан, пролин, цитруллин, — аминомасля-ная кислота (Пахомова, 1963).

Сравнительно мало изучены количественный и качественный состав углеводов у водорослей p. Ankistrodesmus. Согласно исследованиям Кондратьевой Л.Д. и З^эомова Б.В. (1972), общее содержание углеводов у A.septosus - 9,4$, у A.braunii - 12,6$, у A.sp.

- 12,4$ от сухого веса клетки. Было проведено подробное исследование углеводного состава A.braunii (Шнюкова, 1980). Общее содержание углеводов у этого вида 8,6-10,0$$. При изучении качественного состава углеводов A.braunii идентифицированы следующие фракции от общей их суммы: спирторастворимые - 24,5-40,2$, водорастворимые -2,5-10,5$$, запасные - 2,3-14,8$$, гемицеллюлоза и пектиновые -22,6-41,4$$, клетчатка - 10,1-27,3$$ (Шнюкова, 1980). Колебания в содержании углеводов отдельных фракций автор объясняет зависимостью от сезона культивирования водорослей.

Определение содержания липидов у водорослей p. Ankistrodesmus проводилось многими исследователями. Паламарь-Мордвинцева Г.М. (1969), работавшая с культурой A.braunii, указывает, что содержание липидов у этого вида колеблется от 9 до 13$ от сухого веса. При анализе биохимического состава трех видов p. Ankistrodesmus установлено, что липиды составляют от 25,9 до 36,4$ от сухого веса (Кондратьева, Громов, 1972).

В опытах Бердыкулова Х.А. с соавторами (1980) показано, что содержание ЛИПИДОВ yA.angustus и A.braunii равно 26,0-28,0$ при выращивании в лабораторных условиях и 15,7-18,5$ при выращивании в открытых лотковых установках. Снижение содержания липидов в биомассе А.angustus и A.braunii, выращенных в открытых установках, авторы объясняют увеличением интенсивности освещения (до 50-60 клк). По мнению Рахимова А. и Исмаилходжаева Б. (1977), количество липидов в клетках A.angustus может колебаться от 17,6 до 31,5% в зависимости от условии культивирования. Биохимический состав клеток водорослей изменяется и в зависимости от возраста культуры. Отмечено, что содержание липидов у A.braunii составляло 18,6% у 4-не-дельной культуры и 33,7% у 7-недельной культуры (Williams, Г-fcMillan, 1961). Количество ненасыщенных липидов у данного штамма A.braunii оказалось равным 17,1% от суммы липидов, насыщенных - 61,5%, гли-церола - 6,8%. Авторы приводят следующую характеристику жирных кислот: линолевая - 13%, олеиновая - 54%, пальмитиновая - 33%, следы каприновой, лауриновой, пальмитолеиновой и пр.

Содержание липидов, стеролов, свободных жирных кислот зависит также от условий питания культуры. Так, количество липидов у A.braunii при автотрофных условиях составляет 27,5% от сухого вещества, при миксотрофных - 13,9%, при гетеротрофных - 17,7% (Wright et al., 1980). Показано, что коэффициент насыщенности при этом колеблется от 0,37 при гетеротрофных условиях до 0,45-0,53 при автотрофном и миксотройном культивировании.

Особенности жирнокислотного состава липидов различных классов у A.braunii были изучены Парниковым В.Н. (1979). Установлено, что коэффициент насыщенности эфиров стеринов - 0,51, триглицеридов -0,85, свободных жирных кислот - 0,71.

Биохимия водорослей изучается не только с целью установления их питательной ценности, но и с целью дополнения характеристик отдельных таксонов. В настоящее время систематика хлорококковых водорослей крайне несовершенна. Одна, из причин такого положения состоит в том, что до сих пор, особенно для родов и видов, основным и часто единственным методом различения таксонов является морфологический метод (Голлербах и др., 1961). Большое значение для систематики имеют сравнительные исследования культуральных свойств различных водорослей, изучение их биохимии.

Одной из биохимических характеристик обособленности таксонов является содержание у них определенных количеств нуклеиновых кислот, а также отношение суммы пуриновых оснований к сумме пиримиди-новых.

Как показано рядом автором (Пахомова, 1963; Пиневич, Никифорова, 1963; Hellmann, Kessler, 1974), суша, гуанина и цитозина у водорослей p. Ankistrodesmus составляет 58-70% от всех нуклеоти-дов, т.е. они принадлежат к ГЦ-типу.

С целью выработки физиологических и биохимического критериев таксономии p. Ankistrodesmus была проведена серия экспериментов по изучению гидрогеназной активности, способности к синтезу вторичных каротиноидов, способности к разжижению желатины и пр. Показано, что все 22 изученных штамма p. Ankistrodesmus проявляют гидрогеназную активность, способны синтезировать вторичные каро-тиноиды (астаксантин) и разжижать желатину (Kessler, Czygan, 1967), выдерживают понижение рН до 3,5-5,5 (Kessler, 1967; Guminski et al., 1933), неустойчивы к 1-2% концентрации NaCl в питательной среде и неспособны к росту при 33°С (Kessler, 1977), синтезируют эфирные масла в концентрации 0,2-0,7% (Liersch, 1976), неспособны гидролизовать крахмал (Kessler, I960).

С этой же целью было предпринято изучение состава фотосинте-тически активных пигментов у хлорококковых водорослей (Варасова и др., 1965), в том числе и 3 видов p. Ankistrodesmus (A.braunii, A.falcatus, A.nannoselene). Количество пигментов у них оказалось равным 1,6-4,5% от сухого вещества клеток, процентное содержание пигментов от их общего количества варьировало в следующих цредачах: хлорофилла "а" - 50,9-70,7%%, хлорофилла "б" - 12,8-28,5%%, каротина - 2,1-4,0%%, лютеина - 4,9-12,4%%, виолаксантина - 1,6-4,6%%, неоксантина - 1,7-3,5%%.

Анализ приведенных фактов показывает, что в состав водорослей p. Ankistrodesmus, ближайших в систематическом плане к видам p. Closteriopsis, входят все необходимые для питания гетеротрофных организмов вещества.

Таким образом, при знакомстве с основными литературными источниками, посвященными изучению одноклеточных водорослей, мы не обнаружили каких-либо данных, касающихся изучаемой наш формы водорослей - Closteriopsis acicularis var. africana Hind. 0 момента ее выделения из природы и описания Ф.Хиндаком (1970) она, по-видимому, не была предметом изучения. Однако, анализ литературы, посвященной близкому роду, показал перспективность водорослей p. Closteriopsis для использования в биологических системах жизнеобеспечения, а изучение литературы по проблемам заглкнутых экологических систем позволило нам выявить те задачи, которые необходимо решить при введении новой формы водорослей в фотоавтотрофное звено БСКО человека.

- 37

II. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

ВЫВОДЫ

1. Введена в интенсивную культуру и исследована до уровня функционального звена БС20 человека новая перспективная форма одноклеточных водорослей Closteriopsis acicularis var. africana Hind.

2. Изучены условия минерального питания и показано, что клетки клостериопсис способны расти и размножаться с одинаковой скоростью на средах, содержащих азот в разных формах - амидной, аммонийной, нитратной, а также диализат мочи человека в различных разведениях.

3. Разработана и реализована в длительных экспериментах замкнутая технология непрерывного выращивания водорослей. Она основана на использовании созданных сбалансированных корректирующих растворов и найденной корреляции между приростом биомассы водорослей и поглощением биогенных элементов. Она обеспечила поддержание концентрации биогенных элементов в среде и рН в заданных пределах.

4. Исследованы физиолого-экологические оптимумы среды для суспензии высокой плотности и получены данные по функциональной зависимости скорости роста и размножения клостериопсис от температуры, освещенности, концентрации углекислоты и кислорода. Изученная форма термофильна (оптимум лежит в диапазоне 34-36°С) и светолюбива (световое насыщение достигается при освещенности о

225-240 вт/м ФАР), т.е. способна расти и размножаться при высокой напряженности факторов внешней среды.

5. Показано, что скорость фотосинтеза не зависит от концентрации 02 в атмосфере в диапазоне 20-50%. В диапазоне концентраций 5-20% интенсивность фотосинтеза снижается пропорционально содержанию 09 в атмосфере.

6. Установлена зависимость накопления отдельных биогенных элементов и пигментов в клетках от степени интенсификации процесса выращивания. В интенсивных условиях культивирования при высокой продуктивности в составе клеток достоверно снижается содержание азота, калия, магния, пигментов.

7. Реализовано оптимальное сочетание основных факторов среды, позволяющее получить высокую и устойчивую продуктивность водорослей. Она составляла 9,28+1,40 г/л в сутки и оказалась близкой к продуктивности наиболее перспективных штаммов хлореллы применительно к идентичным условиям культивирования.

8. Установлено, что состав биомассы зависит от условий культивирования. При выращивании водорослей в интенсивных условиях при высокой освещенности состав биомассы характеризуется более высоким содержанием (46% на сухой вес) углеводов, представленных преимущественно крахмалом, что. выгодно отличает биомассу клостериопсис от хлореллы.

9. На основе полученных результатов по основным функциональным характеристикам интенсивной культуры клостериопсис (продуктивность, химический и биохимический состав биомассы, элементный состав органического вещества, ассимиляционный коэффициент, качественный состав и количество пигментов, морфология клеток и состояние культуры) и их устойчивости при непрерывном культивировании рассчитан материальный баланс высокопродуктивной популяции клостериопсис, необходимый для определения функций и места водорослей в БСЯО человека.

Р Е К 0 М Е Н Д А Ц И И

I. Изученная форма водорослей - Closteriopsis acicularis var. africana Hind. - может быть рекомендована в качестве компонента фотоавтотрофного звена, основанного на фотосинтезе одноклеточных водорослей, для БСЖО человека. Ее включение в состав звена уже действующих моделей (дополнительно к хлорелле) позволит увеличить долю биомассы в рационе питания за счет высокого содержания углеводов и сбалансировать газообмен между автотрофным и гетеротрофным звеньями в системе за счет более высокой величины ассимиляционного коэффициента клостериопсис.

2. Клостериопсис может быть рекомендована и для производственного культивирования, которое базируется на утилизации энергии Солнца и направлено на решение задачи пополнения пищевых и кормовых ресурсов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Выбор объектов для первых теоретических и экспериментальных исследований биорегенеративных систем не исходил из каких-либо специальных критериев, которые к тому времени не были еще сформулированы. Он был обусловлен накопленной информацией о физиологии и биохимии водорослей рода Хлорелла, являвшихся с давних пор классическим объектом при изучении различных биологических процессов. Используя хлореллу в качестве модельного объекта исследований удалось решить целый ряд физиолого-экологических проблем, связанных с созданием выс ок о продук тивных фотосинтетических систем, функциональных звеньев, замкнутых экологических систем и моделей БСЖО человека.

Одним из существенных достижений этого этапа исследований является определение основных требований системы к фотосинтетическому звену. Показано, что если регенерация атмосферы и воды в системе может быть обеспечена элементарно простыгл звеном, включающим одно видовую высокопродуктивную популяцию организмов, то обеспечение трофических связей оказывается невозможным в этих условиях. Например, в созданных в настоящее время экспериментальных моделях БСЖО на основе хлореллы использование ее биомассы в пищевом рационе составляет всего 8-10$ от общего веса. Это нельзя объяснить лишь какими-то конкретными недостатками этой водоросли, возможности одного вида недостаточны, чтобы обеспечить полностью разнообразные пищевые потребности человека. Отсюда, молено сделать вывод, что автотрофное звено-определяющее звено системы - должно быть многовидовым. При этом, чем разнообразнее по своим характеристикам будут виды в него входящие, тем полнее такое звено сможет обеспечить связи в системе, в том числе и трофические.

Отбор видов водорослей по специальным критериям, как самостоятельный этап исследовании, отсутствовал при создании БСЖО человека, а природный материал водорослей изучен еще недостаточно. Поэтому создание многовидового звена упирается прежде всего в отсутствие достаточного арсенала хорошо изученных,удовлетворяющих требованиям БСЖО человека одноклеточных водорослей. Таким образом, поиск новых форм водорослей является на данном этапе одной из важных задач.

Нами введена в интенсивную культуру и исследована до уровня функционального звена новая зеленая одноклеточная водоросль Closteriopsis- acicularis var.africana Hind. , ceM.Ankistrodesmaceae. Ранее эта форма не являлась предметом исследований, после выделения из природы она хранилась в коллекции Прата, (ЧССР).

Выполненная работа является первым в литературе комплексным исследованием различных сторон метаболизма клостериопсис применительно к разным режимам культивирования. Исследована зависимость скорости роста клостериопсис от основных факторов среды таких, как температура, освещенность, рН среды, концентрация углекислого газа и кислорода в атмосфере и определены оптимальные значения этих факторов для роста и развития. Установлено, что изученная форма водорослей привода для интенсивного культивирования. Она, способна расти и размножаться в суспензиях высокой плотности в условиях прерывистого освещения, которое создается в результате интенсивного перемешивания суспензии. Клетки клостериопсис способны переносить высокую напряженность факторов среды. Устойчивость их к интенсивности этих факторов и диапазону их колебаний примерно такая же, как это было обнаружено ранее для хламидомонады, и несколько ниже, чем установлено для термофильных штаммов хлореллы.

Изучаемая форма водорослей оказалась термофильной с оптимальной температурой роста и развития в диапазоне 34-36°С. Экстремальная температура, при которой прекращается деление клеток, а фотосинтез еще продолжается, оказалась ниже, чем для хлореллы и хламидомонады, и лежит в диапазоне 37-39°С в зависимости от величины освещенности культуры. У нее также, как и других форм зеленых водорослей, температура для. фотосинтеза и размножения разная. При температуре выше оптимальной величины происходит разобщение нормальных клеточных функций роста и размножения, в результате чего наблюдается гипертрофированный рост клеток. Это свидетельствует о том, что при изучении зависимости скорости фотосинтеза от температуры результаты должны обязательно подтверждаться и уточняться еще и по приросту числа клеток.

Клостериопсис оказалась светолюбивой и устойчивой к повышенным интенсивностям света культурой. Это позволило выращивать ее при уровнях освещенности, намного превышающих порог светового насыщения, найденный для водорослей из того же семейства и характеризующий физиологические особенности клеток. Световое насыщение при высокой плотности суспензии достигается при интенсивности 9 освещения 225-240 вт/м" шАР. Повышение этого порога возможно при увеличении весовой плотности суспензии. Однако, в отличие от хлореллы и хламидомонады, у клостериопсис была выявлена зависимость ее характеристик, помимо продуктивности, от величины освещенности культуры. При переходе с низкой освещенности на высокую продуктивность ее увеличивалась в 8,2 раза, что примерно равно величинам, найденным для других водорослей при культивировании в идентичных условиях. Одновременно с этим изменялся метаболизм водорослей. В частности, снижалось поглощение биогенных элементов из среды и их содержание в биомассе, особенно таких как азот, калий, магний. Изменялся и состав биомассы в сторону увеличения содержания углеводов при эквивалентном снижении количества белка. Это в свою очередь приводило и к изменению величины ассимиляционного коэффициента, которая, как известно, связана теснейшим образом с восстановленностью органического вещества. Такое изменение метаболизма водорослей при увеличении освещенности в пределах светового насыщения ранее не были отмечены для других форм водорослей. Переход на интенсивные условия культивирования приводил и к изменению количества хлорофилла в клетках. Содержание его уменьшалось при высокой интенсивности света почти в два раза по сравнению с экстенсивными условиями выращивания. При этом все эти изменения происходили на фоне высокой и устойчивой продуктивности культуры и при нормальных морфофизиологических характеристик клеток водорослей.

Таким образом, при переходе к высоким интенсивноетям света помимо продуктивности, выгодно изменялись и другие характеристики: увеличивалось содержание углеводов при уменьшении содержания белка, что важно для системы с дефицитом углеводов; повышался ассзмиляционный коэффициент, приближаясь к дыхательному коэффициенту человека; уменьшалось содержание хлорофилла в клетках. Низкое содержание хлорофилла, в клетках представляет интерес для БСЖО с двух точек зрения: во-первых, приводит к улучшению оптических свойств плотных популяций водорослей, что позволяет использовать -энергию света с более высоким КПД, а во-вторых, хлорофилл является нежелательным компонентом при использовании биомассы водорослей в пищевых целях. Следует отметить, что при экстенсивном культивировании состав биомассы и содержание хлорофилла в клетках близко к найденным для хлореллы величинам. Следовательно, при промышленном культивировании, где условия близки к экстенсивным, эта форма также может найти применение для получения кормовых высокобелковых веществ.

Продуктивность клостериопсис оказалась практически равной продуктивности наиболее перспективных штаммов хлореллы и хламидомонады. Для наших условий она превышала 9,0 г/л«сутки, и была устойчивой как в'разных опытах, так и режимах культивирования. Нам кажется, что в дальнейшем она может быть повышена путем оптимизации условий среды и, в частности, минерального питания. В этом направлении исследования должны быть продолжены по пути изучения зависимости скорости роста водорослей от концентрации отдельных элементов в среде, что не входило в зада,чу данной работы.

Данные по зависимости интенсивности фотосинтеза клостериопсис от концентрации углекислоты в воздухе не отличались от результатов, полученных для других форм зеленых водорослей. Насыщающая концентрация углекислоты в воздухе зависела от интенсивности фотосинтеза, т.е. от скорости убыли растворенной углекислоты из среды. Чем выше была, интенсивность фотосинтеза, тем выше и величина насыщающей концентрации.

При изучении влияния концентрации кислорода в атмосфере на фотосинтез водорослей были получены оригинальные данные. Скорость роста водорослей не изменялась при концентрации кислорода в воздухе в пределах 19-50$, и только при снижении-ее ниже 19$ наблюдалось постепенное повышение интенсивности фотосинтеза, которое продолжалось линейно со снижением концентрации 02 до 4,5$ (минимальная в нашем опыте). Полученные результаты показали, что эта форма водорослей исключительно устойчива к высоким концентрациям кислорода, что выгодно отличает ее от изученных ранее других зеленых водорослей - хлореллы и хламидомонады, для которых скорость фотосинтеза снижается пропорционально повышению концентрации 02 вплоть до полного прекращения роста при 50-55$ 02 в воздухе.

Одной из основных характеристик является состав биомассы водорослей. Наши исследования показали, что у клостериопсис он зависит от условии культивирования. При экстенсивных условиях -он близок к составу биомассы хлореллы и спирулины и характеризуется высоким содержанием белка при равных долях углеводов и липидов. В интенсивных условиях при высокой продуктивности культуры состав биомассы отличается высоким содержанием углеводов и низким содержанием бежа. При этом, углеводы представлены в основном крахмалом, что позволяет судить о их высокой пищевой ценности. Состав биомассы в пределах отдельных режимов (экстенсивного и интенсивного) культивирования оказался устойчивым.

Учитывая все эти положительные характеристики клостериопсис, а также наличие разработанного нами метода непрерывного непроточного культивирования, данная форма водорослей может быть рекомендована для включения в состав фотоавтотрофного звена БСЖО. Ее включение позволит оптимизировать функциональные характеристики звена и соответственно системы в целом. Для расчета фувдций в системе и сопряжения материальных потоков внутри звена представлен материальный баланс, который получен при изучении функциональных характеристик высокопродуктивной популяции водорослей клостериопсис.

Наличие этих данных позволяет говорить о готовности объекта к выполнению отдельных функций в составе БСЖО человека.

В заключение следует отметить, что изучение одноклеточных водорослей применительно к БСЖО человека не только актуальная проблема прикладного характера в космической биологии. Ее успехи оказывают большое влияние на разработку проблемы производственного фотосинтеза, который базируется на утилизации энергии Солнца и направлен на решение пищевых и кормовых проблем на нашей планете.