Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Физико-химические свойства, стандартизация и контроль качества нового биологически активного вещества шунлит

004683937 На правах рукописи

ВАСИЛЬЕВА Ольга Юрьевна

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА, СТАНДАРТИЗАЦИЯ И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА НОВОГО БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО ВЕЩЕСТВА ШУНЛИТ

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

- 9 СЕН 2010

Москва 2010

004608037

Работа выполнена в лаборатории спектральных исследований и анализа ИОНХ РАН и на кафедре аналитической химии химического факультета МГУ.

Научный руководитель:

доктор фармацевтических наук, профессор А.С. Берлянд

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор доктор химических наук, профессор

Ю.Я. Харитонов Ю.А. Ершов

Ведущая организация: Институт фармакологии РАМН

Защита диссертации состоится "24" сентября 2010 г. в 14.00 на заседании диссертационного совета Д.212.203.13 при ГОУ ВПО «Российский университет дружбы народов» по адресу: 117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.8

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу: 117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.6

Автореферат разослан Л августа 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ

Актуальность темы. Исследования последних лет показали хороший лечебный эффект при применении в медицинской практике методов сорбционной терапии у больных с различными заболеваниями, при которых традиционные методы лечения малоэффективны.

Метод сорбционной детоксикации занял свое место среди прочих методов лечения. Если недавно понятие "сорбент" ассоциировалось лишь с активированным углем, то за сравнительно короткий срок фармацевтический рынок России пополнился такими отечественными энтеросорбентами, как Полифепан, Полисорб и др. Прочные позиции на рынке имеет импортный препарат Смекта. Этим препаратам посвящено много публикаций, главным образом, с результатами клинических исследований. Вместе с тем, данные о физико-химических свойствах сорбентов, в частности, об их сорбционной активности, немногочисленны и не подлежат сравнению по причине разных условий проведения эксперимента.

Несмотря на наличие широкого диапазона энтеросорбентов на фармацевтическом рынке России, проблема создания более экономичных энтерособентов отчественного производства по-прежнему актуальна, и одним из перспективных направлений являются энтерособенты минерального происхождения.

Более 20 лет для очистки питьевой и сточной воды успешно применяются сорбенты на основе природных шунгитов, месторождения которых находятся в Карелии и Казахстане. Однако в качестве энтеросорбентов шунгиты до настоящего времени не использовались, поэтому разработка нового лекарственного препарата на основе природного шунгита является актуальной задачей, позволяющей расширить ассортимент отечественных лекарственных препаратов природного происхождения.

Целью настоящей работы является изучение физико-химических характеристик нового биологически активного микста минералов шунлит на

основе природного шунгита с целью обоснования методов контроля и показателей качества, нормируемых при стандартизации.

Задачи исследования:

установить минеральный состав шунгита Зажогинского месторождения (условное название микста минералов - шунлит);

- изучить физико-химические свойства шунлита;

- разработать способы и методики качественного и количественного анализа шунлита;

- исследовать сорбционные свойства шунлита по отношению к некоторым токсичным органическим соединениям и ионам токсичных металлов;

- исследовать стабильность шунлита при хранении;

- разработать проект фармакопейной статьи предприятия на шунлит;

- изучить антиоксидантную активность шунлита.

Научная новизна. Установлен минеральный состав шунлита. Разработаны способы и методики фармацевтического и физико-химического анализа оценки качества нового биологически активного вещества шунлит.

Разработаны методики количественного определения 8102, А120з и железа в шунлите методами спектрофотометрии и комплексонометрии.

Впервые определено содержание токсичных металлов в шунлите методом атомно-абсорбционной спектроскопии.

Впервые изучена сорбционная способность шунлита по отношению к органическим веществам: фенолу, метиленовой сини, цианокобаламину, бычьему альбумину и ионам тяжелых металлов: меди, ртути, свинца и цинка.

Впервые установлена антиоксидантная активность шунлита.

Практическая значимость работы. Результаты исследований положены в основу проекта ФСП "Шунлит - порошок для приготовления суспензии для приема внутрь". Разработанные методики внедрены в лаборатории спектральных методов анализа ИОНХ РАН, в ООО НПО

"Интерлит" и на кафедре фармацевтической и токсикологической химии медицинского факультета РУДЫ.

Апробация диссертации. Результаты работы представлены на научно-практической конференции "Новая технологическая платформа биомедицинских исследований" (ЮФУ РАН г. Ростов на Дону, 2006г.), II международном семинаре "Охрана окружающей среды в городе" (Москва, 2006г.), IX международном конгрессе "Здоровье и образование в XXI веке" (Москва, РУДН, 2008г.), I всероссийской конференции "Современные методы химико-аналитического контроля фармацевтической продукции" (Москва 2009 г.), XVII российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 2010 г.)

Публикации. По материалам диссертации имеется 11 публикаций, 5 из которых - в центральных журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 138 страницах и состоит из введения, обзора литературы, четырех глав с результатами исследований и их обсуждением, выводов и двух приложений. Обзор литературы включает в себя 170 ссылок, в т.ч. 60 на английском языке. Диссертация содержит 21 рисунок и 24 таблицы. Положения, выдвигаемые на защиту.

- результаты установления минерального состава шунлита

- методики и результаты определения содержания токсичных металлов в шунлите

- методика количественного определения БЮг, АЬ03 и Ре в шунлите

- результаты фармацевтического анализа шунлита

- проект ФСП на "Шунлит - порошок для приготовления суспензии для приема внутрь"

- результаты изучения сорбционной способности шунлита

- результаты изучения антиоксидантной активности шунлита.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Материалы и методы.

Объект исследования - сорбент шунлит - был получен размолом шунгита разновидности III Зажогинского месторождения на шаровой мельнице. Шунгит был предварительно подвергнут очистке от посторонних включений. Полученный порошок был просеян на сите до частиц размером не более 0,31мм.

Элементный анализ шунлита проводили методом лазерной масс-спектроскопии на приборе ЭМАЛ-2. Рентгенофазовый анализ шунлита проводили на порошковом дифрактометре ДРОН-2. Определение токсичных элементов в шунлите проводили методом атомно-абсорбционного анализа. В работе были использованы: атомно-абсорбционный спектрофотометр фирмы Perkin-Elmer (модель 303, пламенный вариант,) и атомно-абсорбционный спектрофотометр фирмы Perkin-Elmer (модель 2100, с электротермической атомизацией в графитовой печи HGA-700).

Все реактивы и индикаторы, использованные для химико-фармацевтического анализа шунлита, описаны в соответствующих разделах Государственной фармакопеи XI издания, выпуск 2. Оптическую плотность растворов метиленовой сини измеряли на спектрофотометре Adilent-8453. ИК спектр шунлита в таблетке с КВг снимали на ИК-спектрометре ФСН-1201.

Для изучения сорбционных свойств шунлита были использованы: дистиллированная вода, полученная двойной перегонкой водопроводной воды; боратный буферный раствор, аммиачный буферный раствор, раствор ацетата натрия, растворы пикрамина -е и ПАР (мононатриевой соли 4(2-пиридил-азо)резорцина), стандартный раствор ртути (ЭАА "Экоаналитика", ион ртути (II), ГСО № 7343-96, 1,0 мг/см3, партия 4-07), стандартный раствор цинка (ЭАА "Экоаналитика", ион цинка, ГСО № 7770-2000, 1,0 мг/см3, партия 5-07), стандартный раствор свинца (ЭАА "Экоаналитика", ион

свинца, ГСО № 7778-2000, 1,0 мг/см3, партия 8-07), стандартный раствор меди, (ГСО №7764-2000, ЭАА 'Экоаналитика", ион меди, ГСО №7764-2000, 1,0 мг/см3, партия 6-07), фульвокислоты почвенные (чернозем типичный курский), выделенные в 2004 г, стандартный 0,1 М раствор НС1, приготовленный из фиксанала; стандартный раствор фенола (1 мг/мл, ЭАА "Экоаналитика", ГСО №7346-96, партия 4-07); метиленовый синий (тригидрат хлорида тетраметилентионина); цианокобаламин (витамин В12); бычий сывороточный альбумин (Fraction V, MW 66338, MP Biomedicals LLC).

Измерение оптической плотности исследуемых растворов проводили на фотоколориметре КФК-2 и спектрофотометре СФ-46, а атомно-абсорбционный анализ - на атомно-абсорбционном спектрометре "Квант". Для центрифугирования была использована центрифуга лабораторная медицинская ОПН-8. Значения рН растворов измеряли при помощи потенциометра рН-121. Сорбционные свойства всех изученных веществ были исследованы в статическом режиме.

Для исследования антиоксидантных свойств шунлита были использованы водные и водно-спиртовые (на 20% этиловом спирте) настои шунлита, а также растворы, содержащие взвесь шунлита. В работе использовали коммерческие препараты ферментов: каталазы (КАТ), супероксиддисмутазы (СОД), глутатионпероксидазы (ГП), глутатионредуктазы (ГР), пируваткиназы (ПК), лактатдегидрогеназы (ЛД), субстраты: глутатион окисленный и глутатион восстановленный, фосфоенолпируват, аденозиндифосфат, гидроксибутил, феназинметасульфат, нитросиний тетразолий; коферменты р-никотинамидадениндинуклеотид фосфат восстановленный (р-НАДФН), -никотинамидадениндинуклеотид восстановленный (р--НАДН) (все препараты ферментов и субстраты фирмы Sigma), реактивы: пирофосфат натрия, трис(гидроксиметил)аминометан, аммоний молибденовокислый (NH4)6Mo7024-4H20, гидроксид натрия, дигидрофосфат калия КН2Р04, пероксид водорода. Скорость

7

ферментативных реакций определяли при помощи спектрофотометра ЗЫтаёги МР8-2000 с непрерывной автоматической регистрацией. 2. Исследование минерального состава шунлита

Элементный анализ шунлита проводили методом лазерной масс-спектроскопии. Было установлено, что основное содержание в шунлите составляют С, О и 81 (10-40 масс.%), а также А1 и К (1-10 масс.%). В состав шунлита в незначительных количествах входят: Са, Бе, "П (0,1-1 масс.%), Ва, С1, Р, 8, КЬ (0,01-1 масс.%), Ав, В, Се, Со, Сг, Си, Ьа, Мп, 1ЧЬ, N1, вг, У, Ъа, Ъх (0,001-0,01 масс.%), а содержание Сё, Н§, РЬ находится ниже предела обнаружения (<0,0001 масс.%). Элементный состав шунлита в пересчете на оксиды представлен в таблице 1.

Таблица 1.Элементный состав шунлита в пересчете на оксиды.

оксид В203 Fe203 Na20 MgO ai2o3 Si02

содержание, масс.% 0,026 0,91 0,24 0,53 4,42 57,32

оксид Р2о5 к2о CaO ТЮ2 Cr2Oj MnO

содержание, масс.% 0,083 2,21 0,31 0,92 0,0182 0,011

Полученные результаты были использованы для установления минерального состава шунлита методом рентгенофазового анализа. Дифрактограмма шунлита представлена на рис.1.

100

5 „о

1 40 1 20

о

80 70 60 ' 50 40 30 20 10 2Ыа

Рис. 1. Дифрактограмма шунлита. 8

lili mill In

Расшифровка дифрактограммы, проведенная с использованием банка рентгенодифракционных стандартов ГСРББ и баз данных по минералогии, показала, что шунлит представляет собой минеральный микст, состоящий из кварца (ЭЮг), кианита (А125Ю5), микроклина (К,Ыа)[А18!308], графита и шамозита (Ре,Л1,М§)6(81,А1)4О10(ОН)8. 3. Химико-фармацевтический анализ шуилита.

Методом атомно-абсорбционного анализа было исследовано 5 серий образцов шунлита. Было установлено, что содержание токсичных элементов Си, Ъп, РЬ, Аэ в шунлите незначительно, а содержание Сс1 и находится ниже предела обнаружения метода (<0,00001%) (табл. 2). Статистическая обработка результатов анализа показывает, что разработанные методики обладают удовлетворительной точностью и воспроизводимостью. Таблица 2. Результаты атомно-абсорбционного определения токсичных

элемент Си Ъл РЬ Ав Сс1 щ

содержание, масс.% 0,0030 0,0089 0,0002 0,0012 <0,00001 <0,00001

Еср,% 4,75 2,24 6,20 7,71 —

Схема химико-фармацевтического анализа шунлита (рис.2, 3) была разработана на основании ОСТ «Стандарты лекарственных средств. Основные положения». Анализ проводили на 5 сериях образцов шунлита.

Рис.2. Схема химико-фармацевтического анализа шунлита.

По внешнему виду образцы шунлита представляли собой порошок черного цвета, без запаха. В свежеприготовленных образцах препарата содержание частиц с диаметром менее 0,31 мм составляло от 98,2 до 99,4%. Образцы, состаренные в течение двух лет в обычных условиях, этот показатель практически не изменили. Изучение растворимости показало, что шунлит практически не растворим в воде, ацетоне и 95% водном растворе этилового спирта.

Для идентификации подлинности было предложено использовать ИК-спектр шунлита в таблетке с КВг. Кроме того, для подтверждения подлинности препарата предлагается использовать окраску и электронный спектр поглощения раствора синего кремниймолибденового комплекса, приготовленного для количественного определения кремния. Спектр был снят в области от 350 до 900 нм в кювете толщиной 10 мм относительно раствора, полученного в контрольном опыте, с максимумом при 817нм и минимумом при 418 нм.

Для обнаружения ионов алюминия и железа были использованы цветные реакции этих ионов с ализарином красным №0 (1,2-диоксиантрахиноном) и ферроцианидом калия соответственно. Реакцию выполняли методом бумажной хроматографии с раствором, полученным при выполнении испытаний по разделу "Вещества, растворимые в кислоте хлористоводородной". В результате на полоске бумаги при погружении ее в 3% раствор уксусной кислоты в месте нанесения раствора появилось отчетливое пятно синего цвета (железо окисное) с кольцевым ореолом фиолетово-красного цвета (алюминий).

Высушивание свежеприготовленных образцов проводили при 120°С, что привело к уменьшению их массы на 0,6 - 1,8%. В процессе хранения образцов в течение двух лет потери в массе практически не изменились.

Потери в массе при прокаливании определяли в условиях медленного нагревания образцов до 1000°С с последующим выдерживанием при этой температуре в течение 30 минут. Потери в массе составили от 29 до 33,8%.

ю

Для изучения адсорбционной способности шунлита о качестве исходного раствора был использован 0,15% водный раствор метиленового синего. Концентрацию раствора после установления адсорбционного равновесия определяли спсктрофотометрически, при длине волны 664 нм. Расчеты проводили с использованием PCO метиленового синего. Величина адсорбционной способности шунлита составила от 0,010 до 0,013 г метиленового синего на 1 г препарата.

Испытания шунлита на микробиологическую чистоту проводили в соответствии с ОФС (ГФ XI, вып.2, С.187) и изменением №3. Все серии препарата удовлетворяли требованиям категории 3.2.

Для проведения количественного анализа из образцов шунлита были приготовлены водная и кислотная вытяжки и раствор плава (рис.3). Водная вытяжка была получена выдерживанием 6 г шунлита в течение 30 мин в 75 мл дистиллированной воды. Для приготовления кислотной вытяжки 5 г шунлита выдерживали в 100 мл 0,1М раствора HCl. Для количественного определения кремния, алюминия и железа шунлит был переведен

образец шунлита

водная вытяжка

кислотная вытяжка

раствор плава

pH видной вытяжки (ГФ XI!

растворимые и кислоте вещества (гравиметрия)

алюминии (комплексонометри.ч)

растворимые в воде вещества (гравиметрия)

кремнии ¡спектрофотометрия)

хлориды

Ttuvi'.

тяжелые металлы, сульфгты, мышьяк

щелочность (ацидиметрия)

(ГФХЦ

железо (комплексонометрия)

Рис.3. Схема количественного анализа шунлита,

в растворимую форму. Навеску шунлита сплавляли со смесью карбоната натрия, тетрабората натрия и нитрата калия при 900°С, полученный плав растворяли в соляной кислоте.

В ходе анализа водной вытяжки были получены следующие результаты: содержание растворимых в воде веществ - < 0,5% в пересчете на сухой препарат, рН водной вытяжки - 7-8, щелочность - 0,075-0,090 % в пересчете на Ка20 в сухом препарате и содержание хлоридов - < 0,05 % в пересчете на сухой препарат. В кислотной вытяжке содержание (в пересчете на сухой препарат) растворимых в НС1 веществ составило 1,1-1,6%, тяжелых металлов - < 0,002%, сульфатов - < 0,1%, мышьяка - < 0,001%.

В растворе плава шунлита было проведено количественное определение кремния, железа и алюминия. Содержание кремния в шунлите проводили по методике, основанной на реакции образования желтого кремниймолибденового комплекса, его последующего восстановления и измерении оптической плотности полученного синего кремниймолибденового комплекса при длине волны 817 нм. При расчетах содержания кремния использовали значение удельного показателя поглощения раствора синего кремниймолибденового комплекса. В 5 сериях образцов шунлита содержание кремния в пересчете на 8Ю2 составило от 56,6 до 62,2%.

Определение содержания железа проводили с помощью комплексонометрического титрования трилоном Б, образующим с Бе3* комплексное соединение. В качестве металлоицдикатора использовали сульфосалициловую кислоту. В состав шунлита входит как трехвалентное железо, так и двухвалентное, однако исследования растворов плава показали, что в продукте плавления препарата все железо находится в форме Ре3+. Таким образом, предложенный метод является методом определения общего железа в препарате. Суммарное содержание железа в образцах шунлита составило от 0,54 до 0,83%.

Содержание алюминия определяли методом обратного титрования раствора, полученного при определении железа. К раствору добавляли избыток трилона Б и проводили титрование нитратом свища в присутствии индикаторной смеси метиленового оранжевого и гексаметилеитетрамина. Содержание алюминия в образцах шунлита составило от 3,6 до 4,9%.

Все разработанные методики количественного определения были

проверены на модельных смесях, имитирующих состав раствора плава

шунлита. Результаты анализа и статистической обработки результатов

сведены в табл. 3. Проверку проводили на 5 сериях образцов.

Таблица 3. Результаты анализа модельных растворов, имитирующих состав испытуемых растворов, н метрологические характеристики методов определения (Г=3, Р=95%).

взято на анализ (ц), г Х(%) Б ДХ(%) е

0,0825-0,1001 100,17 1,26 4,02 4,01 0,27

Ре 0,00151-0,00157 99,95 1,91 6,06 6,06 0,00

А120з 0,00464-0,00968 99,78 0,48 1,54 1,54 0,29

Была исследована стабильность шунлита при хранении. Было установлено, что шунлит может храниться в течение 2 лет при температуре, не превышающей 30°С, без изменения свойств.

На основании проведенных исследований была составлена спецификация шунлита (табл.4), включающая в себя наименование показателей качества препарата, методы их контроля и нормы этих показателей.

Таблица 4. Спецификация порошка шунлита для приготовления суспензии для приема внутрь.

Наименование показателя Метод контроля Норма

Описание Визуальный Порошок черного цвета, без запаха

Растворимость Визуальный (ГФ XI, вып.1, С. 175) Практически не растворим в воде, спирте 95%, ацетоне

Подлинность ИК-спектро фотометрия ИК-спектр препарата, снятый в таблетке с калия бромидом, должен иметь совпадение по положению основных полос поглощения со спектром на прилагаемом рисунке

Спектрофотометрия Электронный спектр поглощения раствора, приготовленного для количественного определения кремния, должен иметь максимум при 817±2 нм

Бумажная хроматография продуктов взаимодействия препарата с калия ферроцианидом и ализарином На бумаге должно появиться отчетливое пятно синего цвета (железо окисное) с кольцевым ореолом фиолетово-красного цвета (алюминий).

Прокаливание препарата при 1000°С Превращение в порошок серого или светло-серого цвета с коричневым оттенком

Измельченность ГФ XI, вып.2, С. 17 Остаток на сите 0,310 мм не должен превышать 2%

Потеря в массе при высушивании ГФ XI, вып.1, С. 176 Не более 2%

Потеря в массе при прокаливании Весовой От 28 до 34%

Растворимые в воде вещества Весовой Не более 0,5%

рН водной вытяжки Потенциометрический (ГФ XI, вып.1, С.113) От 7 до 8

Щелочность Ацидиметрическое титрование Щелочность должна быть не более 0,1% в пересчете на содержание натрия оксида в сухом препарате

Хлориды ГФ XI, вып.1, С.165 Не более 0,05%

Вещества, растворимые в кислоте хлористоводородной Весовой Не более 2%

Тяжелые металлы ГФ XI, вып.1, С.165 Не более 0,002%

Сульфаты ГФ XI, вып.1, С.165 Не более 0,1%

Мышьяк ГФ XI, вып.1, С.165 Не более 0,001%

Микробиологическая чистота ГФ XI, вып.2, С. 187 и Изменение №2 и №3 Категория 3.2

Адсорбционная способность Спектрофотометрия Не менее 0,010 г метиленового синего на 1 г препарата

Количественное определение

Кремний Спектрофотометр™ От 55 до 65%

Железо Комплексонометрия Не более 1%

Алюминий Комплексонометрия От 3 до 6%

Упаковка Согласно ФСП

Маркировка Согласно МУ 9467-015-05749470-98

Срок годности 2 года

На основании проведенных исследований был разработан проект ФСП на шунлит, порошок для приготовления суспензии для приема внутрь, применяемый в качестве лекарственного средства. 4. Исследование сорбционных свойств шунлита.

Сорбционные свойства шунлита изучали в статическом режиме. В качестве сорбатов были выбраны ионы токсичных металлов: свинца, цинка, ртути и меди. В работе использовали навески сорбента массой 0,02-0,1 г, и растворы сорбатов объемом 10 мл. Исследования проводились при значениях рН, близких к кислотности желудка и двенадцатиперстной кишки - 2 и 6,5 соответственно. Время установления сорбционного равновесия составило 40 минут для цинка, ртути и свинца и 30 минут для меди. При рН 2 ионы всех исследуемых металлов не сорбировались на шунлите, а при рН 6,5 сорбция наблюдалась. Данные для построения изотерм сорбции металлов (рис. 4-8) получены при рН 6,5.

Рис.4. Изотерма сорбции цинка Рис.5.Изотерма сорбции свинца на

на шунлите. шунлите.

Сорбция всех изученных катионов удовлетворительно описывается уравнением Фрейндлиха. Параметры сорбции сведены в табл.5.

С, ммоль/п

Рис.8. Изотерма сорбции ртути на шунлите.

0.05 0.10 0.15 С, ммоль/п

С, ммольГл

Рис.6. Изотерма сорбции меди на шунлите

Рис.7. Изотерма сорбции меди на шунлите в присутствии фульвокислоты

Табл.5. Параметры сорбции ионов металлов на шунлите

К п V) (см3/г) X т г.ш\ (ммоль/г)

0,019 3,41 90 1,4x10"''

РЬ* 0,012 4,85 360 7х10"3

Си2+ 0,340 2,99 80 3,3x10"'

" Си*+ "" (фульво-кислота) 0,191 2,03 890 7,8x10"2

нР2+ 0,0191 3,59 220 1,6x10"'

Значения коэффициентов распределения Б на начальных участках изотерм возрастают в ряду Си2+ я Хп2+ < Щ2+ < РЬ2+, что практически совпадает с рядом удерживания этих ионов на катионообменниках. Было установлено, что присутствие фульвокислоты увеличивает коэффициент распределения меди в 10 раз.

В качестве органических сорбатов были использованы соединения, имитирующие различные факторы интоксикации: фенол, метиленовый синий, цианокобаламин и бычий альбумин. Данные для изотерм сорбции получены при рН 2 и 6,5.

Время установления сорбционного равновесия составило 10 мин для фенола, 5 мин для метиленового синего, 2 мин для цианокобаламина и 24 ч для бычьего альбумина. Сорбция всех изученных соединений удовлетворительно описывается уравнением Фрейндлиха (рис. 9-12, табл.6).

С, ммоль/л

Рис.9. Изотерма сорбции фенола в кислой (—А—) и нейтральной (-•-) среде.

Рис.11. Изотерма сорбции цианокобаламина в кислой (—А—) и нейтральной (—•—) среде.

С (ммоль/л)

Рис.10. Изотерма сорбции метиленового синего в кислой (—А—) и нейтральной (—) среде.

С, ммоль/л

Рис.12. Изотерма сорбции бычьего альбумина в кислой (-А-) и нейтральной (—•—) среде.

рН 2 рН 6,5

К п D см3/г Х/Шшгк ммоль/г К п D см3/г Х/гПшк ммоль/г

фенол 0,027 1,82 80 0,053 0,029 2,04 200 0,053

метиленовый синий 0,087 4,33 1660 0,051 0,064 6,08 1620 0,046

цианокобаламин 0,003 1,49 520 0,008 0,015 3,36 920 0,008

бычий альбумин 0,035 1,48 40 4,2x10"4 0,005 2,56 110 4x10^

Значения коэффициентов распределения убывают в ряду: метиленовый синий> цианокобаламин > фенол > бычий альбумин, что согласуется со структурой этих соединений и, вероятно, определяется характером я-я взаимодействий сорбата и матрицей сорбента. 5. Исследование биологической активности шунлита.

Исследование биологической активности шунлита проводили in vitro с помощью следующих молекулярных тест-систем: супероксиддисмутазной (СОД), каталазной (КЛТ), глутатионпероксидазной (ГП), глутатионредуктазной (ГР), и пируваткиназной (ПК). Эти тест-системы, содержание ферменты антиоксидантной защиты, широко используют для выявления веществ, обладающих антиоксидантной, адаптогенной, противовирусной или противомикробной активностью.

Расчеты скорости ферментативных реакций проводили на основании 3 измерений. Относительная ошибка определения не превышала 5%.

Было установлено, что вытяжки из водных и водно-спиртовых растворов шунлита во всем изученном диапазоне концентраций не оказывают влияния на скорость каталазной реакции (рис.13).

Активность каталазы также изучали в водных растворах, содержащих частицы шунлита. Исследования проводили в фосфатном буфере с рН 8,0, соответствующим максимальной активности фермента (рис.14). При концентрации шунлита в пробе, равной 1 мкг/мл, происходила незначительная активация каталазы, что может свидетельствовать об

Рис.13. Влияние водных и водно-спиртовых настоев шунлита на скорость каталазной реакции.

антиоксидантном действии шунлита. При воздействии на каталазу более высоких концентраций шунлита (100-1000 мкг/мл) происходит ее ингибирование, что коррелирует с наличием антибактериальных свойств у шунлита.

Учитывая, что шунлит может быть использован как энтеросорбент, представлялось целесообразным изучить его влияние на активность каталазы в кислой среде. С этой целью использовали К,Ыа-фосфатный буфер с рНЗ,4. Каталаза в зависимости от концентрации шунлита в условиях кислой среды (при рН = 3,4) проявляет два взаимопротивоположных эффекта, в присутствии относительно небольших концентраций шунлита (1-10 мкг/ мл) в кислой среде происходит ее ингибирование (рис.15), в то время как

Рнс.14. Влияние шунлита на Рис.15. Влияние шунлита на активность

активность каталазы при рН 8 каталазы при рН 3,4

увеличение концентрации шунлита от 50 до 500 мкг/мл активирует каталазу в сотни и тысячи раз по сравнению с исходным контролем, не достигая, однако, значений, характерных для активности каталазы при оптимальном рН. Снижение рН буфера до 3,4, т.е. уход от рН-оптимума, характерного для каталазы, приводит к снижению активности каталазы в 60 раз, что, вероятно, связано с частичной денатурацией фермента.

Установлено, что шунлит вызывает активацию супероксиддисмутазы во всем изученном интервале концентраций, причем максимальная активность фермента наблюдалась при концентрациях шунлита 1-100 мкг/мл (рис.16).

Активирующее действие шунлита наблюдалось и в случае глутатионпероксидазной (рис.17) и глутатионредуктазной (рис.18) тест-систем. Скорость ГП-реакции при концентрации шунлита, равной 250 мкг/мл возрастала в 5 раз по сравнению с контролем, а скорость ГР-реакции

300 -1 | 250 -X 111 12 ЕЮ " X ? 8 |

I 200 -§ 150 - I 100 - 5 ЗОН Нип £ > 6 § 1 5 4 X 1 ■ ■ ■ I В I

контр 0,1 1 10 100 1000 С шунлита, мкг/мл контр ОД 1 10 100 250 500 С шунлита, мкг/мл

Рис. 16. Влияние шунлита на активность Рис.17. Влияние шунлита на супероксиддисмутазы. активность глутатионпероксидазы

возрастала в полтора раза при концентрации шунлита 100 мкг/мл.

Было установлено, что все изученные концентрации шунлита ингибируют пируваткиназу (рис.19), что свидетельствует о наличии у шунлита антибактериальных свойств.

25 п

С шунлита, мкг/мл

контр 1 10 100 250 С шунлита, мкг/мл

Рис.18. Влияние шунлита на активность Рис.19. Влияние шунлита на глутатионредуктазы. активность пируваткиназы.

Изучение биологической активности шунлита in vitro показало, что он обладает несколькими ее видами. Активация ферментов антаоксидантной защиты (КАТ, СОД, ГП и ГР), свидетельствует о наличии антиоксвдантной активности, а ингибирование ПК во всем исследованном интервале концентраций и ингибирование КАТ в некоторых интервалах концентраций - о наличии у шунлита бактерицидной активности.

ВЫВОДЫ

1. На основании данных элементного и ренгтенофазового анализа с

использованием банка рентгенодифракционных стандартов ICPDS и электронных баз данных по минералогии установлен минеральный состав шунлита. Минеральный микст шунлит состоит из кварца, кианита, микроклина, графита и шамозита.

2. Методом атомно-абсорбционной спектроскопии установлено, что

содержание токсичных металлов в шунлите незначительно и составляет 0,0032 масс.% для Си, 0,0088 масс.% для Zn, 0,0002 масс.% для РЬ и 0,0014 масс.% для As, а содержание Cd и Hg не превышает 0,00001 масс.%.

3. Разработаны методики качественного и количественного анализа

шунлита, определения содержания в нем примесей, отличающиеся хорошей специфичностью и воспроизводимостью.

4. Предложены показатели и установлены их нормы для оценки качества

порошка шунлита при его стандартизации. Разработан проект ФСП на порошок шунлита для приготовления суспензии для приема внутрь.

5. Установлено, что порошок шунлита обладает высокой сорбциониой

способностью по отношению к ряду токсичных органических веществ и ионам тяжелых металлов в условиях in vitro.

6. С помощью молекулярных тест-ферментных систем установлено, что

шунлит обладает выраженной антиоксидантной и бактерицидной активностью.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Васильева О.Ю., Прокопов A.A., Берлянд A.C., Дубинская В.А. Изучение действия природных шунгитов на ферментные тест-системы in vitro. Сборник "Естествознание и гуманизм". Сибирский Государственный медицинский университет. Томск.2005. - Т.2.- №3. -С.63.

2. Васильева О.Ю., Берлянд A.C. Анализ примесных элементов в природных шунгитах методом атомно-абсорбционной спектроскопии. Сборник "Естествознание и гуманизм". Сибирский Государственный медицинский университет. Томск. - 2005. - Т. 2. - №3. - С.63.

3. Васильева О.Ю., Берлянд A.C., Алиханян A.C., Прокопов A.A. Стандартизация природного биологически активного минерального сырья шунлит Материалы научно-практической конференции "Новая технологическая платформа биомедицинских исследований (биология, здравоохранение, фармация)". Ростов-на-Дону: ЮНЦ РАН -2006.- С.85

4. Васильева О.Ю., Гойзман М.С., Г.Б.Тихомирова, Берлянд A.C., А.САлиханян, А.В.Шевяков. Количественный анализ нового природного биологически активного вещества шунлит. Химико-фармацевтический журнал. 2007. - Т.41. - №10. - С.46-50.

5. Васильева О.Ю., Гойзман М.С., Г.Б.Тихомирова, Берлянд A.C., А.С.Алиханян, А.В.Шевяков. Химико-фармацезтический анализ нового природного биологически активного вещества шунлит. Химико-фармацевтический журнал. 2008. - Т.42. - №5. - С. 33-36.

6. В.В. Ягов, И.В. Ягова, О.Ю. Васильева, A.B. Бородин, А.Н. Жучков, A.C. Берлянд. Изучение сорбции высокотоксичных ионов тяжелых металлов природными шунгитами. Химико-фармацевтический журнал.

2008. - Т.42. - №11. - С. 41-44.

7. Васильева О.Ю., Берлянд A.C. Изучение сорбции ионов некоторых металлов новым природным биологическим активным веществом Шунлит. Сборник научных трудов IX международного конгресса "Здоровье и образование в XXI веке" "Влияние космической погоды на биологические системы в свете учения АЛ. Чижевского". 2008.-Москва,- РУДН,- С.487-488.

8. Васильева О.Ю., Тихомирова Т.И., Берлянд A.C. Сорбция некоторых токсичных металлов на новом биологически активном веществе шунлит. Химико-фармацевтический журнал, 2009. Т. 43. №5. С.44-47.

9. Васильева О.Ю., Тихомирова Т.И., Берлянд A.C. Сорбция некоторых органических соединений на новом биологически активном веществе шунлит. Химико-фармацевтический журнал, 2009. Т. 43. №6. С.40-43

10. Васильева О.Ю., Берлянд A.C., Плесская НА. Исследование сорбционных свойств нового природного энтеросорбента шунлита. Тезисы 1 всероссийской конференции "Современные методы химико-аналитического контроля фармацевтической продукции". - Москва. -

2009. - С.35-36.

П.Васильева О.Ю., Берлянд A.C., Плесская H.A. Установление минерального состава нового биологически активного вещества шунлит методом рентгенофазового анализа. Тезисы докладов XVII российского национального конгресса "Человек и лекарство". -Москва,-2010.-С.511.

Васильева Ольга Юрьевна

"Физико-химические свойства, стандартизация и контроль качества нового биологически активного вещества шунлит "

Шушгит - новое биологически активное вещество минерального происхождения. В работе проведен количественный и химико-фармацевтический анализ шунлита, исследованы его сорбционные свойства и антиокеидантная активность.

На основании полученных результатов разработаны методики количественного анализа шунлита, отличающиеся хорошей воспроизводимостью, выбраны показатели качества шунлита, применяемые для его стандартизации и разработан проект статьи ФСП на порошок шунлит, используемый в качестве суспензии для приема внутрь. Установлено, что содержание токсичных элементов в шунлите незначительно, что шунлит проявляет высокую сорбционную способность по отношению к различным неорганическим и органическим токсичным соединениям и обладает антиоксидантной активностью. Все это свидетельствует о возможности применения шунлита в качестве энтеросорбента.

OJga Y. Vasilyeva

"Physico-chemical properties, standardization and quality control of the new biologically active substance shunlite."

Shunlite is a new biologically active substance of mineral origin. Its quantitative and chemicopharmaceutical analysis has been carried out, its sorption properties and antioxidant activity have been investigated.

Quantitative analysis technique was developed and quality index for its standardization was selected. Pharmacopoeia item was developed for shunlite, powder used for preparation of pulp for ingestion. It was found that the content of toxic elements in shunlite is low and shunlite exhibits antioxidant activity and high sorption capacity for some inorganic and organic toxic substances. All this indicates that shunlite may be applied as an enterosorbent.

Подписано в печать:

02.08.2010

Заказ № 3966 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Актуальность темы

Энтеросорбционная терапия является одним из перспективных направлений развития медицины. С каждым годом показания для энтеросорбции расширяются, так как энтеральное использование сорбентов позволяет исключить или снизить интенсивность медикаментозной терапии. Следует отметить, что в литературе имеется множество публикаций о клинических исследованиях энтеросорбентов, в то время как данные о физико-химических свойствах и сорбционной активности этих препаратов немногочисленны и не подлежат сравнению в связи с различными условиями проведения эксперимента.

В настоящее время на фармацевтическом рынке России представлен широкий ряд энтеросорбентов отечественного и импортного производства. Однако учитывая экономическую ситуацию, сложившуюся в стране, проблема создания новых бюджетных энтеросорбентов отечественного производства остается актуальной. Одним из перспективных путей ее решения является создание энтеросорбента минерального происхождения, обладающего невысокой себестоимостью, что позволит расширить потребительскую аудиторию препарата.

Минерал шунгит, месторождения которого находятся в Карелии и Казахстане, более 20 лет используется в качестве сырья для производства сорбентов, применяемых при очистке сточной и питьевой воды. За последнее десятилетие в медицине, косметологии и ветеринарии было разработано множество препаратов для наружного применения на основе шунгитов. Но в качестве энтеросорбентов препараты на основе шунгитов до настоящего времени не использовались, поэтому разработка нового энтеросорбента на основе шунгита и методик исследования его физико-химических свойств является актуальной задачей.

Цель и задачи исследования Целью настоящей работы является изучение физико-химических характеристик нового биологически активного микста минералов шунлит на основе природного шунгита с целью обоснования методов контроля и показателей качества, нормируемых при стандартизации.

Для реализации поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

- установить минеральный состав шунгита Зажогинского месторождения (условное название микста минералов — шунлит);

- изучить физико-химические свойства шунлита;

- разработать способы и методики качественного и количественного анализа шунлита;

- исследовать сорбционные свойства шунлита по отношению к некоторым токсичным органическим соединениям и ионам токсичных металлов;

- исследовать стабильность шунлита при хранении;

- разработать проект фармакопейной статьи предприятия на шунлит;

- изучить антиоксидантную активность шунлита.

Научная новизна.

Установлен минеральный состав шунлита. Разработаны схемы и методики фармацевтического и физико-химического анализа оценки качества нового отечественного биологически активного микста минералов шунлит.

Разработаны методики количественного определения SiC>2, AI2O3 и железа в шунлите методами спектрофотометрии и комплексонометрии.

Впервые определено содержание токсичных металлов в шунлите методом атомно-абсорбционной спектроскопии.

Впервые изучена сорбционная способность шунлита по отношению к органическим веществам: фенолу, метиленовой сини, цианокобаламину, бычьему альбумину и ионам тяжелых металлов: меди, ртути, свинца и цинка.

Впервые установлена антиоксидантная активность шунлита.

Практическая значимость работы

Результаты исследований положены в основу проекта ФСП "Шунлит -порошок для приготовления суспензии для приема внутрь". Разработанные методики внедрены в лаборатории спектральных методов анализа ИОНХ РАН, в ООО НПО "Интерлит" и на кафедре фармацевтической и токсикологической химии медицинского факультета РУДН. Апробация работы

Результаты работы представлены на научно-практической конференции "Новая технологическая платформа биомедицинских исследований" (ЮФУ РАН г. Ростов на Дону, 2006г.), II международном семинаре "Охрана окружающей среды в городе" (Москва, 2006г.), IX международном конгрессе "Здоровье и образование в XXI веке" (Москва, РУДН, 2008г.), I всероссийской конференции "Современные методы химико-аналитического контроля фармацевтической продукции" (Москва, 2009 г.), XVII российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 2010 г.)

Публикации

Основные результаты работы представлены в публикациях:

1. Васильева О.Ю., Прокопов А.А., Берлянд А.С., Дубинская В.А. Изучение действия природных шунгитов на ферментные тест-системы in vitro. Сборник "Естествознание и гуманизм". Сибирский Государственный медицинский университет. Томск.2005. - Т.2.- №3. - С.63.

2. Васильева О.Ю., Берлянд А.С. Анализ примесных элементов в природных шунгитах методом атомно-абсорбционной спектроскопии. Сборник "Естествознание и гуманизм". Сибирский Государственный медицинский университет. Томск. - 2005. - Т. 2. - №3. - С.63.

3. Васильева О.Ю., Берлянд А.С., Алиханян А.С., Прокопов А.А. Стандартизация природного биологически активного минерального сырья шунлит Материалы научно-практической конференции "Новая технологическая платформа биомедицинских исследований (биология, здравоохранение, фармация)". Ростов-на-Дону: ЮНЦ РАН -2006.- С.85

4. Васильева О.Ю., Гойзман М.С., Г.Б.Тихомирова, Берлянд А.С., А.С.Алиханян, А.В.Шевяков. Количественный анализ нового природного биологически активного вещества шунлит. Химико-фармацевтический журнал. 2007. - Т.41. - №10. - С.46-50.

5. Васильева О.Ю., Гойзман М.С., Г.Б.Тихомирова, Берлянд А.С., А.С.Алиханян, А.В.Шевяков. Химико-фармацевтический анализ нового природного биологически активного вещества шунлит. Химико-фармацевтический журнал. 2008. - Т.42. - №5. - С. 33-36.

6. В.В. Ягов, И.В. Ягова, О.Ю. Васильева, А.В. Бородин, А.Н. Жучков, А.С. Берлянд. Изучение сорбции высокотоксичных ионов тяжелых металлов природными шунгитами. Химико-фармацевтический журнал. 2008. -Т.42.-№11.-С. 41-44.

7. Васильева О.Ю., Берлянд А.С. Изучение сорбции ионов некоторых металлов новым природным биологическим активным веществом Шунлит. Сборник научных трудов IX международного конгресса "Здоровье и образование в XXI веке" "Влияние космической погоды на биологические системы в свете учения A.JI. Чижевского". 2008.- Москва.-РУДН.- С.487-488.

8. Васильева О.Ю., Тихомирова Т.И., Берлянд А.С. Сорбция некоторых токсичных металлов на новом биологически активном веществе шунлит. Химико-фармацевтический журнал, 2009. Т. 43. №5. С.44-47.

9. Васильева О.Ю., Тихомирова Т.И., Берлянд А.С. Сорбция некоторых органических соединений на новом биологически активном веществе шунлит. Химико-фармацевтический журнал, 2009. Т. 43. №6. С.40-43

10. Васильева О.Ю., Берлянд А.С., Плесская Н.А. Исследование сорбционных свойств нового природного энтеросорбента шунлита. Тезисы I всероссийской конференции "Современные методы химико-аналитического контроля фармацевтической продукции". - Москва. -2009. - С.35-36.

П.Васильева О.Ю., Берлянд А.С., Плесская Н.А. Установление минерального состава нового биологически активного вещества шунлит методом рентгенофазового анализа. Тезисы докладов XVII российского национального конгресса "Человек и лекарство". — Москва. - 2010. -С.511.

Связь задач исследования с практическим планом фармацевтических наук

Работа выполнена в рамках плана научных исследований кафедры общей и биоорганической химии МГМСУ "Исследования возможности использования природного минерального сырья в качестве биологически активных веществ" (номер государственной регистрации 01.20.0100391). Положения, выдвигаемые на защиту

- результаты установления минерального состава шунлита

- методики и результаты определения содержания токсичных металлов в шунлите

- методика количественного определения Si02, AI2O3 и Fe в шунлите

- результаты фармацевтического анализа шунлита

- проект ФСП на "Шунлит — порошок для приготовления суспензии для приема внутрь"

- результаты изучения сорбционной способности шунлита

- результаты изучения антиоксидантной активности шунлита.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. На основании данных элементного и рентгенофазового анализа с использованием банка рентгенодифракционных стандартов ICPDS и электронных баз данных по минералогии установлен минеральный состав шунлита. Минеральный микст шунлит состоит из кварца, кианита, микроклина, графита и шамозита.

2. Методом атомно-абсорбционной спектроскопии установлено, что содержание токсичных металлов в шунлите незначительно и составляет 0,0032 масс.% для Си, 0,0088 масс.% для Zn, 0,0002 масс.% для РЬ и 0,0014 масс.% для As, а содержание Cd и Hg не превышает 0,00001 масс.%.

3. Разработаны методики качественного и количественного анализа шунлита, определения содержания в нем примесей, отличающиеся хорошей специфичностью и воспроизводимостью.

4. Предложены показатели и установлены их нормы для оценки качества порошка шунлита при его стандартизации. Разработан проект ФСП на порошок шунлита для приготовления суспензии для приема внутрь.

5. Установлено, что порошок шунлита обладает высокой сорбционной способностью по отношению к ряду токсичных органических веществ и ионам тяжелых металлов в условиях in vitro.

6. С помощью молекулярных тест-ферментных систем установлено, что шунлит обладает выраженной антиоксидантной и бактерицидной активностью.