Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Фармакотерапевтическая эффективность растительного средства "Дифитон" при экспериментальном сахарном диабете

На правах рукописи

ЧЕКИНА НАТАЛИЯ АЛЕКСЕЕВНА

ФАРМАКОТЕРАПЕВТИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ

РАСТИТЕЛЬНОГО СРЕДСТВА «ДИФИТОН» ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ САХАРНОМ ДИАБЕТЕ

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

і ноя 2013

Улан-Удэ-2013

005538170

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Бурятский государственный университет» Министерства образования и науки РФ

Научный руководитель:

Чукаев Сергей Александрович - кандидат медицинских наук, доцент

Официальные оппоненты:

Ажунова Татьяна Александровна - доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт общей и экспериментальной биологию) Сибирского отделения Российской академии наук / лаборатория экспериментальной фармакологии, ведущий научный сотрудник

Матыпов Дамби Леонидович - кандидат медицинских наук, Государственное автономное учреждение здравоохранения «Республиканская клиническая больница восстановительного лечения «Центр восточной медицины» / приемно-диагностическое отделение, врач-терапевт

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение дополнительного профессионального образования «Иркутская государственная медицинская академия последипломного образования» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится «28» ноября 2013 года в 15— часов на заседании диссертационного совета ДМ 003.028.02 при Институте общей и экспериментальной биологии СО РАН по адресу: 670047, г. Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, 6.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке Бурятского научного центра СО РАН.

Автореферат разослан «28» октября 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

к.б.н., доцент

В.Б. Хобракова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Сахарный диабет (СД) во всем мире признан одним из наиболее распространенных неинфекционных заболеваний, занимающих четвертое место среди лидирующих причин смертности (Кисляк O.A. и со-авт., 2008; Романцева Т.И., 2008). В связи с ростом численности и средней продолжительности жизни населения, увеличением распространенности ожирения и малоподвижного образа жизни, вследствие урбанизации территорий, количество больных СД ежегодно возрастает (Кудинов В.И. и соавт., 2012). По последним данным Международной диабетической федерации (IDF), число больных СД среди взрослого населения (20-79 лет) в мире к 2030 г. составит 439 миллионов (Shaw J.E. et al., 2010).

СД - тяжелое прогрессирующее заболевание, связанное с развитием как микро-, так и макрососудистых осложнений (Аметов A.C., 2011; Marfella R. et al., 2009), таких как нефропатия, ретинопатия, поражение магистральных сосудов сердца, мозга, нижних конечностей, являющихся причиной ранней инвалидизации и смертности населения (Nathan D.M, 2008). Такой широкий спектр осложнений объясняет столь высокий интерес к проблеме лечения указанного патологического состояния. В настоящее время в клинической практике сахароснижающие препараты представлены несколькими группами, и отличаются друг от друга не только механизмом действия, но и наличием побочных эффектов, что необходимо учитывать при выборе того или иного средства для проведения терапии (Аметов A.C., 2008; Балаболкин М.И., Клебанова Е.М., 2008; Uehara М.Н., 2001). В то же время рядом работ было установлено, что применение фитотерапии в комплексном лечении СД приводит к предупреждению прогрессирования заболевания и развития осложнений (Джафарова Р.Э., 2010; Roglic G., 2005). Растительные средства, как правило, обладают широким спектром фармакологической активности, низкотоксичны, совместимы с синтетическими лекарственными препаратами, что дает возможность одновременного лечения основного и сопутствующего заболевания, стимулируя защитные силы организма (Карлович Т.И., Ильиченко Л.Ю., 2007; Турищев С.Н., 2007; Николаев С.М., 2012). В этой связи актуальной является задача по разработке и внедрению в клиническую практику новых эффективных и безопасных растительных средств, предназначенных для профилактики и лечения сахарного диабета (Корсун В.Ф., 2007; Lee C.S. et al., 2006). Перспективным направлением при создании данных фитосредств является сочетание достижений современной медицинской науки и рационального опыта традиционной медицины, располагающего обширными сведениями об эффективности многокомпонентных лекарственных препаратов при лечении и профилактике заболеваний (Блинова К.Ф., Пименова P.E., 1968; Петров Е.В. и соавт., 2008; Николаев С.М., 2012).

В соответствии с этим, разработано новое многокомпонентное фитосред-ство, условно названное «Дифитон», представляющее собой сумму экстрактивных веществ из 7 видов растительного сырья Байкальского региона: по-

беги черники обыкновенной (Vaccinium myrtillus L.), створки плодов фасоли обыкновенной (Phaseolus vulgaris L.), листья крапивы двудомной (Urtica dioica L.), побеги пятилистника кустарникового (Pentaphylloides fruticosa L. (о) Schwarz), корни и корневища лопуха большого (Arctium lappa L.), одуванчика лекарственного (Taraxacum officinale Wigg.) и девясила высокого {Inula helenium L.).

Целью настоящего исследования явилось определение фармакологической активности и оценка фармакотерапевтической эффективности растительного средства «Дифитон» при экспериментальном сахарном диабете.

Задачи исследования:

• определить основные фармакологические свойства растительного средства «Дифитон»;

• оценить фармакотерапевтическую эффективность «Дифитона» при экспериментальном сахарном диабете;

• выявить основные механизмы антидиабетического влияния растительного средства «Дифитон»;

• сопоставить эффективность исследуемого средства с таковой препарата сравнения — фитосбора «Арфазетин».

Научная новизна. В работе впервые определены основные фармакологические свойства и фармакотерапевтическая эффективность полученного растительного средства «Дифитон» при экспериментальном сахарном диабете. Установлено, что фитосредство относится к группе относительно безвредных лекарственных средств, обладает гипогликемической, противовоспалительной, стресспротективной, гастропротекторной и мембраностабилизи-рующей активностью. Определено, что «Дифитон» обладает выраженной фармакотерапевтической эффективностью при гипергликемических состояниях, улучшая показатели углеводного и липидного обмена, а также ограничивает дистрофические и некротические процессы в поджелудочной железе. На классической модели аллоксанового диабета выявлено гипогликемиче-ское, гиполипидемическое, гепато-, панкрео- и нефропротекторное влияние испытуемого фитосредства. Установлено, что ведущими механизмами антидиабетического действия «Дифитона» являются гипогликемическое влияние, обусловленное присутствием в его составе комплекса биологически активных веществ (БАВ) (инулин, миртилин, фазеоламин и др.), а также его способность ингибировать процессы перекисного окисления липидов, повышать активность антиоксидантной системы организма и стабилизировать структуру биологических мембран. «Дифитон» в изоэффективной дозе проявляет более выраженную фармакотерапевтическую эффективность по сравнению с препаратом сравнения - фитосбором «Арфазетин».

Практическая значимость. Результаты проведенных экспериментальных исследовав ний позволяют рекомендовать растительное средство «Дифитон» для клинических жсгае-дований в качестве безопасного и эффективного средства в комплексной терапии сахарного диабета с целью снижения ржка развитая осложнений, сопутствующих данному заболева-

нию. Материалы данной работы ^пользуются в учебном процессе m кафедре фармакологии, клинической фармакологии и фитотерапии мед ицинского факультета Бурятского государственною университета. На испытуемое средство получено положительное решение от 23.082013 г о выдаче патента «Средство, обладэющэе шпогаиксмической и прсггивовосга-лигельной акгавнсхлыо» по заявке №2012130746/15(048250).

Основные положения, выносимые на занцпу.

1. Комплексное растительное средство «Дифитон» обладает гипогли-кемической, противовоспалительной, стресспротективной, гастропротектор-ной и мембраностабилизирующей активностью.

2. Курсовое введение «Дифитона» на фоне адреналиновой гипергликемии сопровождается выраженным гипогликемическим действием; при аллокса-новом сахарном диабете проявляет выраженную фармакотерапевтическую эффективность, нормализуя показатели углеводного и липидного обмена, ограничивая дистрофические и некротические процессы в поджелудочной железе, оказывая панкрео-, гепато- и нефропротекторное влияние.

3. Ведущими механизмами антидиабетического действия «Дифитона» являются гипогликемическое влияние, а также его способность ингибиро-вать процессы перекисного окисления липидов, повышать активность анти-оксидантной системы организма и стабилизировать структуру биологических мембран.

Апробация материалов диссертации. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на: III Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Развитие традиционной медицины в России» (Улан-Удэ, 2010); International scientific conference «Current Situation and future trends of drug research and development from natural sources» (Ulaanbaatar, 2010); I Всероссийской научно-практической конференции «Биотехнология в интересах экологии и экономики Сибири и Дальнего Востока» (Улан-Удэ, 2010); Международной научной конференции «Новые задачи современной медицины» (Пермь, 2012); II Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые и специалисты» (Красноярск, 2012); II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Биотехнология в интересах экологии и экономики Сибири и Дальнего Востока» (Улан-Удэ, 2012); The International Conference «New trends of traditional medicine and nursing» (Darkhan, 2012); VI International scientific conference «Traditional medicine: ways of integration with modern health саге» (Улан-Удэ, 2013). Данная работа выполнена в соответствии с программой № 21.1.3 «Разработка лекарственных и профилактических препаратов для медицины. Фундаментальные основы и реализация», утвержденным Президиумом СО РАН.

Публикации. По материалам диссертационного исследования опубликовано 13 научных работ, из них 3 в периодических изданиях, рекомендованных ВАК МО и науки РФ.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 111 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, глав с изложением результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, заключения и списка литературы, включающего 234 источника, из которых 61 - на иностранном языке. Работа иллюстрирована 12 таблицами, 14 рисунками, включая 5 микрофотографий.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальная работа выполнена на 365 крысах обоего пола линии Wistar с исходной массой 180-220 г. Условия содержания животных соответствовали «Правилам лабораторной практики» (GLP) и Приказу МЗ РФ № 708Н от 23.08.2010 г. «Об утверждении правил лабораторной практики». Перед началом экспериментов животные, отвечающие критериям включения в эксперимент, распределялись на группы с учетом пола, возраста, массы и принципа рандомизации. Экспериментальную работу осуществляли в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу МЗ СССР №755 от 12.08.77 г.), «Правилами, принятыми в Европейской конвенции по защите позвоночных животных» (Страсбург, 1986). Протокол исследования согласован с этической комиссией БГУ (протокол № 5 от 03.02.2010 г.). Эвтаназию животных осуществляли методом мгновенной декапитащш под легким эфирным наркозом.

В работе использовали новое многокомпонентное растительное средство, условно названное «Дифитон», представляющее собой сухой экстракт из 7 видов растительного сырья Байкальского региона: побеги V. myrtillus, створки P. vulgaris, листья U. dioica, корни и корневища A. lappa, побеги P. fruti-cosa, корни Т. officinale и корни и корневища I. helenium, взятых в соотношении 4:4:3:3:2:2:2 массовых частей, полученный в лаборатории химико-фармацевтических исследований ИОЭБ СО РАН путем последовательной экстракции (45%, 40% и 35% спирт этиловый и вода) с последующей вакуумной сушкой.

Указанное средство вводили животным опытных групп внутрижелудочно в дозах 100, 300 и 500 мг/кг в форме водного раствора в объеме 10 мл/кг массы. В качестве препарата сравнения использовали официнальный сбор «Ар-фазетин» (Соколов С.Я, 2006), состоящий из побегов черники обыкновенной (Vaccinium myrtillus L.) (20,0), створок плодов фасоли обыкновенной (Phaseolus vulgaris L.) (20,0), корней аралии маньчжурской (Aralia manshurica Rupr. et Maxim) или заманихи высокой (Echinopanax elatus Nacai) (15,0), травы хвоща полевого (Equisetum arvense L.) (10,0) и зверобоя продырявленного (Hypericum perforatum L.) (10,0), цветков ромашки аптечной (Matricaria recutita L.) (10,0), плодов шиповника (Rosa canina L.) (15,0).

«Арфазетин» в форме настоя, приготовленного по требованиям ГФ XI

издания (1990), вводили животным в объеме 10 мл/кг по схеме, аналогичной исследуемому фитосредству. При оценке противовоспалительной активности «Дифитона» в качестве препарата сравнения использовали калефлон в изоэффективной дозе 100 мг/кг. Во всех экспериментах животные интактной и контрольной групп получали воду очищенную в эквивалентном объеме по аналогичной схеме.

Определение острой токсичности «Дифитона» проводили согласно «Руководству по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (2005). Класс токсичности определяли по классификации К.К. Сидорова (1973).

Гипогликемическое действие исследуемого растительного средства «Ди-фитон» при алиментарной гипергликемии оценивали в соответствии с методическими указаниями (Руководство..., 2005) по содержанию глюкозы в крови с помощью глюкометра «Accu-chec Activ» фирмы «Roche» (Швейцария), натощак через 1 час после введения исследуемого средства и после сахарной нагрузки (4 г/кг); содержание сахара в крови определяли через 30, 60, 90 и 120 мин после введения глюкозы.

Противовоспалительную активность исследуемого фитосредства оценивали в условиях моделирования асептического воспаления согласно Методическим рекомендациям (Руководство..., 2005). Экссудативную фазу воспалительной реакции вызывали субплан-арным введением в заднюю правую лапку крысы 0,1 мл 3% водного раствора формалина (Стрельников Ю.Е., 1960); альтеративную фазу - путем подкожного введения в область спинки 0,5 мл 9% раствора уксусной кислоты (Ойвин И.А., Шетель С.Л., 1988). Влияние фитосредства на пролиферативную фазу воспаления изучали на модели «ватной гранулемы» (Тринус Ф.П., и соавт., 1987). Асептический перитонит вызывали внутрибрюшинным введением крысам 1 мл 0,2% раствора серебра нитрата. Критерием развития и выраженности перитонита являлись количество жидкости в брюшной полости и процент дегранулирован-ных тучных клеток в брыжейке крыс (Александров П.Н. и др., 1986).

Стресспротективное действие «Дифитона» исследовали на модели иммо-билизационного стресса, путем фиксации животных на спине в течение 24 часов. Для оценки антистрессорной активности определяли выраженность триады Селье: гипертрофию надпочечников, инволюцию иммунокомпетент-ных органов и появление деструктивных повреждений в слизистой оболочке желудка. Для каждого вида повреждений подсчитывали «индекс Паулса» (Калуев A.B., 1998).

Для исследования антиоксидантных свойств фитосредства использовали ABTS-тест с использованием модельной системы генерации свободных радикалов in vitro (Re R., 1999). Численную оценку антиоксидантной активности (АОА) «Дифитона» осуществляли путем определения эффективной действующей концентрации, снижающей концентрацию свободных радикалов в реакционной среде в 2,0 раза.

Мембраностабилизирующую активность фитоэкстракта определяли in vitro по степени торможения перекисного и осмотического гемолиза эритроцитов донорской крови (Ковалев И.Е. и соавт., 1986).

Для исследования фармакотерапевтической эффективности комплексного растительного средства «Дифитон» воспроизводили адреналиновую гипергликемию и аллоксановый сахарный диабет.

Экспериментальную гипергликемию вызывали однократным внутри-брюшинным введением 0,1% раствора адреналина гидрохлорида в дозе 1,5 мг/кг животным, голодавшим в течение 12-15 часов до инъекции гормонального препарата (Гацура В.В., Саратиков A.C., 1977; Баранов В.Г., 1983). Оценку влияния исследуемого фитосредства на уровень глюкозы проводили через 30 мин после введения адреналина с помощью глюкометра «Accu-chec Activ».

Экспериментальный сахарный диабет у белых крыс воспроизводили путем однократного внутрибрюшинного введения аллоксана моногидрата («Sigma-Aldrich», США) в дозе 55 мг/кг. Исследования проводили на 3 и 7 сутки (Баранов В.Г., 1983; Полторак В.В., Покрышкин В.И., 1986).

Для оценки гиполипидемического влияния «Дифитона» в сыворотке крови определяли уровень холестерина (ХС), триацилглицеридов (ТГ), липопро-теидов низкой плотности (ЛПНП), липопротеидов высокой плотности (ЛПВП), энзиматическим фотометрическим методом на биохимическом анализаторе «Sapphire-400» с использованием реактивов фирмы «Chronolab» (Швейцария). Степень панкреозащитного влияния фитосредства оценивали по динамике изменения активности панкреатического фермента - а-амилазы в сыворотке крови энзиматическим кинетическим методом на автоматическом биохимическом анализаторе «Sapphire-400» (Япония) с использованием реактивов фирмы «Chronolab» (Швейцария).

Функциональное состояние печени и почек оценивали по биохимическим показателям сыворотки крови: активности аспартатаминотрансферазы (АсАТ), аланинаминотрансферазы (АлАТ), щелочной фосфатазы (ЩФ), уровню общего белка, а также определяли показатели мочевины и креатини-на на биохимическом анализаторе «Sapphire-400», с использованием стандартного набора реактивов (Меньшиков В.В. и соавт., 1987; Камышников B.C., 2000; Кушкин A.A., 2012).

Интенсивность процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) и активность антиоксидантной системы организма оценивали соответственно по содержанию ТБК-реактивных продуктов (Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г., 1977) и активности каталазы в сыворотке крови (Королюк М.А. и соавт., 1988).

Для патоморфологических исследований поджелудочную железу фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, с последующей окраской гематоксилин-эозином (Микроскопическая..., 1996). На гистологических препаратах с помощью компьютерной программы «Motic Images 2000» оце-

нивали структуру ткани поджелудочной железы, определяли площадь островков Лангерганса, общее количество и плотность клеток в островках.

Полученные результаты обработаны с использованием вариативной статистики. Результаты для малой выборки с определением средней величины (М) и ошибки (ш), выражали в виде М ± т. При оценке уровня статистической значимости полученных результатов использовали непараметрический U-критерий Манна-Уитни. Различия между экспериментальными группами по исследуемым параметрам считали значимыми при стандартном для медико-биологических экспериментов уровне р< 0,05 (значимость 95%) (Серги-енко В.И., Бондарева И.Б., 2006).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Исследование спектра фармакологической активности растительного средства «Дифитон»

При оценке острой токсичности «Дифитона» в опытах на белых крысах линии Wistar установлено, что при внутрижелудочном введении сухого экстракта гибели животных при максимально возможном разведении средства не наблюдалось. При внутрибрюшинном введении животным сухого экстракта DL50 составила 7062 мг/кг (7062±722,3). Таким образом, полученные данные позволяют отнести испытуемое средство к относительно безвредным средствам по классификации К.К. Сидорова (1973).

При исследовании гипогликемического действия фитоэкстракта на базовый уровень глюкозы в крови интактных белых крыс установлено, что «Дифитон» в экспериментально-терапевтических дозах не оказывает значимого влияния на указанный уровень глюкозы в крови животных.

Данные, представленные в таблице 1, свидетельствуют, что введение животным «Дифитона» в дозе 300 мг/кг и калефлона в дозе 100 мг/кг статистически значимо угнетает формалиновый отек по сравнению с контрольным уровнем на 39% и 22% соответственно, что указывает на наличие у исследуемых средств антиэкссудативного действия.

Таблица 1 - Влияние «Дифитона» и калефлона на степень экссудации при «формалиновом» отеке у белых крыс___

Группы животных Д V, мл % угнетения отека

Контрольная (Н20), п=7 0,51±0,05 -

Опытная 1 («Дифитон»), п=7 0,31±0,01* 39

Опытная 2 (калефлон), п=7 0,40±0,02* 22

Примечание. Д V - разность между объемами отечной и неотечной лапок белых крыс; * - здесь и далее значения, значимо отличающиеся от данных животных контрольной группы при р < 0,05; п - количество животных в группе.

Антиальтеративное действие «Дифитона» оценивали, используя планиметрический метод, по степени развития некроза и регенерации тканей. Выявлено, что у животных, получавших исследуемый фитоэкстракт в дозе 300 мг/кг, площадь деструкции на 7, 14 и 21 сутки наблюдения была ниже таковых показателей крыс контрольной группы на 23%, 40% и 46%; у крыс, получавших калефлон, - на 19%, 30% и 21% соответственно (рис. 1). При моделировании пролиферативной стадии воспалительного процесса установлено, что введение белым крысам «Дифитона» в дозе 300 мг/кг не оказывало существенного влияния на процессы пролиферации.

Выраженное противовоспалительное действие фитоэкстракта выявлено на модели острого асептического перитонита: объем внутрибрюшинной жидкости, а также количество дегранулированных тучных клеток было в среднем в 1,9 раза ниже указанных показателей животных контрольной группы (табл. 2).

Рис. 1. Влияние «Дифитона» и ка-лефлона на процессы альтерации у белых крыс.

Таблица 2 - Влияние «Дифитона» на объем внутрибрюшинной жидкости и количество дегранулированных тучных клеток у белых крыс при асептическом перитоните_

Группы животных Объем внутрибрюшинной жидкости, мл Количество дегранулированных тучных клеток, %

Интактная (Н20), п=6 0,21 ±0,01 5,4±0,20

Контрольная (А£Ы03+ Н20), п=7 2,40±0,35 71,0±5,01

Опытная (А§Ш3 + «Дифитон»), п=7 0,65±0,40* 36,8±3,36*

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о наличии у комплексного средства «Дифитон» выраженного противовоспалительного дей-

ствия, обусловленного наличием в нем широкого спектра биологически активных веществ: флавоноидов, каротиноидов, полисахаридов и др., для которых характерно антиальтеративное и антиэкссудативное действие (Лагерь A.A., 2002; Телятьев В.В., 2004).

Исследование стресспротективного действия «Дифитона» на фоне суточной иммобилизации животных показало, что у крыс опытной группы относительная масса надпочечников снижается на 25%, относительные массы тимуса и селезенки повышаются на 22% и 21 % по сравнению с аналогичными показателями животных контрольной группы. Индекс Паулса для точечных кровоизлияний у животных, получавших исследуемый фитоэкстракт в дозе 300 мг/кг, был ниже данного показателя в контроле в 2,5 раза, для эрозий - в 3,8 раза. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что исследуемое фитосредство оказывает значимое протекторное действие на слизистую ЖКТ, предотвращает развитие стресс-индуцированных повреждений в надпочечниках, тимусе и селезенке животных на фоне иммобили-зационного стресса. Указанное влияние обусловлено входящими в его состав U. dioica, A. lappa, 1. helenium, обладающих стресспротективной активностью и способностью стимулировать грануляцию и эпителизацию поврежденных тканей (Телятьев В.В., 2004; Рычкова Ю.В., 2008).

Фармакотерапевтическая эффективность растительного средства «Дифитон» при гипергликемии и сахарном диабете

В серии экспериментов, посвященных оценке сахароснижающего действия фитосредства с использованием глюкозотолерантного теста, выявлено, что после сахарной нагрузки содержание глюкозы в сыворотке крови животных контрольной группы повышалось в среднем в 1,5 раза по сравнению с показателями натощак, что соответствует физиологической норме (рис. 2).

Рис. 2. Влияние

-♦-контроль «Дифитона» на

уровень глюко-

"Дифитон" зы в крови бе-

100мг/кг лых крыс при -ir-"Дифитон" глюкозотоле-

0

300 мг/кг рантном тесте, —в—"Дифитон"

О 30 60 90 120 500 мг/кг

время, МИН

У животных, получавших «Дифитон» в форме экстракта в дозах 100, 300

и 500 мг/кг, содержание глюкозы в сыворотке крови после сахарной нагрузки было ниже аналогичного показателя в контроле на 8%; 16%; 13% соответственно, что свидетельствует о наличии у испытуемого средства слабо выраженного сахароснижающего эффекта при алиментарной гипергликемии. Таким образом, анализ полученных данных, а также отсутствие влияния исследуемого фитосредства на базовый уровень глюкозы в крови опытных животных свидетельствует о том, что «Дифитон» действует подобно синтетическим противодиабетическим препаратам (Шарофова М.У., 2007), проявляя гипогликемическое действие лишь при наличии соответствующих нарушений со стороны функции поджелудочной железы.

Известно, что стресс провоцирует возникновение эмоциональной гипергликемии, развивающейся в результате воздействия факторов раздражения через гипоталамические центры и симпатическую нервную систему на надпочечники, стимулируя выброс в кровь большого количества адреналина (Адо А.Д., Ишимова JI.M., 1980). Исследование гипогликемического действия «Дифитона» при адреналиновой гипергликемии показало, что введение животным на фоне инъекции адреналина испытуемого средства в дозе 100 мг/кг не оказывало значимого влияния на содержание глюкозы в крови белых крыс по отношению к контролю. При этом сухой экстракт в дозах 300 и 500 мг/кг проявлял выраженное гипогликемическое действие, снижая данный показатель на 34% и 31% соответственно по сравнению с показателем животных контрольной группы.

В следующей серии экспериментов оценивали фармакотерапевтическую эффективность «Дифитона» в условиях экспериментального аллоксанового диабета. Выявлено, что на фоне введения крысам сухого экстракта в дозах 100, 300 и 500 мг/кг уровень глюкозы в крови на 3 сутки эксперимента снижался по сравнению с таковым показателем контрольных животных на 33%, 47% и 43% соответственно (табл. 3). На 7 сутки наблюдений максимальное снижение указанного показателя (на 31%) по отношению к контролю отмечалось в опытной группе животных, получавших экстракт «Дифитон» в дозе 300 мг/кг. Таким образом, на основании полученных результатов, а также данных литературы (Арьяева М.М., 1998; Занабадарова З.М., 2001), правомерно предположить, что данный эффект «Дифитона» объясняется наличием в нем компонентов (V. myrtillus, P. vulgaris, Т. officinale), включающих ин-сулиноподобные вещества - неомиртиллин, фазеоламин, инулин (Петков В., 1988; Аметов A.C., 2011), способные понижать содержание сахара в крови (Корсун В.Ф., 2007).

Выявлено, что введение аллоксана белым крысам вызывает повреждение поджелудочной железы, о чем свидетельствовало четырехкратное повышение а-амилазы в сыворотке крови животных контрольной группы на 3 сутки эксперимента по сравнению с таковой интактных животных (рис. 3). Экстракт «Дифитон» в дозах 100, 300 и 500 мг/кг оказывал панкреозащитное влияние, снижая в указанные сроки активность а-амилазы в сыворотке крови

белых крыс по отношению к контролю на 12%, 27% и 16% соответственно, «Арфазетин» - в среднем на 7%. К 7 суткам наблюдения курсовое введение крысам экстракта в исследуемых дозах снижало активность а-амилазы на 25%, 30% и 36% соответственно по сравнению с данными крыс контрольной группы (рис. 3).

Таблица 3 - Влияние «Дифитона» и «Арфазетина» на содержание глюкозы в крови белы;; крыс при аллоксановом диабете__

Группы животных Концентрация глюкозы ммолъ/л

3 сутки 7 сутки

Интактная (Н20), п=6 5,8±0,10 4,8±0,07

Контрольная (аллоксан + Н20), п=7 15,9±0,70 7,2±0,14

Опытная 1 (аллоксан + «Дифитон», 100 мг/кг), п=7 10,6±0,62* 5,3±0,51

Опытная 2 (аллоксан + «Дифитон», 300 мг/кг), п=7 9,0±0,82* 5,0±0,40*

Опытная 3 (аллоксан + «Дифитон», 500 мг/кг), п=7 8,5±0,77* 5,8±0,19*

Опытная 4 (аллоксан + «Арфазетин», 10 мл/кг), п=7 11,3*2,11* 5,4±0,10*

Способность «Дифитона» проявлять панкреопротекторное влияние, обусловлена входящими в его состав экстрактами фасоли и черники обыкновенной, ингибирующая активность которых в отношении а-амилазы сопоставима с таковой у акарбозы (Аметов A.C., 2011; Melzig M.F., Funke L., 2007).

3000 2500 2000 |l500 1000 500 0

у////ш£> сутки —♦— 7 сутки

Рис. 3. Влияние «Дифитона» и «Арфазетина» на активность а-амилазы в сыворотке крови белых крыс при аллоксановом диабете: 1 - Интакт (Н20); 2 - Контроль (аллок-сан+Н20); 3 - Опыт 1 (аллок-сан + «Дифитон», 100 мг/кг); 4 - Опыт 2 (аллоксан + «Дифитон», 300 мг/кг); 5 - Опыт 3 (аллоксан + «Дифитон», 500 мг/кг); 6 - Опыт 4 (аллоксан + «Арфазетин», 10 мл/кг).

При оценке гиполишидемического влияния «Дифитона» на модели аллок-санового диабета установлено, что введение животным экстракта в дозе 300 мг/кг сопровождается нормализацией липидного обмена к 7 суткам наблюдений, проявляющейся значительным снижением в сыворотке крови животных уровня ХС (в 2,3 раза), ТГ (в 1,8 раза) и ЛПНП (в 2,5 раза), на фоне повышения содержания ЛПВП (в 3,0 раза) по отношению к контролю. Препа-

рат сравнения «Арфазетин» также оказывал позитивное влияние на липид-ный обмен, но в менее выраженной степени по сравнению с испытуемым средством (рис. 4).

Рис. 4. Влияние «Дифитона» и «Арфазетина» на уровень липидов в сыворотке крови белых крыс при ал-локсановом диабете (7 сутки): 1 - Интакт (Н20); 2 - Контроль (аллоксан+Н20); 3 -Опыт 1 (аллоксан + «Дифитон»,300 мг/кг); 4 - Опыт 2 (аллоксан + «Арфазетин» 10 мл/кг)

При исследовании протекторного влияния фитосредства на функциональное состояние печени лабораторных животных в условиях аллоксаново-го диабета установлено, что на 3 сутки эксперимента в сыворотке крови крыс контрольной группы отмечалось повышение активности ферментов: АсАТ -в 1,6 раза, АлАТ - в 3,2 раза, ЩФ - в 4,4 раза по сравнению с показателями интактных животных. На фоне введения животным «Дифитона» в дозах 300 и 500 мг/кг в указанные сроки наблюдений активность АсАТ снижалась на 27% и 17 %, АлАТ - на 38% и 46%, ЩФ - на 57% и 54% соответственно по сравнению с показателями животных контрольной группы. Значимое повышение содержания общего белка в сыворотке крови лабораторных животных по отношению к контролю наблюдалось во всех опытных группах и составило в среднем 35%-57%. На 7 сутки эксперимента в опытных группах животных, получавших фитоэкстракт в дозе 100 мг/кг, активность АсАТ и АлАТ снижалась на 20% и 24% соответственно по сравнению с данными контрольных животных. Использование «Дифитона» в дозах 300 и 500 мг/кг понижало активность АсАТ на 17% и 14%, АлАТ - на 52% и 50%, ЩФ - на 22% и 44% соответственно по отношению к контролю. Также установлено, что введение «Дифитона» сопровождалось уменьшением степени гипопротеинемии; наиболее выраженное повышение содержания общего белка в сыворотке крови наблюдалось у крыс, получавших фитоэкстракт в дозе 300 мг/кг, и составляло 27% от такового показателя контрольных животных. «Арфазетин» также способствовал снижению в сыворотке крови активности АсАТ (на 27%), АлАТ (на 8%) и ЩФ (на 17%), а также повышению уровня общего белка (на 14%) по отношению к показателям контрольных животных, но в

ШХС ШТГ ЕЭЛПВП ИЛПНП

менее выраженной степени по сравнению с «Дифитоном». Таким образом, испытуемое средство «Дифитон» подавляет проявления синдрома цитолиза и нарушение белоксинтезирующей функции печени при экспериментальном СД, что, вероятно, является, одним из факторов, реализующих его гиполипи-демический эффект (Лапинская Е.С., Копытько Я.Ф., 2008; Биличенко С.В., 2010).

Как известно, СД сопровождается прогрессирующим нарушением функции почек, приводящим к развитию хронической почечной недостаточности (Балаболкин М.И. и соавт., 2005). В связи с этим, проведены экспериментальные исследования по оценке нефропротекторных свойств комплексного фитосредства «Дифитон» (табл. 4).

Таблица 4 - Влияние «Дифитона» и «Арфазетина» на показатели азотистого обмена при аллоксановом диабете у белых крыс _

Группы животных Концентрация мочевины ммоль/л Концентрация креатинина, ммоль/л

3 сутки 7 сутки 3 сутки 7 сутки

Интактная (Н20), п=6 5,1±0,35 4,9±0,22 50,3±0,17 45,4± 1,03

Контрольная (аллоксан + Н20), п=7 7,5±0,15 7,2±0,34 72,0±3,24 63,8±3,12

Опытная 1 (аллоксан + «Дифитон», 100 мг/кг), п=7 7,0±0,54 б,5±0,18 57,6±2,29* 52,0±2,74'

Опытная 2 (аллоксан + «Дифитон», 300 мг/кг), п=7 6,8±0,23* 5,8±0,26* 54,9±3,09* 45,6±3,01"

Опытная 3 (аллоксан + «Дифитон», 500 мг/кг), п=7 6,5±0,51* 5,8±0,53* 57,4±2,58" 47,1±3,36*

Опытная 4 (аллоксан + «Ар-фазетин», 10 мл/кг), п=7 7,3±0,65 6,6±0,29 67,6±2,36 54,3±2,42"

Как следует из данных, представленных в таблице 4, курсовое введение животным опытных групп фитосредства приводило к снижению в сыворотке крови на 7 сутки наблюдений концентрации мочевины в среднем на 10-19% и креатинина - на 16-29% по сравнению с показателями животных контрольной пэуппы, что свидетельствует о наличии у испытуемого средства способности оказывать позитивное влияние на функциональное состояние почек, проявляя при этом умеренно выраженную нефропротекторную активность. Результаты патоморфологических исследований показали, что на 3 сутки эксперимента в поджелудочной железе животных контрольной группы наблюдались выраженные структурные изменения эндокринной части, характеризующиеся увеличением площади островков на 13% и выраженной (в 2,0 раза) пролиферацией клеток по сравнению с данными животных интакт-ной группы (рис. 5).

Рис. 5. Влияние «Дифито-на» и «Арфазетина» на плотность клеток в островке Лангерганса поджелудочной железы: 1 - Интакт (Н20); 2 - Контроль (аллок-сан + Н20); 3 - Опыт 1 (ал-локсан+ «Дифитон», 300 мг/кг); 4 - Опыт 2 (аллоксан + «Арфазетин» 10 мл/кг).

Увеличение плотности клеток в островках Лангерганса на фоне аллокса-нового диабета согласуется с данными литературы и обусловлено повышением глюкагонпродуцирующих а-клеток на первой неделе развития СД (Алеева Г.Н., 2002). На фоне введения животным исследуемого фитоэкс-тракта в дозе 300 мг/кг и препарата сравнения - «Арфазетина» общее количество клеток в островках поджелудочной железы было соответственно на 29% и 26% ниже такового показателя животных контрольной группы.

При оценке влияния «Дифитона» на процессы ПОЛ в условиях экспериментального СД, установлено, что на 3 и 7 сутки наблюдений на фоне введения животным экстракта в дозе 100 мг/кг концентрация ТБК-реактивных продуктов понижалась в среднем на 51% (табл. 5).

Таблица 5 - Влияние Дифитона» и «Арфазетина» на содержание ТБК-реактивных продуктов и активность каталазы в сыворотке крови белых крыс при аллоксановом диабете ___

Группы животных МДА, мкмоль/мл Каталаза, мкат/л

3 сутки 7 сутки 3 сутки 7 сутки

Интактная (Н20), п=6 3,4±0,81 4,3±0,53 1,6±0,10 1,7±0,12

Контрольная (аллоксан + Н20),п=7 15,5±2,97 13,1±0,89 0,7±0,09 1,(Ы:0,03

Опытная 1 (аллоксан + «Дифитон», 100 мг/кг), п=7 7,5±0,49* 6,5±0,97* 1,3±0,18* 1,1±0,08

Опытная 2 (аллоксан + «Дифитон», 300 мг/кг), п=7 6,5±0,95* 4,1±0,26* 1,5±0,26* 1,6±0,09*

Опытная 3 (аллоксан + «Дифитон», 500 мг/кг), п=7 5,5±0,86* 4,9±1,69* 1,3±0,29 1,2±0,12

Опытная 4 (аллоксан + «Арфазетин», 10 мл/кг), п=7 7,6±0,45* 5,5±1,50" 1,0±0,15 1,1 ±0,02*

В дозе 500 мг/кг - на 64%, в дозе 300 мг/кг - соответственно срокам на 58% и 69%. Фитосбор «Арфазетин» понижал указанный показатель по отношению к контролю на 51% и 58% соответственно. Снижение уровня продуктов ПОЛ сопровождалось достоверным увеличением активности катала-зы: максимальная активация фермента в указанные сроки наблюдалась у животных, получавших «Дифитон» в дозе 300 мг/кг, и превышала данный показатель контрольных животных соответственно в 2,1 и 1,6 раза.

Установленное антиоксидантное влияние «Дифитона» при аллоксановом СД подтверждается данными, полученными в модельных системах (in vitro). Так, с использованием ABTS-теста показано, что «Дифитон» проявляет выраженные антиоксидантные свойства, о чем свидетельствует монотонное снижение концентрации свободных радикалов в модельной реакционной среде при повышении концентрации фармакологического агента от 0,01 мг/мл до 1,0 мг/мл (рис. 6).

Рис. 6. Оценка антиоксидантных свойств «Дифитона» с помощью ABTS-теста.

Концентрация "Дифагтона", аг/мл

В диапазоне концентраций 0,01-0,1 мг/мл фитоэкстракт снижает величину регистрируемого параметра в среднем на 19-21% по сравнению с уровнем контрольных значений, что можно оценить, как эффект умеренной степени выраженности. Дальнейшее повышение содержания тестируемого агента (С=0,3-1,0 мг/мл) уменьшает величину экстинкции реакционной среды в среднем на 33-68%, что соответствует проявлению выраженного антиоксидантного эффекта. Мембраностабилизирующую активность «Дифитона» в реакциях осмотического и перекисного гемолиза исследовали в концентрациях от 0,00001 до 1,0 мг/мл. Полученные данные свидетельствуют о том, что фитоэкстракт в концентрации 1,0 мг/мл ингибирует перекисный гемолиз на 73%, осмотический гемолиз - на 59%. Установлено, что 1С50при перекис-ном гемолизе соответствует 9,0 мкг/мл, а при осмотическом гемолизе - 3,0 мкг/мл. Антиоксидантное и мембраностабилизирующее действие «Дифитона» обусловлено присутствием в составе фитоэкстракта комплекса природных соединений, обладающих соответствующими свойствами, прежде всего,

полифенолов A. lappa, I. helenium (Санин И.JI., 2012) и витаминов антиокси-дантной группы U. dioica (Лапинская Е.С., Копытько Я.Ф., 2008).

Таким образом, растительное средство «Дифитон» в форме экстракта на фоне аллоксанового диабета проявляет выраженную фармакотерапевтиче-скую эффективность, нормализуя углеводный и липидный обмен, ограничивая структурные изменения в эндокринной ткани поджелудочной железы, оказывая панкрео-, гепато- и нефропротекторное влияние, ингибируя процессы ПОЛ и повышая активность антиоксидантной системы организма. При этом показано, что «Дифитон» в изоэффективной дозе обладает наиболее выраженной фармакотерапевтической эффективностью по сравнению с препаратом сравнения - «Арфазетином».

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенных фармакологических исследований по изучению спектра активности и фармакотерапевтической эффективности комплексного растительного средства «Дифитон» установлено, что испытуемое фитосредство, состоящее из 7 видов растительного сырья Байкальского региона, относится к группе относительно безвредных веществ. Фитоэкстракт обладает гипогликемической, выраженной противовоспалительной активностью, наиболее значимо подавляя альтеративную и экссудативную стадии воспалительной реакции. Наряду с этим, «Дифитон» оказывает антистрес-сорное действие, препятствуя развитию стресс-индуцированных повреждений в надпочечниках, тимусе и селезенке животных, а также проявляя гас-тропротекторную активность.

Оценка фармакотерапевтической эффективности исследуемого фитоэкс-тракта в условиях адреналиновой гипергликемии, а также экспериментального СД продемонстрировала наличие у него выраженной гипогликемической активности. Помимо благоприятного влияния на углеводный обмен, «Дифитон» уменьшает выраженность дислипидемических расстройств, снижая содержание ХС, ТГ и ЛПНП, а также повышая уровень ЛПВП в сыворотке крови животных на фоне аллоксанового диабета. Установлено панкре-опротекторное влияние «Дифитона», характеризующееся его способностью восстанавливать внешнесекреторную функцию поджелудочной железы, снижая активность а-амилазы и ограничивая структурные изменения в поджелудочной железе. О наличии у «Дифитона» гепатопротекгорного влияния свидетельствует его выраженное позитивное действие в отношении снижения активности ферментов (АлСТ, АсАТ и ЩФ) и повышения уровня общего белка в сыворотке крови лабораторных животных. Установлено, что «Дифитон» значимо снижает уровень мочевины и креатинина в сыворотке крови, уменьшая нефротоксическое действие аллоксана и демонстрируя, тем самым, нефропротекторное влияние. Учитывая, что в патогенезе полиорганной патологии при сахарном диабете значимая роль принадлежит активации процессов липопероксидации, было установлено, что «Дифитон» в иссле-

дуемых дозах подавляет ПОЛ и обладает высокой антиоксидантной активностью, достоверно понижая концентрацию ТБК-реактивных продуктов и повышая активность каталазы в сыворотке крови до уровня показателей ин-тактных животных. Одним из важных аспектов протекторного влияния «Ди-фитона» в отношении поджелудочной железы, печени и почек при сахарном диабете является наличие у данного фитоэкстракта базисной мембраноста-билизирующей активности, реализация которой связана с антиоксидантным действием комплекса фенольных соединений, входящих в состав исследуемого фитосредства.

Установлено, что ведущими механизмами антидиабетического действия «Дифитона» являются гипогликемическое влияние, обусловленное присутствием в его составе комплекса БАВ (инулин, неомиртиллин, фазеоламин и др.), обладающих соответствующим действием, а также его способность ин-гибировать процессы перекисного окисления липидов, повышать активность антиоксидантной системы организма и стабилизировать структуру биологических мембран.

ВЫВОДЫ

]. Комплексное растительное средство «Дифитон» обладает гипоглике-мической, противовоспалительной, стресспротективной, гастропротекторной и мембраностабилизирующей активностью.

2. Курсовое введение «Дифитона» на фоне адреналиновой гипергликемии сопровождается выраженным гипогликемическим действием; при ашюксановом сахарном диабете «Дифитон» проявляет выраженную фармакотерапевтиче-скую эффективность, нормализуя показатели углеводного и липидного обмена, ограничивая дистрофические и некротические процессы в поджелудочной железе, оказывая панкрео-, гепато- и нефропротекторное влияние.

3. Ведущими механизмами антидиабетического действия «Дифитона» являются гипогликемическое влияние, а также его способность ингибировать процессы перекисного окисления липидов, повышать активность антиоксидантной системы организма и стабилизировать структуру биологических мембран.

4. «Дифитон» в изоэффективной дозе проявляет более выраженную фарма-котерапевтическую эффективность по сравнению с препаратом сравнения — фитосбором «Арфазетин».

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Чекина H.A. Сахарный диабет возможности фармакотерапии с использованием средств растительного происхождения / H.A. Чекина, С.А. Чукаев, С.М. Николаев // Вестник Бурятского государственного университета. Серия: медицина. - 2010. - Выпуск 12. - С. 71-78.

2. Чекина H.A. Фармакологическая эффективность пятилистника кустарникового в профилактике и лечении сахарного диабета / H.A. Чекина,

СЛ. Чукаев, В .Б. Хобракова // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. - 2010. - № 3(73). - С. 379-382.

3. Чекина H.A. Оценка антиоксндантной активности нового комплексного растительного противодиабетического средства / H.A. Чекина, С.А. Чукаев, С.Ю. Хайхадаева // Мат-лы III Всероссийской конф. «Развитие традиционной медицины в России». - Улан-Удэ, 2010. - С. 318-321.

4. Chekina N.A. Estimation of antioxidant activity of a new complex plant antidiabetic remedy / N.A. Chekina, S.A. Chukaev // Abstracts of International scientific conference «Current situation and future trends of drug research and development from natural sources». - Ulaanbaatar, 2010. - P. 50-51.

5. Чекина H.A. Флавоноиды в лечении сахарного диабета / H.A. Чекина // Молодой ученый. - 2010. - № 6(17). - С. 369-373.

6. Чекина H.A. Разработка новогс комплексного растительного средства из флоры Байкальского регаона / H.A. Чекина, В.А. Козин, Г.Г. Николаева, С.А. Чукаев // Мат-лы Всероссийской научно-практ. конф. «Биотехнология в интересах экологии и экономики Сибири и Дальнего Востока». - Улан-Удэ, 2010. - С. 66-68.

7. Чекина H.A. Перспективы применения многокомпонентного сбора из флоры Байкальского региона для лечения и профилактики сахарного диабета / H.A. Чекина // Мат-лы Международной науч. конф. «Новые задачи современной медицины». — Пермь, 2012. - С. 118-120.

8. Чекина H.A. Растительные антиоксиданты в профилактике и лечении сахарного диабета / H.A. Чекина, И.В. Насникова // Мат-лы II Всероссийской научно-практ. конф. «Молодые ученые и специалисты». - Красноярск, 2012.-С. 124-126.

9. Чекина H.A. Исследование безопасности экстракта сухого из флоры Байкальской Сибири / H.A. Чекина, В.А. Козин // Мат-лы И Всероссийской научно-практ. конф. (с международным участием) «Биотехнология в интересах экологии и экономики Сибири и Дгільнего Востока». - Улан-Удэ, 2012. -С. 104-106.

10. Чекина H.A. Оценка спектра противовоспалительной активности нового комплексного средства растительного происхождения / H.A. Чекина, Я.Г. Разуваева, С.А. Чукаев // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. - 2012. - № 6(88).-С. 106-108.

11. Чекина H.A. Противовоспалительное и антиоксидантное действие нового комплексного фитосредства / H.A. Чекина, В.А. Козин, С.А. Чукаев // Abstracts of International conference «New trends of traditional medicine and nursing». - Darkhan, 2012. - C. 90-93.

12. Чекина H.A. Изучение антиоксидантной активности и острой токсичности комплексного растительного противодиабетического средства / H.A. Чекина, С.М. Гуляев, С.А. Чукаев // Вестник Бурятского государственного университета. Серия: Медицина. Фармация. - 2012. - Выпуск 2. - С. 1317.

13. Chekina N.A. Anti-inflammatory and antioxidant effects of the new complex herbal remedy / N.A. Chekina, S.A. Chukaev, D.Ch. Sanzhieva // Proceedings of the VI International Scientific Conference «Traditional medicine: Ways of Integration with Modem Health Care». - Ulan-Ude, 2013. - P. 68-69.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АлАТ - аланинаминотрансфераза; АсАТ - аспартатаминотрансфераза; ГФ - государственная Фармакопея; ЖКТ - желудочно-кишечный тракт; ЛПВП - липопротеи-ды высокой плотности; ЛПНП - липопротеиды низкой плотности; МДА - малоновый диальдегид; ПОЛ - перекисное окисление липидов; СД - сахарный диабет; СРО - свободнорздикальное окисление; ТБК-РП - продукты, взаимодействующие с тиобарбитуровой кислотой (ГБК-реактивные продукты); ТГ - триацилглицериды; ХС - общий холестерин; ЩФ - щелочная фосфатаза; ABTS - (2,2-азинобис-(3-этил-бензотиазолин-6-сульфониевая кислота); n)F - (The International Diabetes Federation) Международная диабетическая федерация.

Подписано в печать 28.10.2013 г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Объем 1,4 печ. л. Тираж 100. Заказ № 46.

Отпечатано в типографии Изд-ва БНЦ СО РАН 670047 г. Улан-Удэ ул. Сахьяновой, 6.