Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Фармакологическое изучение ингипрола - нового ингибитора протеолитических ферментов

РГБ ОД

1 2 СЕН российская академия медицинских наук

научно-исследовательский институт фармакологии

На правах рукописи

РЫЖКОВА Галина Ильинична

ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ИНГИПРОЛА— НОВОГО ИНГИБИТОРА ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ

14.00.25 — фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва — 1994

Работа выполнена в Государственном институте кровезаменителей и медицинских препаратов Минздравмедпрома РФ

(директор — академик АТН РФ, доктор медицинских наук, профессор Хлябич Г. Н.).

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор, член-корр. АТН

А. С. Новохатский

доктор медицинских наук А. Н. Яворский Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор В. П. Жердев

доктор медицинских наук, профессор А. А. Зозуля.

Ведущая организация: Московский медицинский стоматологический институт им. Н. А. Семашко.

Защита состоится « » (£¿¿¿<£¿>/¿.4 1994 г. в на заседании диссертационного совета Д 001.25.01 в НИИ фармакологии РАМН (125315, Москва, Балтийская ул., 8).

С диссертацией можно ознакомиться в научной части института.

Автореферат разослан «

5/ » 1994 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

А. Н. Яворский

0Е2ДЯ ХАШТЕРИСГШ» РАБОТЫ

Асгугльность те?яА Универсальный характер шстивации систем протеолиза при различных патологических процессах обусловливает высокую эффективность применения ингибиторов протеолитических Ферментов для медикаментозной терапии больных многими тяжелыми заболеваниями.

Если первоначально препараты ингибиторов протеолитических ферментов рекомендовали только для лечения острого панкреатита, рецидивов хронического пдакреатита и профилактики панкреатитов при операциях на желудке и желчных путях,то в настоящее время показания для их клинического применения стали гораздо более широкими.

Так, установлено лечебное действие ингибиторов протеолитичес-ких ферментов при кровотечениях, имевших место при больших хирургических вмешательствах, нередко осложняемых тромбогеморрагическим синдромом. Капельное внутривенное введение ингибиторов протеиназ в стадии гипокоагуляции способствует снижению тромболитической активности крови и остановке кровотечения.

Показана эффективность их терапевтического применения для профилактики нарушений ' фибринолиза во время операций на открытом сердце с применением гемодиализа. Использование ингибитор л; проте-. иназ дает положительный эффект при терапии шока различного геноза, ииемической болезни сердца к инфаркта ' мискарда. ' Внутрисуставное введение препаратов' ингибитора протеиназ способствует снижению протеолитической активности синовияальнлй жидкости и прекращения воспалительного процесса в суставе. Многими ¡циническими наблюдениями установлена целесообразность терарапевтического использования этих препаратов при аллергических заболеваниях (ринит, бронхиальная астма) и, как рачозажив.ляхлцегс средства при лечении ожогов и ран.

Учитывая такой широкий спектр клинических показаний и соответственно большую потребность медицинской практики в препаратах -ингибиторах протеолитических ферментов, ведущие фармацевтические фирмы организовали промысленный выпуск его лекарственных форм: Гразилол (Bayer, Германия).Контрикал (Berlin Chemie, Германия), Гордокс (Gedecn Ricter, Венгрия), Трасеолон (Polfa, Польша), Мид-ран (Novo, Дрчия) , Зимофрен (Specie, Германия).

В нашей стране в течение ряда лет выпускали два лекарственных препарата ингибиторов протеиназ - Пантрипин и Ингитрид. Однако в 1ÖS3 году их выпуск был прекращен в связи с низкой активностью получаемой с использованием несовершенной технологии выделения субстанции. Так, в расчете на один грамм субстанции ферментативная активность составляла только 550 - 650 КИЕ независимо от вида животного сырья, используемого для его выделения (поджелудочные гжлеаы для пактрипина и легкие крупного рогатого скота для ингит-рила).

В то зке время ежегодная потребность отечественного здравоохранения в этих лекарственных препаратах составляет около 8 миллионов а»пул и удовлетворяется частично еа счет закупок по импорту. Учитывая эти обстоятельства, коллективом специалистов Государственного института кровезаменителей н медицинских препаратов Министерства Здравоохранения и медицинской промышленности РФ (ГК- ' КнШ) и Московского Гисударственного университета имени U. В. Ломоносова была разработана оригинальная технология получения новой высокоочищенной субстанции поливалентного ингибитора протеиназ. Первые опытно-промышленные партии повой субстанции были наработаны в экспериментально-производственном отделе ГИКиШ на базе ГЮ"Белмедпрепараты".

По этой технологии в качестве исходного сырья для получения субстанции ингибитора протеиназ используется готовый полупродукт

- О -

сулъфокагиопит КУ - 23Я с сорбированными на нем белками поел? десорбции инсулина, получаемый по действующей ионообменной технологии выделения инсулина из экстрактов подхэлудочной ;г.елезы крупного рогатого скота. Ферментативная активность получаемой субстанции по ингибкрованию трипсина составляет 5000 КИЕ/мг, а методами высокоэффективной жидкостной хроматографии и диск-электрофореза показана высокая степень ее чистоты. Разработанная на основе этой новой субстанции готовая лекарственная форма ингибитора нротеиказ -" Ип-гипрол для инъекций" представляет собой раствор действующего вещества в 0,8 % изотоническом растворе N'aCl с ферментативной активностью 10 ООО КИЕ/мл, с добавкой в качестве консерванта 0,12 У. раствора нипагииа.

Цель лсследоваша. Экспериментальное (дошшническое) изучение субстанции и готовой лекарственной формы оригинального отечественного поливалентного ингибитора протеолитических ферментов -"Ингипрол для инъекций"в качестве нового фармакологического средства

В соответствии с этим конкретные задачи исследования состояли в следующем:

1. ^характеризовать физико-хишчеекке свойства новой субстанции ингибитора протеиказ.

Г. Определить спектр специфической антифзрментяой активности новой субстанции в опыта;: in vitro.

3. Изучить специфическую фармакологическую активность Ингип-рола на моделях экспериментальной патологии.

4. .Изучить фармакокинетику Ингипрола.

б. Оценить общетоксическое и местнораздражаетцэе действие Ингипрола.

б. Провести оценку аллергенных свойств и иимуномоделирующэго действия Ингипрола.

Каучиая новизна Впервые охарактеризован спектр и уровень антиферм&нткой активности новой субстанции поливалентного ингибитора протеиназ, полученной по оригинальной технологии из полупродукта действующего производства выделения инсулина крупного рогатого скота.

Впервые выявлена высокая ингибирующая способность и широкий спектр антиферментной активности новой субстанцил ингибитора про-теиказ.

Впервые показано, что созданная на основе новой субстанции поливалентного ингибитора протеиназ лекарственная форма • "Ингип-рол для инъекций" является эффективным средством экспериментальной терапии острого панкреатита.

Впервые выявлено цитопротективное действие Ингилрола на модели острого язвенного поражения слизистой желудка крыс и наличие противовоспалительных свойств препарата.

В материалах исследований наглядно показано, что по общему и специфическому фармакологическому действию Ингипрол сопоставим с препаратом сравнения Гордокс ( бейеоп Ис&ег, Венгрия).

Впервые проведено комплексное изучение влияния Ингипрола на организм .животных, включая оценку функционального состояния нервной, сердечно-сосудистой, дыхательной, выделительной, эндокринной и репродуктивной систем, печени, углеводного, липидного, белкового и азотистого обмена и, иммунологической резистентности,в котором показано отсутствие неблагоприятного действия препарата

Практическая значимость результатов.

Результаты щ введенного доклинического изучения эффективности и безвредности нового поливалентного ингибитора протеиназ из поджелудочной железы крупного рогатого скота Ингипрола послужили экс-периментачьным обоснованием для получения разрешения на проведение

его клинических испытаний в качестве нового фармакологического средства Ка основании положительных результатов клинических испытаний приказом Министра Здравоохранения и медицинской промышленности Российской Федерации N 250 от 28.10.1993 года (регистрационное удостоверение 93/250/11 ) Ингипрод разрешен для медицинского применения в качестве нового лекарственного средства и в настоящее время препарат успешно используется в клинической практике.

Разработанные ка примере Ингипрола методические подходы к экспериментальной оценке эффективности и беавредности ингибиторов протеолитических ферментов могут быть использованы при доклиническом изучении других предназначенных для этих целей новых Фармакологических средств.

Апробация работм. По теме диссертации опубликовано G работ. Материаш диссертации долоиэкы и обсу.здены на научной конференции молодых ученых "Современные проблемы получения лекарственных препаратов", Ленинград, 1990, IV Всесоюзной научно-технической конференции "Актуальные проблемы улучшения качества кровезаменителей, консервантов крови, гормональных и оргакотералевтичесгах препарат в", Москва 1991, научной конференции "Актуальные проблемы клинической фармакологии ", Винница, 1993, меялабс; ¿торном коллоквиуме ГЙК и Ш, Москва, 1994.

Структура и обсш дассергагзяг. Диссертация состоит иг введения, обзора литературы, .^Гглав результатов ссбственанх ксо.чедозг-ний, обсуждения, выводов, сиксиса использованной литературы, содержащего 75 отечественных и 98 зарубежных чсточнкгхт. Диссертация изложена на ---- страницах ихиинопксного текста и содержит. таблиц и. SÄ рисунков.

оодермаюев работы материал и 15етоды исследования

Опыты проведены на 6 различных видах животных: 100 белых беспородных кчшах-самцах, массой 18-20 г, 140 мышах Fl (СВА х С57В1), масооР 18-20 г, 210 белых крысах-самцах, массой 150-200 г, 50 половозрелых морских свинках-самцах, массой 250-300 г, 23 кроликах породы Шиниила, массой 3100-3300 г, 10 беспородных кошках, массой 3000-3500 г, 20 беспородных собаках , массой 10-20 кг.

Физико-химическая характеристика субстанции, лекарственной формы Ингипрола и вспомогательных веществ, изучалась в соответствии с требованиями Британской Фармакопеи (1988 г.) к ингибиторам протеолитических ферментов Кунигца-Нзргропа Изучение аминокислотного состава субстанции Ингипрола и анализ лекарственной формы проводили с помощью гель-хроматографии на сефадексе 6-50 с использованием диск-электрофореза в 15 % полиакриламидном геле в сравнении о лекарственной Формой эталонного препарата Гордокс (Gadoori Richter, Венгрия).

Содержание высокомолекулярных примесей в субстанции Ингипрола изучали методом жидкостной хроматографии в соответствии с требованиями Британской Фармакопеи (1988 г.).

Специфическую фармакологическую активность Ингипрола изучали в опытах in vivo и in vitro.

В опытах in vitro методом Erlanger исследовали ингибирующий в^фзкт Ингипрола в отнопьлии специфической ферментной активности трипсина с использованием в качестве субстрата N'-бензои^-ДЛ-арги-нин-паранитроачилида (БАША) (Erlanger В., 1961). Ингибиругацее

действие препзоата на специфическое элаетолктическое действие эластазы определяли с использованием метода Yeokas, используя в качестве субстрата эластин (Yeokas М., 1967). Способность ингип-рола подавлять суммарную активность секреторных панкреатических протеолитических ферментов изучали непосредственно на гомогенате ткани подхелудочной железы, активированной энтерекинагсй двенадцатиперстной кишки. Протеоллтическую активность определяли, используя метод Веремеенко IUL, 1988, который был использован также для изучения способности ингипрола тормозить специфическую ферментативную активность калликреина.

Дополнительно тем лк> методом изучали воздействие физико-химических факторов (температуры и рН) на ингибируюшую активность ингипрола в отношении трипсина.

В опытах in vivo специфическую фармакологическую активность ингипрола изучали на модели острого панкреатита у крыс, вызванного непосредственным химическим повреждением под.телудочиой келезы ледяной уксусной кислотой (Лебедевз К Н. и соавт., 1S7S). Для количественной оценки терапевтической эффективности Шгипрола использовали следующие критерии: изменение массы поджелудочной гве-лезы; определение объема, цветности, а также количества лейкоцитов в экссудате брюшной полости; макро- и микроскопический анализ повреждения подхелудочной железы.

Противовоспалительное действие Ингипрола изучали в ош кос на 30 крысах-самцах с асептическим воспалением вызванным введением С, 2 мл декстрана под апоневроз правой задней лапки (Астраускас В. ,1965). Ингипрол вводили однократно г'утрибрюшинно в дозе 24СС0 Ш1Е/кг за 15 минут до повреждающего воздействия. Действие Ингипрола оценивали в течение 24 часов по изменению объема конечности и количеству лейкоцитов в периферической крови.

Цитопротективное действие Ингипрола изучали в опытах на 60 крысах-самцах с химическим поратением слизистой яелудка, модели-

руемым по методу КигоЬаузк1 I. ,1979. Крысам, голодавшим в течение 24 часов, через зонд в желудок вводили 1 мл агрессивной жидкости, представляющей собой 60%-ный раствор зтанолз в 150 мМ соляной кислоте. Подопытным животным Ичгипрол вводили однократно внутриб-ряшинно в дозе 24000 КИЕ/кг за 15 минут до моделирования повреждения. Контролем служили крысы, получагшие в аналогичных условиях опыта инъекции 0.9 % раствора натрия хлорида. Пловдь язвенного •поражения слизистой желудка оценивали планиметрически (Автайдилов Г. Г. , 1990).

Изучение влияния Ингипрола на содержание (примесь) веществ гиеташноподобного действия проводили в опытах на 10 кошках, наркотизированных нембуталом согласно требованиям ГФ XI вып. 2, стр. 185.

Фармакокинетику Ингипрола изучали в опытах на 20 крысах-самцах радисизотопным методом с использованием меченной иод 131 субстанции препарата

Динамику выведения Ингипрола из кровяного русла изучали в опытах на 50 крысах-самцах. Кнгипрол вводили однократно внутривенно в дозе 10000 КИЕ/кг. Пробы крови брали через 2, 5, 10, 30, 60, '20 минут. О скорости выведения Ингипрола судили по уменьшению кнгибируэдей активности крови в отношении трипсина.

Острую токсичность Ингипрола изучали в опытах на 50 белых мьглах и 40 белых крысах при однокра!ном внутривенном введении, "о последующим вычислением 50 % смертельной дозы (ЛД 50) по методу Кербера .

Хроническую токсичность Ингипрола изучали в опытах на 100 белых крысах и 20 собаках обоего пола

Крысам Ингипрол вводили внутрибрюшнно 1 раз в сутки в течении 30 дней в дозах 43800 КИЕ/к:\ 131400 КИЕ/кг и 219000 КИЕ/кг, что превосходит максимальную терапевтическую дозу, рекомендованную для человека (7200 КИЕ/кг) соответственно в 5, 18 и 30 раз.

- и -

Крысы К 'нтрольиой группы в аналогичных условиях опыта получали О, 9Х раствор натр:« хлорида в том же объеме. Через 30 суток часть животных била эзтаназирована, а за остальными наблюдение продолжалось еще 15 дней. В течение всего срока опыта оценивали общее состояния и поведение животных, динамику массы и температуры тела и суточный диурез.

Стандартны;,я гематологическими методами (Меньшиков а Е , 1987) у крыс определяли скорость свертывания цельной крови, содержание гемоглобина, эритроцитов, лейкоцитов.

Стандартными биохимическими методами (Меньшиков ЕВ., 1987) в сыворотке крови крыс определяли содержание глюкозы, билирубина, холестерина, альфа - амилазы, щелочной фосфотазы, аланиновой и аспарагииовой трансаминаз, общего белка, общих липидоэ, креатини-на.

После завершения опытов все животные были подвергнуты пато-морфологическому исследованию с последующим патогистологическим изучением головного мозга, сердца, легких, печени, почек, надпочечников, селезенки, поджелудочной железы, гонад и брюшной стенки в месте введения препарата , С этой целью криостатние натявные и фиксированные парафиновые гистологические срезы органов окрашивали гематоксилин-эозином, толлуидиновым синим и на РНК по Р аше.'

Собакам Ингипрол вводили внутривенно 1 раз в сутки в течение 30 дней в ¿озах 7300 КИЕ/кг и ЗШ50'КПЗ/кг, что соответствует максимальной и 5-кратно увеличенной терапевтической дозе,' рекомендованной для человека. Собакам 2-х онтрольных групп в аналогичных условиях опыта соответственно вводили 0,9 X раствор натрет хлорида и консервант нипагин в объеме 4 мл на кг массы тела. 1.

Наблюдение за поведением и общим состоянием животных провоз дили в течение 30 суток введения исследуемых вещества и 1.5 суток после прекращения введения..

Для оценки функционального состояния организма животных регистрировали массу тела, частоту дыхательных движения, частоту сердечных сокращений, осуществляли запись ЭКГ во втором стандартном отведении и проводили лабораторный анализ крови и мочи.

Стандартными гематологическими методами (Меньшиков а а , 1987) определяли скорость оседания эритроцитов (СОЭ), содержание гемоглобина, эритроцитов, лей!социтоь-, тромбоцитов и проводил!! подсчет лейкоцитарной формулы.

Стандартными биохимическими методами (Меньшиков а В, 1987) с использованием наборов Био-Ла-Тест фирмы "Лахема" ЧСС" изучали показатели белкового (мочевина, азот мочевины), пигментного (бил-лирубин, уробилиноген), липидного (общие лилиды, холестерин, триглицериды) и углеводного (глюкоза) обмена; исследовали активность ферментов - аланинаминотрансферазы (АЛА'Г), аспартатаминот-рансферагы (ЛсАТ) и альфа -амилазы.

Сбший анализ мочи включал определение физических свойств и реакции мочи, белка, глюкозы, гемоглобина, билирубина, уробилино-гена и микроскопию осадка.

Эвтаназию .животных осуществляли внутривенным введением летальной дозы нембутала ( 200 мг/кг) через 30 суток от начала введения и через 15 суток после прекращения введения исследуемых веществ.

После патологоанатомического исследования собак опытной и контрольных групп проводили патогистологическое изучение головного мозга, сердца, легких, печени, почек, селезенки, поджелудочной яелеэн, надпочечников, гонад.

Местнораздрглающее действие Ингипрола изучали в опытах на 20 крысах и 11 кроликах. Крысам Ингипрол вводили внутрибрюшикно 1 раз в сутки в течение Ю дней в дозе 219000 КИЕ/кг. Ткани в месте инъекции (кожа, подкожная клетчатка, мышцы живота, брюшина) под-

вергал"оь пато^истологическому исследованию. Кроликам Ингипрол закапывали в правый глаз 1 раз в сутки в течение 3-х дняй в дозе 218000 КИЕ/кг. Эффект Ингипрола сравнивали с действием Гордокса , 0,9 % раствора хлорида натрия и 0,12 X раствора консерванта нипа-гина.

Влияние Ингипрола на функцию жизненно валаш органов оценивали по его действию на центральную нервную и сердечно-сосудистую системы.

Изучение влияния ингипрола на Функцию централкой нервной системы проведено в опытах на 30 крысах самцах по методу описанному Березовской И. Б. и Бальтиной С. Н. , 1931. Ингипрол вводили внутрибрюшинно 1 раз в сутки в течение месяца в дозе 6000 КИЕ/кг.

Влияние Ингипрола на сердечно-сосудистую систему оценивали по показателям артериального давления и электрокардиограммы .

Регистрацию артериального давления проводили в опыта:': на 9 наркотизированных уретаном (0,5 г/кг) кроликах породы Шииаша прямым методом из сонной артерии на приборе "Нихоя Коден", Япония. Ингипрол и препарат сравнения Гордокс вводили однократно в яремную вену в дозах 2000, 5000, ¡20000, или 30000 ККЕ/!и\

Регистрацию ЗКГ во втором стандартно!« отведении проводили у 3 наркотизированных уретаном (0,5 г/кг) кроликов породы 1, «наила на приборе "Нихон Кодек", Японкг. Ингипрол и Гордокс ьводь.л однократно з яремную веку з дозе 26000 КЙЕ/кг,

Оценку аллергенных озоЯств Ичгкпро^а проводили согласно тодическим рекомендациям по сценке ул генных заойсуэ фармалож»-гических средств" М. , 1688. Во всех опытах з качёотре лпепарота сравнения использовали Гордокс.

Исследования реакции общей анафилаксии проведены э о.чша\" Х'.э, БО морских свинках-альбиносах. Ингипрол"эзодмлм ко схекэ з разовой дозе 7200 КИЕ/кг. Реакцию гкперчувствительь'ости ?,а.ур ценного

- и -

типа изучали в опытах на 4.0 Се лих шыах . Инг ип рол вводили в дозах 720 КИЕ/кг, 7200 КИЕ/кг, 72000 КИЕ/кг. Непрямую реакцию дег-ранулящш тучных клеток изучали в опытах на 40 крысах, используя рабочую концентрацию Ингипрола 10000 КИЕ/мл.

Оценку иммуномоделирующего действия Ингипрола проводили б . сравнении с препаратом Гордокс, который вводили в тех же дозах. Реакцию гиперчувствительности замедленного типа изучали в опытах на 60 мышах П (СВАХС57В1). Ингипрол вводили в дозах 720 КИЕ/кг, 7200 КИЕ/кг, 72000 КИЕ/кг. Определение числа антителообразующих клеток в селезенке проводили в опытах на 80 мышах П (СВАхС57Е1) методом Ерне и Нордин. Ингипрол вводили по схеме внутрибр шинно в дозах 720 КИЕ/кг, 7200 КИЕ/кг, 72000 КИЕ/кг.

Количественные данные, полученные в экспериментах, обрабатывали стандартными методами вариационной статистики, используя таблицы Н. Е Самойлова (1070). Достоверность различий сравниваемых величин оценивали по непараметрическому критерию Вилкоксона-Манна -Уитни (Е. Е. Рублер, А. А. Генкин, 1973) и критерию Стькдента (П.ЕТерентьев, ЕС.Ростова, 1973). Различия меаду группами считали статистически значимыми со степенью вероятности Р с 0,05.

результаты исследований

При изучении физико-химических свойств субстанции Ингипрола было показано, что ее качественные показатели соответствуют требованиям Британской Фармакопеи (1988 г.) к ингибиторам протеолитических ферментов Кунитца-Кортропа . Результаты изучения аминокислотного сост. за субстанции Ингипрола совпадает с данными литературы о составе ингибитора Кунитца-Кортропа. При анализе субстанции Ингипрола с помощью гель-проникающей хроматографии дополнительные высокомолекулярные вещества отсутствовали. Специфи-

ческая активность субстанции Ингипрола по субстрату БАПНА составляла не менее 5000 КИЕ /мг (относительно международного стандарта).

Важное значение для характеристики Ингипрола имеют результаты опытов in vitro по изучению его ингкбирувщего эффекта в отношении специфической ферментной активности трипсина, калликреина, эластазы, а также суммарной протеолитической активности в гомоге-натах ткани поджелудочной железы.

Установлено, что специфический икгибирующий эффект Ингипрола в отношении трипсина проявлялся быстро и не отличался от такового у Гордокса. Так, уже в первые 5 минут инкубации в концентрации ингибитора 100 КИЕ/ мл он достигал максимума и в дальнейшем не зависел от времени инкубации. В отношении калликреина действующая концентрация ингибитора составляла 500 ККЕ/мл. В отношении эластазы ингибирующий эффект Ингипрола развивался также быстро, но проявлялся лишь при концентрации 12500 КИЕ/мл.

Таким образом, ингипрол обладает широким спектром антиферментной активности, ингибируя трипсин, калликреин и зластазу .

Это заключение подтверждается результатами изучения способности Ингипрола подавлять суммарную активность секреторных панкреатических протеиназ непосредственно в ткани поджелудочной железы. Показано, что Ингипрол и препарат сравнения Гордокс в равной степени снижали исходную активность панкреатических протеиназ на 25-40 X.

'Существенное значение для полной характеристики Ингипрола, как антиферментного препарата, имеют результаты его испытаний на сохранение ингибирующей активности при нагревании и низких значениях рН. ' Показ аю, что Ингчпрол обладает термо- и кислотоустойчивыми >. чойствами, соответствующими препарату сравнения Гордого.

Эти, характеризующие Ингипрол экспериментальные данные были ис-t-

польэованы при разработке готовой лекарственной [{ормы и определении срока хранения препарата

Таким образо'г, полученные в опытах in vitro данные свидетельствуют, что Ингипрол обладает всеми описанными в литературе свойствами ингибитора Кунитца-Нортропа.

Это заключение было подтверждено результатами опытов in vivo по изучению эффективности Ингипрола в качестве средства экспериментальной терапии острого панкреатита у крыс. В качестве препарата сравнения использовали широко известный в клинической медицине антиферментный препарат Гордокс.

Опыты проведены с использованием модели непосредственного повреждения паренхимы поджелудочной железы аппликацией ледяной уксусной кислоты, клинико-лабораторная и патогистологическая характеристика которой соответствует наиболее тяжелой форме панкреатита у человека. Так, развивающийся у экспериментальных животных панкреатит, начинался с отечно-геморрагической стадии и быстпо переходил в стадию геморрагического панкреонекроза. При этом клеточная воспалительная реакция была не выражена и формировалась только в следующей стадии паренхиматозного некроза.

Ингипрол при однократном внутрибрюшинном введении в дозе 24GOO КИЕ/кг через 30 минут после нанесения повреждения оказывал выраженный терапевтический эффект у крыс с экспериментальным панкреатитом (таблица 1).

. Таблица 1

Влияние Ингипрола и Гордокса на содержание амилазы в крови,

количество п&ритонеальнсго экссудата и 1„ассу поджелудочной талезы у крыс е панкр^окекроаом ( М ± rv-íO )

¡Группа ! Амилаза, ! Количество И Масса ¡йизоткьа Í ед/MJi I экссудата, мл ? нелезы, г

Без лечения 14545 ± 018 4,85 ± 0,28 0,68 ir 0,040

(контроль)

Ингипрол 5825 t 551 2,31 4 0,35 0,4S i'0,024

Гордокс ' 5732 + 549 ' 2.42 ■£ 0,76 0,52 i 0,013

Р < 0,001 по отношению к контролю.

При микроскопическом исследовании поджелудочной жэлегм крыс, получавших Ингипрол очаги коагуляционного некроза ацинарных клеток были меньшего объема, а перифокальная воспалительная инфильтрация полинуклеарами зон некроза паренхимы более выражена по сравнению с контрольны).« животными. При этом в зоне некроза хоропо сохранялись строма, выводные протоки и сосудистая сеть. Аналогичным терапевтическим эффектом обладал и препарат сравнения Гсрдокс.

Тагам образом, применение Ингипрола при экспериментальном панкреонекрозе у крыс, предотвращает выброс панкреатических ферментов в кровь, препятствует диссеминации некроза паренхимы, усиливает перифокальную воспалительную реакцию, улучшает микроциркуляцию в поджелудочной яелезе. Под влиянием препарата коагуляционный некроз железы развивается на фоне отечного панкреатита, минуя стадию геморрагического панкреснекроза.

Изучение противовоспалительного действия Ингипрола' проведено в опытах на 30 крысах на модели асептического воспаления (отек лапы) с использованием в качестве флогогеннсго агента декстрана После введения декстрана отек конечности достигал максимума к 3-5 часам и к 24 часам наблюдалось его снижение. Ингипрол, при его профилактическом однократном внутрибрюшлнном введении в дозе 24000 КИЕ/кг за 15 минут до воздействия д:кстрана вызывал уменьшение отека конечности на 55-60 % по сравнению с контролем. Аналоги "ный фармакс -югический эффект наблюдался и при введении Гср-докса.

Таким образеч, Ингипрсл является перспективным противовоспалительным средством.

Цитопротективное действие Ингипрола изучали в опытах на 80 крысах на модели острого поражения слизистой оболочки желудка агрессивной жидкостью, состоящей из 60 % раствора этанола в 150 мМ соляной кислоте. Непосредственное введение в желудок животным этой смеси приводило к развитию некрозов слизистой желудка макроскопически регистрируемых в виде полосок черного цвета. Ингип-рол, при его однократном внутрибрюшинном введении в дозе 24000 КИЕ/кг за 30 минут до введения агрессивной жидкости в желудок уменьшал планиметрически регистрируемый объем поражения слизистой оболочки желудка в 4 раза по сравнению с контролем. Аналогичны., фармакологический эффект наблюдался и при введении Гордокса.

Эти данные позволяют заключить, что Ингипрол обладает цитоп-ротектиЕным действием.

При изучении фармакокинетики установлено, что Ингипрол, такте как и препарат сравнения Гордокс, при внутривенном введении белым крысам быстро'выводился из организма. Через 2 минуты в сыворотке крови содержалось 88,5 7. Ингипрола,- а через 30 минут -23,4 %, а через 4 часа - 14,4 % от исходного уровня. Период полужизни "Ингипрола составлял 20 минут и не отличался ст такового у

Гордокса. Эти результаты соответствует литературным данным по

1 ■

изучению фармакокинетики ингк6..гора Кунитца-Нортропа "

.• При изучении кинетики меченного иод 131 Ингипрола были полу- • чены данные, . совпадающие о результатами'изучения антипротеазной. активности сыворотки крови.- • ■ ..-

, Таким образом, лекарственная форма ингибитора протеиназ Ингипрола по данным изучения фармакокинетики в острых опытах на бе-, льсс крысах соответствует общепризнанный показателям кинетика ен-

гибитора Кунитца-Нортропа для этих экспериментальных животных.

Таким образом, на основе результатов экспериментального изучения можно заключить, что новый отечественный препарат Ингилрол обладает высокой специфической антиферментной активностью и по своей фармакологической характеристике не отличается от эталонного ингибитора протеиназ Гордокса

Экспериментальная оценга безвредности Ингипрола вшшчала изучение острой и хронической токсичности, местнораэдражажщего действия, влияния на функцию жизненно важных органов, аллерген-ности и икмуномодулирующих свойств.

Изучение острой токсичности Ингипрола проведено а опытах на 50 белых мышах и 40 белых крысах-самцах.

Установлено, что средняя смертельная доза (ЛД 50> Ингипрола для мышей при внутривенном введении составляла . 4553500. КЙЗ/'кг,, что ниже опубликованных данных по медицинских препаратам этой группы. Однократное внутркбрюиинное введение- Ингипрола крысам не вызывало гибели животных даже в дсэе 3600000« КИЕ/кг, превышающей максимальную терапевтическую дозу* рекомендованную для. человека в 300 раз.

Эти данные позволяют сделать, заключение,, что Ингипрол характеризуется низкой токсичностью. И; бодащой. терапевтической широтой.

Как известно, цель© хронических токсикологических зксп°ри-ментов является характеристика. степени повреждающего действия фармакологического вещества, при- его длительном введении, выявление наиболее чувствительных органов и систем организма, а также исследование степени, обратимости вызываемых им повреждений.

Хроническую- токсичность Ингипрола изучат п опытах на 20 собака' № 1ДО бедда крысах.

Со 'акам. препарат вводили внутривенно, 1 раз в сутки в течение 30 дней» в-лозах 7300 КИЕ/кг и 30500 КИЕ/кг. В результате установлено,. что во время инфузии большой ( 36500 КИЕ/кг) дезы Ин-

гипрола животные были беспокойны, появлялась отдышка, а сразу после введения наблюдалась заторможенность и слабость. Через 10-15 минут после прекращения инъекции состояние животных нормализовалось.

Эти экспериментальные наблюдения соответствуют известным медицинским рекомендациям о необходимости избегать быстрого внутривенного введения больших доз ингибиторов протеолитических ферментов, так как это может обусловить массивное освобождение гистаыина. Инъекции Ингипрола в дозе 7300 КИЕ/кг массы тела, соответствующей максимальной терапевтической дозе, рекомендованной для человека, не вызывали выше описанных явлений у собак.

Анализ динамики массы тела собак при введении Ингипрола не выявил изменений этого показателя по сравнению с контрольными жи-

Е ОТНЫМИ.

Исследование частоты дыхательных движений, частоты сердечных сокращений, ' анализ ЭКГ показали, что на фоне введения Ингипрола эти показатели колеблются в пределах физиологической нормы.

Гематологические показатели (СОЗ, эритроциты, гемоглобин, тромбоциты, лейкоциты и лейкоцитарная формула) животных, получавших Ингипрол не отличались от таковых у собак контрольной группы.

Результаты биохимических исследований крови подопытных ки-вотных покапали, в течение 30-дневного курса введения Ингипрола и 15- дневного периода последействия, изучаемые показатели углеводного, белкового, липидного и пигментного обмена, а такте актив-кость определяемых ферментов не отличались от таковых у контрольных животных и оставались в пределах физиологической нормы.

Исследование мочи так.1® не выявило различий между подопытными и контрольными животными.

■ . Внутривенное введение Ингипрола в исследованных дозах в течение 30 суток не вызывало патологических изменений микроскопического строения головного мозга, сердца, легких, печени, почек.

надпочечников, селезенки, поджелудочной железы и гонад собак.

При изучении хронической токсичности на крысах Ингипшл вводили внутрибрюшинно 1 раз в сутки в течение 30 дней в дозах 43800 КИЕ/кг, 131400 КИЕ/кг 219000 КЙЕ/кг, что превышало максимальную терапевтическую дозу, рекомендованную для человека в 6, 18, 30 раз соответственно.

Полученные экспериментальные данные свидетельствуют, что Ия-гипрол е указанных дозах не оказывал влияния на общее состояние и поведение животных, массу тела, гематологические и биохимические показатели. При патоморфологическом исследовании головного мозга, сердца, легких, печени, почек: надпочечников, селезенки, поджелудочной железы ц гонад подопытных крыс установлено, что Кнгипрол в исследованных дозах не вызывал нарушения макро- и микроскопического строения этих органов и развития воспалительных и дистрофических процессов. В последующие 15 суток после окончания введения Ингипрола развития патологических процессов во внутренних органах также не обнаружено.

Таким образом, полученные на двух видах животных экспериментальные данные свидетельствуют о безопасности к-урсового применения Ингипрола в течение 30 суток.

Важнее значение для вырзботки рекомендаций по безопасному клиническому применению Ингипрола имеют результаты опытов по изучению влияния' Ингипрола на сердечно-сосудистую систему. Опыты проведены на 12 наркотизированных кроликах.

'Установлено, что внутривенное введение Ингипрола е дозах 2000 КИЕ/кг, 5000 КИЕ/кг, 20000 КИЕ/кг, 30000 КИЕ/кг вызывает скитание артериального давления у кроликов, величина которого прямо зависела о« дозы и скорости В1 эдения препарата. Эти экспериментальные данные совпадают с выработанными в клинической практике рекомендациями избегать, быстрого парентерального введения медицинских препаратов на основе ингибитора протеиназ в больших дозах. Тканевые

ингибиторы протеичаз имея высокую основность могут обусловливать освобождение гкстаыина и приводить к анафилактической реакции и падению артериального давления. Наблюдаемый в наших исследованиях гипотензивный эффект Ингипрола был кратковременным так как артериальное давление нормализовалось в течение 55-65 секунд и оставалось постоянным при дальнейшим наблюдении.

При анализе ЭКГ изменений после введения Ингипрола не обнаружено. •

Учитывая, что обнаруженный гипотензивный эффект Ингипрола может быть обусловлен наличием в препарате примесей в виде веществ гистаминоподобного действия, для контроля чистоты Ингипрола было проведено его изучение на содержание веществ гистаминоподобноп действия согласно Требованиям ГФ XI, в. 2, 1987 г., с. 185.

3 результате установлено, что тест доза Ингипрола 2700 КИЕ/кг вызывала снижение артериального давления в пределах 8-10 мм. рт. ст. , что по требованиям БХС 42 -2176-92 считается допустимым. Следовательно, Ингипрол не содержит примесей вызывающих гис-таминоподобный эффект.

Месткораздражающре действие Ингипрола изучено в опытах на 20 крысах и 11 кроликах. Установлено, что Ингипрол при его внутриб-рксшном введении крысам 1 раз в сутки в течение 30 дней в дозе 219000 КИЕ/ кг и нанесении на роговицу глаза кроликам ке обладал месткораздражаючщм действием.

Изучение аллергенных свойств является обязательной частью программы исследования безопасности всех новых лекарственных препаратов. Однако эти исследования особенно важны для биопрепаратов белковой природы, к которым отк сятся ингибиторы протеиназ, обла-д&»щ:е, как известно, относительно высоким аллергенным потенциалом. .

■. Полученные экспериментальные данные показали, что Ингипрол и ярепарат сравнения Гордокс при их курсовом введении в дозе 7200

КИЕ/кг (соответствующей максимальной терапевтической дозе для человека) способны вызывать в равной степени выраженную реакцию общей анафилаксии у морских свинок-альбиносов. Однают, мо-но полагать, что анафилактическая реакция развивается не только из-за образования иммунных комплексов в крови е активацией комплемента, но и за счет высвобождения гистамина при одномоментном введении разрешающей дозы препаратов. В пользу этого предположения свидетельствуют и отрицательные результаты изучения реакции гиперчувствительности замедленного типа на мышах и непрямой реакции дегра-нуляции тучных клеток.

Экспериментальное изучение иммуномоделирувщего действия в опытах на мышах П (СВАхС57В1) показало, что Ингипрол, ■ как и Гор-докс, не вызывал сдвига индекса реакции гиперчувствительности замедленного типа и не влиял на клеточное звено иммунитета.

Аналогичные данные были получены при определен™ числа анш-телосбразующих клеток в селезенке мышей. Эти результаты позволили заключить, что Ингипрол и Гордокс в фармакологически эффективных дозах не оказывали влияния на иммунный ответ организма.

Таким образом, проведенные экспериментальные исследования свидетельствуют о том, что полученный на основе ингибитора протз-иназ Кунитца-Нортропа новый отечественный фармакологический препарат Ингипрол обладает выраженной антиферменткой активностью и высоко эффективен при лечении экспериментального панкреонекроза у крыс, а также обладает противовоспалительными и цитопротективными свойствами. '

Ингипрол по сеоим фармакологическим свойствам и безопасности соответствует международным требованиям к лекарственным препаратам на основе ингибитора протеинаэ.

Сочетание высокой терапевтической эффективности исследуемого препарата с низкой токсичностью и хорошей переносимостью делает его перспективным для лечения многих заболеваний.

Представленные в диссертации результаты доклинического изучения Ингипрола послужили экспериментальным обоснованием для получения разрешения Фармакологического комитета Минздрава РФ на проведение клинических испытаний препарата. На основании поло.ти-тельн^ результатов клинических испытаний Минздрав РФ разрешил медицин!, "ое применение Ингипрола в качестве нового лекарственного средства

ВЫВОДЫ

1. Новый отечественный препарат Ингипрол в опытах in vitro обладает высокой ингибирующей активностью в отношении широкого спектра (трипсин, эластаза, калликреин, суммарные секреторные панкреатические протеиназы) протеолитических Ф>зр-ментов. По специфической ингибирующей активности ( не менее 5000 КИЕ /мг по трипсину) и чистоте субстанции Ингипрол соответствует' международным стандартам.

2. В опытах in vivo Ингипрол обладает антинекротическим, противовоспалительным и цитопротективным эффектами, оказывая выраженное лечебно-профилактическое действие при таких видах экспериментальной патологии как острый панкреонекроз, асептическое воспаление и язвенное поражение слизистой желудка.

3. Ингипрол характеризуется большой терапевтической широтой и практическим отсутствием общетоксического действия и при однократном внутривенном введении не вызывает гибели крыс в дозе в 30Ü раз превышающей среднюю терапевтическую.

4. . При длительном введении в фармакологически эффективных дозах Ингипрол не нарушает функциональное состояние и гистологическую картину крови и органов нервной, сердечно-сосудистой, дыхательной, пищеварительной, выделительной, эндокрин-

. ной, репродуктивной' и иммунной систем . организма и биохимические показатели С лкового, углеводного, липидного и пигментного обмена,' а также не обладает местнораздражшщш действие^-. Введение высоких доз Ингипрола сопровождается быстро проходящим'гипотензивным эффектом и развитием признаков реакции общей анафилаксии.

Б. Результаты клинических испытаний подтвердили эффективность и безвредность Ингипрола как ингибитора протеолитических ферментов и препарат официально разрешен для медицинского применения в качестве нового лекарственного средства

CIÎÎÎCCK РАБОТ ОПУБВЯЮВАШЛХ ПО ТЕ1£Е ДНССЯРТАШГ

1. Фармакотоксикологическая характеристика ноеого ингибитора протеиназ. Тез. докл. конференц. "Современные проблемы получения лекарственных препаратов", Ленинград, 1990. с. 114.

2. К вопросу о расширении показаний применения Ингипрола в медицинской практике. Тез. докл. всесоюзной конференц. "Актуальные проблемы улучшения качества кровезаменителей, консервантов крови, гормональных и органотерапевтических препаратов", 1991, с. 207 ( совместно с Кондратьевым Е С., Новохатским А. С., Егоровой Е. Ф. ).

3. Влияние инъекционной лекарственной формы апротинина на развитие асептического воспаления. Тез. докл. всесоюзной конференц. Актуальные проблемы улучшения качества-кровезаменителей, консервантов крови, гормональных и органотерапевтнческих препаратов", Москва, 1991, с. 208.

4. К вопросу орального способа введения раствора апротинкна. Тез. докл. всесоюзной конференц. Актуальные проблемы улучшения качества кровезамен"телей, консервантов крови, гормональных и органотерапевтнческих препаратов", Москва, 1991, с. 209 ( совместно с Новохатским А. С., Кондратьевым В. С. )'.

о. Модель для изучения цитопротективного действия лекарственных средств. Тез. докл. всесоюзной конференц. Актуальные проблемы улучшения качества кровезаменителей, консерьантов крови, гормональных и органотерапевтнческих препаратов", Москва, 1991, с. 212 ( сов, естно с Новохатским А С., Кондратьевым Е. С. ).

б. Тармакотоксикологическая характеристика Ингипрола. Тез. докл. конферени;. "Актуальные проблемы клинической фармакологии", Винница, 1993, с.74-75(совместно с Яворским A. IL , Новохатским А С).