Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Фармакологические свойства местноанестезирующего лекарственного средства - артистезин

На правах йукописи

ГОРИН АЛЕКСАНДР АЛЕКСАНДРОВИЧ

ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА МЕСТНОАНЕСТЕЗИРУЮЩЕГО ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА - АРТИСТЕЗИН

,0

14.00 25 - Фармакология, клиническая фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

003052950

На правах рукописи

ГОРИН АЛЕКСАНДР АЛЕКСАНДРОВИЧ

ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА МЕСТНОАНЕСТЕЗИРУЮЩЕГО ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА - АРТИСТЕЗИН

14.00 25 - Фармакология, клиническая фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Работа выполнена в ФГУ «Государственный институт кровезаменителей и медицинских препаратов» г. Москва

Научный руководитель

доктор биологических наук, профессор Митрохин Николай Михайлович;

Научный консультант

кандидат медицинских наук Хлябич Кирилл Георгиевич

Официальные оппоненты. доктор медицинских наук, профессор

Ковалева Виолетта Леонидовна;

доктор медицинских наук, профессор Суханов Юрий Семенович

Ведущая организация: Московский государственный

медико-стоматологический университет

Защита диссертации состоится 27 февраля 2007 г. в II30 час на заседании диссертационного Совета (Д-217.004 01) во Всесоюзном научном центре по безопасности биологически активных веществ (142450, Московская обл., Ногинский район, пос. Старая Купавна, ул. Кирова, 23).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке «ВНЦБАВ». Автореферат разослан 25 января 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета, доктор биологических наук,

профессор Корольченко Л.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Безболезненные стоматологические вмешательства, связанные с широким использованием местных анестезирующих средств определили в значительной мере успехи современной стоматологии.

Как отмечают Е.В.Зорян, Е.Н.Анисимова (29) «необходимость адекватного обезболивания у подавляющего большинства пациентов не только не вызывает сомнений, но и создает психофизиологический комфорт, значительно снижает эмоциональную нагрузку как на пациента, так и на врача . ».

При хирургических вмешательствах в стоматологической практике наиболее удобным и безопасным методом контроля над болевыми ощущениями является местная анестезия при которой снятие боли происходит без выключения сознания больного и сохранении контакта пациента с врачом.

В настоящее время в мире разработано и широко применяется значительное количество местных анестетков от традиционного новокаина до препаратов последнего поколения на основе субстанции артикаина: альфакаин, септанест, убистезин, ультракаин, фармакологические свойства которых изучены достаточно хорошо в экспериментах на биологических моделях и еще более весомо подтверждены клиническими результатами, достоверно свидетельствующими в целом о высокой эффективности и безопасности анестетиков.

Высокая эффективность применяемых в последние годы анестетиков определяется в том числе и наличием в препаратах вазоконстрикторов в различных концентрациях, углубляющих и удлиняющих анестезию, вызывающих спазм периферических кровеносных сосудов и приводящих к гипоксии тканей в области инъекции, что снижает возбудимость миэлиновых нервных волокон и естественно способствует дополнительному снижению болевой чувствительности.

По химической структуре все применяемые в настоящее время местные анестетики делятся на сложные эфиры и амиды. К первым относятся: новокаин, анестезин и дикаин, группа амидов представлена многочисленными лекарственными формами, в том числе большим количеством аналогов, однако наиболее широко используются препараты: лидокаин, тримекаин, мепивакаин, прилокаин, бупивакаин, септанест, брилокаин и ультракаин.

Эти препараты отличаются, прежде всего, тем, что на месте инъекции они наилучшим образом диффундируют в ткани, начало действия их проявляется быстро, практически в течение нескольких минут, имеют широкий ареал анестезии с более прочным взаимодействием с тканями и как следствие незначительным поступлением препарата в ток крови, что естественно снижает их избыточное, токсическое действие. Именно по этому амидные анестетики наиболее

широко используются для проведения всех видов инфильтрационной и проводниковой анестезии.

Вместе с тем препараты создаются разработчиками на основе различных субстанций, имеют различное содержание в готовых лекарственных формах основных веществ (например субстанцию артикаина и вазоконстриктора - эпинефрина), а также вспомогательных веществ, в связи с чем требуют детального изучения, поскольку могут обладать не только повышенным местно-раздражающим эффектом, но и высоким общетоксическим действием и вызывать серьезные побочные явления: нарушение сердечного ритма, повышение артериального давления, гипогликемию и другие явления (Рабинович С.А. (48), Стец В.Р., Сливко С.Ф (55), Химич И.В. (59), Шугайлов И А (60), Grigoleit H.G. (81), Melamed S.F. (99), Rudolph H De Jong end Jong D Bonin (107). Последнее обстоятельство наиболее значимо, поскольку стоматологическими пациентами являются, в том числе и больные с тяжелыми заболеваниями сердечно-сосудистой системы, гипертонией, тиреотоксикозом, сахарным диабетом и др.

Изложенное продиктовало необходимость проведения фармакологических и токсикологических исследований разработанного в ФГУ «Государственный институт кровезаменителей и медицинских препаратов» анестетика артистезина на основе синтезированной отечественными исследователями субстанции артикаина гидрохлорида

Цель работы. Изучить фармакологические свойства нового отечественного локального анестетика артистезина.

Основные задачи исследования. Для достижения поставленной цели планировалось решение следующих задач:

1. Определение оптимальной концентрации действующего вещества - артикаина в составе лекарственной формы - артистезина, обеспечивающего обезболивающий эффект.

2. Изучение специфической фармакологической активности артистезина при проведении инфильтрационной и проводниковой анестезии.

3. Исследование острой и подострой токсичности артистезина.

4. Изучение местно-раздражающего действия препарата и аллергенных свойств артистезина.

Научная новизна. В результате проведенных исследований впервые:

1. Получены данные, характеризующие специфическое действие и токсикологические свойства нового отечественного анестетика - артистезина.

2. В сравнительных экспериментах на морских свинках показано, что продолжительность анестезирующего эффекта артистезина так же, как и ультракаина зависит от

концентрации субстанции в препарате Четырехпроцентная концентрация является оптимальной для получения анестезирующего эффекта

3 При инфильтрационной проводниковой анестезии между артистезином и ультракаином по глубине и продолжительности обезболивания не было существенных различий

- анестезия наступает через 30-40 сек после инъекции;

- максимальная глубина обезболивания наблюдалась через 30-60 минут после введения,

- продолжительность эффекта при инфильтрационной анестезии составляла 2,5-3 часа, а

при проводниковой 1,5-20 часа

4. Артистезин не токсичен при многократном введении, не обладает раздражающим и заметным аллергизирующим действием.

Научно-практическая значимость работы. Результаты проведенных исследований обосновывают целесообразность регистрации артистезина в качестве лекарственного средства для проведения анестезии в клинической практике.

Установлено, что различные концентрации субстанции артикаина в готовом препарате обеспечивают различную длительность анестезии. Полученный результат является предпосылкой создания аналогичных местноанестезирующих препаратов из отечественной субстанции с различной продолжительностью анестезирующего эффекта

Полученные материалы явились основой для разработки готовой лекарственной формы артистезина и организации экспериментального производства препарата в ФГУ «Государственный институт кровезаменителей и медицинских препаратов».

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Новый отечественный анестетик обладает высокой местноанастезирующей активностью при проведении инфильтрационной и проводниковой анестезии и не уступает по активности немецкому аналогу - ультракаину.

2. По глубине и продолжительности обезболивания между исследуемым препаратом и препаратом сравнения нет существенных различий.

3 Снижение пороговой чувствительности к болевому воздействию при проводниковой анестезии несколько ниже и кратковременней, чем при инфильтрационной анестезии.

4. Препарат характеризуется как безопасное лекарственное средство. Токсичность, мест-нораздражающее действие и аллергенность артистезина не превышают таковые по сравнению с ультракаином.

Апробация работы. Материалы и положения диссертации доложены и обсуждены на-Третьей отраслевой научно-практической конференции «Проблемы медицинской биотехноло-

гии» (Москва, 2005 г.); заседании Ассоциации «Союзмедпром» по проблеме «Разработки новых отечественных лекарственных средств» (Москва, апрель 2006 г.).

Публикации. По основным материалам диссертации опубликовано 3 печатные работы.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 110 страницах компьютерного текста и включает следующие разделы введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследований, собственные исследования, обсуждение полученных результатов, выводы, рекомендации и список литературы.

Работа иллюстрирована 7 рисунками и 24 таблицами. Библиография включает 119 источников литературы, из которых 61 отечественных и 58 иностранных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Лабораторные животные

Экспериментальный материал для изучения фармакологических свойств препарата арти-стезин, изложенный в настоящей работе, получен в опытах на лабораторных животных 4-х видов

-154 белых беспородных мышах-самцах, массой 18-20 г 2-3 месячного возраста,

-12 кроликах породы шиншилла массой 2,5-3 кг в возрасте 4-5,5 мес.,

-177 беспородных белых крысах самцах массой 100-250 г,

- 58 морских свинках альбиносах самцах массой 230-270 г.

Эксперименты проведены в соответствии со статьей 11-1 Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации (1964) и «Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1985).

Материалы

Для проведения исследований по анестезирующей активности и токсичности препарата были использованы следующие вещества и лекарственные средства:

"Артистезин ", раствор для инъекций в картриджах по 1,7 мл, произведенный в ГУ «Государственный институт кровезаменителей и медицинских препаратов»,

Артикаин гидрохлорид синтезированный на фирме ОАО «БИОН», г Москва - Российская Федерация по показателям качества соответствующей субстанции артикаина производства фирмы «Авентис» («Хехст») - Германия.

Адреналин гидротартрат ФС 42-3307-96

"Ультракаин ДС"- в качестве препарата сравнения производства фирмы «Авентис АГ» -Германия из субстанции Артикаин, разработанной и выпускаемой той же компанией (НД 426805-03 015119/01 020903)

Прозрачная бесцветная жидкость, 1 мл раствора содержит: артикаина гидрохлорида - 40 мг (в пересчете на безводное вещество) эпинефрина гидрохлорида - 0,006 мг (в пересчете на основание).

Вспомогательные вещества: натрия хлорид - 0,5 мг, натрия метабисульфит - 0,5 мг, РН раствора - 5,3 ± 0,2.

Методы исследований

1) Методы оиенки специфического анестезирующего действия.

Специфическую анестезирующую активность локальных анестетиков, как правило, изучают в эксперименте на моделях инфильтрационной, проводниковой и поверхностной анестезии. В работе оценивали анестезирующую активность артистезина в опытах на белых крысах на двух моделях инфильтрационной анестезии: по модифицированный метод Е Bulding und I Weida (67) с введением препарата подкожно в заднюю лапку и последующей регистрацией реакции животного на болевое раздражение (укол иглой); по методу Ю.Д Игнатова с соавт, 2000 г (31), по которому препарат вводили в хвост крысам и о степени анестезии судили по реакции на тепловое воздействие. Проводниковую анестезию изучали на белых крысах, которым обкалывали анестетиком основание хвоста О глубине эффекта судили по изменению пороговой чувствительности к тепловому воздействию (31). Поверхностную анестезию в настоящей работе не изучали, т.к. из литературы известно, что артикаин обладает очень слабой поверхностно анестетической активностью (12,103).

2). Метод изучения фаумакокинетит Аутистезина

Фармакокинетику артистезина изучали по методу Leuschner J. and Lebland D. (93)

Животные получали подкожно препарат в дозах 25 и 50 мг/кг однократно Определяли концентрацию артистезина в сыворотке крови крыс. Пробы крови брали у интактных животных (биологический контроль) и у экспериментальных через 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 и 90 минут после инъекции. Для каждой точки использовали кровь от трех животных.

Артистезин экстрагировали методом М. Uihlein (115) Количество артистезина в пробах определяли методом ВЭЖХ и затем вычисляли концентрацию артикаина.

Количественное описание фармакокинетических параметров Для анализа фармакокине-тики исследуемого препарата использовали математическую модель, описанную Холодовым Л. Е. с соавт. (58) На основании полученных данных фармакокинетический процесс характеризовался по следующим параметрам.

максимальная концентрация препарата в крови (Стах) — мкг/мл;

время достижения максимальной концентрации (tmax) — мин; константа скорости абсорбции (ка) — мин'1, константа скорости элиминации (кс) — мин"1 период полуабсорбции (ti£a) — мин; период полуэлиминации (ti/ге) — мин;

площадь под кривой "концентрация-время" (AUC) — мкгмин-мл"1, 3). Исследование безвредности аутистезина

а) Острая токсичность

Острую токсичность изучали на беспородных белых мышах и беспородных белых крысах Расчет ЛД50 производили по методу Кербера (4)

б) Подострая токсичность.

Подострую токсичность изучали на белых крысах самцах (по 10 голов в группе). Животные получали подкожно препарат ежедневно в течение двух недель в дозе, соответствующей 25 мг/кг артикаина гидрохлорида. Испытуемый препарат сравнивали с коммерческим препаратом ультракаин ДС, который вводили в той же дозе. Животные контрольной группы получали физиологический раствор в эквивалентном объеме.

До начала и после окончания введения препарата животных взвешивали. Накануне забоя для определения суточного диуреза крыс помещали на сутки в обменные клетки Животные лишались корма, при этом сохранялся свободный доступ к воде.

При визуальном наблюдении обращали внимание на общее состояние, внешний вид, подвижность, отношение к корму

По окончании периода наблюдения в периферической крови, взятой из хвостовой вены определяли гематологические показатели: содержание гемоглобина, эритроцитов, лейкоцитов, а также концентрацию глюкозы. Форменные элементы крови подсчитывали на гемоцитометре кондуктометрическом (ГЦМК-3). Содержание гемоглобина определяли фотометрическим методом Девиза Г. В. и Воробьева А. И. (24, 35), а концентрацию глюкозы - глюкометром типа "Сателлит". Для биохимических исследований кровь брали из бедренной вены. Биохимические анализы проводили с помощью диагностических наборов фирмы SIGMA и LACHEMA В сыворотке крови определяли содержание общего белка, белковых фракций, креатинина, билирубина, активность аланиновой и аспарагиновой аминотрансфераз и щелочной фосфатазы (37). Внутренние органы животных взвешивали и подвергали патоморфологическому исследованию.

в) Местно-раздражающее действие изучали на морских свинках и кроликах при макроскопическом и микроскопическом исследовании места введения препарата морским свинкам и реакции конъюнктивы глаза у кроликов.

г) Оценка аллергенных свойств

Аллергенные свойства артистезина оценивали по реакции общей анафилаксии (анафилактический шок). Эксперименты проведены на морских свинках альбиносах массой 250 г Препарат вводили через день трижды в дозе в 10 раз превышавшей терапевтическую с учетом коэффициента видовой чувствительности. Разрешающую дозу, равную сумме сенсибилизирующих доз, вводили внутривенно в течение 1,5 минут на 16 день после начала сенсибилизации. Интенсивность анафилактической реакции оценивали по поведению и гибели животных

Полученные данные подвергались статистической обработке общепринятым методом с использованием критерия I (Стьюдента). Разница между результатами считалась достоверной при уровне значимости (р) <0,05 (9).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Разработка состава и получение артистезина

В Государственном институте кровезаменителей и медицинских препаратов получен отечественный анестетик - артистезин, являющийся фактически дженериком, широко применяемых в мире и зарегистрированных в России препаратов немецкого ультракаина и французского септанеста, производимых из субстанции артикаина фирмы «Авентис»-Германия

Однако лекарственная форма артистезин создана на основе отечественной субстанции артикаина, синтезированной российской компанией ОАО «Бион» и поэтому требовала детального изучения При этом следует отметить, что отечественная субстанция артикаин и артикаин фирмы «Авентис» по физико-химическим и биологическим свойствам субстанции являются практически идентичными

При разработке лекарственной формы артистезина авторы руководствовались данными многочисленных исследований, определивших возможность использования в составе препарата минимальной концентрации вазоконстриктора адреналина гидротартрата 1:200000 в качестве ингибитора сосудорасширяющей активности артикаина тем более, что повышение концентрации вазоконстриктора в два раза практически не влияет на активность препарата, лишь удлиняет его действие.

Исследования Бизаева А.Ф. (И) ДаЪп II. (105), и др. (29) показали, что применение местных амидных анастетиков с низкими концентрациями эпинефрина позволили практически полностью исключить вопрос о противопоказаниях к использованию анестезирующего раствора для пациентов группы риска. Очевидно именно по этому в странах Европы и Америки использование анестетиков с концентрацией адреналина 1:200000 составляет 85-90% и лишь 1015% с концентрацией 1:100000. Указанный факт решил вопрос о выборе оптимальной концентрации адреналина гидрохлорида 1:200000 в отечественном препарате.

Как правило, в препараты артикаина с адреналином, чтобы обеспечить стабильность лекарственной формы, вводят стабилизаторы (натрия метабисульфит, натрия бисульфит) и ком-плексоны (ЭДТА), которые нейтрализуют возможное действие на адреналин кислорода, попадающего в карпулу при изготовлении препарата, особенно в условиях диффундирования металлов из стекла карпулы Для обеспечения стерильности раствора применяют бактериостатические средства (метиловый парабен - нипагин).

Чтобы обеспечить стабильность артистезина и исключить факторы, стимулирующие окисление адреналина, в процессе изготовления артистезина были использованы силиконированные стеклянные карпулы, пробки и поршни, что практически исключает диффузию ионов металла в раствор и процесс образования крупных комплексов, не обладающих активностью и снижающих обезболивающее действие анестетика Благодаря этому оказалось возможным уменьшить концентрацию стабилизатора (натрия бисульфита) до минимальной 0,5 мг/мл., а также отказаться от включения в препарат комплексона ЭДТА.

Так как упаковка препарата в картриджи предусматривает одноразовое использование карпулы, оказалось возможным при применении современной технологии производства не вводить в рецептуру бактериостатическое средство - метиловый парабен (нипагин)

Таким образом, исключение или снижение до минимума концентрации ряда активных токсичных веществ в препарате дает возможность максимально снизить его избыточное действие и расширить показания к применению, особенно среди пациентов группы риска.

Изучение физико-химических свойств артистезина

Сравнительное изучение физико-химических свойств артистезина и ультракаина проводили в соответствии с международными требованиями, предъявляемыми к инъекционным препаратам, содержащим артикаин (ГФ XI, вып.1; Европейская Фармакопея, 2005).

Было проведено определение содержания субстанции - артикаина гидрохлорида, эпинефри-на, посторонних примесей в препаратах артистезин и ультракаин методом ВЭЖХ, а также другие показатели качества

Представленные данные свидетельствуют о том, что по физико-химическим показателям препараты отличаются незначительно, но оба соответствуют требованиям Европейской фармакопеи.

- 5дтр1еНатв АгадЬз1п_М1к1П VI«! а 1п^свопЗ С|1алг«й УМп С*11

--5атрМ1вте Шгаса1П_ипЛ1 ШЗ 1щкИоп1 СЬаппи! ИМп СМ

_Сотроотм Биттагу Там»_

И СЬиплв* К*тв ЯТ

\ иксЯ 1 Айвгейвж 9ГЗО

2 ЛПЖИИП.ипЛ 1 №.1л&11 Азг«та1в» А

Рис 1 Сравнительные хроматограммы адреналина в лекарственных формах артистезина и ультракаина

-5атр1е%т9 иНпхню VI»! $ 1П|«№1П г Сгалп»1 Шп СЬ1

— — ватр^ат« Уш!6 (П|*сйоп 1 СЬаг>пв1 УМп СМ

Сотропвп! Зи ттауу ТаМа

бжщЬЫатв Ц Оагш МУМ ЯГ

1 ! ЯМ» СМ АЛ*«» эд/к

? ЦПгяьэя ? ЛгхяЫ

Рис. 2 Хроматограммы Артистезина и Ультракаина

Таблица 1. Сравнительные аналитические данные препаратов Артистезин и Ультракаин

Наименование показателей Требования проекта ФСП 42- Результат исследования

Артистезин Ультракаин

Описание Прозрачная бесцветная или слегка окрашенная жидкость Прозрачная бесцветная жидкость Прозрачная бесцветная жидкость

Подлинность- A.Артикаин (методом ВЭЖХ) Б.Адреналин (методом ВЭЖХ) B. Сульфит ион Время удерживания основного пика на хроматограмме раствора испытуемого препарата должно соответствовать времени удерживания пика артикаина на хроматограмме раствора PCO артикаина. Время удерживания основного пика на хроматограмме раствора испытуемого препарата должно соответствовать времени удерживания пика адреналина на хроматограмме раствора PCO адреналина Качественная реакция на сульфит ион Удовлетворяет требованиям Удовлетворяет требованиям Удовлетворяет требованиям Удовлетворяет требованиям Удовлетворяет требованиям Удовлетворяет требованиям

Прозрачность (ГФ XI, вып. 1) Препарат должен быть прозрачным или выдерживать сравнение с эталонным раствором I Прозрачный Прозрачный

Цветность (ГФ XI, вып. 1, с. 194) Препарат должен быть бесцветным или выдерживать сравнение с эталоном № 76 или № 7в Бесцветный Бесцветный

рН (ГФ XI, вып 1) От 4,0 до 5,5 4,8 5,1

Посторонние примеси, % Индивидуальная примесь Суммарно Не более 0,5 Не более 1,0 0,1 0,1 0,08 0,15

Номинальный объем (ГФ XI, вып. 1) Не менее номинального Удовлетворяет требованиям Удовлетворяет требованиям

Механические включения Препарат должен выдерживать требования РД 42-501-98 Удовлетворяет требованиям

Стерильность (ГФ XI, вып. 1) Должен бьгть стерильным Стерильный Стерильный

Бактериальные эндотоксины, ЕЭ/мл ОФС 42-0020-04 Не более 50 Менее 20 Менее 10

Количественное определение артикаина гидрохлорида, мг/мл адреналина гидро-тартрата, мг/мл Не менее 38 и не более 42 Не менее от 0,0040 до 0,0055 40,4 0,005 40,8 0,0045

Изучение фармакологических свойств артистезина

А. Исследование специфического анестезирующего действия артистезина

1). Инфильтрационная анестезия Прежде чем приступить к изучению основного действия артистезина - его анестезирующей активности представлялось целесообразным провести сравнительные исследования длительности анестезии при различных концентрациях сравниваемых препаратов, что позволит определить концентрацию раствора, оптимальную для проведения инфильтрационной и проводниковой анестезии

а) Исследование местноанестезирующей активности на модели инфильтрационной анестезии по методу Bulding und Weida (671 на морских свинках

Исследования были выполнены по методу Bulding und Weida, разработанному авторами еще в 1945 г., однако успешно применяемому исследователями до настоящего времени.

Для внутрикожного введения артистезина и ультракаина были использованы взрослые морские свинки. Накануне опыта волосы на спинке выстригали и два участка диаметром 4-5 см выбривали. Эта процедура иногда вызывала раздражение кожи животных, которое проходило в течение 12-14 часов. Каждую концентрацию местных анестетиков исследовали на 3 морских свинках. Препараты в концентрации от 0,5% до 8,0% вводили внутрикожно по 0,2 мл. На участке, в который вводили препарат, образовался инфильтрат; его отмечали чернилами. Реакцию на укол иглой проверяли через каждые 5 сек после инъекции до наступления обезболивания, затем через каждые 5 минут в течение всего опыта до появления чувствительности. Регистрировали время, в течение которого животные на уколы реагировали, а затем отмечали время, в течение которого реакции на укол не было. В качестве контроля использовались морские свинки, которым вводили физиологический раствор.

В таблице 2 приведены данные о времени наступления и длительности анестезирующего эффекта, свидетельствующие о зависимости длительности анестезии от концентрации анестетика.

Время наступления анестезии после инъекции раствора незначительное, оно сокращалось в зависимости от увеличения концентрации препарата практически адекватно для обоих анестетиков от 90 сек до 30 сек. Следует полагать, что указанный факт не имеет решающего значения для поликлинической практики

Период начала наступления анестезии может быть важным в скоропомощьных условиях, прежде всего в случаях оказания помощи больным при травмах.

Таблица 2. Средние данные нала и длительности анестезии в зависимости от концентрации анестетика

Концентрации препаратов в % Начало анестезирующего эффекта (в сек) / Длительность анестезии (в мин)

артистезин ультракаин

0,6 90/ 12,5±2,4 85 /14,5±2,0

1,0 65 / 22,0±2,0 65/22,0±1,2

2,0 50 / 44,5±3,8 60 / 44,5±2,7

4,0 35 /66,0±2,4 40/64,5±1,6

6,0 30 / 67,0±2,8 35 / 68,0±2,2

8,0 30 / 68,5±2,7 30 / 70,0±2,4

Представленные данные свидетельствуют о том, что с увеличением концентрации раствора длительность анестезии увеличивается Длительность анестезии при введении животным артистезина и ультракаина практически не отличается. Увеличение концентрации растворов с 4,0% до 8,0% не приводит к адекватному увеличению длительности анестезии.

б) Исследование местноанестезирующей активности на модели инфильтрационной анестезии по модифицированному методу Bulding und Weida (67) на крысах

Испытание проводили на белых крысах самцах массой 160-180 г по 10 животных в группе Испытуемый препарат и препарат сравнения вводили в заднюю лапку крысам подкожно по 0,2 мл. Об анестезирующем действии судили по отсутствию болевой чувствительности в ответ на болевые раздражения, наносимые в виде уколов. В качестве контроля использовали физиологический раствор, который вводили в той же дозе, но в другую лапку.

Продолжительность местноанестезирующего действия артистезина составила 2,0 ± 0,88 часа, а для ультракаина ДС 2,2 ± 0,63 часа. Разница между полученными значениями статистически не существенна (t = 0,463). Артистезин по анестезирующему действию практически не отличается от ультракаина ДС.

Б. Исследование фармакодинамики

Исследование фармакодинамики артистезина проводилось на моделях инфильтрационной и проводниковой анестезии при термическом воздействии на хвост крысы.

а) Исследование местноанестезирующей активности на модели инфильтрационной анестезии при термическом воздействии.

Испытание проводили на белых крысах самцах массой 120-130 г. Принцип метода заключа ется в регистрации латентного периода рефлекса отдергивания хвоста (tail flick) при термическом воздействии в области проксимальной трети хвоста. Термическое воздействие наносили с помощь лампы накаливания мощностью 15 ватт Раствор препарата с содержанием артикаина гидрохлорид 10 мг/мл вводили крысам подкожно в хвост в области нанесения термического воздействия в дозе

32 мг/кг. Измерение латентного периода при термальном воздействии проводили до введения препарата, а затем каждые 15-30 минут после инъекции до исчезновения анестезирующего эффекта, б). Исследование местноанестезирующей активности на модели проводниковой анестезии при термическом воздействии Для получения модели проводниковой анестезии равномерно с четырех сторон обкалывали корень хвоста крыс раствором препарата в суммарной дозе вдвое превышавшей дозу для ин-фильтрационной анестезии (64 мг/кг).

Полученные данные обрабатывали статистически и сопоставляли со значениями латентных периодов в контрольной группе животных. Для оценки динамики анестезии при анализе данных, полученных в экспериментах на обеих моделях, использовали условный коэффициент реакции "К", который представляет собой отношение среднего значения латентных периодов отдергивания хвоста после введения препарата к среднему значению исходных латентных периодов в контроле.

Эксперименты показали, что при инфильтрационной анестезии между исследуемым препаратом и препаратом сравнения по глубине и продолжительности обезболивания нет существенных различий При введении артистезина в дозе 32 мг/кг порог чувствительности к термальному воздействию максимально снижался через 30-60 минут после введения препарата Продолжительность анестезии составляла 2,5 - 3 часа (табл 3)

При проводниковой анестезии (общая доза 64 мг/кг) снижение пороговой чувствительности к термальному воздействию было несколько ниже и кратковременной. Реакция на испытуемый препарат и препарат сравнения была практически одинаковой. Максимум реакции так же, как и при инфильтрационной анестезии наблюдался через 30-60 минут после введения. Продолжительность анестезии составляла 1,5-2,0 часа (табл 4).

Таблица 3 Сравнительная оценка местноанестезирующей активности Артистезина и Ультракаина по изменению порога чувствительности при термальном воздействии (латентный период, сек). Инфильтрационная анестезия

Сроки Артистезин Ультракаин

наблюдения, мин М±т, сек М±ш, сек t Р

исходно 7,0 ±0,55 6,0 ±1,14 0,7874 >0,05

15 21,8 ±3,45 27,3 ± 4,92 0,9153 >0,05

30 43,2 ±5,94 50,0 ±6,38 0,7801 >0,05

60 65,8 ± 8,91 62,0 ±6,92 0,3368 >0,05

90 36,8 ±5,30 40,0 ±4,19 0,2199 >0,05

120 30,0 ± 5,35 32,3 ±4,71 0,3227 >0,05

150 19,0 ±5,53 20,6 ±5,47 0,2057 >0,05

180 22,2 ±3,18 14,6 ±6,53 1,4436 >0,05

210 6,6 ± 1,14 9,4 ± 1,60 1,5089 >0,05

Таблица 4 Сравнительная оценка местноанестезирующей активности Артистезина и Ультракаина по изменению порога чувствительности при термальном воздействии

Сроки наблюдения, мин Артистезин М±т, сек Ультракаин М±т, сек t Р

исходно 10,8 ±2,17 8,8 ± 0,49 0,8990 >0,05

15 12,7 ±2,67 10,6 ± 1,75 0,7174 >0,05

30 21,0 ±5,57 23,0 ±4,34 0,2832 >0,05

60 33,7 ±2,57 31,0 ±4,53 0,5280 >0,05

90 12,5 ± 3,07 12,2 ±2,13 0,0803 >0,05

120 9,0 ±3,21 6,2 ± 0,97 0,8350 >0,05

150 8,3 ±2,50 3,6 ±0,68 1,7948 >0,05

Динамика местноанестезирующего эффекта артистезина при инфильтрационной и проводниковой анестезии представлена на рисунках 3,4

Рис 3. Сравнительная динамика анестезирующего эффекта препаратов артисгезин и ультракаин (сек)

Проводниковая анестезия. Латентный период, сек.

—*—артастезин ■ ультракаин

О 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150

мин

Рис 4 Сравнительная динамика анестезирующего эффекта препаратов артистезин и ультракаин (сек)

Приведенные данные показывают, что испытуемый препарат Артистезин не отличается существенно по глубине, длительности и динамике анестезирующего эффекта от препарата сравнения "Ультракаин ДС".

В. Изучение фармакокинетикп препарата

В экспериментах использовали белых крыс самцов массой 220-250 г. артистезин вводили однократно подкожно в дозах, соответствующих 25 и 50 мг/кг артикаина гидрохлорида. Пробы крови брали через 10. 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 и 90 минут после инъекций препарата Контролем служила кровь интактных животных.

Через 10 минут обнаруживается заметное количество препарата в крови (978±24,6 и 1703±24,0 мкг/мл при дозах 25 и 50 мг/кг артикаина соответственно; концентрация препарата продолжала нарастать и достигала максимума через 40 мин для обеих доз. Затем начиналось снижение содержания артикаина в крови. Профили концентрации артикаина в крови крыс после введения обеих доз представленынарис 4.

Математическая обработка полученных данных позволила характеризовать фармакоки-нетические параметры процесса (табл 5). Так, максимальная концентрация препарата (CmiK), была равна 1908±21,7 и 3793±21,9 мкгминмл"1 при дозах 25 и 50 мг/кг артикаина соответственно Константа скорости абсорбции (ка) равнялась 0,021 и 0,011 и мин"1, а период полуабсорбции (ti/2a) — 33 и 63 мин. Константа скорости элиминации (ке) равнялась 0,036 и 0,025 мин" период полуэлиминации (ti/2ei) — 19 и 28 мин.. Площадь под фармакокинетической кривой (AUC) составляла 107,4 и 233, 04 мкг мин/мл при дозах 25 и 50 мг/кг артикаина соответственно

Таблица 5 Статистическая характеристика фармакокинетики артикаина при однократном подкожном введении крысам

параметры размерность Доза

25 мг/кг 50 мг/кг

С шах нг/мл 1908 3793

Т шах мин. 40,0 40,0

ка мин 0,021 0.011

Т 1Д а мин 33,0 63,0

ке мин 0,036 0,025

Т 1/2 е мин 19,3 28,0

AUC МКГ. мин. мл 107,4 233,0

На рис. 5 представлен фармакокинетический профиль артикаина после однократного подкожного введения артистезина

Результаты, полученные в наших экспериментах, близки описанным другими авторами (92, 96), изучавших Фармакокинетику ультракаина на аналогичной биологической модели

Рис 5 Фармакокинетический профиль артикаина при однократном подкожном введении крысам.

Исследование безвредности препарата

А. Острая токсичность

Опыты по изучению острой токсичности проводились на двух видах животных: белых мышах при подкожном и внутрибрюшинном введении и белых крысах при подкожном введении.

а1} Опыты на белых мышах при подкожном введении

Изучение острой токсичности проводилось в опытах на белых мышах самцах массой по 7 голов в группе. Введение летальных доз препарата вызывало гибель мышей, при явлениях ле-гочно-сердечной недостаточности и судорогах в первые минуты после инъекций.

б-) Опыты на белых мышах при внутрибрюшинном введении

Опыты проводились на белых мышах самцах массой по 7 голов в группе. При введении летальных доз препарата внутрибрюшинно наблюдались те же симптомы, что и при подкожном введении препаратов.

Статистические показатели изучения острой токсичности артистезина в сравнении с ультракаином представлены в таблице 6, из которой следует, что ЛД50 при подкожном введении для Артистезина равнялась 7,68±0,9 мл/кг, что соответствует 307,2 ±36 мг/кг артикаина гидрохлорида. Для препарата сравнения «Ультракаин» ЛД50 при подкожном введении составляло 8,04+0,96 мл/кг что соответствует 321,5+38,5 мг/кг артикаина гидрохлорида (р>0,05).

ЛД50 при внутрибрюшинном введении для Артистезина равнялась 3,66±0,54 мл/кг что соответствует 146,5±21,5 мг/кг артикаина гидрохлорида. Для препарата сравнения "Ультракаин

с адреналином" ЛД50 при внутрибрюшинном введении для Ультракаина 3,84±0,46 мл/кг что соответствует 153,5±18,5 мг/кг артикаина гидрохлорида (р>0,05).

Таблица 6. Результаты изучения острой токсичности Артистезина _на мышах (статистические показатели)_

показатели подкожно внутрибрюшинно

Артистезин Ультракаин с адреналином Артистезин Ультракаин с адреналином

сублетальная доза, мл/кг 2,50 2,50 1,25 2,5

LDi6, мл/кг 3,25 3,94 2,0 2,88

LÜ84, мл/кг 9,6 13,25 4,88 4,50

LDioo, мл/кг 15,0 15,0 6,25 6,25

LD50, мл/кг 7,68 8,04 3,66 3,84

±т, мл/кг ±0,90 ±0,96 ±0,54 ±0,46

t 0,2736 0,2537

Р >0,05 >0,05

в) Опыты на белых крысах.

Опыты проводились на белых крысах самцах по 6 голов в группе Испытуемый препарат вводили подкожно в область холки

Через несколько минут после введения препарата у крыс нарушалась координация движения, развивались судороги, интенсивность и продолжительность которых зависела от дозы. При введении сублетальных доз (5,0 мл/кг = 200 мг/кг артикаина) состояние животных развивалось аналогично, но с меньшей выраженностью симптомов, а затем постепенно нормализовалось. Более высокие дозы вызывали частичную или 100% гибель.

Статистические данные приведенных исследований свидетельствуют о том, что ЛД50 для крыс в этих опытах равнялась 11,25 ± 0,91 мл/кг артистезина, что соответствует 450 ± 36,27 мг/кг артикаина гидрохлорида. Для препарата сравнения «Ультракаин» ДД50 для крыс составляла 10,42 ± 0,97 мл/кг, что соответствует 416,7±38,78 мг/кг артикаина гидрохлорида (р>0,05) (таблица 7).

Таблица 7. Результаты изучения острой токсичности Артистезина на крысах _(статистические показатели)_

Показатели Артистезин Ультракаин

сублетальная доза, мл/кг 5,00 5,00

1Х>16, мл/кг 7,25 6,00

ЬГ>84, мл/кг 14,25 14,00

ЫЭюо, мл/кг 15,0 15,0

1Ю50, мл/кг 11,25 10,42

±т, мл/кг ±0,91 ±0,97

1 0,6240

Р >0,05

Таким образом, рассматривая полученные параметры острой токсичности при парентеральных способах введения животным артистезина в рамках классификации И.В Березовской (10), следует констатировать, что препарат относится к четвертому классу токсичности, то есть является малотоксичным

Б Подострая токсичность

Подострая токсичность артистезина изучалась на 30 крысах (по 10 животных в каждой группе), которым на протяжении 15 дней ежедневно подкожно вводилось 25 мг/кг препарата; животным контрольной группы вводили физиологический раствор По окончанию эксперимента фиксировалось общее состояние крыс во всех трех группах, измерялась масса тела и внутренних органов животных, показатели крови, функциональное состояние внутренних органов, путем исследования биохимических показателей крови и мочи Органы животных подвергнуты патоморфологическим исследованиям.

а) Общее состояние крыс, масса тела и внутренних органов

После двухнедельного подкожного введения артистезина общее состояние животных, внешний вид, подвижность, отношение к корму были удовлетворительны и не различались в опытной и контрольных группах. Болевая реакция на введение препарата не отмечена. В течение опыта ни одно животное не погибло.

Масса тела крыс в обеих экспериментальных группах и в группе биоконтроля увеличивалась одинаково.

Относительная масса внутренних органов у крыс опытных групп соответствовала этому показателю у контрольных животных. Наблюдавшиеся колебания значений находились в пределах физиологической нормы.

б) Влияние испытуемых препаратов на состояние крови

Гематологические исследования показали, что исследуемые препараты при ежедневном подкожном введении крысам в течение 2-х недель не оказывали влияния на содержание в крови гемоглобина, эритроцитов и лейкоцитов Регистрировавшиеся показатели крови в опытных группах сопоставимы с аналогичными данными, полученными в группе биоконтроля, и находятся в пределах нормальных значений для этого вида животных. (57, 77).

в) Функциональное состояние внутренних органов.

О функциональном состоянии внутренних органов судили по биохимическим показателям крови крыс — содержанию общего белка, альбумина, глобулинов, концентрации глюкозы, креатинина, билирубина и активности аминотрансфераз (АсАТ и АлАТ). Показателем функционального состояния почек также являлся суточный диурез животных (Табл. 8).

Полученные результаты показывают, что после многократного подкожного введения Артистезина значения биохимических показателей сыворотки крови у экспериментальных крыс существенно не отличались от значений этих параметров у животных группы биоконтроля и находились в одном и том же физиологическом диапазоне величин (Табл. 9).

Моча животных нормального желтовато-соломенного цвета, прозрачная. Суточный диурез в экспериментальных группах и в группе биоконтроля, был практически одинаковым (Табл. 10).

Полученные данные свидетельствуют об отсутствии какого-либо негативного влияния исследуемых препаратов на гематологические показатели и на функциональную деятельность внутренних органов крыс.

Таблица 8. Активность аспарат-аминотрансферазы (АсАТ) и аланин-аминотрансферазы (АлАТ) в крови крыс, получавших Артистезин в течение 2-х недель

Группы животных АсАТ АлАТ

ЕД/л 1 Р ЕД/л 1 Р

Артистезин 75,40 +8,74 1,-0,0560 12-0,2395 >0,05 >0,05 23,48 ±3,34 11-1,2439 12-0,6794 >0,05 >0,05

Ультракаин 72,51 +8,38 11-0,3570 >0,05 26,78 ±3,52 11-2,0569 >0,05

Био-контроль 74,96 ±4,87 18,95 ±1,44

^-к контролю; к препарату сравнения

Таблица 9 Уровень общего белка, белковых фракций, глюкозы, креатинина и билирубина в сыворотке крови крыс, получавших Артистезин в течение 2-х недель (средние результаты)

Группы животных Общий белок, г% Альбумин, 1% Глобулин, г% Креатинин, мг% Глюкоза, мг% Билирубин мг%

Артистезин 6,46+0,154 4,08± 0,126 2,38±0,155 0,589± 0,063 5,29± 0,204 0,129±0,017

1, 1,1428 0,6524 0,4683 1,8093 0,7001 0,5954

к 1,3088 0,5381 1,9745 1,8942 0,6932 0,8149

Р> >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05

Р2 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05

Ультракаин 6,71± 0,113 3,99± 0,110 2,72± 0,075 0,456± 0,031 5,09± 0,204 0,155 ±0,027

1, 0,0549 1,2113 0,9824 0,0584 1,4001 0,2174

Р1 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05

Биоконтроль 6,70± 0,143 4,20+0,134 2,504 0,211 0,45 3± 0,041 5,49± 0,200 0,147± 0,025

ргК контролю; и, Р2- к препарату сравнения

Таблица 10 Суточный диурез крыс, получавших Артистезин в течение 2-х недель (средние результаты)

Группы Объем, мл t P

животных

Артистезин 12,45 t,-1,2069 >0,05

+ 1,65 ta-0,3410 >0,05

Ультракаин 13,45 ti-0,4908 >0,05

±2,53

Биоконтроль 14,80

±1,08

ti-к контролю; \2- к препарату сравнения

Патомоуфологическое исследование.

У наркотизированных крыс для гистологического исследования брали следующие органы сердце, селезенку, печень, почки, желудок и 12-ти перстную кишку. Кусочки нефиксированных органов после глубокого замораживания (для исключения артефактов) резали в крио-стате. Гистологические срезы окрашивали толуидиновым синим (pH - 4,0) и смесью Судана III - IV для выявления жировых включений

У контрольных и подопытных крыс макроскопическая картина была одинаковой. Шерстный покров не отличался и был гладким, блестящим. Кожа без изменений. При аутопсии расположение внутренних органов правильное. В брюшной и плевральной полостях свободная жидкость не отмечена. При вскрытии трахеи и бронхов просвет свободен. Легкие розового цвета, воздушные Сердце обычных размеров, на разрезе темно-красного цвета Желудок и 12-ти перстный кишечник с хорошо выраженными складками. Слизистая без признаков воспаления, кровоизлияний и изъязвлений. Печень на разрезе без признаков некроза, полнокровная. Почки, селезенка без признаков патологии.

Группа биоконтроля. Макроскопическое изучение материала контрольной группы показало, что внутренние органы по форме, величине и цвету соответствуют органам здоровых животных

Микроскопическое изучение сердца, печени, легких, селезенки, желудка, 12-ти перстной кишки не выявило нарушений гистологического строения внутренних органов

Изучение местно-раздражающего действия.

Местно-раздражаюшее действие изучали на животных двух видов, кроликах породы Шиншилла массой 2,5 - 3,0 кг и морских свинках самцах массой 300-350 г.

Опыты на кроликах. Исследуемые препараты закапывали кроликам в конъюнктивальный мешок правого глаза один раз в день в течение 3 суток В левый глаз закапывали физиологический раствор (контроль) Наблюдали за состоянием слизистых оболочек глаз в течение недели

В обоих случаях в первые секунды после инсталляции не отмечалась реакция животных на раздражение. Дальнейшие наблюдения показали, что Артистезин также, как и Ультракаин не вызывал воспаления конъюнктивы глаз кроликов.

Опыты на морских свинках. Морским свинкам вводили подкожно Артистезин в дозе 0,2 мл, а другой группе, контрольной, такую же, дозу Ультракаин. Кусочки кожи с подкожной клетчаткой из места введения препаратов, взятые через 12 и 24 часа после инъекции подвергались гистологическому исследованию. Образцы после глубокого замораживания резали в мик-ротом-криостате Гистологические срезы окрашивали 1 % раствором толуидинового синего При микроскопическом анализе полученных препаратов признаков некроза и воспаления в подкожной клетчатке не было обнаружено ни в одном случае.

Оценка аллергенных свойств.

Морские свинки были разделены на 5 групп по 6 голов в каждой. Сенсибилизировали морских свинок следующим образом. Животным первой и второй групп вводили трижды через день Артистезин по 0,25 и 2,5 мл/кг, что соответствует средней терапевтической и десятикратной дозам с учетом видовой специфичности. Морские свинки третьей и четвертой групп получали Ультракаин в тех же дозах. Животным пятой контрольной группы вводили физиологический раствор

Первую инъекцию производили подкожно в холку, две последующие внутримышечно в область бедра Разрешающую дозу, равную сумме сенсибилизирующих доз, вводили внутривенно в течение 1,5 минут на 16 сутки после начала сенсибилизации Морские свинки первой и третьей групп не отличались от контрольных животных Во второй и четвертой группах у 2 животных отмечено нарушение координации и у одной свинки клонические судороги. Гибель животных не наблюдалась ни в одном случае. Реакция на Артистезин и препарат сравнения Ультракаин была одинаковой.

ВЫВОДЫ

1. На основе отечественной субстанции артикаина гидрохлорида, синтезированного на фирме ОАО «БИОН», получен препарат группы анестетиков - артистезин - раствор для инъекций в картриджах, содержащий минимальное количество вспомогательных веществ, что снижает вероятность проявления побочных реакций при применении препарата в стоматологической, клинической практике

2. Полученный препарат по физико-химическим свойствам соответствовал требованиям Международных Фармакопеи.

3. В сравнительных экспериментах на морских свинках показано, что продолжительность анестезирующего эффекта артистезина так же, как и ультракаина зависит от концентра-

ции субстанции артикаина в препарате. Четырехпроцентная концентрация является оптимальной для создания анестезирующего эффекта

4. При инфильтрационной и проводниковой анестезии между артистезином и ультракаином по глубине и продолжительности обезболивания не было существенных различий

- анестезия наступает через 30-40 сек после инъекции,

- максимальная глубина обезболивания наблюдалась через 30-60 минут после введения;

- продолжительность эффекта при инфильтрационной анестезии составляла 2,5-3 часа, а при проводниковой 1,5-2,0 часа

5. Исследование фармакокинетики артистезина показало, что уже через 10 минут после подкожного введения крысам обнаруживается заметное количество артикаина в крови, которое независимо от дозы препарата достигало максимума через 40 минут.

6 ЛД50 артистезина существенно не отличалась от ультракаина, для мышей при подкожном введении составляла 7,68±0,9 мл/кг, а при внутрибрюшинном 3,66±0,54 мл/кг

7. Артистезин не токсичен при многократном введении, не обладает раздражающим и заметным аллергизирующим действием

8 Полученные результаты легли в основу разработки нормативно-технической документации, регистрации препарата в качестве лекарственного средства и организации его промышленного производства.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1 По результатам проведенных исследований новый отечественный препарат - артистезин может быть рекомендован для эффективного клинического применения.

2. Полученные материалы являются основой для разработки готовой лекарственной формы артистезина и организации экспериментального производства препарата в ФГУ «Государственный институт кровезаменителей и медицинских препаратов»

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Исследование острой токсичности артистезина// «Проблемы медицинской биотехнологии» Сборник материалов отраслевой научной конференции ГУ «ГИКиМП» М. 2005. С. 1416 (совместно с М.А.Фиалковой, К.Г.Хлябичем)

2. Проблемы местного обезболивания в стоматологии. «Проблемы медицинской биотехнологии». Сборник материалов III отраслевой научной конференции ГУ «ГИКиМП» М., 2005, С. 8-11 (совместно с К.Г.Хлябичем).

3 К вопросу безопасности отечественного анестетика артистезина // Российский стоматологический журнал М. 6-2006 С. 16-18 (совместно с 3 М.Гасановой, Д.Е Митрушкиным, Г.Т.Черненко).