Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Фармакологическая регуляция фиксированных воротных зарядов межклеточных соединений

о

На правах рукописи

Абдалкин Михаил Евгеньевич

Фармакологическая регуляция фиксированных воротных зарядов межклеточных соединений

14.00.25 — фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени • кандидата медицинских наук

Челябинск — 1997

Работа выполнена на кафедре фармакологии Самарского государственного медицинского университета

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки России, Соросовский профессор

А-А-Лебедев

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Г.Д Аникин

Ведущая организация: Российский государственный медицинский университет г.Москва.

Диссертационного Совета Д.084.04.02 при Челябинской государственной медицинской академии (454092, г.Челябинск, ул.Воровского, 64).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Челябинской государственной медицинской академии.

доктор медицинских наук, профессор О.Б.Кузьмин

Защита состоится «

»

1997 г. в___часов на заседании

Автореферат разослан «_»

1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

А-В.Зурочка

Общая характеристика работы Актуальность исследования

В последние годы все большее внимание уделяется транспорту ионов через биологические мембраны. Причем внимание исследователей уделяется не только трансмембранному переносу ионов в клетку, но и переносу ионов и воды по межклеточным соединениям, особенно в тканях, направленно транспортирующих натрий от одной своей поверхности к другой. Такие процессы происходят в стенке нефрона почки. Изменение межклеточной проницаемости может существенно изменить перенос ионов и молекул воды через стенку почечного канальца. Расширение межклеточных соединений приводит к уменьшению количества реарсорбированного клубочкового фильтрата. Некоторые фармакологические вещества как, например, диуретики, могут расширять межклеточные соединения и изменять тем самым функцию нефрона (А.А.Лебедев, 1989).

Процесс изучения межклеточного переноса в стенке канальца затруднен вследствие малого размера объекта, и поэтому ряд исследований предусматривает изучение на биологический моделях процесса межклеточного переноса иоиов и воды. Биологическими моде\нми стенки почечного канальца могут быть стенка мочевого пузыря лягушки, кожа \ягл'1пкн. стенка желчного пузыря млекопитающих. Эти ткани активно транспортируют ион натрия от одной своей поверхности к другой, ионы могут днигаться и через клеточные мембраны и парацеллюлярно.

Многолетние исследования кафедры фармакологии Самарского государственного медицинского университета, проведенные под руководством профессора А.А.Лебедева, были посвящены . изучению действия диуретиков на транспорт ионов через стенку почечного канальца, осуществляющих направленный транспорт ионов и воды, а также исследованию этого транспорта через стенку мочевого пузыря лягушки и кожу лягушки. Эти ткани могут считаться биологическими моделями стенки почечного канальца, т.к. процессы, протекающие во всех трех тканях идентичны, они заключаются в переносе ионов и воды не только через мембраны, но и межклеточным путем. В результате этих исследований были получены данные о влиянии диуретиков на проницаемость межклеточных соединений в тканях, осуществляющих

I (

направленный перенос ионов, клторые легли в основу нового . представления о механизме действия диуретиков на межклеточные • соединения.

Постепенно оформилась и научная гипотеза, которая последующем переросла в теорию о фиксированных воротных зарядах ] межклеточных соединениях, определяющих внеклеточный транспор' ионов и селективное отношение к ионам различного заряда. Согласн< теории, межклеточные соединения проницаемы для движения ионов, Н1 они не являются простыми механическими щелями, через которы< анионы и катионы проходят в одинаковом количестве. Селективност; определяется фиксированными зарядами отрицательного знака находящимися на мукозной стороне стенки мочевого пузыря или н< люменальной стороне почечного канальца. Положительные зарядь находятся при входе в межклеточное соединение на базальной сторон« (серозной для мочевого пузыря лягушки). Эти заряды расположены пр1 входе в канал межклеточного соединения, отсюда и их название -воротные заряды, которые фиксированы по всей вероятности I мембранам межклеточного соединения, возможно они представляю: собой молекулы белка, группы которого имеют или положительный ил> отрицательный заряд. Молекулы расположены при входе в канал. Рол] фиксированных воротных зарядов в канальцах почек сводится » селективной реарсорбции одних ионов в канальцах почек, например катионов, и препятствию к реарсорбции анионов. Очевидно, в почечны) канальцах обработка фильтрата происходит, не только благодар* активному транспорту, но и селективной реарсорбции по межклеточным соединениям.

Поэтому цель нашего исследования — изучить парацеллюлярнык транспорт ионов и роль фиксированных зарядов в воротах межклеточньн каналов более совершенными методами исследования — представляется актуальной. Разработанная нами методика определение электрофоретической подвижности базальной и люменальной мембран почки является актуальной, т.к. позволяет привести доказательства существования базальных и люменальных фиксированных зарядов в везикулах мембран, выделенных из почечных канальцев.

Актуальна и задача исследования изучить влияние диуретиков на перенос ионов флуоресцеина через стенку мочевого пузыря лягушки, так как позволяет получить представление о влиянии диуретиков на межклеточный транспорт при помощи новой методики изучения проницаемости. Задача эта позволяет получить представление о механизмах действия диуретиков и подтвердить или корректировать экспериментальные данные, полученные ранее А.А.Лебедевым и В.П. Посоховым (1981), В.А.Шелеповым (1968), Т.И.Бочкаревой (1992).

Важно и актуально было изучить влияние на функцию фиксированных воротных зарядов и веществ, блокирующих отрицательные или положительно заряженные группы белковых молекул, а также веществ, связывающих ионы кальция, который играет большую роль в цементировании межклеточных соединений.

Цель работы

Изучение трансцеллюлярного переноса ионов в стенке нефрона и его фармакологическая регуляция с точки зрения теории фиксированных воротных зарядов межклеточных соединений.

Задачи исследования:

1. Изучение электрофоретической активности базальных и люменальных мембран, выделенных из эпителия почечных канальцев с тем, чтобы получить доказательство реальности теории воротных зарядов.

2. Выяснить роль кальция в функции межклеточных соединений путем изучения влияния этилендиаминтетрауксусной кислоты . на асимметрию потоков органического аниона флуоресцеина через стенку мочевого пузыря лягушки.

3. Апробировать новую методику изучения переноса аниона флуоресцеина в динамике по межклеточным соединениям стенки мочевого пузыря лягушки. Выяснить возможность наблюдения асимметрии потоков аниона флуоресцеина при помощи этой методики, сравнит*, преимущества методики с рутинным способом изучения функции фиксированных воротных зарядов.

4. Изучить феномен асимметрии потоков и их величину путем динамической регистрации при действии диуретиков: фуросемида, этакриновой кислоты, гипотиазида и нового активного в диуретическом плане соединения под условным названием "алвизид".

5. Оценить влияние блокирования фиксированных воротных зарядов стенки мочевого пузыря путем введения в растворы, омывающие серозу и мукозу, отрицательно заряженных молекул гепарина и положительно заряженных молекул протамина сульфата.

I Научная новизна и практическая значимость

Исследован механизм действия диуретиков: фуросемида этакриновой кислоты, гипотиазида на фиксированные воротные заряды межклеточных соединений, а также на проницаемость межклеточных соединений к аниону флуоресцеина при помощи оригинальной методики динамической регистрации движения флуоресцеина по градиенту концентрации через стенку мочевого пузыря лягушки. Применение этой методики позволило не только подтвердить данные ранних работ, но и

получить новые результаты, которые показали, что не только отдельны« диуретики, но все исследованные соединения, правда, в различной степени, способны повышать проницаемость межклеточных контактов. Наиболее слабо, но статистически достоверно повышает проницаемость фуросемид. Наиболее значительно увеличивает проницаемость межклеточных соединений и устраняет асимметрию потоков флуоресцеина этакриновая кислота и гипотиазид, в отношении последнего способность влиять на проницаемость является новым фактом, показывающим его высокую активность, и на проницаемость межклеточных соединений и на фиксированные воротные заряды. Наконец, алвизид, новое химическое соединение, по структуре близкое к буметаниду, и обладающее значительным диуретическим эффектом, способно увеличивать проницаемость межклеточных соединений и влиять на функцию фиксированных воротных зарядов.

' В то же время, были получены новые результаты по изучению фиксированных воротных зарядов в клетках, осуществляющих направленный перенос ионов. На специально сконструированной установке было изучено движение базальных и люменальных везикул мембран почечного эпителия в электрическом поле. Было показано разнонаправленное движение обоих видов мембран, что и свидетельствует о наличии фиксированных зарядов.

. Было показано, что фиксированные заряды можно блокировать гепарином на серозной поверхности стенки мочевого пузыря, а также протамином сульфатом на мукозной поверхности. Таким образом, фиксированные воротные заряды являются фактором, модулирующим межклеточную проницаемость для ионов. Удаление ионов кальция из межклеточных соединений ЭДТА способствует резкому расширению межклеточных соединений, что проявляется увеличением проницаемости, но асимметрия потоков флуоресцеина сохраняется.

Внедрение

Результаты исследования внедрены в педагогический процесс и используются на кафедре фармакологии Самарского государственного медицинского университета при изучении раздела «Мочегонные средства».

Апробация работы

Результаты работы доложены на студенческих научных конференциях в Самарском медицинском университете (1991), в Красноярском медицинском институте (1992), на конференции по фармакологии почек и водно — солевого обмена в г.Чебоксары (1993), на юбилейной конференции фармацевтического факультета СМГУ (1996), на заседании Самарского общества фармакологов.

Публикации и структура диссертации

По материалам диссертационной работы опубликовано 5 печатных научных работ. Диссертация состоит из 130 страниц машинописи и включает в себя: введение, обзор литературы, описание методов исследования, результаты исследования, обсуждение, выводы и библиографический указатель. Иллюстративный материал представлен 16 таблицами и 24 рисунками.

Работа выполнена по плану НИР Самарского медицинского университета в рамках проблемы «Механизм действия диуретиков и поиск новых диуретических средств», номер госрегистрации 01960002087.

Содержание работы Методы исследования

Для изучения наличия и характера фиксированных воротных зарядЛ на поверхности мембран канальцев почки у крыс, мы избрали косвенный метод определения путем электрофореза везикул люменальных или базальных мембран почки. Для обоснования этого метода мы выдвинули предположение, что фиксированные воротные заряды расположены не только в устьях межклеточных соединений, но и по всей поверхности мембран. На люменальной мембране присутствуют отрицательные фиксированные заряды, на базальной положительные. Везикулы тех и других мембран, приготовленных из ткани почки, должны иметь соответствующие заряды и в электрическом поле двигаться к аноду или катоду в зависимости от поверхностного заряда везикулы.

Люменальные мембраны выделялись из ткани почки методом дифференциального центрифугирования (Wright S.H. a. Wunz Т.Н., 1987). Базолатеральные мембраны выделялись по методу D.E.Fitzpotrick et al, 1969. Электрофоретическая подвижность мембран измерялась при помощи оригинальной методики, предложенной нами. Взвесь мембран

вводилась в камеру, изготовленную из увиолевого стекла, шириной 0,7 мм, изготовленную по размерам предметного стекла микроскопа. В среду с повышенной вязкостью, заполнявшей камеру, вводилась 0,1 мл взвесь люменальных или базальных мембран. Затем мембраны подвергались электрофорезу, что вызывало их перемещение по длиннику камеры. Принцип метода состоит в том, чтобы определить положение фракции биомембран в достаточно вязкой среде до прохождения электрического тока и после прохождения. Положение фракции биомембран определялось по их триптофановой флуоресценции, возбуждаемой ультрафиолетовым светом (длина волны флуоресценции 353 нм). Кювета в специально сконструированной камере спектрофлуориметра регистрировалась на ленте самописца. Положение взвеси биомембран регистрировалось в виде пика флуоресценции. Измерений расстояния взвеси мембран от флуоресцентной метки, давало возможность следить за перемещением их в процессе электрофореза. В зависимости от их движения к катоду или аноду можно было сделать вывод о характере заряда везикул мембран.

Стенка мочевого пузыря лягушки является широко применяемой моделью дм изучения транспортных процессов через клеточные мембраны и межклеточные соединения. А.ЬеаГ и соавторы (1976) заключили, что стенка мочевого пузыря лягушки представлена однослойным плоским эпителием. Перенос ионов через нее как и стенку почечного канальца осуществляется как через клеточные мембраны, так и по межклеточным соединениям. Если перенос через билипидный слой клеточных мембран является активным, т.е. требующим затраты энергии, то перенос по межклеточным соединениям представляется движением по градиенту концентрации. Стенка мочевого пузыря лягушки неоднократно использовалась для изучения транспортных процессов по межклеточным соединениям (А.П.Клименков, 1970; А.А.Лебедев и В.П.Посохов, 1981; В.П.Посохов, 1981; Т.И.Бочкарева, 1993). Для изучения межклеточной проницаемости применяется натриевая соль флуоресцеина (уранин), анион флуоресцеина не обладает способностью проникать через мембраны клеток мочевого пузыря и поэтому распределяется внеклеточно. Поэтому перемещение через стенку мочевого пузыря натриевой соли флуоресцеина происходит в различной степени в зависимости от направления градиента концентрации. Если градиент концентрации направлен от мукозы к серозе, то флуоресцеин переносится в меньшем количестве, чем тогда, когда градиент концентрации направлен от серозы к мукозе. Аналогичным образом

перемещаются и другие отрицательно заряженные ионы — иодид, хлорид. Наоборот, такие катионы как литий, натрий в большем количестве перемещаются по градиенту концентрации от мукозы к серозе. На основании этих данных и была предложена концепция фиксированных воротных зарядов межклеточных соединений (рис.1).

Наличие отрицательных зарядов в воротах межклеточных соединений на мукозной поверхности способствует входу в канал катионов и их большему переносу. И в то же время наличие во входе в канал положительных зарядов со стороны серозы способствует входу анионов и большему их переносу, если градиент концентрации направлен от серозы к мукозе.

2

3

+ +

Анионы

+ +

|

+

--► Катионы

1 +

Рис./. Перенос анионов и катионов по градиенту концентрации через межклеточные соединения стенки мочевого пузыря лягушки.

1 — клетки стенки мочевого пузыря,

2 — мукозная мембрана клеток,

3 — серозная мембрана клеток,

/ + , — / — фиксированные воротные заряды при входе в межклеточные соединения.

Стрелки — величина переноса ионов при различном направлении градиента концентрации.

1

Эти теоретические концепции были иолучены на основе опытов со стенкой мочевого пузыря лягушки при изучении переноса флуоресцеина через промежутки времени за 1 час, за этот период суммировалось количество перенесенного флуоресцеина (В.П.Посохов, 1981). Для этой цели мочевой пузырь удалялся и фиксировался на стеклянной трубке, позволяющей вводить в его полость раствор флуоресцеина. Трубка с мочевым пузырем помещалась в раствор Рингера и в нем измерялось флуоресцентным методом количество перенесенного через стенку флуоресцеина. Если испытуемое вещество вводилось внутрь пузыря, то оно могло двигаться по градиенту концентрации в направлении от мукозы к серозе, кроме того, во втором варианте опытов пузырь вывертывался так, что внутри оказывалась серозная оболочка В последнем варианте введенный внутрь пузыря флуоресценн двигался через стенку в направлении градиента концентрации от серош к мукин

Эта методика позволяла изумить проницаемость к флуоресцеину через сравнительно большие промежутки времени, в опытах наших предшественников — за 1 час, в наших опытах за 10 минут, что имело свои недостатки. Поэтому для более углубленного изучения скорости переноса был разработан способ изучить скорость переноса уранина в более короткие промежутки времени. Этот способ позволял измерять автоматически прирост концентрации уранина (флуоресцеина) в среде в более короткий промежуток времени (1 — 2 мин.). Он позволял также автоматически измерять прирост концентрации уранина в среде, окружающей мочевой пузырь, и регистрировать этот прирост на ленте самописца. Была сконструирована установка, позволяющая регистрировать прирост концентрации уранина в кювете флуориметра при инкубации в ней мочевого пузыря, содержащего раствор уранина. В кювету помещалась не только трубка с мочевым пузырем, но и трубки для аэрации. Свет, возбуждающий флуоресценцию, подавался только в нижнюю часть кюветы и флуоресценция прошедшего через стенку пузыря флуоресцеина регистрировалась на ленте самописца. Концентрация флуоресцеина в кювете нарастала с различной скоростью в зависимости от величины проницаемости, чем больше была проницаемость, тем круче нарастала кривая. Величина проницаемости

оценивалась по величине 1д утла а, построенного на основании крутизны подъема и нулевой линии (см. рис.2).

'/ 1 :/ I

Рис.2. Нарастание концентрации уранина в кювете флуориметра при внесении в нее мочевого пузыря, наполненного раствором флуоресцеина при постоянной скорости самописца.

1, 2, 3 — замена раствора Рингера и внесение пузыря с новой порцией уранина.

Чем больше величина утла а, тем выше проницаемость. Полученные величины тангенса утла подвергались статистической обработке и характеризовали величину проницаемости.

В наших опытах изучалось влияние диуретиков на проницаемость стенки мочевого пузыря лягушки. Фуросемид добавлялся к инкубационным растворам в концентрации 2 мМ/л, гипотиазид 2 мМ/л, этакриновая кислота 2 мМ/л, оригинальное соединение, обладающее диуретической активностью, "алвизид" — 1 мМ/л. Кроме того, для изучения механизмов изменения проницаемости, добавлялась для связывания ионов кальция в межклеточных соединениях этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) в концентрации 1 мМ. Для блокирования фиксированных воротных зарядов применялся раствор протамина сульфата (1:100), л также для связывания положительных фиксированных зарядов — раствор гепарина в концентрации 50 ед/мл. В различных вариантах опытов" диуретики добавлялись либо с одной стороны мочевого пузыря, либо с двух.

Основные результаты исследования

/

I /

ш

г / У

Изучение электрофоретической подвижности везикул базальных люменальных мембран составило первый раздел исследования. Установка

для электрофореза мембран, описанная выше, позволила прежде всего, изучить и подобрать среду, имеющую достаточную вязкость, чтобы изучить перемешивание фракции мембран во время электроф.ореза. Основой для среды служил веронал—мединаловый буфер (рН 7,0). ¡Взвесь мембран вводилась в определенный участок кюветы в количестве 0,1 мл. Однако, если кювета была заполнена веронал—мединаловым буфером, то происходило быстрое перемешивание фракции мембран со средой и при сканировании кюветы ультрафиолетовым лучом, не удавалось получить четкое выявление фракции мембран. Для повышения вязкости среды был исследован крахмал и агар—агар. При помощи агар—агара, многократно очищенного в концентрации 1%, удалось получить золь для наполнения кюветы, который давал дополнительную вязкость среде и не препятствовал электрофорезу крупных частиц. После подбора необходимого напряжения и силы тока, были получены первые результаты.

Движение люменальных мембран и движение базальных мембран отличаются при электрофорезе. Люменальные мембраны движутся к аноду, что свидетельствует об их отрицательном поверхностном заряде. Электрофоретическая подвижность базальных мембран составила 19,38+1,35 мм/час по направлению к катоду, при напряжении 90 Вольт и силе тока 0,2 мА/мм2. Таким образом, можно считать установленным положительный заряд базальных мембран. Электрофоретическая подвижность люменальных мембран составляет 39,1+.1.70 мм/час в направлении анода, что говорит об их отрицательном заряде. Очевидно, заряды присутствуют на всей поверхности мембран, а не только в области ворот межклеточного канала, но нет оснований считать, что они могут с люменальной стороны способствовать входу в канал катионов, а с базальной — анионов, что и создает асимметрию потоков ионов при различном направлении градиента концентрации. Поэтому наши опыты с изучением заряда люменальных и базальных мембран являются одним из доказательств существования и фиксированных воротных зарядов.

Вторым важным доказательством существования воротных зарядов являются поставленные нами опыты на стенке мочевого пузыря лягушки с гепарином и протамин —сульфатом. Молекула гепарина имеет мощный отрицательный заряд и способна блокировать положительные фиксированные заряды, которые, по нашему предположению, расположены в области входа в межклеточные соединения со стороны серозной мембраны клеток мочевого пузыря лягушки. Или применительно к почке — со стороны базальной мембраны, что показано нашими

данными. Протамин —сульфат несет мощный положительный заряд, который может блокировать отрицательные фиксированные заряды на мукозной поверхности мочевого пузыря лягушки. Поэтому цель данных опытов состояла в изучении совместного влияния гепарина со стороны серозной поверхности и протаминсульфата со стороны мукозной поверхности на асимметрию потока флуоресцеина, которая, как мы предполагаем, осуществляется фиксированными воротными зарядами положительного и отрицательного знака.

В таблице 1 приведены результаты опытов, обработанные по зависимым данным. Из таблицы видно, что перенос флуоресцеина больше от серозы к мукозе, чем при обратном направлении концентрационного градиента, т.е. налицо феномен асимметрии потоков. Блокирование фиксированных воротных зарядов одновременным добавлением к растворам, омывающим стенки мочевого пузыря лягушки протамина — к мукозной поверхности и гепарина — к серозной поверхности, приводит к двум эффектам. Увеличивается проницаемость при обоих направлениях градиента концентрации, но степень повышения проницаемости при направлении градиента от серозы к мукозе меньше, чем при обратном направлении. Поэтому асимметрия потоков исчезает.

ТАБЛИЦА 1

Влияние гепарина со стороны серозы и протамина сульфата со стороны мукозы на перенос флуоресцеина через стенку мочевого пузыря лягушки

Направление

градиента

концентрации

Контроль При действии гепарина и протамина

/М/

Через 30 мин. ДМ +_ т

сульфата

Через 60 мин. ДМ _±т

Мукоза — сероза 0,70

1,71_+0,05 р <0,01 •

3,43±0,87 р < 0,002

Сероза — мукоза 1,21

1,57 + 0,62 р < 0,01

к

2,60_+0,97 р < 0,02

На основании изложенного, можно утверждать, что протамин со стороны мукозы и гепарин со стороны серозы умеренно увеличивают

[

проницаемость и вместе с этим, нивелируют асимметрию потоков. По-видимому, блокада фиксированных воротных зарядов этими веществами, способна нарушить межклеточный селективный механизм транспорта ионов, в частности органического аниона, которым является флуоресцеин.

Наконец, в третьей серии опытов изучалась роль удаления ионов кальция из межклеточных соединений при помощи ЭДТА. В первом варианте опытов добавлялась с обеих сторон эпителия мочевого пузыря, во втором варианте опытов либо со стороны серозы, либо со стороны мукозы. Добавление ЭДТА с двух сторон почечного эпителия вызывало весьма значительное увеличение проницаемости (см. таблицу 2), но асимметрия потоков при этом сохранялась.

ТАБЛИЦА 2

Влияние ЭДТА, добавленной со стороны мукозы и серозы стенки мочевого пузыря лягушки, на проницаемость к уранину , (тангенс утла а)

Направление градиента концентрации Контроль /М/ При добавлении ЭДТА

Через 30 мин. ДМ ± т Через 60 мин. ДМ +. т

Мукоза-»сероза 0,33 0,53+0,21 1,10+0,40

р <0,05 р < 0,02

Сероза—>мукоза 1,21 6,95+. 1,82 8,48 + 0,75

р < 0,002 р < 0,001

Причем, увеличение проницаемости при добавлении ЭДТА было более значительно при направлении градиента концентрации флуоресцеина от серозы к мукозе, что не только сохраняло явления асимметрии, но делало их еще более значительными. Добавление ЭДТА со стороны серозы, либо со стороны мукозы вызывало аналогичные эффекты, но менее выраженные.

Таким образом, в нашем исследовании подтверждается теория профессора А.А.Лебедева о роли фиксированных воротных зарядов в межклеточном транспорте как на ткани почки, так и в стенке мочевого

пузыря лягушки. Показано, что люменалыше мембраны имеют отрицательные фиксированные заряды, а базальные — положительные. Возможна фармакологическая регуляция межклеточного транспорта. Блокада как положительных, так и отрицательных зарядов гепарином и протамином сульфатом прекращает явления асимметрии, что полностью согласуется с теоретическими предпосылками. Устранение роли кальция из межклеточных соединений существенно увеличивает проницаемость межклеточных соединений, но сохраняет асимметрию потоков уранина. Таким образом, фармакологический анализ показывает возможность раздельного регулирования проницаемости межклеточных контактов и функции воротных зарядов.

В заключительных опытах мы провели исследование диуретиков — фуросемида, этакриновой кислоты и гипотиазида — на проницаемость стенки мочевого пузыря для флуоресцеина (рис.3 — 5).

Как следует из рисунка, фуросемид увеличивает проницаемость при направлении градиента концентрации от серозы к муказе, имеется небольшая тенденция увеличения проницаемости от мукозы к серозе. В этом варианте опытов фуросемид добавлялся к обеим сторонам стенки мочевого пузыря (рис. ЗА).

Для изучения механизма действия фуросемида проведены опыты с добавлением фуросемида с одной стороны стенки мочевого пузыря (рис. ЗБ). Добавление фуросемида с серозной поверхности не изменяет проницаемость стенки, а добавление с мукозной поверхности повышает проницаемость так, что феномен асимметрии перестает выявляться.

Таким образом, фуросемид может повышать проницаемость для движения флуоресцеина при направлении градиента концентрации от мукозы к серозе. Хотя следует отметить, что повышение очень незначительное и не идет в сравнение со значительным повышением проницаемости, которое вызывают другие диуретики.

На рис. 4А приведены данные о действии этакриновой кислоты с двух сторон стенки мочевого пузыря лягушки. Этакриновая кислота значительно повышает проницаемость стенки мочевого пузыря лягушки для ионов уранина в обоих направлениях градиента концентрации. Количество флуоресцеина, перенесенное в обоих направлениях градиента концентрации выравнивается к концу опыта. Так тангенс угла а через 60 минут после начала опыта равен 6,89:+1,13 в направлении от серозы к мукозе, в то время как в обратном направлении он равен 4,02_+0,95

А '

|—•—М-»С | I—Ш--С->М( 2

К J0

Мни.

Рис.3 . Влияние фуросеии^а на перенос уранина через стенку мочевого пузыря лягушки, расчет по независимым данным /1g угла оС , Шт/. А - опыты с влиянием фуросеиида с двух сторон мочевого пузыря, Б - с одной стороны. М->С - со стороны мукозы, С->М - со стороны серозы, * - статистически достоверные отличия проницаемости при направлении градиента концентрации от М->С, и от С-:м.

2 S

2

1 5

О 5

О

(р>0,05). Увеличение проницаемости сопровождается снижением асимметрии потоков.

В опытах с добавлением этакриновой кислоты с одной стороны мочевого пузыря (рис.4Б) показано, что асимметрия потоков флуоресцеина сохраняется, а проницаемость также как и в предыдущих опытах возрастает, но в меньшей степени, чем в предыдущем варианте опытов. Есть все основания полагать, что действие этакриновой кислоты с одной стороны — с мукозы и серозы — вызывает меньшее увеличение ' проницаемости, чем в предыдущем варианте опытов, оно не способно устранить асимметрию потоков. Очевидно, для полного действия этакриновой кислоты необходимо, чтобы она проявляла свой эффект с двух сторон эпителия стенки.

Гипотиазид, добавленный с обеих сторон стенки мочевого пузыря лягушки, (рис.5А), значительно увелич„«>ас. ироницаемость для флуоресцеина при обоих направлениях градиента концентрации, хотя его эффект на проницаемость и менее выражен, чем у этакриновой кислоты. При этом он снижает явления асимметрии потоков флуоресцеина, очевидно, потому, что проницаемость при направлении градиента концентрации от мукозы к серозе возрастает в большей степени.

Когда же гипотиазид добавлен с одной стороны эпителия мочевого пузыря (рис.5Б), он также увеличивает, причем значительно проницаемость, не менее, чем при действии с двух сторон. Причем проницаемость при действии его на мукозную поверхность возрастает более значительно, и явления асимметрии исчезают. Это подчеркивает, что его эффект более значительно проявляется со стороны мукозы, чем со стороны серозы. Нельзя не отметить сходство в эффектах фуросемида и гипотиазида, и тот и другой более значительно повышают проницаемость в направлении градиента концентрации от мукозы к серозе, чем при обратном. Следует однако подчеркнуть, что эффект гипотиазида на проницаемость выражен гораздо сильнее.

Алвизид также увеличивал проницаемость к уранину при действии или с серозной или с мукозной поверхности эпителия, наблюдаются явления уменьшения асимметрии потоков.

Таким образом, все диуретики, но в различной степени, способны увеличивать проницаемость эпителия стенки мочевого пузыря лягушки. Очень слабо такая способность выражена у фуросемида, который повышает проницаемость только при направлении градиента от мукозы к серозе. Этакриновая кислота, гипотиазид, алвизид существенно увеличивают проницаемость стенки мочевого пузыря лягушки. Причем

1-*-с->м| 4

К 10

Мин

—М »< С >м

К 30

Мин

Рис -А - Увеличение переноса уранина чорс>з стенку мочевого пу-.шря лягушки, рассчитанные п независимым данным (.д угла с цел;,к.

сравнить выраженность яалений асимметрии потоков уранина.

*

А - опиты с влиянием этакриновои кислоты с двух сторон моченого пузыря, Б - с одной стороны мочевого пузыря. К->С перенос у|шнин > по градиенту концентрации со стороны мукозы к серозе. С->Н - со стороны серозы. * - статистически достонерные различия величии М->С и С->М.

о

и

А

■ —♦— м-»с • с >м

К 30

Мин

- м -С

- С -М

к зо

Мин

РИС. 5". Увеличение переноса уранина через стенку мочевого пузыря лягушки, рассчитанное по независимым данным ьд угла . /Маш/. А - опыты с влиянием гипотиазида с дну* сторон моченого пузиря, Б - с одной стороны мочевого пузыря, М->С - со стороны мукозы, С->М - со стороны серозы, * - статистически достоверные отличия указывающие на явления асимметрии.

о

нашей кафедре (В.П.Посохов, 1981). Снижает асимметрию потоков и гипотиазид, он действует одинаково эффективно с одной стороны и при действии с двух сторон эпителия. Данные по изучению влияния гипотиазида существенно отличаются от данных более раннего исследования на кафедре фармакологии СГМУ, причина этого расхождения изучается.

Следовательно, расширение межклеточных соединений способно в ряде случаев нарушать и асимметрию потоков флуоресцеина при различных направлениях градиента концентрации, т.е. нарушать функцию воротных зарядов.

Выводы

1. Фуросемид незначительно, но статистически достоверно увеличивает поток флуоресцеина по градиенту концентрации в направлении от мукозы к серозе, не нарушая величину потока от серозы к мукозе. При действии с двух сторон стенки мочевого пузыря лягушки, он не нарушает явления асимметрии потоков.

2. Этакриновая кислота значительно увеличивает проницаемость стенки мочевого пузыря лягушки для флуоресцеина и нивелирует асимметрию потоков его. При действии с одной стороны этакриновая кислота увеличивает проницаемость менее значительно.

3. Гипотиазид также значительно увеличивает проницаемость стенки мочевого пузыря для флуоресцеина, полностью нарушает асимметрию потоков. Его эффект проявляется одинаково с одной стороны мочевого пузыря и двух сторон.

4. Химическое соединение по структуре близкое к буметаниду, под условным названием "алвизид" существенно увеличивает проницаемость стенки мочевого пузыря для флуоресцеина и нарушает явления асимметрии.

5. Изучение выделенных из гомогената почечной ткани люменальных и базальных мембран почечного эпителия методом электрофореза показало, что в электрическом поле базальные мембраны движутся к катоду, люменальные — к аноду, что свидетельствует об их поверхностном потенциале — положительном для базальных мембран и отрицательном для люменальных.,

6. Введение в раствор, омывающий серозную мембрану мочевого пузыря лягушки, гепарина и в раствор, омывающий мукозную поверхность стенки мочевого пузыря, протамина сульфата вызывает

' 6. Введение в раствор, омывающий серозную мембрану мочевого пузыря лягушки, гепарина и в раствор, омывающий мукозную поверхность стенки мочевого пузыря, протамина сульфата вызывает нарушение феномена асимметрии .потоков флуоресцеина, что свидетельствует о существовании фиксированных зарядов на поверхностях стенки мочевого пузыря лягушки.

7. Удаление ионов кальция "из межклеточных соединений зтилендиаминтетраукс^сной кислотой способствует резкому расширению межклеточных соединений, что проявляется увеличением проницаемости для флуоресцеина при сохранении асимметрии потоков.

8. Найдено два типа взаимодействия химических соединений с межклеточными путями в стенке мочевого пузыря лягушки. При первом типе ЭДТА расширяет межклеточные соединения, не нарушая асимметрии потоков флуоресцеина. При втором типе взаимодействия диуретики— этакриновая кислота, гипотиазид, алвизид, не только расширяют межклеточные соединения, но и прекращают асимметрию потоков флуоресцеина, что свидетельствует о влиянии их на систему воротных зарядов межклеточных соединений.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Абдалкин М.Е. Исследование электрофоретической подвижности везикул базолатеральных и люменальных мембран почечного эпителия крыс. // Тезисы студенческой научной конференции 1992 года. — Ставрополь, 1992. - с.27-28.

2. Абдалкин М.Е., Булатова М.В., Горячева О.О. Влияние диуретиков на межклеточные соединения в биологических мембранах. //Фундаментальные исследования на основе издания лекарственных средств. — М., 1995. — с.З.

3. Абдалкин М.Е., Булатова М.В. О роли фиксированных воротных зарядов межклеточных соединений в переносе флуоресцеина через стенку мочевого пузыря лягушки. //Современное состояние и перспективы научных исследований в области фармации. — Самара, 1996. — с.212— 213.

4. Абдалкин М.Е. Исследование электрофоретической подвижности везикул базальных и люменальных мембран почечного эпителия крыс. //Фармакология водно — солевого обмена. — Чебоксары, 1993. — с.З.

»