Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Фармакологическая коррекция гестоза L-аргинином при моделировании дефицита оксида азота в эксперименте

11-4

1208

Ка правах г,::

Барсук Анна Александровна

Фармакологическая коррекция гестоза Ь-арпшином при моделировании дефицита оксида азота в эксперименте

14.03.06 фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Работа выполнена на базе Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор Покровский Михаил Владимирович

доктор медицинских наук Лазарева Галина Анатольевна

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Быстрова Наталья Анатольевна доктор медицинских наук Якушева Елена Николоаевна

Ведущая организация: ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита состоится « 2011 г. в /3 часов

на заседании диссертационного совета Д 208.039.03 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (305041, г. Курск, ул. К. Маркса, 3).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО КГМУ Минздравсоцразвития России

Автореферат разослан « ¿V »

Ученый секретарь диссертационного совета

РОССИЙСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ БИБЛИОТЕКА 2011

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Несмотря на то, что патогенез гестоза далек от полного понимания, в последние годы наибольшее внимание уделяется эндотелиальной дисфункции. Плацентарная ишемия приводит к высвобождению многочисленных плацентарных факторов, которые оказывают серьёзное влияние на кровоток и регуляцию сосудистого русла. Эти факторы включают в себя рецептор-1 растворимого фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) (sFlt-1), аутоантитело рецептора ангиотензина II (тип 1) (АТ1-АА) и цитокины (фактор некроза опухоли (TNF)-»), которые по очереди формируют масштабную дисфункцию эндотелия материнских сосудов. Эта дисфункция проявляется в качестве усиленного образования таких факторов, как эндотелии, активные формы кислорода (ROS), тромбоксан, 20-гидроксиэйкозатетраеновая кислота (20-НЕТЕ) и повышенная чувствительность к ангиотензину II. Кроме этого преэклампсия также связана с уменьшенным формированием сосудорасширяющих факторов (окись азота (N0) и простациклин. Эти изменения в функции сосудов ведут не только к гипертензии, но и к дисфункции многих органов, особенно у женщин с ранним проявлением преэклампсии. (Blaauw J. 2006, Germain A.M. 2007, McCord N. 2006, Noris M. 2004, Ranta V. 1999, Shaamash A.H. 2000).

Метилированные аналоги L-аргинина ассиметричный диметиларгинин (ADMA) и монометиларгинин (L-NMMA) являются эндогенными ингибиторами эндотелиальной окиси азота (eNOS) (Böger R.H. 2009, Sawidou M.D. 2003, Smith C.L. 2003, Speer P.D. 2008).

В последние годы обнаружено, что концентрации ADMA в материнской плазме гораздо выше у женщин с преэклампсией и, что повышенные концентрации ADMA являются одними из предикторов преэклампсии.

Таким образом, сформировалась фармакологическая мишень «ADMA-eNOS», которая явилась объектом настоящего исследования при преэклампсии.

Ранее было показано, что L-аргинин как монотерапия, так и в сочетании с антигипертензивными средствами на ADMA-подобной модели L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции эффективно, увеличивал активность эндотелиальной NO-синтазы и продукцию оксида азота и предотвращал развитие эндотелиальной дисфункции у крыс-самцов (Покровский М.В.2008, Залозных Я.И. 2007).

В связи с вышеизложенным, целью настоящей работы явилось изучение возможности коррекции ADMA-подобного L-NAME-индуцированного гестоза в эксперименте с помощью L-аргинина и его сочетания с амлодипином.

Цель исследования: Провести комплексное сравнительное изучение влияния L-аргинина и амлодипина и их сочетанного использования на течение экспериментального L-NAME индуцированного гестоза.

Задачи исследования:

1. Оценить развитие экспериментального гестоза при L-NAME-индуцированной модели эндотелиальной дисфункции с использованием

результатов функциональных проб, оценки плацентарной микроциркуляции, биохимических маркеров и результатов морфологических исследований.

2. Изучить влияние L-аргинина на течение экспериментального гестоза при моделировании L-NAME- индуцированной эндотелиальной дисфункции с использованием результатов функциональных проб и оценки плацентарной микроциркуляции, биохимических маркеров и морфометрических показателей.

3. Изучить влияние амлодипина на течение экспериментального гестоза при моделировании L-NAME- индуцированной эндотелиальной дисфункции с использованием результатов функциональных проб и оценки плацентарной микроциркуляции, биохимических маркеров и морфометрических показателей.

4. Изучить влияние сочетанного использования L-аргинина и амлодипина на течение экспериментального гестоза при моделировании L-NAME- индуцированной эндотелиальной дисфункции с использованием результатов функциональных проб и оценки плацентарной микроциркуляции, биохимических маркеров и морфометрических показателей.

5. Провести интегральный векторный анализ для комплексной оценки протективных эффектов L-аргинина и амлодипина при моделировании L-NAME-индуцированного гестоза.

Научная новизна:

В работе впервые предложен способ моделирования гестоза при L-NAME-индуцированной NO-дефицитной эндотелиальной дисфункции. Продемонстрировано, что экспериментальный гестоз характеризуется развитием выраженной артериальной гипертензии, нарушениями плацентарной микроциркуляции и протеинурией. Параллельно развивается комплекс изменений характерных для эндотелиальной дисфункции, выражающейся в изменениями соотношений сосудистых реакций на ацетилхолин (эндотелийзависимая вазодилятация) и нитропруссид (эндотелий независимая вазодилятация) с увеличением коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД) в 3 раза, резким снижением показателей биохимических маркеров (Total NO, экспрессии eNOS-синтетазы), а также характерной динамикой морфофукциональных показателей в плаценте и почечной ткани.

В работе впервые показано, что L-аргинин 200 мг/кг однократно в течение 7 суток внутрижелудочно оказывает протективное действие при экспериментальном гестозе на фоне L-NAME-индуцированной N0-дифицитной ЭД, выражающееся в нормализации плацентарной миркоциркуляции, снижении артериальной гипертензии, предотвращении протеинурии и нормализации соотношения эндотелийзависимой и эндотелийнезависимой вазодилатации.

Амлодипин 0,5 мг/кг однократно в течение 7 суток внутрижелудочно, как монотерапия также обладал эндотелиопротективными эффектами на выбранной модели патологии, однако микроциркуляция в плаценте и альбуминурия не предотвращались.

Сочетанное использование L-аргинина 200 мг/кг с амлодипином 0,5 мг/кг показало аддитивное протективное действие при экспериментальном гестозе, что выражалось в нормализации плацентарной миркоциркуляции, снижении артериальной гиперетензии, предотвращении протеинурии и нормализации соотношения эндотелезависимой и эндотелеонезависимой вазодилатации. Параллельно обнаружена положительная динамика морфологической картины в плацентарной и почечной тканях.

Научная новизна подтверждается 1 заявкой на получение патента РФ.

Практическая значимость:

В работе обоснована эффективность применения L-аргинина в качестве монотерапии и в сочетании с амлодипином при экспериментальном гестозе на фоне L-NAME-индуцированной NO-дифицитной ЭД в эксперименте. Показано, что использование L-аргинина позволяет нормализовать плацентарную микроциркуляцию, артериальное давление, предотвратить протеинурию, а также изменение соотношений сосудистых реакций на ацетилхолин (эндотелийзависимая вазодилятация) и нитропруссид (эндотелий независимая вазодилятация), предотвратить снижением показателей биохимических маркеров (Total NO, активность NO-синтетазы), улучшения морфологической картины в плацентарной и почечной тканях.

Полученные данные позволяют рекомендовать целенаправленные клинические испытания L-аргинина для профилактики гестоза как монотерапии, так и в сочетании с амлодипином.

Внедрение результатов научных исследований. Материалы диссертационного исследования используются в учебном процессе и научно-исследовательской работе ряда кафедр ГОУ ВПО КГМУ Росздрава, ГОУ ВПО БелГУ, ГОУ ВПО ВГМА им. Н.Н.Бурденко.

Апробация работы. Материалы работы доложены на итоговых научных сессиях и конференциях молодых ученых ГОУ ВПО КГМУ в 2009, 2010 и 2011 гг., XIV и V национальном конгрессе «Человек и лекарство». Апробация диссертации проведена на научно-практической конференции кафедр фармакологии, клинической фармакологии и фармакотерапии,

патофизиологии, гистологии, внутренних болезней №2, НИИ экологической медицины КГМУ. По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ, в том числе 4 в журналах рекомендуемых перечнем ВАК РФ, получено 1 положительное решение о выдаче патента на изобретение.

Положения, выносимые на защиту:

1. Экспериментальный гестоз при L-NAME-индуцированной NO-дефицитной эндотелиальной дисфункции характеризуется выраженной артериальной гипертензией, нарушениями плацентарной микроциркуляции и альбуминурией на фоне изменений соотношений сосудистых реакций на ацетилхолин (эндотелийзависимая вазодилятация) и нитропруссид (эндотелий независимая вазодилятация) с увеличением коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД) в 3 раза, резким снижением показателей биохимических маркеров (Total NO, активность NO-синтетазы), а также характерной динамикой морфофункционапьных показателей сосудов плаценты.

2. Ь-аргинин 200 мг/кг однократно в сутки в течение 7 дней внутрижелудочно оказывал протективное действие при экспериментальном гестозе на модели Ь-КАМЕ-индуцированной ЫО-дефицитной ЭД, выражающееся в нормализации артериального давления, плацентарной микроциркуляции, предотвращением протеинурии, снижением КЭД и значений биохимических маркеров и морфометрических показателей плаценты, характеризующих ЭД.

3. Амлодипин 0,5 мг/кг однократно в сутки в течение 7 дней внутрижелудочно, как монотерапия также обладал протективными эффектами при экспериментальном гестозе, снижая артериальное давление и КЭД, однако не нормализовал плацентарную микроциркуляцию, АД и морфологические показатели сосудов плаценты.

4. Сочетанное использование Ь-аргинина 200 мг/кг с амлодипином 0,5 мг/кг показало аддитивное протективное действие при экспериментальном гестозе, что выражалось в нормализации плацентарной микроциркуляции, снижении артериальной гипертензии, предотвращении протеинурии и нормализации КЭД. Параллельно обнаружена положительная динамика морфометрических показателей плаценты и почечной ткани.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, результатов исследования, обсуждения полученных результатов, выводов и списка используемой литературы, включающего 164 источника, из них 39 отечественных и 125 зарубежных авторов. Диссертация изложена на 120 страницах машинописи, содержит таблиц - 13, рисунков - 53.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Моделирование Ь^АМЕ-икдуцированного гестоза и оценка эндотелийзависимых и эндотелийнезависимых сосудистых реакций.

Опыты проводились на белых беременных крысах самках линии ^^^аг массой 250-300 г. Начиная с 14 суток беременности.

Для формирования групп беременных животных с заданными сроками, находящихся на раздельном содержании, самок (3 животных) подсаживали к самцам (2 животных) на 36 часов. Затем животных рассаживали и через 14 суток в условии эфирного сна пальпаторно определяли наличие беременности. В наших экспериментах беременность наступала в 30-40%.

Для моделирования гестоза с 14 суток беременным самкам вводили Ы-нитро-Ь-аргинин метиловый эфир (Ь-ЫАМЕ) ежедневно однократно в сутки, внутрибрюшинно в дозе 25 мг/кг на протяжении 7 дней.

На 8 день моделирования гестоза (21 сутки беременности) под наркозом (хлоралгидрат 300 мг/кг) вводили катетер в левую сонную артерию для регистрации показателей, болюсное введение фармакологических агентов осуществляли в правую бедренную вену. Показатели гемодинамики: систолическое артериальное давление (САД), диастолическое артериальное давление (ДАД) и частоту сердечных сокращений (ЧСС) измеряли непрерывно посредством датчика и компьютерной программы '^^Кпо\у1е<3§е версии

З.8.1.". Функциональные пробы: внутривенное введение ацетилхолина (40мкг/кг) (J.B.Laursen, 1997) и нитропруссида натрия (30 мкг/кг) (Галаган М.Е., 1991).

Биохимические маркеры эндотелиальной дисфункции. Нами использована модификация метода определения стабильных метаболитов NO, (Метельская В.А., Туманова Н.Г., 2005). Принцип метода заключается в одновременном восстановлении нитратов в нитриты в присутствии хлористого ванадия и реакции диазотирования с последующим развитием окраски, интенсивность которой определяли спектрофотометрически при длине волны 540 нм. Анализ 100 мкл депротеинизированной сыворотки проводили в 96-ти луночных планшетах с плоским дном. Чувствительность метода на приборе Labsystems Multiskan МСС/340 составляет 1,7 мкМ. Для колориметрического определения нитрит-иона использовали реактив Грисса, состоящий из равных частей раствора I (0,05% раствор N-нафтилэтилендиамина в воде) и раствора II (1% раствор сульфаниламида в 30% уксусной кислоте. Оба раствора хранятся в темноте при температуре 4°С в течение нескольких месяцев. Для приготовления раствора хлористого ванадия, 400 мг VC13 растворяли в 50 мл IN НС1 с последующим фильтрованием через бумажный фильтр. Всегда использовали свежеприготовленный раствор.

Уровень метаболитов NO (т.е. суммарную концентрацию нитратов и нитритов, NOx) определяли колориметрическим методом по развитию окраски в реакции диазотирования нитритом сульфаниламида, входящего в состав реактива Грисса. Для построения калибровочной кривой использовали 1М раствор NaN02 в воде, который хранили при температуре -20°С; перед употреблением его разводили в 1000 раз и готовили серию разведений для построения кривой.

Уровень экспрессии эндотелиальной синтазы оксида азота (e-NOS) определяли в клеточном лизате с небольшими модификациями. По окончании инкубации клеток с исследуемой сывороткой человека их трижды промывали 5 мМ фосфатным буфером, рН 7,4, клетки из одной лунки собирали в 100 мкл лизирующего буфера: 0,1 M ацетат Na, рН 6,8, содержащего 5 шМ ЭДТА и 3% додецилсульфат Na (SDS), центрифугировали 10 мин. при 1000 х g и подвергали электрофорезу в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии SDS, согласно методу (ссылка из статьи).В лунку наносили 20 мкг белка. На каждую пластину наносили смесь предварительно окрашенных белков-метчиков с диапазоном молекулярной массой (М.м.) 7000-200000 Да (Bio-Rad Kaleidoscope Prestained Standards, USA), что позволяло идентифицировать полосу, соответствующую eNOS (М.м. которой 140000 Да). Белок в клеточном лизате определяли по методу Lowry с использованием БСА в качестве стандарта.

По окончании электрофореза осуществляли перенос белков с геля на нитроцеллюлозную мембрану Вестерн-блот (60 В, 1 час) (ссылка). Эффективность переноса определяли с помощью обратимого окрашивания

мембран белковым красителем Ponceau Red (Sigma, USA). После трёхкратной отмывки мембраны 5 мМ фосфатным буфром pH 7,4, содержащим 150 мМ NaCl и 0,05 % твина-200, её в течение ночи обрабатывали раствором поликлональных кроличьих антител против eNOS человека (BD Transduction Labs, USA), разведённых (в соотношении 1:500) в 5 мМ фосфатном буфере, pH 7,4, содержащем 0,1% азида натрия. Затем мембрану отмывали 7 раз по 10 мин в том же буфере. В течение часа мембрану инкубировали с разведёнными в соотношении 1:300 вторыми антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена (goat anti-rabbit IgG antibodies,Sigma, USA). При этом неспецифическое связывание коньюгатом блокировали добавлением в буфер 5% обезжиренного сухого молока. Затем мембрану снова отмывали в фосфатном буфере (7 раз по 10 мин).

Детекцию полосы eNOS проводили методом усиленной хемолюминесценции (ECL). После отмывки в фосфатном буфере 7 раз по 10 мин мембрану обрабатывали соответствующим раствором (ECL, Amersham), как указано производителем, экспонировали на плёнку Hyperfilm-ECL (Amersham.UK) в течение 2 ч в темноте. Полоску, соответствующую eNOS детектировали в соответствии с её молекулярной массой, устанавливаемой по сравнению с белками-метчиками. Плёнку высушивали на воздухе, полосы сканировали и рассчитывали площадь под кривой с использованием программы Total Lab.

Оценка плацентарной микроциркуляции. Для получения данных о состоянии микроциркуляции в плаценте на 21 сутки беременности под наркозом в 5 точках измеряли уровень микроциркуляции на расстоянии 1 мм от края плаценты. Для получения данных о состоянии микроциркуляции использовали оборудование производства компании Biopacsystems: полиграф МР100 с модулем лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ) LDF100C и инвазивным игольчатым датчиком TSD144, который устанавливался непосредственно на поверхность органа. Регистрация и обработка результатов ЛДФ производилась с помощью программы AcqKnowledge версии З.8.1., значения микроциркуляции выражались в перфузионных единицах (ПЕ) среднее из 5 измерений.

Сбор суточной мочи и оценка протеинурии. Сбор мочи у интактных и опытных групп беременных крыс проводился с использованием специальных метаболических клеток. Животное помещалось в клетку на сутки с обеспечением свободного доступа к воде.

Обоснование доз и дизайн эксперимента. Согласно данным литературы кардиотропные эффекты L-аргинина в экспериментах на крысах обнаруживаются в диапазоне доз от 10 до 600 мг/кг. При этом различают малые дозы 10-30 мг/кг, что соответствует суточной дозе L-аргинина в качестве БАД. Большие дозы L-аргинина 200 - 600 мг/кг используются в комплексной терапии ИБС, ХСН для коррекции эндотелиальной дисфункции и в качестве дополнительной терапии к донорам NO - нитратам.

В хронических экспериментах при моделировании L-NAME-опосредованного дефицита оксида азота у самцов, проведенных в нашей 8

лаборатории Ь -аргинин вводили в дозе 200 мг/кг один раз в сутки внутрибрюшинно в течение 7 дней через 30 минут после введения Ь^АМЕ. Принятая схема соответствует основной массе экспериментальных исследований на крысах.

Амлодипин «Норваск» - антагонист кальция дигидропиридинового ряда согласно стандартам лечения применяется у беременных женщин для купирования и профилактики артериальной гипертензии в дозах 5 и 10 мг. При пересчете начальной дозы амлодипина 5 мг на крысу с учетом видовой специфичности по формуле Улановой доза амлодипина для крыс составила 0,5 мг/кг.

Мы использовали амлодипин в дозе 0,5 мг/кг, что соответствует данным доступной литературы и выявляет эффективное гипотензивное и кардиопротективное препаратов в экспериментах, ранее проведённых в нашей лаборатории.

Комбинированное использование Ь-аргинина 200 мг/кг (внутрижелудочно) плюс амлодипин 0,5 мг/кг (внутрижелудочно) проводилось по вышеописанному протоколу один раз в сутки в течение 7 дней на фоне введения Ь-ЫАМЕ.

Дизайн эксперимента состоит из следующих блоков:

Контрольная группа.

Моделирование Ь-ЫАМЕ-индуцированного гестоза.

Оценка эффективности Ь-аргинина 200 мг/кг и амлодипина 0,5 мг/кг в виде монотерапии.

Оценка эффективности сочетанного применения Ь-аргинина 200 мг/кг с амлодипином 0,5 мг/кг.

Протокол эксперимента состоит из следующих разделов:

Спаривание животных и пальпаторное определение факта беременности на 10 сутки.

Моделирование Ь-ЫАМЕ-индуцированного гестоза у беременных крыс (с 14 по 21 сутки) и его коррекция с помощью аргинина, амлодипина и их сочетаний в течение 7 суток.

Помещение животных в метаболическую клетку и сбор суточной мочи с последующим определением протеинурии.

На 8-е сутки моделирования гестоза (21 сутки беременности) в условиях хлоралгидратного наркоза оценка плацентарной микроциркуляции, оценка эндотелийзависимых и эндотелийнезависимых реакций, артериального давления на внутривенное одномоментное введение ацетилхолина и нитропруссида натрия.

Взятие венозной крови для определения биохимических маркеров.

Взятие почек и плаценты для патоморфологических исследований.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Исследование динамики функциональных, биохимических и морфологических показателей при моделировании Ь-ОДМЕ-индуцированного гестоза.

Блокада МО-синтазы, вызванная 7-дневным введением Ь-ЫАМЕ беременным крысам, приводила к нарушению взаимоотношений вазодилатирующих и вазоконстрикторных механизмов регуляции сосудистого тонуса, о чем свидетельствуют результаты сосудистых проб на эндотелий-зависимое расслабление (ацетилхолин) и эндотелий-независимое (нитропруссид натрия). Математическое выражение описанного явления представлено нами в виде коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД), являющегося отношением площади среднего артериального давления на нитропруссид к площади среднего артериального давления на ацетилхолин (рис. 1,2). В группе животных с Ь-ЫАМЕ происходило увеличение КЭД с 1,28±0,23 у интактных беременных животных до 3,06±0,32 (р<0,05).

Кроме этого, наблюдался значительный подъем систолического и диастолического артериального давления с 125±6,3 и 82,0±5,8 до 183,1±9,4 и 136,7±7,4 мм.рт.ст., соответственно (рис.3).

Рис. 1. Кривые САД, ДАД, ЧСС при проведении функциональной пробы на эндотелийзависимую вазодилатацию (внутривенное введение ацетилхолина 40 мкг/кг).

Рис. 2. Кривые САД, ДАД, ЧСС при проведении функциональной пробы на эндотелийзависимую вазодилатацию (внутривенное введение нитропруссида натрия 30 мкг\кг).

Введение Ы^АМЕ приводило также к увеличению протеинурии с 0,90±0,10 г/л до 1,88±0,19 г/л (р<0,05) (рис.3).

Динамика биохимических маркеров Ь^АМЕ-индуцированного гестоза заключалась в снижении концентрация нитрит-ионов (ЫОх) и снижении экспрессии эндотелиальной ЫО-синтазы (еМОБ). В группе интактных животных и животных с патологией эти показатели составил соответственно 72,9±3,8% и 21,4±4,7%.

Для более полной оценки нарушений возникающих при моделировании данной патологии нами было проведено исследование микроциркуляции в плаценте. Введение блокатора МО-синтазы приводило к значительному снижению показателя микроциркуляции в плаценте с 425,90±39,55 до 237,50±38,18 (р<0,05) (рис. 3).

Гистологическая картина почек у интактных беременных крыс (21 сутки беременности) характеризовалась нормальным полнокровием клубочков, без утолщения базальной мембраны капилляров, которые выглядели слабоконтурированными. Мелкие артерии в корковом веществе без признаков гипертрофии и повреждений эндотелия.

к 80,0

ч

о & 60,0

Е § 40,0

н

о 20,0

£

0,0

-434т-

N N

ТЯнкпоинпкУляиин

□ 1 - Ингактные ■ 2 - Ь-КАМЕ

* - при р<0,05 в сравнении с группой интактных животных

Рис. 3. Функциональные, биохимические и морфологические показатели при моделировании Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита оксида азота.

Примечание. Здесь и везде далее: АД - артериальное давление, КЭД -коэффициент эндотелиальной дисфункции, еЫОБ - экспрессия ЫО-синтазы, N0.4 - концентрация конечных стабильных метаболитов оксида азота, у.е -условные единицы, П.е - перфузионные единицы.

При микроскопии почечной ткани животных получавших Ь-ЫАМЕ на фоне ишемии наблюдались клиновидные участки некроза, атрофии паренхимы с коллапсом стромы, ее лимфоидной инфильтрацией. Выраженные диффузные изменения почечных телец в виде сморщивания, гиалиноза и склероза, гиалиноз и склероз артерий. Эпителий канальцев уплощен, на значительных участках десквамирован. Практически все канальцы заполнены плотными гиалиновыми цилиндрами. В контрлатеральных почках наблюдались закономерные компенсаторные изменения в виде гипертрофии почечных телец (средний диаметр 87,4+0,8; в норме 72,6+0,8 мкм) с расширением полости капсулы, составившей 19,5% площади (в норме 14,6%), что в сочетании с диффузным полнокровием свидетельствует о развитии гиперфильтрации. Заметной реакции мезангия не отмечено: среднее количество клеток на клубочек составило 31,0+0,6, (в норме 37,8+0,9) (рис 4).

Рис. 4. Гистологическая картина почки интактного животного и при моделировании Ь-ЫАМЕ-индуцированного гестоза

Плацента крыс на 21 сутки беременности без признаков повреждения с нормальным эндотелием. Морфологическая картина плаценты при Ь-ЫАМЕ-индуцированном гестозе проявлялась в виде ишемии ворсин и интервиллезных пространств и слущиванием эндотелия в сосудах плаценты. В отдельных случаях это приводило к появлению очагов некроза децидуальных клеток в ткани плаценты. На внешней поверхности плаценты наблюдались массивные отложения фибрина (рис 5).

Таким образом, вышеизложенное свидетельствует о том, что длительное в течение 7 суток внутрибрюшинное введение Ы^АМЕ в дозе 25 мг/кг вызывает у беременных самок крыс комплекс функциональных , биохимических и морфологических изменений, связанных с развитием дефицита N0 вследствие блокады МО-синтетазы. В частности, на 8-е сутки развивалась выраженная гипертензия и эндотелиальная дисфункция, резко уменьшался уровень нитрит-ионов. ЛДФ-метрия обнаружила нарушения

плацентарной микроциркуляции на фоне протеинурии. Гистологически обнаруживались признаки ишемических повреждений почек и плаценты. Описанный симптомокомплекс клинически можно экстрапалировать на развитие гестоза.

Рис. 5. Гистологическая картина плаценты интактного животного и при моделировании Ь-ЫАМЕ-индуцированного гестоза

Исследование эндотелиопротекгивных эффектов монотеропии L-аргинином и амлодипином при моделировании L-NAME-индуцированного гестоза.

Длительное, в течение 7 суток, ежедневное внутрижелудочное введение L-аргинина (200 мг/кг) на фоне L-NAME-индуцированного гестоза приводило к достоверному снижению КЭД до 1,50±0,25, что в два раза меньше, чем у не леченных животных (р<0,05). Отмечалось так же, предотвращение увеличения артериального давления однако значения не достигали целевого уровня (рис.6).

Исследование микроциркуляции плаценты у животных получавших L-аргинин (200 мг/кг) обнаружило ее существенное улучшение (почти в 2 раза) и значения не отличались от интактных беременных крыс. Параллельно обнаружено снижение протеинурии до уровня интактных животных 0,98±0,11 г/л. Отмечалась положительная динамика показателей NO-продуцирующей функции эндотелия, которая заключалась в статистически значимом (р<0,05) подъеме концентрации нитрит-ионов (NOx) и экспрессии эндотелиальной N0-синтазы (eNOS) по сравнению с группой не леченных животных.

Использование в монотеропии амлодипина приводило к менее выраженным положительным эффектам, которые заключались в снижении АД и коэффициента эндотелиальной дисфункции. На показатели NO-продуцирующей функции эндотелия и микроциркуляцию в плаценте какого, либо значимого эффекта амлодипин не оказывал.

114,1

-NOx~

116,1*

—— б i ,2 _

1 I -1

3

x

« 2 o

¿I

r

gs^ Мт'пл.щптопдипа_Qx

342*!

sa

202

1

72,9

e-NOS

21,4

38*

.24,3.

□ 1 - интактные Ш 2-L-NAME ES 3- L-NAME+L-Аргинин 0 4- L-NAME+Амлодипин

* - при p<0,05 в сравнении с группой интактных животных

Рис. 6. Функциональные, биохимические и морфологические показатели при монотеропии L-аргинином и амлодипином при моделировании L-NAME-индуцированного гестоза

Исследование эндотелиопротективных эффектов сочетанного применения L-аргинином и амлодипином при моделировании L-NAME-нндуцированного гестоза.

Сочетанное использование L-аргинина 200 мг/кг и амлодипина 0,5 мг/кг приводило к более значительному снижения артериального давления при моделировании L-NAME-индуцированного гестоза, которые достоверно отличались от показателей у животных, получавших L-NAME. В то же время, целевой уровень АД как при монотерапии, так и комбинированной не достигнут, однако, в наибольшей степени приближался к значениям интактной группы их всех серий проведенных нами экспериментов (рис. 7).

Комбинированная терапия указанными прераратами оказывало выраженное эндотелиопротективное действие на модели L-NAME-индуцированного гестоза. При этом КЭД составил 1,39±0,16 (рис. 7.). Обращает на себя внимание, что это лучше чем при монотерапии

амлодипином (1,48±0,21) и Ь-аргинином (1,5±0,25). В сочетании с описанными сведениями о благоприятном влиянии сочетанного использования Ь-аргинина и амлодипина на исходные цифры артериального давления при моделировании Ь-ЫАМЕ-индуцированного гестоза, возможно предположить, что в основе эффективности предложенной комбинации лежит влияние на два разных патогенетических звена. С одной стороны - Ь-Аргинин, являясь донатором N0, компенсирует нарушения выработки N0 в эндотелии, а с другой, антагонист кальция амлодипин предотвращает кальциевую перегрузку сарколеммы гладкомышечных элементов сосудистой стенки.

зб*Н113^124*н1да

1

72,9 е-Шв

21,4 38*

П 1 24,3"ТТ -ЖЛ1

1 2 3 4 5

□ 1 - интактные Ш 2-Ь-ЫАМЕ й 3- Ь-ЫАМЕ+Ь-Аргинин 0 4- Ь-ЫАМЕ+Амлодипин Ц 5- Ь-ЫАМЕ+Ь-Аргинин + Амлодипин

* - при р<0,05 в сравнении с группой интактных животных

Рис. 7. Функциональные, биохимические и морфологические показатели при комбинированном использовании Ь-аргинина и амлодипина при моделировании Ь-ЫАМЕ-индуцированного гестоза

Таким образом, полученные данные свидетельствуют об эффективности сочетанного использования Ь-аргинина 200 мг/кг с амлодипином 0,5 мг/кг коррекции Ь-ЫАМЕ-индуцированной патологии, что позволяло достичь более низких цифр АД при наиболее эффективном снижении КЭД.

Сочетанное применение L-аргинина 200 мг/кг и амлодипина 0,5 мг/кг по своей эффективности влияния приближалось к действию L-аргинина 200 мг/кг и значения eNOS составили 42,1±4,6%, а концентрация NOx, соответственно, П5,7±4,8 мкМоль. Следует отметить, что в экспериментах выполненных ранее, в нашей лаборатории на самцах, обнаружена аналогичная закономерность дозо-зависимого увеличения нитрит-ионов при экзогенном введении L-аргинина и донаторов N0.

Таким образом на модели L-NAME-индуцированного гестозасочетанное применение L-аргинина (200 мг/кг) и амлодипина (0,5 мг/кг) полностью предотвращали падение содержания концентрации нитрит-ионов NOx и незначительно увеличивали экспрессию e-NOS, что, вероятно, обусловлено вкладом L-аргинина, так как отдельно амлодипин не влиял на эти показатели.

На 21 сутки беременности при моделировании гестоза обнаружили ее существенное снижение до 237,5±38,2 ПЕд по сравнению с интактными беременными (425,9±39,6 ПЕд). Курсовое назначения L-аргинина (200 мг/кг перорально однократно в течение 7 суток) вызывало существенное улучшение микроциркуляции до средних значений 342,5±29,3 ПЕд, что было достоверно выше чем у беременных самок с гестозом (р<0,05), но не достигало значений микроциркуляции у интактных беременных крыс. При этом, в отличие от животных с L-NAME-индуцированной патологией на ЛДФ-кривой в большей степени проявлялись кардиальные и дыхательные волны, что свидетельствует о нормализации динамической составляющей микроциркуляции и косвенно предполагает улучшение реалогической составляющей. Комбинированное использование препаратов полностью восстанавливала микроциркуляцию в плаценте.

Сочетанное использование L-аргинина 200 мг/кг и амлодипина 0,5 мг/кг полноятью предотвращало развитие протеинурии при моделировании L-NAME-индуцированного гестоза у беременных крыс.

Следует обратить внимание на то, что это наблюдалось на фоне более низких значений артериального давления, повышения плацентарной микроциркуляции и уровня нитрит-ионов в сыворотке крови, что свидетельствует о комплексном протективном действии сочетанного применения L-аргинина и амлодипина при АДМА-подобном гестозе у экспериментальных животных.

При морфологическом исследовании почек и плаценты также обнаружен протективный эффект сочетанного использования L-аргинина и амлодипина (табл. 1.: рис. 8. - 9.).

При морфологическом исследовании сосудов почек у животных получавших L-NAME на фоне лечения сочетанием L-аргинина (200 мг/кг) и амлодипина (0,5 мг/кг) картина резко отличалась от контрольной группы беременных крыс. Мелкие артерии коркового вещества почки без признаков гипертрофии мышечного слоя. Капилляры почечных клубочков полнокровны, базальные мембраны не утолщены, симптом «проволочных петель» отсутствует (рис 8).

Таблица 1.

Влияние сочетанного применения Ь-аргинина и амлодипина на комплекс патоморфологических изменений в сосудах почек и плаценты при моделировании Ь-ЫАМЕ-

Ыпп Серия экспериментов Комплексная оценка в баллах

1. Интактные беременные самки 0-1

2. Ь-ЫАМЕ-индуцированный гестоз 5-6*

3. Ь-ЫАМЕ + Ь-аргинин 200 мг/кг 3-4*

4. Ь-ЫАМЕ + амлодипин 0,5 мг/кг 4-5*

5. Ь-ЫАМЕ + Ь-аргинин 200 мг/кг + амлодипин 0,5 мг/кг 2-3

Примечание: * - Р<0,05 по сравнению с интактными беременными самками, по критерию

Рис. 8. Гистологическая картина почки при моделировании Ь-ЫАМЕ-индуцированного гестоза и его комплексной коррекцией Ь-Аргинином и амлодипином

Морфологическая картина плаценты при Ь-ЫАМЕ-индуцированном гестозе интервиллезных пространств. На внешней поверхности плаценты наблюдались слабые отложения фибрина (рис 9). Плацента без патологических изменений, ворсины и интервиллезные пространства полнокровны. Интегральная оценка показала 2-3 балла, что явилось лучшим значением в нашем исследовании.

Таким образом, при морфологическом исследовании сосудов почек и плаценты обнаружено выраженное протективное действие сочетанного использования Ь-аргинина 200 мг/кг и амлодипина 0,5 мг/кг, выражающееся в приближении морфологической картины к интактным беременным животным без признаков ишемических повреждений как это отмечалось у контрольной группы с Ь-ЫАМЕ-индуцированным гестозом.

Сочетанное использование Ь-аргинина 200 мг/кг и амлодипина 0,5 мг/кг оказывало выраженное эндотелиопротективное действие на модели Ь-ЫАМЕ-

ЫМАМЕ

Ь-ЫАМЕ + Ь-Аргинин + Амлодипин

Не наблюдались клиновидные участки некроза, атрофии паренхимы с коллапсом стромы, ее лимфоидной инфильтрацией. Отсутствовали диффузные изменения почечных телец в виде сморщивания, гиалиноза и склероза, гиалиноз и склероз артерий. Заметной реакции мезангия не отмечено: среднее количество клеток на клубочек составило 36,1+0,5, (в норме 37,8+0,9).

индуцированного гестоза, что выражалось в преобладании эндотелийзависимого расслабления сосудов и снижении КЭД до уровня интактных животных, а также в полном предотвращении снижения содержания нитрит-ионов >Юх.

Ь-ЫАМЕ

Ь-ЫАМЕ + Ь-Аргинин + Амлодипин

Рис. 9. Гистологическая картина плаценты при моделировании Ь-ЫАМЕ-индуцированного гестоза и его комплексной коррекцией Ь-Аргинином и амлодипином

Одновременно результаты исследований микроциркуляции плаценты выявили предотвращение снижения показателей перфузии на фоне полного предотвращения протеинурии. Морфологические исследования обнаружили предотвращение под влиянием сочетанного применения Ь-аргинина 200 мг/кг и амлодипина 0,5 мг/кг развития нарушений в сосудистом эпителии почечных артерий и ишемических изменений в плаценте. В то же время, следует отметить, что сочетанная терапия Ь-аргинином 200 мг/кг амлодипином 0,5 мг/кг не достигала заданных значений артериального давления, однако значения максимально приближались к группе интактных беременных животных.

Таким образом, комбинацию Ь-аргинина с амлодипином на модели Ь-ЫАМЕ-индуцированного гестоза следует рассматривать как оправданную, что позволяет за счет патогенетически обоснованного воздействия на нитроэргическую и антикальциевую системы рекомендовать к широкому клиническому изучению.

Для оценки эндотелиопротективного действия исследуемых препаратов нами был использован комплекс функциональных проб, биохимических маркеров и результатов морфологических исследований, позволяющий дать интегральную характеристику эндотелиальной функции сердечно-сосудистой системы. С этой целью значения САД, ДАД, КЭД, Протеинурия, ЫОх и Оценка в баллах морфологических изменений (ОМИ) были представлены в процентном отношении от соответствующих значений группы интактных животных, принятых за 100%, с последующим расчетом площадей векторных диаграмм, которые выражались в условных единицах (усл. ед.) (рис. 10).

-СЩ-

ДАД

КЭД

Прогеинуоий

Интактные: Б = 5,48±0,321 усл. ед.

САД

Протеинурия

ГЛУАМЕ: Э = 17 5±0,63 усл. ед.

САД

оми

дед

КЭД

ДАД

КЭД

Протеинурия

Ь-аргнннн: Э = 11,7б±0,57* усл. ед.

Праге журия

Лмлодипин: Б =13,16±0,591 усл. ед.

САД

ДАД

Рис. 10. Площади векторных диаграмм функциональных, биохимических и морфологических показателей при коррекции эндотелиальной дисфункции Ь-Аргенином 200 мг/кг, Амлодипином 50 мг/кг и их комбинацией. Примечание. 1 - при р<0,05 в сравнении с группой животных, получавших Ь-ЫАМЕ.

Протеинурия

Ь-аргинин+Амлвдипин: Я = 9,62±0,45' усл. ед.

Сравнивая площади векторных диаграмм, мы получили выраженные различия между группой интактных животных и животных с экспериментальным гестозом. Значение площади векторной диаграммы в

19

группе с Ь-ЫАМЕ- индуцированным гестозом оказалось увеличенным более чем в 3 раза по сравнению с интактной группой (рис. 10).

Наиболее выраженный эффект от лечения наблюдается в группе животных с комбинированным использованием Ь-Аргинина и Амлодипина, что выражалось в снижении площади векторной диаграммы на 45% и подтверждает их положительное фармакодинамическое действие на модели Ь-NAME-индyциpoвaннoгo гестоза (рис. 10).

ВЫВОДЫ

1. Длительное в течение 7 суток внутрибрюшинное введение Ь-КАМЕ в дозе 25 мг/кг вызывало у беременных самок крыс комплекс функциональных, биохимических и морфологических изменений ассоциированных с МО-дефицитной эндотелиальной дисфункцией. На 8-е сутки развивалась выраженная гипертензия (183,1+9,4 и 136,7+7,4 мм.рт.ст.), в 3 раза увеличивался коэффициент эндотелиальной дисфункции (КЭД), резко, в 2,5 раза, уменьшался уровень нитрит-ионов. ЛДФ-метрия обнаружила более чем 2-х кратное снижение плацентарной микроциркуляции на фоне протеинурии. Гистологически обнаруживались признаки ишемических повреждений почек и плаценты.

2. Ь-аргинин в дозе 200 мг/кг проявлял выраженное эндотелиопротективное действие на модели Ь-ЫАМЕ-индуцированного гестоза, что выражалось в снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции КЭД до уровня интактных животных, а также в снижении содержания нитрит-ионов. Одновременно обнаружено улучшение плаыентарной микроциркуляции на фоне отсутствия протеинурии. Морфологические исследования обнаружили предотвращение под влиянием Ь-аргинина 200 мг/кг развития нарушений в сосудистом эндотелии почечных артерий и ишемических изменений в плаценте.

3. Амлодипин в дозе 0,5 мг/кг проявлял эндотелиопротективное действие на модели Ь-МАМЕ-индуцированного гестоза, что выражалось в снижении КЭД до уровня интактных животных и предотвращении протеинурии. Однако, под влиянием амлодипина не наблюдалось предотвращения снижения экспрессии еЫОБ и содержания нитрит-ионов и нормализации микроциркуляции плаценты. Морфологические исследования обнаружили предотвращение под влиянием амлодипина развития нарушений в сосудистом эндотелии почечных артерий и ишемических изменений в плаценте. Монотерапия амлодипином 0,5 мг/кг не достигала заданных значений артериального давления.

4. Сочетанное использование Ь-аргинина 200 мг/кг и амлодипина 0,5 мг/кг оказывало выраженное эндотелиопротективное действие на модели Ь-ЫАМЕ-индуцированного гестоза, что выражалось в снижении КЭД до уровня интактных животных, а также в полном предотвращении снижения содержания нитрит-ионов, нормализации плацентарной микроциркуляции и протеинурии. Сочетанная терапия Ь-аргинином 200 мг/кг амлодипином 0,5 мг/кг позволяла

наиболее существенно снизить артериальное давление, показатели которого приближались к группе интактных беременных животных.

5. Интегральный векторный анализ эффективности протективного действия L-аргинина и амлодипина при L-NAME- индуцированном гестозе показал, что комбинированное применение L-аргинина и амлодипина проявляет положитёльное фармакодинамическое взаимодействие, что предполагает различные патогенетические точки приложения действия и позволяет расположить исследуемые препараты в следующей последовательности амлодипин 0,5 мг/кг < L-аргинин 200 мг/кг < L-аргинин 200 мг/кг + амлодипин 0,5 мг/кг.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Моделирование L-NAME-индуцированного гестоза у крыс / A.A. Барсук, В.В. Гуреев, М.В. Покровский и др., // Актуальные вопросы фармакологии и фармации: сб. трудов межвуз. науч. конф. посвящ. памяти проф. Владислава Васильевича Пичугина и 75-летию КГМУ. - Курск, 2009. - С. 104

2. Использование L-аргинина в профилактике развития L-NAME-индуцированного гестоза в эксперименте / В.В. Гуреев, А.А.Барсук, Е.В. Проскурякова и др., // Актуальные вопросы фармакологии и фармации: сб. трудов межвуз. науч. конф. посвящ. памяти проф. Владислава Васильевича Пичугина и 75-летию КГМУ. - Курск, 2009. - С. 165

3. Комбинированное использование L-аргинина и амлодипина в коррекции L-NAME-индуцированного гестоза у крыс / М.В. Покровский, Г.А. Лазарева, A.A. Барсук и др., // Актуальные вопросы фармакологии и фармации: сб. трудов межвуз. науч. конф. посвящ. памяти проф. Владислава Васильевича Пичугина и 75-летию КГМУ. - Курск, 2009. - С. 289

4. Использование амлодипина в коррекции L-NAME-индуцированного гестоза крыс / Е.В. Проскурякова, A.A. Барсук, В.В. Гуреев и др., // Актуальные вопросы фармакологии и фармации: сб. трудов межвуз. науч. конф. посвящ. памяти проф. Владислава Васильевича Пичугина и 75-летию КГМУ. - Курск, 2009. - С.304

5. Амлодипина в коррекции L-NAME-индуцированного гестоза крыс / Е.В. Проскурякова, A.A. Барсук, В.В. Гуреев и др., // XVII Рос. нац. конгр. «Человек и лекарство»: сб. материалов конгр.; тез. докл. (г. Москва, 12-16 апреля 2010). - М., 2010. - С. 707

6. L-аргинин в профилактике развития L-NAME-индуцированного гестоза у крыс / В.В. Гуреев, A.A. Барсук, Е.В. Проскурякова и др. // XVII Рос. нац.

конгр. «Человек и лекарство»: сб. материалов конгр.; тез. докл. (г. Москва, 1216 апреля 2010). - М., 2010. - С.601

7. Сочетанное использование L-аргинина и амлодипина в коррекции L-NAME-ндуцированного гестоза в эксперименте / М.В. Покровский, Г.А. Лазарева, A.A. Барсук и др. // XVII Рос. нац. конгр. «Человек и лекарство»: сб. материалов конгр.; тез. докл. (г. Москва, 12-16 апреля 2010). - М., 2010. - С.704

8. Амлодипин в коррекции L-NAME-ндуцированного гестоза крыс / Е.В. Проскурякова, A.A. Барсук, В.В. Гуреев и др. // XVII Рос. нац. конгр. «Человек и лекарство»: сб. материалов конгр.; тез. докл. (г. Москва, 12-16 апреля 2010). - М., 2010. - С.575

9. Фармакологическая коррекция L-аргинином ADMA-eNOS-ассоциироваиных мишеней при экспериментальной преэклямпсии / М.В. Покровский, Т.Г. Покровская, В.В. Гуреев и др. // Кубанский науч. мед. вест.-2010.-№ 1.-С.-85.

10. Реалии и перспективы фармакологической коррекции ADMA-eNOS — ассоциированных путей при преэклампсии / М.В. Покровский, Н.Г. Филиппенко, М.В. Корокин и др. // Рациональная фармакотерапия в кардиологии. - 2010. - № 6. - С. 882 - 887.

11. Пути коррекции NO-дефицитного состояния при патологии беременных в эксперименте / В.В. Гуреев, М.В. Покровский,

О.С. Полянская, А.П. Почечун, Е.А. Климова, A.A. Барсук // Научные ведомости Белгород, гос. ун-та. Серия: Медицина. Фармация. -2011. -№ 4(99). Выпуск 13/2. - С. 44-48.

12. Влияние фактора роста эндотелия сосудов VEGF на выработку NO / A.A. Арустамова, A.C. Белоус, М.В. Покровский, В.И. Якушев,

A.A. Барсук, О.С. Гудырев, М.В. Корокин // Научные ведомости Белгород, гос. ун-та. Серия: Медицина. Фармация. - 2011. - № 4(99). Выпуск 13/2. - С. 67-70.

13. L-NAME-индуцированный гестозу крыс / А.А.Барсук, Н.В.Мальцева, О.С.Полянская // материалы 75-ой всероссийской научной конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Молодежная наука и современность», посвященной 75-летию КГМУ(20-21 апреля 2010г)-Курск:Изд-во КГМУ,2010.-Часть 1 С.282

14. Сочетанное использование L-аргинина и амлодипина в коррекции L-NAME-ндуцированного гестоза в / А.А.Барсук, Н.В.Мальцева, О.С.Полянская // материалы 75-ой всероссийской научной конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Молодежная наука и современность»,

посвященной 75-летию КГМУ(20-21 апреля 201 Ог) -Курск:Изд-во КГМУ.2010.-Часть 1 С.283

15.Фармакологическая коррекция Ь-ЫАМЕ-индуцированного гестоза крыс амлодипином / А.А.Барсук, А.А.Конопля ,С.Н. Козлова// материалы 75-ой всероссийской научной конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Молодежная наука и современность», посвященной 75-летию КГМУ(20-21 апреля 2010г) -Курск:Изд-во КГМУ,2010.-Часть 2 С.36

16.Положительное решение о выдаче патента на изобретение по заявке № 2010121673 от 10.05.2011г. «Способ коррекции нарушения микроциркуляции в плаценте при АОМА-подобной модели гестоза в эксперименте» // М.В.Покровский, В.В.Гуреев, А.А.Барсук и др.

Сдано в набор 19.05.2011 г. Подписано в печать 19.05.11 Формат 30x421/8 Усл.печ.л.1,0 Тираж 100 экз Печать офсетная. Бумага офсетная.

Отпечатано ООО АПИИТ «ГОРОМ» 305000, г.Курск, Красная площадь, б Тел. (4712) 56-09-05 e-mail: girom@,vandtx.ni

91- 1 4 860

3&

2009256260

2009256260

Эндотелиальные клетки сосудистого русла, осуществляя синтез локально действующих медиаторов, морфофункционально ориентированы на оптимальное регулирование органного кровотока [4]. Оксид азота (NO) - ведущий гуморальный эндотелиальный модулятор дилятации, релаксирующий сосуды. Общая масса эндотелия у человека колеблется в пределах 1600-1900 г, что даже больше массы печени. Поскольку клетки эндотелия выделяют большое количество различных веществ в кровь и окружающие ткани, поэтому их комплекс можно рассматривать как самую большую эндокринную систему [11,23].

В патогенезе и клинике гестоза, артериальной гипертонии, атеросклероза, сахарного диабета и их осложнений одним из важных аспектов считается нарушение структуры и функции эндотелия. При этих заболеваниях он предстает в роли первоочередного органа мишени, поскольку эндотелиальная выстилка сосудов участвует в регуляции сосудистого тонуса, гемостаза, иммунного ответа, миграции клеток крови в сосудистую стенку, синтезе факторов воспаления и их ингибиторов, осуществляет барьерные функции [50,63,134].

Как известно NO синтезируется из L-аргинина под влиянием NO-синтазы путем присоединения молекулярного кислорода к конечному атому азота гуа-нидиновой группы L-аргинина [103,121].

Несмотря на то, что в патогенезе преэклампсии обнаружено множество компонентов, в последние годы наибольшее внимание уделяется эндотелиаль-ной дисфункции [7, 18]. Плацентарная ишемия приводит к высвобождению многочисленных плацентарных факторов, которые оказывают серьёзное влияние на кровоток и регуляцию сосудистого русла [139]. Эти факторы включают в себя рецептор-1 растворимого фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) (sFlt-1) [117,140], аутоантитело рецептора ангиотензина II (тип 1) (АТ1-АА) [57,74] и цитокины (фактор некроза опухоли (TNF)-a) [161,162], которые по очереди формируют масштабную дисфункцию эндотелия материнских сосудов [134]. Эта дисфункция проявляется в качестве усиленного образования таких факторов, как эндотелии, активные формы кислорода (ROS), тромбоксан, 20-гидроксиэйкозатетраеновая кислота (20-НЕТЕ) и повышенная чувствительность к ангиотензину II [99]. Кроме этого преэклампсия также связана с уменьшенным формированием сосудорасширяющих факторов (окись азота (N0) и простациклин) [48]. Эти изменения в функции сосудов ведут не только к гипертензии, но и к дисфункции многих органов, особенно у женщин с ранним проявлением преэклампсии [63].

Метилированные аналоги L-аргинина ассиметричный диметиларгинин (ADMA) и монометиларгинин (L-NMMA) являются эндогенными ингибиторами эндотелиального оксида азота (eNOS) [140].

В последние годы обнаружено, что концентрации ADMA в материнской плазме гораздо выше у женщин с преэклампсией [142] и, что повышенные концентрации ADMA являются одними из предикторов преэклампсии [59].

Таким образом, сформировалась фармакологическая мишень «ADMA-eNOS» при преэклампсии, которая на наш взгляд, будет объектом повышенного интереса фармакологов к этой проблеме в предстоящие годы.

Ранее нами было показано, что L-аргинин как монотерапия, так и в сочетании с антигипертензивными средствами на ADMA-подобной модели L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции эффективно увеличивал активность эндотелиальной NO-синтазы и продукцию оксида азота и предотвращал развитие эндотелиальной дисфункции у крыс-самцов [27]. Эффективными на данной модели оказались активатор eNOS - резвератрол, антиокси-данты потенцированные поликлональные антитела к eNOS [29] и др. Более того, определенное развитие получили исследования эндотелиопротективной активности на других «ADMA-eNOS -ассоциированных» экспериментальных моделях «метаболического X синдрома, гомоцистеин-индуцированной, гипоэ-строген-индуцированной, сепсис-индуцированной эндотелиальной дисфункции и при реактивном поствакцинальном васкулите.

В своём первом приближении разрабатываемая концепция нуждается в экспериментальной и клинической оценке в нескольких основных направлениях.

Во-первых, исследование эффективности коррекции морфофункциональ-ных нарушений при гестозе, с использованием препаратов с потенциально возможной эндотелиопротективной активностью, реализующейся за счет воздействия в различные точки - <<АВМА-еЖ)8-мишени>> на путь Ь-аргинин-оксид азота. Прежде всего, речь может идти о природном донаторе N0 - аминокислоте Ь-аргинине.

Во-вторых, исследование эффективности фармакологической коррекции морфофункциональных нарушений с использованием препаратов с доказанной эндотелиопротективной активностью, реализующейся за счет воздействия в различных точках приложения на путь Ь-аргинин-оксид азота, например антагонисте кальция дигидропиридинового ряда — амлодипине.

В-третьих, необходимо оценить эффективность сочетанного использования традиционных препаратов, использующихся при лечении гестозов в клинике. Данный подход позволит проводить фармакологическую коррекцию с влиянием сразу на несколько звеньев патогенетических нарушений метаболизма оксида азота.

Безусловно, решение поставленных выше вопросов потребует формирования комплекса методических подходов, включающего оценку эффективности фармакотерапии на системном и органном уровнях, в условиях моделирования Ь-ЫАМЕ индуцированного гестоза. При этом особое внимание потребуется сосредоточить на оценке эндотелийзависимых и эндотелийнезависимых сосудистых реакциях при острых фармакологических пробах, а также методологии оценки степени нарушения микроциркуляции в плаценте и почечной паренхимы. Биохимическое моделирование и степень коррекции эндотелиальной дисфункции рационально оценивать при определении концентрации стабильных метаболитов оксида азота, экспрессии эндотелиальной ЫО-синтазы, эндотели-на, ассиметричного диметиларгинина.

Среди фармакологических агентов, планируемых к комплексному изучению в контексте вышеизложенного, предполагается исследование эффективности Ь-аргинина (производства «Е1ЛЮВЮРНАКМ .Гп^Н», Гамбург) и амлоди-пина («Амлотоп», производства «Макизфарма», Россия), а также их сочетанно-го применения. ЦЕЛЬ РАБОТЫ:

Провести комплексное сравнительное изучение влияния Ь-аргинина и ам-лодипина и их сочетанного использования на течение экспериментального Ь-ЫАМЕ-индуцированного гестоза.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи исследования:

1. Оценить развитие экспериментального гестоза при Ь-ЫАМЕ-индуцированной модели эндотелиальной дисфункции с использованием результатов функциональных проб, оценки плацентарной микроциркуляции, биохимических маркеров и результатов морфологических исследований.

2. Изучить влияние Ь-аргинина на течение экспериментального гестоза при моделировании Ь-КАМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункции с использованием результатов функциональных проб и оценки плацентарной микроциркуляции, биохимических маркеров и морфометрических показателей.

3. Изучить влияние амлодипина на течение экспериментального гестоза при моделировании Ь-ЫАМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункции с использованием результатов функциональных проб и оценки плацентарной микроциркуляции, биохимических маркеров и морфометрических показателей.

4. Изучить влияние сочетанного использования Ь-аргинина и амлодипина на течение экспериментального гестоза при моделировании

L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции с использованием результатов функциональных проб и оценки плацентарной микроциркуляции, биохимических маркеров и морфометрических показателей.

5. Провести интегральный векторный анализ для комплексной оценки протективных эффектов L-аргинина и амлодипина при моделировании L-NAME-индуцированного гестоза.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе впервые предложен способ моделирования гестоза при L-NAME-индуцированной NO-дефицитной эндотелиальной дисфункции. Продемонстрировано, что развивается комплекс изменений характерных для эндотелиальной дисфункции, выражающейся в изменении соотношений сосудистых реакций на ацетилхолин (эндотелийзависимая вазодилатация) и нитро-пруссид (эндотелий независимая вазодилатация) с увеличением коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД) в 5 раз, резким снижением показателей биохимических маркеров (Total NO, активность NO-синтазы), а также характерной динамикой морфофукциональных показателей сердечнососудистой системы (диаметр миокардиоцитов и прирост давления при пробе на нагрузку сопротивлением, диаметр миокардиоцитов и адренореактивности, соотношение интима-медиа и т.д.).Параллельно развивается экспериментальный гес-тоз,который характеризуется развитием выраженной артериальной гипертен-зии, нарушениями плацентарной микроциркуляции и альбуминурией.

В работе впервые показано, что L-аргинин 30 мг/кг и 200 мг/кг однократно в течение 7 суток внутрижелудочно оказывает дозозависимое протек-тивное действие при экспериментальном гестозе на фоне L-NAME-индуцированной NO-дефицитной ЭД, выражающееся в нормализации плацентарной миркоциркуляции, снижении артериальной гипертензии, предотвращении альбуминурии и нормализации КЭД.

Амлодипин 0,5 мг/кг однократно в течение 7 суток внутрижелудочно как монотерапия также обладал эндотелиопротективными эффектами на выбранной модели патологии, однако микроциркуляция в плаценте и альбуминурия не предотвращались.

Сочетанное использование L-аргинина 200 мг/кг с амлодипином 0,5 мг/кг показало аддитивное протективное действие при экспериментальном гес-тозе, что выражалось в нормализации плацентарной миркоциркуляции, снижении артериальной гипертензии, предотвращении альбуминурии и нормализации КЭД. Параллельно обнаружена положительная динамика морфометриче-ских показателей плаценты миокариоцитов и сосудистой стенки.

Научная новизна подтверждается получением 1 патента РФ.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

В работе обоснована эффективность применения L-аргинина в качестве монотерапии и в сочетании с амлодипином при экспериментальном гестозе на фоне L-NAME-индуцированной NO-дефицитной ЭД в эксперименте. Показано, что использование L-аргинина позволяет нормализовать плацентарную микроциркуляцию, артериальное давление, предотвратить альбуминурию, а также изменение соотношений сосудистых реакций на ацетилхолин (эндоте-лийзависимая вазодилатация) и нитропруссид (эндотелий независимая вазоди-латация), предотвратить снижением показателей биохимических маркеров (Total NO, активность NO-синтетазы), добиться положительной динамики морфофункциональных показателей сердечнососудистой системы (диаметр миокардиоцитов и прирост давления при пробе на нагрузку сопротивлением, диаметр миокардиоцитов и адренореактивности, соотношение интима-медиа и т.д.).

Полученные данные позволяют рекомендовать целенаправленные клинические испытания L-аргинина для профилактики гестоза как монотерапии, так и в сочетании с амлодипином (см. Приложение №1 «Протокол клинического испытания L-аргинина при артериальной гипертензии» НИИ профилактической кардиологии от. 07.05.2004).

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Экспериментальный гестоз при L-NAME-индуцированной NO-дефицитной эндотелиальной дисфункции характеризуется выраженной артериальной гипертензией, нарушениями плацентарной микроциркуляции и альбуминурией на фоне изменений соотношений сосудистых реакций на ацетилхо-лин (эндотелийзависимая вазодилатация) и нитропруссид (эндотелий независимая вазодилатация) с увеличением коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД) в 3 раза, резким снижением показателей биохимических маркеров (Total NO, активность NO-синтетазы), а также характерной динамикой морфо-функциональных показателей сосудов плаценты.

2. L-аргинин 200 мг/кг однократно в сутки в течение 7 дней внутрижелу-дочно оказывал протективное действие при экспериментальном гестозе на модели L-NAME-индуцированной NO-дефицитной ЭД, выражающееся в нормализации артериального давления, плацентарной микроциркуляции, предотвращении альбуминурии, снижении КЭД и значений биохимических маркеров и морфометрических показателей плаценты, характеризующих ЭД.

3. Амлодипин 0,5 мг/кг однократно в сутки в течение 7 дней внутриже-лудочно как монотерапия также обладал протективными эффектами при экспериментальном гестозе, снижая артериальное давление и КЭД, однако не нормализовал плацентарную микроциркуляцию, АД и морфологические показатели сосудов плаценты.

4. Сочетанное использование L-аргинина 200 мг/кг с амлодипином 0,5 мг/кг показало аддитивное протективное действие при экспериментальном гестозе, что выражалось в нормализации плацентарной микроциркуляции, снижении артериальной гипертензии, предотвращении альбуминурии и нормализации КЭД. Параллельно обнаружена положительная динамика морфометрических показателей плаценты и сосудистой стенки.

ВНЕДРЕНИЕ В ПРАКТИКУ

Материалы диссертационного исследования используются в учебном процессе и научно-исследовательской работе ряда кафедр ГОУ ВПО КГМУ Росздрава, ГОУ ВПО БелГУ, ГОУ ВПО ВГМА им. Н.Н.Бурденко.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ И ПУБЛИКАЦИИ

Материалы работы доложены на итоговых научных сессиях и конференциях молодых ученых ГОУ ВПО КГМУ в 2009, 2010 и 2011 гг., XIV и V национальном конгрессе «Человек и лекарство». Апробация диссертации проведена на научно-практической конференции кафедр фармакологии, клинической фармакологии и фармакотерапии, патофизиологии, гистологии, внутренних болезней №2, НИИ экологической медицины КГМУ. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе 3 в журналах, рекомендуемых перечнем ВАК РФ.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, результатов исследования, обсуждения полученных результатов, выводов и списка используемой литературы, включающего 164 источника, из них 39 отечественных и 125 зарубежных авторов. Диссертация изложена на 120 страницах машинописи, содержит таблиц - 13, рисунков - 53.

выводы

1. Длительное в течение 7 суток внутрибрюшинное введение Ь-ЫАМЕ в дозе 25 мг/кг вызывало у беременных самок крыс комплекс функциональных, биохимических и морфологических изменений ассоциированных с N0-дефицитной эндотелиальной • дисфункцией. На 8-е сутки развивалась выраженная гипертензия (183,1+9,4 и 136,7+7,4 мм.рт.ст.), в 3 раза увеличивался коэффициент эндотелиальной дисфункции, резко, в 2,5 раза, уменьшался уровень нитрит-ионов. Показатели лазердопплерфлоуметрии продемонстрировали более чем 2 кратное снижение плацентарной микроциркуляции на фоне протеи-нурии. Гистологически обнаруживались признаки ишемических повреждений почек и плаценты. Описанный симптомокомплекс можно соотнести с развитием гестоза в клинических условиях.

2. Ь-аргинин в дозе 200 мг/кг проявлял выраженное эндотелиопротек-тивное действие на модели Е-КАМЕ-индуцированного гестоза, что выражалось в преобладании эндотелийзависимого расслабления сосудов и снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции КЭД до уровня интактных животных, а также в снижении содержания нитрит-ионов ЫОх. Одновременно результаты исследований микроциркуляции плаценты выявили снижение показателей перфузии на фоне отсутствия протеинурии. Морфологические исследования обнаружили предотвращение под влиянием Ь-аргинина 200 мг/кг развития нарушений в сосудистом эндотелии почечных артерий и ишемических изменений в плаценте. Монотерапия Ь-аргинином 200 мг/кг не достигала заданных значений артериального давления и не. полностью восстанавливала плацентарную микроциркуляцию.

3. Амлодипин в дозе 0,5 мг/кг проявлял эндотелиопротективное действие на модели Ь-МАМЕ-индуцированного гестоза, что выражалось в преобладании эндотелийзависимого расслабления сосудов и снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции КЭД до уровня интактных животных и предотвращении протеинурии. Однако под влиянием амлодипина не наблюдалось предотвращения снижения экспрессии еЖ)8 и содержания нитрит-ионов 1\Юх. Одновременно результаты исследований микроциркуляции плаценты не выявили предотвращение снижения показателей перфузии. Морфологические исследования обнаружили предотвращение под влиянием амлодипина развития нарушений в сосудистом эндотелии почечных артерий и ишемических изменений в плаценте. Монотерапия амлодипином 0,5 мг/кг не достигала заданных значений артериального давления.

4. Сочетанное использование Ь-аргинина 200 мг/кг и амлодипина 0,5 мг/кг оказывало выраженное эндотелиопротективное действие на модели Ь-ЫАМЕ-индуцированного гестоза, что выражалось в преобладании эндоте-лийзависимого расслабления сосудов и снижении коэффициента эндотелиаль-ной дисфункции КЭД до уровня интактных животных, а также в полном предотвращении снижения содержания нитрит-ионов КЮх. Одновременно результаты исследований микроциркуляции плаценты выявили предотвращение снижения показателей перфузии на фоне полного предотвращение под влиянием сочетанного применения Ь-аргинина 200 мг/кг и амлодипина 0,5 мг/кг развития нарушений в сосудистом эпителии почечных артерий и ишемических изменений в плаценте. Сочетанная терапия Ь-аргинином 200 мг/кг амлодипином 0,5 мг/кг позволяла наиболее существенно снизить артериальное давление, показатели которого приближались к группе интактных беременных животных.

5. Интегральный векторный анализ эффективности протективного действия Ь-аргинина и амлодипина при Ь-НАМЕ-индуцированном гестозе показал, что более выраженную активность проявлял Ь-аргинин 200 мг/кг по сравнению с амлодипином 0,5 мг/кг. Комбинированное применение Ь-аргинина и амлодипина проявляет положительное фармакодинамическое взаимодействие, что предполагает различные патогенетические точки приложения действия и позволяет расположить исследуемые препараты в следующей последовательности: амлодипин 0,5 мг/кг < Ь-аргинин 200 мг/кг < Ь-аргинин 200 мг/кг + амло-дипин 0,5 мг/кг.