Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Фармакологическая коррекция антигипоксантами последствий воздействия экстремальных факторов физической и химической природы

На правах рукописи

ВОРОБЬЕВА Виктория Владимировна

ФАРМАКОЛОГИЧЕСКАЯ КОРРЕКЦИЯ АНН IГ Ш ЮК САЙТАМ И ПОСЛЕДСТВИЙ ВОЗДЕЙСТВИЯ ЭКСТРЕМАЛЬНЫХ ФАКТОРОВ ФИЗИЧЕСКОЙ И ХИМИЧЕСКОЙ ПРИРОДЫ

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

1 О ИЮЛ 2014

Санкт-Петербург, 2014

005550384

005550384

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном военном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова» МО РФ

Научный консультант: доктор медицинских наук профессор Петр Дмитриевич Шабанов

Официальные оппоненты:

Барнаулов Олег Дмитриевич, доктор медицинских наук, ФГБУН «Институт мозга человека им. Н.П. Бехтеревой» РАН, ведущий научный сотрудник

Крауз Владислав Алексеевич, доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия» МЗ РФ, кафедра фармакологии, профессор

Петров Александр Николаевич, доктор медицинских наук, профессор, ФГБУН «Институт токсикологии Федерального медико-биологического агентства», лаборатория психофармакологии, заведующий

Ведущее учреждение:

ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет» МЗ РФ

Защита состоится «16» сентября 2014 года в 13.00 часов на заседании диссертационного совета Д 215.002.07 при ФГБВОУ ВПО «Военно-медицинская академии им. С.М. Кирова» МО РФ (194044, г. Санкт-Петербург, ул. акад.

Лебедева, д.6).

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ФГБВОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова» МО РФ

Автореферат разослан «_» июня 2014 года

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук профессор

Борис Николаевич Богомолов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Сохранение здоровья и работоспособности людей в условиях воздействия экстремальных факторов является одним из актуальных направлений авиационной, космической и морской медицины, а также медицины труда и катастроф (Измеров Н.Ф., 2008; Боченков A.A., Загородников Г.Г., 2010; Ко-невских Л.А. и др., 2013).

Комплекс экстремальных воздействий включает широкий спектр антропогенных влияний (общая и локальная вибрация, шумовое и электромагнитное воздействие, статическое напряжение), предъявляющих высокие требования к организму людей ряда профессиональных групп. В частности, у лиц, длительно работающих в виброопасных условиях, частота сердечно-сосудистой патологии в 1,5—2 раза выше, чем в среднем по популяции (Войтович Т.В., 2004; Афанасьева O.E. и др., 2010). Производственными исследованиями подтверждено, что повреждающее влияние вибрации на организм усугубляет охлаждение, чрезмерная физическая активность, что быстрее ведет к срыву адаптации, ускоряет развитие вибрационной болезни, при этом увеличиваются показатели общей смертности, в том числе лиц трудоспособного возраста (Измеров Н.Ф., 1999, 2008).

Активное развитие и внедрение химических технологий в производство, оборонную промышленность, быт поставило проблему разработки лечебно-профилактических мер по охране здоровья людей при возможном контакте с вредными и опасными токсикантами. В структуре общей смертности в Российской Федерации увеличилась смертность от несчастных случаев вследствие отравлений. Ее влияние на ожидаемую продолжительность жизни становится настолько значимым, что данный показатель почти сравнялся с показателем смертности от заболеваний сердечно-сосудистой системы (Мамедов М.Н., Деев А.Д., 2008; Хальфин P.A., 2008).

Установлено, что среди ведущих этиологических факторов смертельных острых отравлений в бытовых условиях от 3 до 5% составляют суррогаты алкоголя (технические спирты, органические растворители и другие непищевые спиртосодержащие жидкости). В состав этих жидкостей входят этиленгликоль и дихлорэтан, обладающие не только нейротоксичностью, но повреждающие паренхиматозные органы (Куценко С.А., 2004).

Средний возраст отравившихся колеблется от 29 до 40 лет, что приводит к социально-экономическому ущербу и ухудшает демографическую ситуацию (Власов В.Н., 2009; Остапенко Ю.Н. и др., 2010). Кроме этого, важную составляющую бытовых и промышленных (в ходе уничтожения запасов химического оружия) отравлений представляют отравления фосфороргани-ческими соединениями (ФОС). В отличие от дихлорэтана и этиленгликоля, ФОС имеют антидоты, применение которых эффективно лишь на ранних этапах отравления, но не снимает необходимости ликвидации так называе-

мых отдаленных последствий интоксикации (Прозоровский В.Б., 2007; Чепур C.B., 2010). Отдаленные (отставленные последствия) острых интоксикаций ФОС разнообразны и формируют неблагоприятный фон для возникновения и прогрессировали! различных хронических заболеваний.

Степень разработанности темы исследования

Состояние вибрации приводит к дисфункции многих органов и систем, в основе которой лежат, прежде всего, нарушения в энергетическом обмене (Воробьева В.В., Шабанов П.Д., 2008,2013). Следует констатировать, что целостное представление о механизмах перестройки энергетического обмена различных органов под действием общей и локальной вибрации до сих пор отсутствует, не определены также роль и закономерности развития дисфункций митохондрий тканей, вовлеченных в патогенез вибрационной болезни. Применение общепринятых для лечения вибрационной болезни лекарственных средств не дает значимого клинического эффекта, вероятно, в силу ограниченности точек приложения или неправильного их понимания. Возможно, это связано и с тем, что их действие не может полностью реализоваться на уровне систем энергообеспечения гомеостатических функций, наиболее уязвимого звена при вибрационном воздействии (Потеряева E.JI. и др., 2004; Артамонова В.Г., 2010; Кирьяков В.А. и др., 2013). Это же и объясняет резистентность данной патологии к медикаментозной терапии, особенно когда к повреждающему действию вибрации присоединяется холодовое воздействие, повышенные физические нагрузки и действие токсикантов (Измеров Н.Ф., 2008). Как показано в последние годы (Зарубина И.В., 2011), отдаленные последствия в действии токсикантов также связаны с дисфункцией систем энергопродукции и энергопотребления. Поэтому поиск средств восстановительно-реабилитационной направленности, обладающих защитными энерго-протективными эффектами, как в токсикогенной фазе острого отравления, так и в отдаленные сроки после отравлений, представляется весьма актуальным.

Цель и задачи исследования

Цель исследования: разработка методов фармакологической коррекции последствий воздействия факторов физической и химической природы, а также факторов их осложняющих (чрезмерные физические нагрузки, переохлаждение, иммобилизация).

Задачи исследования:

1. Разработка модели гипоксического состояния клеточного метаболизма вследствие воздействия общей вибрации для оценки энергопротектив-ного действия фармакологических средств защиты от вибрации (вибропротекторов).

2. Изучить особенности энергетического обмена в печени и почке экспериментальных животных (кролики, крысы) при действии локальной и общей вибрации по показателям функциональной активности митохондрий, активности ферментов крови (сукцинатдегидрогеназа, каталаза) и морфологической картине органов (кролики).

3. Провести сравнительный фармакологический анализ энергопротек-тивного действия субстратных антигипоксантов (янтарная и глутаминовая кислоты), блокаторов кальциевых каналов (фенигидин), пиридин-3-карбоновой кислоты и их комбинаций при действии общей вибрации у кроликов.

4. Провести сравнительный фармакологический анализ энергопротек-тивного действия субстратных антигипоксантов (янтарная и глутаминовая кислоты) при сочетанном действии вибрации с предельной физической нагрузкой, переохлаждением и иммобилизацией у крыс.

5. Изучить антигипоксантные, актопротекторные и органопротектив-ные эффекты антигипоксантов 2-этилтиобензимидазола гидробромида и 5-этокси-2-этилтиобензимидазола в моделях интоксикации карбофосом, эти-ленгликолем, дихлорэтаном у крыс, уточнить их молекулярные механизмы действия.

Научная новизна

Разработана оригинальная модель гипоксического состояния клеточного метаболизма вследствие воздействия общей вибрации для оценки энерго-протективного действия фармакологических средств защиты от вибрации (вибропротекторов). В основе данной модели лежат два характерологических критерия - частота и длительность вибрации. С увеличением частоты с 8 до 44 Гц повреждающие действие вибрации на энергетический метаболизм нарастает. Также оно нарастает с увеличением длительности сеансов вибрации, особенно в интервале с 21 до 56 сеансов. Качественная характеристика модели заключается в переключении доминирования НАД-зависимого звена дыхательной цепи в ФАД-зависимый (принцип фазности). Доказано вибро-протективное действие субстратных антигипоксантов (янтарная и глутаминовая кислоты) в моделях общей вибрации у кроликов. Оно состоит в активизации энергетического обмена тканей через повышение активности НАД-зависимого звена дыхательной цепи и регуляторного сдерживания активности сукцинатзависимой биоэнергетики. Аналогичным действием обладают и блокаторы кальциевых каналов (фенигидин). В противоположность этому, пиридин-3-карбоновая кислота усугубляет нарушения энергетического метаболизма при воздействии общей вибрации. Комбинирование субстратных антигипоксантов (янтарная и глутаминовая кислоты) и блокаторов кальциевых каналов (фенигидин) повышает эффективность защиты об общей вибрации в сравнении с действием отдельных компонентов. Факторы охлаждения, чрезмерной физической нагрузки и иммобилизации усугубляют действие вибрации. Бытовые токсиканты (карбофос, этиленгликоль, дихлорэтан) также оказывают отрицательное действие на энергетический метаболизм. При отравлении данными токсикантами резко снижается физическая выносливость, нарушаются функции печени, накапливаются продукты распада белков, повышается активность перекисного окисления липидов мембран. Антигипо-ксанты 2-этилтиобензимидазола гидробромид и 5-этокси-2-этилтиобензимидазол приблизительно в равной степени восстанавливают нарушенные показатели. Механизм защитного действия антигипоксантов при

отравлении карбофосом, этиленгликолем и дихлорэтаном состоит в сохранении эффективности работы дыхательной цепи, мембраностабилизирующем и органопротективном действии. Полученные результаты позволяют рекомендовать субстратные антигипоксанты (янтарная и глутаминовая кислоты) отдельно или в сочетании с блокаторами кальциевых каналов (фенигидин) для профилактики и лечения структурно-метаболических нарушений в тканях при длительном воздействии вибрации (вибрационной болезни). Также рекомендовано использование прямых антигипоксантов (2-этилтиобензимидазола гидробромид и 5-этокси-2-этилтиобензимидазол) для коррекции последствий действия бытовых токсикантов (карбофос, эти-ленгликоль, дихлорэтан) на нервную систему и внутренние органы. Работа относится к исследованиям в области фундаментальной, профессиональной, военной и экстремальной медицины.

Научно-практическая значимость Теоретическая значимость работы определяется разработкой оригинальной модели гипоксического состояния клеточного метаболизма вследствие воздействия общей вибрации для оценки энергопротективного действия фармакологических средств защиты от вибрации (вибропротекторов). Описаны характеристики модели, возможности ее использования в экспериментальной фармакологии. С помощью данной модели оценено действие субстратных антигипоксантов (янтарная и глутаминовая кислоты), блокаторов кальциевых каналов (фенигидин) и пиридин-3-карбоновой кислоты на энергетический метаболизм при воздействии локальной и общей вибрации. Практическое значение определяется доказательством вибропротективного действия субстратных антигипоксантов (янтарная и глутаминовая кислоты), возрастающего при комбинировании с блокаторами кальциевых каналов (фенигидин) и уменьшающегося при добавлении пиридин-3-карбоновой кислоты. В основе положительного вибропротективного действия лежат биоэнергетические феномены, связанные с оптимизацией энергопродукции и энергопотребления, нарастающего при суммационном действии вибрации. Кроме того, доказано защитное действие антигипоксантов 2-этилтиобензимидазола гидробромида и 5-этокси-2-этилтиобензимидазола при отравлении карбофосом, этиленгликолем и дихлорэтаном. Основу положительного действия антигипоксантов также составляет оптимизация энергетического обмена при действии токсикантов. Результаты исследования расширяют современные представления о биоэнергетическом звене патологических изменений в тканях, вызванных длительным воздействием общей и локальной вибрации, а также возможностях фармакологической коррекции данных расстройств с помощью энергопротективных (эрготропных) веществ, к которым относятся антигипоксанты. Изучение механизмов защитного действия 2-этилтиобензимидазола гидробромида и 5-этокси-2-этилтиобензимидазола в моделях интоксикации бытовыми ядами (карбофосом, этиленгликолем и дихлорэтаном) также позволяет оптимизировать схемы лечения больных за счет включения в них веществ эрготропного действия.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Факторы физической природы (общая и локальная вибрация) вызывают в тканях внутренних органов изменения по типу гипоксических (биоэнергетическая гипоксия), основным проявлением которых является переключение с доминирования НАД-зависимого звена дыхательной цепи на ФАД-зависимый тип (фазности). Это создает основу для использования данного механизма в качестве мишени действия разных антигипоксантов (субстратных, прямых или с вторичным антигипоксическим действием).

2. Биоэнергетические механизмы защитного действия препаратов субстратных антигипоксантов (препаратов, содержащих митохондриальные субстраты янтарную и глутаминовую кислоты) и блокаторов кальциевых каналов реализуются через восстановление активности НАД-зависимого звена дыхательной цепи и регуляцию сукцинатзависимой энергетики в предложенных режимах воздействия локальной и общей вибрации.

3. Дополнительным методом оценки действия антигипоксантов является изучение энергетического статуса лимфоцитов крови при экспериментальной общей и локальной вибрации, которое позволяет выявить последствия действия данного экстремального фактора и адекватно оценить эффективность фармакологической защиты от вибрации.

4. Субстратные антигипоксанты (препараты на основе митохондриаль-ных субстратов) способствуют сохранению гомеостатических параметров организма в условиях воздействия многофакторного стресса (вибрация в сочетании с предельной физической нагрузкой, переохлаждением и иммобилизацией). Антигипоксанты препятствуют формированию низкоэнергетического сдвига на уровне систем энергопродукции тканей, нормализуют клеточные и популяционные характеристики сукцинатдегидрогеназного статуса лимфоцитов, восстанавливают активность антиокислительных систем.

5. Факторы химической природы (острое отравление карбофосом, дихлорэтаном или этиленгликолем) снижают переносимость физической нагрузки, повышают активность печеночных ферментов, показатели азотистого обмена, перекисного окисления липидов и снижают активность антиокислительных систем в крови, нарушают микроциркуляцию, реологические свойства крови и газообмен тканей.

6. Прямые антигипоксанты (2-этилтиобензимидазола гидробромид и 5-этокси-2-этилтиобензимидазол) при курсовом применении (10 дней) восстанавливают переносимость физической нагрузки и нарушенные биохимические показатели в крови, оказывая антитоксическое действие.

Методология и методы исследования

Методология исследования состояла в изучении энергетического обмена внутренних органов (печень, почка) грызунов (кролик, крыса) методами биохимии, молекулярной биологии, фармакологии и морфологии при воздействии общей и локальной вибрации (разные режимы и продолжительность), сочетании вибрации с предельной физической нагрузкой, переохлаждением и иммобилизацией, воздействии бытовых токсикантов (карбофос, этиленгли-коль и дихлорэтан) и фармакологической коррекции последствий этих воз-

действий с помощью субстратных антигипоксантов (янтарная и глутаминовая кислоты), антигипоксантов с вторичным действием (блокаторы кальциевых каналов) и прямых антигипоксантов (2-этилтиобензимидазола гидробромид и 5-этокси-2-этилтиобензимидазол). Исследования выполнены с соблюдением всех принципов доказательной биологии и медицины и одобрены локальным комитетом по этике при Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова МО РФ.

Степень достоверности и апробация материалов исследования

Статистическая обработка результатов. Выборка для каждой группы животных составила не менее 10-12 кроликов и крыс. Результаты обрабатывали статистически с использованием t-критерия Стьюдента, непараметрического критерия U Вилкоксона-Манна-Уитни, дисперсионного анализа по методу ANO VA на персональном компьютере.

Реализация результатов работы. Полученные результаты используются в учебном процессе кафедры фармакологии ФБГВОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова» МО РФ, кафедры специализированной терапии Института медицинского образования ФГБОУ ВПО «Новгородский государственный университет имени Ярослава Мудрого» Минобрнауки РФ, ГБОУ ВПО «Кировская государственная медицинская академия» МЗ РФ (г. Киров). Работа выполнена в соответствии с плановыми научно-исследовательскими разработками Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова МО РФ. Материал диссертации вошел в грантовые разработки Российского фонда фундаментальных исследований при РАН (РФФИ №1004-00473, №13-04-00186).

Апробация и публикация материалов исследования. Результаты и основные положения диссертации доложены и обсуждены на второй научно-практической конференции «Достижения клинической фармакологии в России» (Москва, 2009), VII Всероссийской конференции, посвященной 160-летию И.П. Павлова « Механизмы функционирования висцеральных систем» (СПб., 2009), 3-ей международной научной конференции «Экспериментальная и клиническая фармакология» (Минск, 2009), Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 40-летию фармацевтического факультета Самарского государственного медицинского университета «Современная фармацевтическая наука и практика: традиции, инновации, приоритеты» (Самара, 2011), научно - практической конференции «Современные проблемы военной медицины, обитаемости и профессионального отбора», посвященной 90-летию проф. И.Д. Кудрина (СПб., 2011), Российской научной конференции «Актуальные проблемы токсикологии и радиобиологии» (СПб., 2011), Всероссийской научной конференции «Фармакологическая нейропро-текция» (Санкт-Петербург, 2013).

Апробация диссертации состоялась на совместном заседании кафедр фармакологии, глазных болезней, отдела обитаемости Научно-исследовательского центра ФБГВОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова» МО РФ и отдела нейрофармакологии им. C.B. Аничкова

ФГБУ «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины» СЗО РАМН.

По теме диссертации опубликовано 27 печатных работ, из них 17 статей в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК, и 1 монография.

Личный вклад автора. Личный вклад автора осуществлялся на всех этапах работы и состоял в планировании экспериментов, их непосредственном выполнении, обработке полученных результатов, обсуждении результатов, написании статей и тезисов, написании диссертации и автореферета. Участие автора в выполнении, сборе и анализе -95%, статистической обработке - 100%, В написании статей и тезисов - 90%, написании диссертации и автореферата - 95%.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы собственных исследований, обсуждения результатов, заключения, выводов, научно-практических рекомендаций и списка литературы. Диссертация изложена на 288 страницах машинописного текста, содержит 15 таблиц, 38 рисунков. Библиографический указатель содержит 609 наименований, в том числе 469 отечественных и 140 иностранных.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1 представляет собой обзор литературы и описывает современные представления о патофизиологии последствий воздействия вибрации и токсикантов на организм, а также фармакологии антигипоксантов, включая субстратные, прямого и непрямого действия (С. 18-64).

Глава 2 включает описание основных методических приемов, которые были использованы при выполнении диссертации (С.64-88).

Глава 3 описывает результаты собственных исследований автора, объединенных в 7 разделов, в каждом из которых приведено обсуждение полученных результатов (С.88-201).

В заключении дано общее обсуждение результатов, обобщены основные перспективы исследования (С.201-211), приведены выводы (С.212), научно-практические рекомендации (С.215) и список использованных литературных источников (С.216-288).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальные животные. Опыты выполнены на 289 крысах самцах Вистар массой 180-220 г., полученных из питомника Рапполово РАМН (Ленинградская область) и 155 кроликах-самцах породы Шиншилла (Oristolagus cuniculus, Linnaeus) с начальной массой 2,7-3,3 кг в возрасте 3-4 месяцев.

Модели экстремальных воздействий. Локальное вибрационное воздействие на крыс с частотой 30 Гц амплитудой 2,5 мм по 90 мин на протяжении ежедневных 7 сеансов моделировали с помощью локального электродинамического генератора. Устройство устанавливали в правом подреберье аб-

доминальной области (электрод площадью 1,5x1,5 см) иммобилизованного на спине животного.

Действие общей вертикальной вибрации на кроликов с амплитудой 0,5 мм осуществляли с помощью стационарной промышленной установки УВ-70/200. В зависимости от серии опыта количество ежедневно проводимых сеансов вибрации с частотой 8 и 44 Гц по 60 мин каждый составляло 7, 21 и 56.

Воздействие общей вертикальной вибрации в сочетании с предельной физической нагрузкой моделировали в тесте принудительного плавания у крыс с грузом, составляющим 10% от массы крыс, при температуре воды 18°С (Волчегорский И.А. и др., 2000). Перед проведением теста принудительного плавания животных подвергали ежедневному в течение 7 дней воздействию общей вертикальной вибрации по 30 мин с амплитудой 0,5 мм и частотой 44 Гц.

Изучение воздействия общей вертикальной вибрации в сочетании с острым охлаждением и иммобилизацией крыс проводили после процедуры вибрации в течение 90 мин с частотой 44 Гц в течение 7 дней. На 7-ой день, после окончания всех сеансов вибрации, крыс фиксировали в специальных контейнерах, обеспечивающих неподвижность, тем самым, устраняя роль скелетной мускулатуры в реакции срочной адаптации к холоду и поддержании температурного гомеостаза организма. Далее иммобилизованных животных помещали в морозильную камеру с температурой - 22°С на 60 мин. До охлаждения и после него измеряли ректальную температуру электротермометром ТПЭМ-1.

Эксперименты выполняли в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ №755 от 12. 08.1977г. МЗ СССР).

Биохимические исследования. После вскрытия брюшной полости животного быстро извлекали печень, почку и помещали в среду выделения фиксированного состава, охлажденную до 0 °С. Используемые в биохимических исследованиях сложные солевые растворы имитировали состав внутриклеточной среды (Мазина Н.К., Воробьева В.В., 2002, 2006). Для приготовления среды выделения и инкубации применяли следующие реактивы: сахароза, КН2Р04, MgS04, KCl (Реахим, Россия); трис-HCl, ЭДТА (Serva, Германия); субстраты окисления: натриевую соль янтарной кислоты, смесь натриевых солей глутаминовой и яблочной кислоты (глу+мал), разобщитель 2,4-динитрофенол (2,4-ДНФ) (Sigma, США); ингибиторы дыхательной цепи: амитал натрия (Serva, Германия) и малонат (Реахим, Россия). Все растворы готовили ex tempore на бидистиллированной воде.

Изучение функциональных состояний нативных митохондрий тканей в составе гомогенатов (Захарченко М.В. и др., 2011) проводили полярографическим методом (Кондрашова М.Н., Ананенко A.A., 1973) в ячейке 1 мл, при 37°С в среде инкубации, уравновешенной с кислородом воздуха. В целях обеспечения синхронности измерений в сжатые сроки использовали неполный цикл метаболических состояний «эндогенное дыхание —»покой—^активность» (Никольс Д.Д., 1985; Грицук А.И. и др., 2002).

Скорость дыхания митохондрий (V) в зависимости от добавок в среду инкубации выражали в нг-атом О мин"'мг 1 белка. Метаболические состояния митохондрий «покоя» и «активности» моделировали in vitro при варьировании экзогенных энергетических субстратов до и после введения в ячейку 2,4-динитрофенола (Кондрашова М.Н., Ананенко A.A., 1973; Никольс Д., 1985).

Данные ингибиторного анализа с амиталом или малонатом по 2 мМ (Никольс Д., 1985; Маевский Е.И. и др., 2001) позволяли оценить вклад в эндогенную дыхательную активность митохондрий НАД- и ФАД-зависимых субстратов. В качестве экзогенных субстратов использовали ФАД-зависимый субстрат - янтарную кислоту (ЯК), 1 мМ или смесь НАД-зависимых субстратов - яблочной и глутаминовой кислот (мал+глу) по 3 мМ- Через 60 сек субстратного дыхания в ячейку вводили разобщитель окисления-фосфорилирования 2,4-динитрофенола (2,4-ДНФ) (Кондрашова М.Н., Ананенко A.A., 1973; Никольс Д., 1985) до общепринятой разобщающей концентрации 20 мкМ. Введением в ячейку разобщителя окисления-фосфорилирования 2,4-ДНФ имитировали состояние АТФ-азной «активности» митохондрий. Устранение с помощью протонофора электрохимического потенциала мембраны нарушает синтез АТФ и его регулирующее влияние в пунктах сопряжения дыхания с фосфорилированием (Северин Е.С., 2003).

Оценка ответа митохондрий на воздействие неблагоприятного фактора и фармакологическую защиту проводилась по совокупности кинетических (V) и расчетных параметров различных метаболических состояниях митохондрий рассчитывали коэффициенты приращения сукцинатзависимого дыхания (КП) в состоянии покоя (п) и разобщения (р): КПЭ = [ФАД/НАД]Э = % малонатчувствительного дыхания /% амиталчувствительного дыхания; КПп = [ФАД/НАД]„ = V„K /VГЛу+мал; КПР = [ФАД/НАД]-Р = Уях.р /Углу+мал.р, где V« и Углу+мал- скорости окисления экзогенного сукцината и смеси глутамата и ма-лата в состоянии «покоя», V„K.P и Vrjiy+MM-p - скорости окисления субстратов в «активном» состоянии митохондрий в условиях АТФ-азной нагрузки, моделируемой с помощью разобщителя 2,4-ДНФ (Маевский Е.И. и др., 2001).

Для оценки функций митохондрий в переходных состояниях были введены регуляторные параметры, количественно характеризующие переход митохондрий от эндогенного дыхания в состояние «покоя»; от покоя в «активное» состояние. Рассчитывали коэффициенты стимуляции дыхания митохондрий с помощью соответствующих субстратов (КСяк и КСглу+мал) или коэффициенты разобщения субстратного дыхания с фосфорилированием (КРГ. лу+мал> КРяк). Их вычисляли как КСс = Vc/V3; КРС = Vc.p/Vc, где: КСс - стимуляция эндогенного дыхания экзогенным субстратом (с), Vc - скорость дыхания митохондрий после добавления экзогенного субстрата (янтарной кислоты или композиции глутамата и маната), V3 - скорость эндогенного дыхания; КРС - стимуляция субстратного дыхания 2,4-ДНФ, Vc.p - скорость окисления экзогенного субстрата после добавления 2,4-ДНФ. Коэффициенты стимуляции и разобщения выражали в относительных единицах измерения.

Для определения активности сукцинатдегидрогеназы (СДГ) лимфоцитов периферической крови использовали готовые цитохимические наборы

(производитель ОО НПФ «Либрус» г. Москва), в состав которых входит сук-цинат натрия, n-ншротетразолий фиолетовый, фосфатный буфер и трилон Б. Реакция проводилась на стандартных свежих мазках крови.

Энергетический статус лимфоцитов оценивали количественно цитохи-мически по параметрам активности сукцинатдегидрогеназы (СДГ) лимфоцитов (Нарциссов Р.П. 1969): Q - средняя активность, V — коэффициент вариации, А — коэффициент асимметрии, Е — коэффициент эксцесса.

Концентрацию белка в гомогенате измеряли модифицированным мик-робиуретовым экспресс-методом по J.Goa (Goa J., 1953). Измерение каталаз-ной активности проводили в плазме крови и отмытых эритроцитах полярографическим методом (Rio L.A.et al., 1977; LesslerM.A. 1980). Оценивали по скорости выделения кислорода в среде, содержащей 0,01% SDS (додецил сульфат натрия) и 0,02 Трис-HCl (Tris-[hydroxymethyl]aminomethane), рН 7,4 с 20 мкл гепаринизированной крови после добавки 1 мкл 3% перекиси водорода и выражали в нг-атом О • мин"'мг'белка

Повреждающее действие вибрации и протективные свойства лекарственных препаратов подтверждали морфогистологическим анализом.

В моделировании интоксикации карбофосом, дихлорэтаном, эти-ленгликолем было использовано 180 беспородных белых крыс-самцов массой 180-200 г. За 24 ч до опытов кормление животных, находившихся на свободном режиме, прекращали. Изучаемые токсические агенты вводили однократно внутрижелудочно в дозе 1,0 ЛД50. В качестве основного показателя токсичности использовали среднесмертельные дозы яда (ЛД50), равные для карбофоса 256,4 ± 8,7 мг/кг, дихлорэтана ЛД50 - 736,9 ± 9,4 мг/кг, этиленгликоля - 692,8 ± 35,2 мг/кг. Расчет ЛД50 производили методом наименьших квадратов пробит-анализа кривых летальности по В.Б. Прозоровскому (Куценко С.А., 2004) и табличными методами определения средней эффективности дозы или среднего времени выживания.

Забор крови осуществляли у наркотизированных гексеналом (125 мг/кг) животных из брюшной аорты или нижней полой вены. Оценку физической выносливости при интоксикации (Заугольников С.Д. и др., 1974) и на фоне защиты антигипоксантами осуществляли по плавательной пробе с отягощением (Волчегорский И.А. и др., 2000), оценивая время удержания на плаву (ВУП). Последнюю выражали в процентах от уровня показателя у ин-тактных крыс. Тестирование проводили на 1, 3, 5, 7 и 10 сут после отравления.

Биохимические исследования выполняли на автоанализаторе фирмы Texnicon Instruments Corporation (США). В крови контрольных и животных, подвергнутых интоксикации, изучали активность аспартатаминотрансферазы (АсАТ), аланинаминотранферазы (АлАТ), общего белка, креатинина, азота мочевины, калия и натрия сыворотки на 1, 3 и 7 сут после отравления.

Активность процессов свободнорадикального окисления оценивали по содержанию малонового диальдегида (МДА); функцию антиоксидантной системы - по концентрации восстановленного глутатиона (ВГ). Интегративную оценку эндогенной интоксикации осуществляли, вычисляя лейкоцитарный

индекс интоксикации (ЛИИ) по О.В. Островскому (1994) и Я.Я. Кальф-Калифу (1941). В качестве средств фармакологической защиты в моделях интоксикации были использованы прямые антигипоксанты 2-этилтиобензимидазола гидробромид и 5-этокси-2-этилтиобензимидазол.

Фармакологические средства для анализа. Использовали субстратные антигипоксанты янтарную кислоту (Новочеркасский завод синтетических продуктов, Новочеркасск), глютаминовую кислоту (Ajinomoto Со Inc, Япония), пиридин-3-карбоновую кислоту (никотиновая кислота) (Мосхим-фарм, Москва), антагонист кальциевых каналов 1,4-Дигидро-2,6-диметил-4-(2-нитрофенил)-3,5-пиридиндикарбоновой кислоты диметиловый эфир (фе-нигидин, МНН - нифедипин) (Белмедпрепарат, Беларусь), рассматриваемый как антигипоксант непрямого действия, прямые антигипоксанты 2-этилтиобензимидазола гидробромид (метапрот) (Усолье-Сибирский ХФЗ) и 5-этокси-2-этилтиобензимидазол (этомерзол) (Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова). Все лекарственные средства использовали в виде субстанций, на основе которых готовили растворы для введения ex tempore.

Статистическую обработку данных выполняли с помощью пакета прикладных программ «Ехе1-2002» (MS Office 2002), STATISTICA 6.0. Значимость межгрупповых различий оценивали с помощью параметрического (t-критерия Стьюдента) и непараметрического U-теста (Вилкоксона-Манна-Уитни) в зависимости от нормальности распределения параметра, которую определяли по тесту Колмогорова-Смирнова в модуле «Basic Statistica/Tables. Frequency tables» пакета прикладных программ STATISTICA for Windows 6.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Динамика показателей функциональной активности митохондрий тканей экспериментальных животных (кролики, крысы) при воздействии общей и локальной вибрации

Показатели функциональной активности митохондрий печени

Известно, что нарушения микроциркуляции, возникающие в ответ на длительное вибрационное воздействие, приводят к синдрому регенераторно-пластической недостаточности (висцеропатии) на уровне паренхиматозных органов (Сухаревская Т.М. и соавт., 2000; Цирулин А.В., 2007; Зуева М.А. и соавт., 2010). Перестройки функциональной активности систем энергопродукции тканей включали этапы регуляторных переключений, касающихся интенсивности и эффективности окисления и синтеза макроэргов в митохондриях паренхиматозных органов, вовлеченных в процесс приспособления к длительной вибрации.

Общая вибрация вызывала изменения в динамике скорости эндогенного дыхания митохондрий печени (рис. 1).

Рис. 1. Изменение скорости эндогенного дыхания нативных митохондрий печени кролика (нг-атом О мин"1 мг"1 белка) на фоне вибрации 8 и 44 Гц длительностью 7, 21,56 сеансов относительно показателей группы интактного

контроля

* — р < 0,05 статистически значимые различия с контрольной группой.

Ингибиторный анализ показал, что коэффициент приращения малонат-чувствительности (КПмаяч) на фоне воздействия вибрации 8 Гц, снизившись на 40% от показателей контрольных животных, сохранялся на этом уровне до завершения вибрации.

Через 7 сеансов вибрации 44 Гц коэффициент приращения малонат-чувствительности увеличивался на 20% по отношению к показателям интактного контроля, свидетельствуя о накоплении эндогенной янтарной кислоты и увеличении ее вклада в процессы окисления в ткани печени.

После 56 сеансов вибрации 44 Гц данный показатель становился на 40% (р < 0,01) ниже уровня контроля, отражая начавшиеся процессы повреждения в ФАД-зависимом звене дыхательной цепи и истощение механизмов адаптивных перестроек, реализуемых, прежде всего, через изменение мета

Окисление экзогенных НАД-зависимых субстратов в состоянии «покоя» угнетаются как при низко-, так и высокочастотной вибрации (рис. 2А). Скорость окисления экзогенной янтарной кислоты возрастает на 44% (р < 0,05) после 21 сеанса вибрации 44 Гц. Однако более продолжительная (56 сеансов) высокочастотная общая вибрация вызывает угнетающий эффект на данный кинетический параметр (рис. 2Б).

После 7 и 21 сеанса вибрации 8 Гц показатель Уяк.р, не отличавшийся от интактного контроля, начинает увеличиваться к завершению вибрационного воздействия (рис. 2Г). Темпы окисления янтарной кислоты на фоне вибрации 44 Гц в состоянии активности превосходят темпы окисления данного субстрата на фоне вибрации 8 Гц в два раза (р < 0,01) после 21 сеанса вибрации. Однако к 56 сеансу вибрации 44 Гц показатель Уяк.р начинает снижаться,

свидетельствуя о том, что гиперактивность сукцинатзависимой биоэнергетики привела к феномену «разрыхления» дыхательной цепи (Кондрашова М.Н., 1987, 1989), нарушению ее электронтранспортной функции и началу II фазы биоэнергетической гипоксии (Лукьянова Л.Д., 2004,2010).

Коэффициенты КСглу+мал и КРглу+мал в ответ на вибрационное воздействие угнетаются. Исчезает стимулирующее действие разобщителя (КРглу+мал —>1,0). После завершения 56 сеансов вибрации 8 Гц коэффициент КРглу+мал < 1,0, что свидетельствует о нарушении энергетической регуляции процессов окислительного фосфорилирования в зоне основного НАД-зависимого пути дыхательной цепи, указывая на снижение его активности и уменьшении вклада в энергообеспечение. Следствием этого является нарушение трансформации энергии в различные формы (АТФ, ГТФ, Др. Н, Дц \|/ и др.) (Скула-чев В.П., 1989) и развитие низкоэнергетического сдвига (Булдаков A.B., 2006) или биоэнергетической гипоксии (Лукьянова Л.Д., 2004; Левченкова О.С., 2012).

О компенсаторном включении системы окисления янтарной кислоты свидетельствует динамика КСяк и КРяк. После 7 сеансов вибрации 8 Гц подъем KC,k составил 88% (р < 0,01), сохранился до 21 сеанса и вернулся к показателям контроля. Коэффициент КРяк на фоне низкочастотной вибрации претерпел подъем на 14% к 21 сеансу, а затем также вернулся к показателю контроля, вероятно, свидетельствуя о регуляторном ограничении активности ФАД-зависимого звена дыхательной цепи.

Динамика КСяк на фоне вибрации 44 Гц была менее выраженной, подъем ограничился 40% к 21 сеансу; через 56 сеансов данный показатель стал ниже контроля на 18%. Коэффициент КРяк постепенно возрастал и к 56 сеансу превосходил уровень контроля более чем в 2 раза (р < 0,01), подчеркивая диссонанс между показателями переходных состояний и выявляя тенденции к гиперактивации системы окисления янтарной кислоты с признаками «истощения» и последующим развитием низкоэнергетического сдвига (Кондрашова М.Н. и др., 1973), который является компонентом неспецифической ответной реакции ткани на неблагоприятное внешнее воздействие а так же служит мерой для оценки нарушения ее функций (Кондрашова М.Н., 1989; Мазина Н.К. и др., 2001).

Через 56 сеансов отмечали тенденцию к изменению морфологической характеристики печени по компенсаторному типу, что соответствует литературным данным (Рахимов Я.А. и др., 1979). Морфогистологические изменения, обусловленные усилением режимов общей вибрации, подтвердили ее дизрегулирующий и даже повреждающий характер (Воробьева В.В., Шабанов П.Д., 2010; Кирьяков В.А и др., 2010) и соотносятся с изменениями биоэнергетических показателей ткани.

21 53

-егц

-44 ГЦ

21 £6

— 8 Гц -».ГЦ

Рис. 2. Влияние частоты и длительности вибрации на окисление НАД-зависимых субстратов (А, В) и ФАД-зависимых (Д Г) в состоянии «покоя» и активности митохондрий печени (нг- атом О мин"1 мг"1 белка) на фоне вибрации 8 и 44 Гц длительностью 7,21, 56 сеансов относительно показателей

группы контроля (К) * - р < 0,05, ** -р < 0,01 статистически значимые различия по отношению к

контролю.

Показатели функциональной активности митохондрий почки

У интакных животных интенсивность окисления эндогенных субстратов митохондрий определяется тканевой принадлежностью. Эндогенное дыхание в почке оказалось на 60% больше, чем в митохондриях ткани печени, что соответствует литературным данным (Кудрявцев В.В., Мазина Н.К., 2007). В процессе кумуляции эффектов вибрации при варьировании частоты и длительности проявлялись разнонаправленные сдвиги (рис. 3). Через 21 сеанс вибрации 8 Гц наблюдалось снижение скорости на 27%, но к завершению воздействия показатель резко

увеличивался на 73% (р < 0,01) по отношению к контролю. Динамика скорости эндогенного дыхания при высокочастотной вибрации имела противоположную направленность: через 7 сеансов наблюдали ускорение окисления эндогенных субстратов на 24%, через 21 сеанс - на 40%, к завершению вибрации показатель возвращался к уровню интактного контроля, свидетельствуя о сохранности резерва эндогенных энергетических субстратов.

Рис. 3. Изменение скорости эндогенного дыхания нативных митохондрий почки кролика (нг-атом О мин'1 мг"1 белка) на фоне вибрации 8 и 44 Гц длительностью 7,21, 56 сеансов относительно показателей группы интактного

контроля ** —р < 0,01.

Ингибиторный анализ показал, что на фоне вибрации 8 Гц прирост ма-лонатчувствительности составил 20% через 7 сеансов вибрации, а затем плавно снизился к показателю интактного контроля. Высокочастотная вибрация в те же сроки вызвала подъем данного показателя на 40% (р < 0,05) с последующим уменьшением ниже уровня контроля, свидетельствуя о начале угнетения сукцинатзависимой биоэнергетики (Кондрашова М.Н., 1990; Лукьянова Л.Д., 2004). Как при 8 Гц, так и при 44 Гц темпы приращения чувствительности к малонату превышали темпы усиления чувствительности к ами-талу.

Окисление экзогенных НАД-зависимых субстратов угнетаются как при низко- так и высокочастотной вибрации (рис. 4А). По мере пролонгации вибрации 8 Гц в митохондриях почки наблюдали монотонное торможение дыхания под действием композиции субстратов глутамата+малата (Углу+мал). Высокочастотная вибрация не вызвала достоверных изменений данного показателя.

Скорость окисления экзогенной янтарной кислоты возрастала на 40% после 56 сеансов вибрации 8 Гц. Ее стимулирующее действие на дыхание митохондрий при воздействии вибрации 44 Гц (Уяк) практически отсутствовало (рис. 4Б), тогда как при работе дыхательной цепи в оптимальном режи-

ме добавка экзогенного субстрата к тканевому препарату в состоянии эндогенного дыхания должна оказывать активизирующее воздействие.

к 30

Рис. 4. Влияние частоты и длительности вибрации на окисление НАД-зависимых (А, В) и ФАД-зависимых субстратов (Б, Г) митохондрий в состоянии «покоя» и активности (нг-атом О мин"1 мг"1 белка) на фоне вибрации 8 и 44 Гц длительностью 7, 21, 56 сеансов относительно показателей группы

контроля (К) *-р<0,05; **-р<0,01.

В условиях АТФ-азной нагрузки показатель Углу+мал.р митохондрий почки снижался на 40-74% (р < 0,05) через 7-56 сеансов соответственно на фоне вибрации 8 Гц (рис. 4В); снижение показателя на фоне вибрации 44 Гц колебалось на уровне 59-22-17% в сроки 7-21-56 сеансов соответственно. Подобная динамика свидетельствует об угнетении окисления НАД-зависимых субстратов в разобщенном состоянии митохондрий.

В активном состоянии митохондрии почки окисляли экзогенную янтарную кислоту более интенсивно, чем НАД-зависимые субстраты (рис. 4Г). На фоне вибрации наблюдали разнонаправленные высокоамплитудные колебания показателя Уяк.р в диапазоне 50-60% после 7 и 21 сеанса и возвращение к показателям интактного контроля к 56 сеансу вибрации. При 44 Гц наблю-

дали подъем Уяк_р на 40% относительно интактного контроля и сохраняющийся к завершению вибрационного воздействия. Таким образом, темпы окисления янтарной кислоты в состоянии «покоя» и «активности» превосходили скорости окисления НАД-зависимых субстратов. Это свидетельствовало об активации сукцинатзависимой энергопродукции тканью почки в процессе суммации эффектов пролонгированной вибрации.

По мере пролонгации вибрации 8 Гц наблюдали монотонное торможение дыхания под действием композиции субстратов глутамата и малата к 56 сеансу, коэффициент КСГЛу+мал <1,0. На фоне вибрации 44 Гц также отсутствовало активизирующее воздействие экзогенных НАД-зависимых субстратов, что свидетельствует о нарушениях в зоне I фермент-субстратного комплекса почки (рис. 5А).

Напротив, стимуляция дыхания в системе окисления янтарной кислоты (рис. 5Б) более выражена и аналогична той картине, которая описана для печени. В частности, на фоне вибрации 8 Гц отмечается выраженное увеличение КСяк на 58-95% через 7 и 21 сеанс соответственно (р < 0,01). Однако воздействие высокочастотной вибрации лишает экзогенную янтарную кислоту стимулирующего действия на II фермент-субстратный комплекс, что свидетельствует о накоплении повреждающих эффектов со стороны вибрации в зоне ФАД-зависимого звена дыхательной цепи.

Показатель КРглу+мал_р колеблется при этом в широком диапазоне (рис. 5В). В частности, после 56 сеансов вибрации 8 Гц он достигает значения, близкого к 1,0. Это свидетельствует об отсутствии стимулирующего действия 2,4-ДНФ и коррелирует с утратой сопряженности между окислением и фосфорилированием и, следовательно, с уровнем энергетической регуляции дыхания в зоне НАД-зависимого звена дыхательной цепи. Картина глубоких изменений усугубляется тем фактом, что стехеометрически на НАД-зависимом участке дыхательной цепи митохондрий в физиологических условиях функционируют 3-4 пункта сопряжения и теоретически эффективность окислительного фосфорилирования в 1,5-2 раза выше, чем на ФАД-зависимом участке (Никольс Д., 1985). Снижение энергетической регуляции также ярко выражено на фоне воздействия вибрации 44 Гц. Коэффициент КРглу+мал-р остается при этом ниже уровня контроля на 66-20% (р < 0,05).

При окислении янтарной кислоты в миохондриях почки стимулирующее действие 2,4-ДНФ проявилось неоднозначно. После 7 сеансов низкочастотной вибрации уровень энергетической регуляции повышался к 7-му сеансу на 17%, к 21 — снижался на 65% (р < 0,01), достигая значения КС як.р <1,0, а затем возвращаясь к уровню контроля. На фоне вибрации 44 Гц КСяк.р монотонно и недостоверно превосходил показатель интактного контроля на 14-30%.

Таким образом, отклик дыхательной цепи почки так же проявляется развитием митохондриальной дисфункции по типу биоэнергетической гипоксии 1-П стадии. Усиление интенсивности вибрационного воздействия сопровождалось нарастанием изменений морфогистологической характеристи-

Рис. 5. Влияние частоты и длительности вибрации на коэффициент стимуляции (КС) НАД- (А) и ФАД-зависимого (Б) звеньев и коэффициент разобщения (КР) НАД-зависимого (В) и ФАД-зависимого (Г) звеньев дыхательной цепи митохондрий почки * - р < 0,05; ** —р < 0,01.

Со стороны клубочкового аппарата развивалась гломерулопатия экссу-дативного интра- и экстракапиллярного типа. Увеличение степени полнокровия капилляров клубочков сочеталось с неравномерным оскудением их клеточного состава, нарастали явления интерстициального отека коркового слоя и появлялись кровоизлияния.

Итак, дыхательная цепь исследованных тканей (печени и почки) откликается на изменение режима вибрационного воздействия перестройкой окислительного метаболизма. С увеличением частоты и длительности общей вибрации вклад активности НАД-зависимого фермент-субстратного комплекса дыхательной цепи снижался, что согласуется с представлениями о его большей уязвимости (Зарубина И.В., Шабанов П.Д., 2004; Зарубина И.В., 2011).

Активность ФАД-зависимого звена повышалась, свидетельствуя о его ведущей роли в поддержании функции дыхательной цепи в неблагоприятных условиях вибрационного стресса и гипоксии и становилась чрезмерной. Это указывает на формировании низкоэнергетического сдвига в системе энергообеспечения тканей (Кондрашова М.Н., 1987) по типу I-II фазы биоэнергетической гипоксии, что подробно описано нами в научной литературе (Воробьева В.В., 2006; Воробьева В.В., Шабанов П.Д., 2009, 2010; Vorobieva V.V., Shabanov P.D., 2009).

Биоэнергетические механизмы защитного действия вибропротекторов субстратного (янтарная и глутаминовая кислоты) и непрямого антиги-поксического действия (блокаторы кальциевых каналов, пиридин-3-

карбоновая кислота)

Как было показано выше, митохондрии печени и почек характеризуются высокой виброчувствительностью. Биоэнергетические изменения в тканях не имеют каких-либо специфических особенностей, связанных с причинным фактором в виде вибрации и проявляются «сменой метаболических путей» обнаруженных на фоне целого ряда других видов неблагоприятных воздействий (Лукьянова Л.Д., 2010; Левченкова О.С. и др., 2012). Это позволило использовать наиболее «жесткие» режимы вибрации (21-56 сеансов вибрации с частотой 44 Гц) в качестве неинвазивной модели клеточной гипоксии для дальнейшего изучения биологических феноменов вибрации, углубления сведений о патогенезе вибрационно-обусловленной патологии и исследования возможностей фармакологической защиты от вибрации.

Вибропротективные эффекты антигипоксантов на уровне паренхиматозных органов кролика

По мере пролонгации вибрации в митохондриях паренхиматозных органов (печень, почка) происходят регуляторные переключения интенсивности и эффективности процессов окисления и синтеза макроэргов (Воробьева В.В., Шабанов П.Д., 2008,2013).

Введение животным субстратных антигипоксантов (янтарной и глута-миновой кислоты и их комбинации) или фенигидина в период вибрационного воздействия повысило активность систем энергопродукции паренхиматозных органов, восстановив кинетические и регуляторные параметры функционирования ФАД- и НАД-зависимых звеньев дыхательной цепи до уровня близкого к физиологическому. Это видно на примере скорости эндогенного дыхания - параметра, отражающего тканеспецифичность метаболических ответов митохондрий, то есть интенсивность окислительных процессов в той или иной ткани (рис. 6).

Вопреки разнонаправленное™ и неоднородности параметров-откликов, тканеспецифичности их проявлений, стало очевидно, что степень вовлеченности сукцинатзависимой биоэнергетики митохондрий печени и почки в pea-

лизацию фармакологического виброзащитного эффекта митохондриальных антигипоксантов и фенигидина более выражена, чем НАД-зависимой.

□ 14чтак1Найксн!рогь с &15ра+та о янтарная кютпа

Рис. 6. Изменение скорости эндогенного дыхания нативных митохондрий печени и почки кролика в (нг- атом О мин"' мг"1 белка) на фоне 56 сеансов общей вибрации 44 Гц и фармакологической защиты янтарной кислотой * - р < 0,05 статистически значимые различия между группами интактных и подвергнутых вибрации животных.

Ограничение избыточной активации быстрого метаболического кластера осуществлялось синхронно в митохондриях исследованных тканей; межтканевые различия митохондриальных ответов стирались. Фармакологическая коррекция с помощью антигипоксантов существенно смягчала и даже нивелировала дизрегулирующие и повреждающие эффекты пролонгированной вибрации, причем эффективность действия субстратных антигипоксантов не уступала действию фенигидина.

Вибропротективные эффекты субстратных антигипоксантов и фенигидина вызвали положительные морфологические изменения, по сравнению с морфогистологической картиной тканей животных, подвергнутых вибрации без фармакологической защиты. Признаки дистрофии тканей уменьшились, активизировался ангиогенез и восстановилась капиллярная сеть, уменьшался спазм артериол, снижался межклеточный отек, ограничились и/ или исчезали очаги кровоизлияний и некроза.

По выраженности вибропротективного действия антигипоксанты можно расположить в следующей последовательности: янтарная кислота > фениги-дин > глутаминовая кислота > пиридин-3-карбоновая кислота. Вибропротективные эффекты пиридин-3-карбоновой кислоты на уровне паренхиматозных органов оказались ограниченными, что отразилось на морфологической структуре тканей. По многим морфогистологическим признакам защитное действие пиридин-3-карбоновой кислоты было менее выражено по сравнению с другими препаратами и их комбинациями. Анализ биоэнергетических и морфогистологических параметров паренхиматозных органов на фоне фармакологической защиты антигипоксантами подтвердил фармакодинами-ческую интерференцию их позитивных эффектов от субклеточного уровня

митохондриальных взаимодействий до тканевого, отражая эффект полиорганной энергопротекции.

Фармакология вибропротекторов-антигипоксантов при сочетанном действии общей вибрации с другими неблагоприятными факторами Физическая выносливость крыс в условиях вибрационного воздействия. Ежедневная вибрация вызвала дизрегуляцию гомеостатических систем организма экспериментальных животных, что проявилось в виде снижения на 27,6% (р < 0,001) их устойчивости к физической нагрузке и уменьшение времени плавания по сравнению с интактными животными, которые удерживались на плаву в течение 15,2±1,7 мин (рис. 7).

Субстратные антигипоксанты (янтарная кислота 18 мг/кг, глутаминовая кислота 135 мг/кг, 7 дней, внутрь), пиридин-3-карбоновая кислота 6 мг/кг и их комбинации в равной мере нивелировали неблагоприятное вибрационное воздействие. Следовательно, курсовое ежедневное введение антигипоксантов и их комбинаций перед сеансом вибрации способствовало сохранению ресурсов физической выносливости. При этом все препараты продемонстрировали сходную эффективность, и межгрупповые различия между ними по времени удержания на плаву оказались недостоверными.

Рис. 7. Влияние антигипоксантов на продолжительность удержания на плаву

крыс, подвергшихся вибрации Обозначения: ИК - интактный контроль, ОВ - общая вибрация, Ж - янтарная кислота, ГК - глутаминовая кислота, НК - пиридин-3-карбоновая кислота. * — р < 0,05 статистически значимые различия между группами интактных и подвергнутых вибрации животных.

Многофакторный стресс (переохлаждение, иммобилизация, вибрация) и защита антигипоксантами у крыс. Искусственное снижение температуры окружающей среды является классическим экспериментальным воздействием, моделирующим состояние энергодефицита, и позволяющим оценить устойчивость механизмов термогенеза, как отражение уровня энергообеспечения организма (Иванов К.П., 1990). В данном разделе мы использовали регистрацию ректальной температуры у крыс как показатель поддержа-

ния метаболического (энергетического) гомеостаза при воздействии разных стрессогенных факторов (переохлаждение, иммобилизация, вибрация). Переохлаждение моделировали однократным помещением крыс в иммобилизиро-ванном состоянии (находящихся в специальных пеналах, где было невозможно менять положение тела) в температурные условия -22°С на 60 мин на 7-е сут после курсового применения общей вибрации 44 Гц (7 дней по 90 мин).

Комплексное воздействие общей вибрации, иммобилизации и переохлаждения приводило к снижению ректальной температуры с 34,6±0,41°С (1-ая группа) до 22,7±2,5 °С (2-я группа). Предварительное введение янтарной кислоты (100 мг/кг, 7 дней) или глутаминовой кислоты (112 мг/кг, 7 дней) достоверно предупреждало критическое падение ректальной температуры до 26,5±3,6°С (3-я группа) и 26,1±2,9°С (4-я группа) соответственно (р < 0,05). Следовательно, курсовое введение субстратных антигипоксантов-вибропротекторов способствует поддержанию метаболического (энергетического) гомеостаза крыс при воздействии многофакторного стресса (вибрация, переохлаждение, иммобилизация). Подтверждением этих данных стали исследования энергетического статуса лимфоцитов крыс по активности СДГ.

В наших исследованиях значения средней активности (С>) СДГ лимфоцитов животных 1-й группы (интактный контроль) составили 8,6 ± 0,7 гранул на клетку (рис. 8). Коэффициент вариации (V), характеризующий популяци-онную изменчивость (разнородность клеточной популяции по активности СДГ), имел значения 38,9± 1,6%. Популяция лимфоцитов в 1-й группе была сбалансирована, и количество клеток с высокой активностью фермента уравновешивалось количеством клеток с низкой активностью. Об этом свидетельствовали значения коэффициента асимметрии (А). Коэффициент эксцесса (Е), характеризующий избыток или недостаток клеток со средней (типичной) активностью СДГ, отражал достаточный уровень резерва типичных лимфоцитов в популяции интактных животных (табл. 1).

сАг 1Й

эалериуо-пагъкзв гругы

гксперииеытагы-ью г^ут*»1

Рис. 8. Показатели удельной активности (А) и вариабельности (Б) СДГ лимфоцитов крови крыс при воздействии многофакторного стресса и фармакологической защиты

Ось абсцисс - группы сравнения; ось ординат - изменение показателя в % относительно группы интактных животных (нулевая линия); * -р<0,05,

** -р <0,01.

Таким образом, значения показателей О, V, А, Е характеризовали близкий к оптимальному уровню энергетический статус популяции лимфоцитов у крыс 1-й группы, а, следовательно, ее функциональной активности, и отражали уровень энергетического баланса для реализации адаптационных возможностей организма животных в целом.

Таблица 1

Коэффициенты асимметрии (А) и эксцесса (Е) на фоне воздействия _многофакторного стресса и фармакологической защиты_

Показатель Группа

1-я (интактный контроль) 2-я (вибрация, иммобилизация, охлаждение) 3-я (стресс + янтарная кислота) 4-я (стресс + глутаминовая кислота)

А +9,6±0,7** 46,3±3,1* 0,33±0,1** -0,62±0,22*

Е +10,0±1,1* 45,3±3,2* -0,051±0,2** -0,64±0,09*

Примечание: * - р <0,05; ** -р <0,01 к интактному контролю.

Общая вибрация и холодовое воздействие в совокупности на фоне иммобилизации вызвали перестройку энергетического статуса лимфоцитов периферической крови у животных 2-й группы. Удельная СДГ активность клеток (С>) уменьшилась на 33% (р < 0,05), нарушалось соотношение количества клеток с низкой и высокой активностью фермента в сторону преобладания пула с низкой активностью, поэтому коэффициент асимметрии популя-ционного распределения (А) и параметр распределения клеток четвертого порядка (Е) увеличивались (табл. 1), свидетельствуя о включении и клеточных и популяционных механизмов компенсаторного усиления энергопродукции. Совокупность параметров, характеризующих энергетический статус популяции лимфоцитов крыс 2-й группы, подвергнутых воздействию многофакторного стресса, по СДГ-активности, свидетельствовала о рассогласованности (дезрегуляции) клеточной энергопродукции и популяционной структуры лимфоцитов под действием неблагоприятных факторов.

Клеточные и популяционные параметры активности СДГ лимфоцитов изменялись у крыс 3-й и 4-й групп при введении янтарной и глутамино-вой кислоты. Удельная активность СДГ повышалась на 68-75% (р<0,01) относительно животных, подвергнутых воздействию стрессирующих факторов, становясь на 12-16% выше уровня интактного контроля (1-ой группы). Попу-ляционная изменчивость лимфоцитов (V) также увеличивалась относительно показателя стрессированных животных (2-я группа) на 38% (р < 0,01), становясь более высокой относительно интактного контроля. Влияние субстратных антигипоксантов «гармонизировало» популяцию лимфоцитов, уменьшая избыток низкоактивных клеток и ликвидируя недостаток высокоактивных.

Коэффициенты ассиметрии (А) и эксцесса (Е) также приближались к уровню интактного контроля.

Таким образом, применение субстратных антигипоксантов частично нивелировало воздействие многофакторного стресса на уровне системы энергопродукции лимфоцитов и оказало оптимизирующее и регулирующее воздействие на энергетический статус популяции клеток.

Фармакология вибропротекторов-антигипоксантов при действии локальной вибрации. В данном разделе исследований использовали прием локальной вибрации 30 Гц в течение 7 сеансов (1 сеанс в день по 90 мин). Для снятия избыточного стресса крысам за 30 мин до опыта вводили анксио-литик диазепам 0,15 мг/кг внутрибрюшинно. В качестве вибропротектора использовали субстратный антигипоксант янтарную кислоту 100 мг/кг, которую вводили внутрь за 15 мин до сеанса вибрации.

Локальная вибрация резко усиливала потребления кислорода во всех изучаемых тканях (миокард, печень, почка), о чем свидетельствуют скорости эндогенного дыхания (рис. 9). Максимальный прирост потребления кислорода регистрировали в миокарде.

200% -)

Уэ сердце Уэ почка Уэ печень

Рис 9. Влияние локальной вибрации и янтарной кислоты 100 мг/кг на тканевое дыхание (Уэ) крыс Ось ординат - отклонение от уровня контрольных животных; ЛВ - локальная вибрация; ЛВ+Ж - локальная вибрация на фоне введения янтарной кислоты 100 мг/кг. * —р < 0,05; ** -р < 0,01 - статистически значимые различия с

контролем.

Эндогенное дыхание препарата нативных митохондрий осуществляется за счет окисления энергетических субстратов, имеющихся в ткани к моменту измерения. У животных группы интактного контроля оно оптимально струк-

туркровано (табл. 2) из-за необходимости сохранения максимальной эффективности метаболизма.

Таблица 2

Показатели градаций метаболических состояний митохондрий сердца интактных крыс

Показатели М±т

Уэ 18,4±5,7

Амиталчувствительность, % 62

Малонатчувствительность, % 44

V™ 32,5±7,0

^глу+мал 15,1±4,0

V у як-р 65,4±14,2

^глу+мал-р 37,4±15,7

КСЯК 2,3±0,5

КСрлу+мал 1,0±0,3

КРяк 2,0±0,5

КРглу+мал 2,5±0,6

Примечание. Скорости дыхания митохондрий даны в (нг-атом О мин"'мг1 белка), КС, КР - в условных единицах измерения. Указаны средние значения показателей с их доверительными интервалами.

Оценка соотношения вкладов малонат- и амиталчувствительного дыхания, проведенная с помощью анализа чувствительности эндогенного дыхания к специфическим ингибиторам малонату (ФАД-зависимая фракция) и амита-лу (НАД-зависимая фракция) показала, что в сердце и почках наблюдается рост малонатчувствительного дыхания на 23 и 55% соответственно (р < 0,05). Это отражает активность СДГ и вклад ФАД-зависимой составляющей в эндогенное дыхание. При этом чувствительность к амиталу снижается (сердце) или остается без изменений (почка). Напротив, в печени сохраняется высокий уровень амиталчувствительного дыхания, отражая сохранную активность НАД-зависимого звена дыхательной цепи, подобно контрольным ин-тактным животным.

Увеличение показателей окисления экзогенного сукцината в состоянии покоя митохондрий (Уяк) в сердце и почках на 23% (р < 0,05), подтвержденное ростом коэффициента стимуляции (КСяк) на фоне снижения Углу+мал и КСГЛу+мал, свидетельствует об активизации и доминировании сукцинатзависи-мой фракции дыхательной цепи. В печени коэффициент стимуляции КСГЛу+мал

остается на уровне интактного контроля, тогда как КСЯ„ снижена на 30% (р < 0,05).

Скорость окисления экзогенных субстратов на фоне 2,4-ДНФ, создающего максимальную функциональную нагрузку на дыхательную цепь митохондрий сердца (Никольс Д., 1985), свидетельствует о низкой сопряженности окислительного фосфорилирования, при этом показатели Уяк.р, КРяк, Углу+мал.р, КРглу+мал имеют тенденцию к снижению. В почках четкие закономерности изменения данных показателей отсутствуют, а в печени они доминируют, свидетельствуя о сохранности процессов окисления и фосфорилирования как в НАД-, так и ФАД-зависимом звене дыхательной цепи.

Таким образом, функциональная перестройка в дыхательной цепи митохондрий сердца и почек крыс свидетельствовала о торможении НАД-зависимого звена дыхательной цепи и активации системы окисления эндогенной янтарной кислоты, что соответствует развитию 1-П фазы биоэнергетической гипоксии (Воробьева В.В., Шабанов П.Д., 2009, 2013). Активизация и сохранность биоэнергетических процессов на уровне НАД-зависимого звена дыхательной цепи печени свидетельствуют о развитии начальной, I фазы биоэнергетической гипоксии и большей устойчивости этого органа к воздействию изучаемого режима вибрации.

Энергетический статус лимфоцитов крови крыс при экспериментальной локальной вибрации и фармакологической защите от вибрации антигипоксантами. У интактных животных показатели СДГ активности составляли: <3=4,9±0,8 гранул на клетку, У=12,9±3,9%. Коэффициент асимметрии А был равен +0,61±0,11, а коэффициент эксцесса Е составлял -0,22±0,09. Значения показателей С>, V, А, Е характеризовали оптимальный энергетический статус популяции лимфоцитов у интактных животных.

Локальная вибрация вызывала перестройку энергетического статуса лимфоцитов периферической крови экспериментальных животных. Удельная СДГ-активность клеток (О) возрастала на 52% (р < 0,05), вариабельность (V) - в 3 раза (р < 0,05), при этом локальная вибрация нарушала соотношение количества клеток с низкой и высокой активностью фермента в сторону преобладания пула с низкой активностью. Коэффициент асимметрии популяцион-ного распределения (А) и параметр распределения клеток четвертого порядка (Е) увеличивались до +1,04±0,12 и +0,38±0,12 соответственно, свидетельствуя о появлении избытка пула клеток со средней активностью СДГ. Следовательно, совокупность параметров, характеризующих энергетический статус популяции лимфоцитов экспериментальных животных по СДГ-активности, указывает на рассогласованность (дизрегуляцию) клеточной энергопродукции и популяционной структуры лимфоцитов под действием вибрационного фактора. Очевидно, что локальная вибрация вызывала адаптивную перестройку статуса популяции, направленную на противодействие дизрегули-рующему фактору.

Субстратный антигипоксант янтарная кислота 100 мг/кг изменяла клеточные и популяционные параметры активности СДГ лимфоцитов следующим образом. Удельная активность СДГ снижалась на 8% относительно виб-

рированных животных, однако оставаясь повышенной на 40% (р < 0,05) относительно контрольных значений. Популяционная изменчивость лимфоцитов (V) снижалась относительно показателя вибрированных животных на 32% (р < 0,01), но оставалась значительно повышенной относительно контроля. Янтарная кислота «гармонизировала» популяцию лимфоцитов, уменьшая избыток низкоактивных клеток и ликвидируя недостаток высокоактивных. Коэффициенты А и Е приближались к уровню интактного контроля (до +0,49±0,26 и +0,12±0,08 соответственно).

Таким образом, применение янтарной кислоты в субстратной дозе (100 мг/кг) частично нивелировало воздействие вибрации на уровне системы энергопродукции лимфоцитов и оказало оптимизирующее и регулирующее воздействие на энергетический статус лимфоцитов. Препарат улучшал структуру и состояние клеточной популяции лимфоцитов по их энергетическому статусу и в значительной степени предупредил рассогласованность ведущих параметров популяционной изменчивости клеточного пула.

В наших экспериментах однонаправленные сдвиги проявились как на тканевом уровне (при сравнительном анализе интенсивности и структуры эндогенного дыхания), так и на организменном - при оценке ферментного статуса клеток белой крови -. Однако «платой» за срочную мобилизацию окислительных процессов явилось одновременное накопление активных форм кислорода, и, как следствие, повышение активности каталазы — первого звена антиокислительной системы (Коркина О.В., Рууге Э.К., 2000; Суворов Г.А. и др., 2002). Если в наших опытах у интактных животных активность каталазы составляла 2422±472 нг-атом О мин"'мг"'белка, то на фоне вибрационного воздействия ее рост составил 90% (р < 0,05), тогда как янтарная кислота устраняла этот сдвиг.

Механизмы защитного действия прямых антигипоксантов 2-этилтиобензимидазола гидробромида и

5-этоксн-2-этилтиобензимидазола в моделях интоксикации

В настоящем исследовании в качестве бытовых токсикантов использовали органические растворители (дихлорэтан и этиленгликоль) и фосфорор-ганический пестицид карбофос, которые обладают выраженной нейроток-сичностью (Куценко С.А., 2004). Оценивали общее защитное действие прямых антигипоксантов 2-этилтиобензимидазола гидробромида и 5-этокси-2-этилтиобензимидазола (25-50 мг/кг, 10 дней внутрибрюшинно), при острой интоксикации дихлорэтаном, этиленгликолем и карбофосом, используемых в дозах, составляющих 1,0 ЛД50 (737,0±9,4; 692,8±35,2 и 256,4±8,7 мг/кг соот-ветственнно). В качестве теста на работоспособность использовали плавательную пробу с грузом 10% от массы животного, регистрируя время удержания на плаву (ВУП) до полного первого полного погружения в воду.

Защитные эффекты 2-этилтиобензимидазола гидробромида и 5-этокси-2-этилтиобензимпдазола в модели интоксикации карбофосом. Острое отравление карбофосом характеризовалось выраженным нарушением

физической работоспособности крыс (рис. 10) в сравнении с группой интакт-ного контроля.

Рис. 10. Влияние 2-этилтиобензимидазола гидробромида (метапрот) и 5-этокси-2-этилтиобензимидазола (этомерзол) на восстановление физической работоспособности по данным плавательной пробы при отравлении карбофосом в дозе 1,0 ЛД5о (М ± п) По оси ординат - ВУП от уровня интактных животных (%), покоси абсцисс -время (сут). * - р < 0,05 в сравнении с интактными крысами, - р < 0,05 в сравнении с отравленными крысами.

На 7-е сут в группе крыс, леченных 5-этокси-2-этилтиобензимидазолом, отмечали практически полное восстановление физической работоспособности - ВУП составило 99,0 ± 2,0%, а на фоне лечения 2-этилтиобензимидазола гидробромида - 92,0 ± 1,9%. В контрольной группе ВУП на 7-е сут составило 64,0 ± 1,5%. К 10-м сут после отравления работоспособность животных, получавших 2-этилтиобензимидазола гидробромид, была несколько выше уровня интактных крыс -104,0 ± 2,0%, а при использовании 5-этокси-2-этилтиобензимидазолома достоверно выше- 107,0±3,1% (р < 0,05), тогда как в контрольной группе ВУП на 10-е сут составило 78,0 ±2,1%.

Степень поражения паренхиматозных органов токсикантами оценивали по активности печеночных ферментов. Максимальное повышение активности АсАТ отмечали во всех группах отравленных крыс на 3-й сут после отравления. Однако на 7-е сут на фоне применения исследуемых веществ активность АсАТ восстановилась практически до уровня интактных животных, а в контрольной группе оставалась выше нормы на 65%.

Активность АлАТ в контрольной группе на 7-е сут отравления была повышена более чем в 2 раза. При использовании антигипоксантов максимальная активность АлАТ отмечалась на 1-е сут после отравления, а на 3-е сут - достоверно снижалась. К 7-м сут активность АлАТ у животных, получавших 2-этилтиобензимидазола гидробромид и 5-этокси-2-этилтиобензимидазол, была на уровне нормальных величин.

120

^емя пссле Ееедения кар&фэса (сутки)

Уровень общего билирубина, максимально повышенный на 1-е сут после отравления во всех группах, в дальнейшем снижался. Однако в контрольной группе на 7-е сут он остался повышенным на 40%, тогда как на фоне фармакологической защиты достиг показателей интактного контроля.

Концентрация креатинина и азота мочевины в контрольной группе отчетливо нарастала к 7-м сут после отравления. Препараты 2-этилтиобензимидазола гидробромида и 5-этокси-2-этилтиобензимидазола снижали уровень азотистых шлаков до нормальных величин к 7-м суткам.

Таким образом, острое отравление карбофосом сопровождается отклонениями от нормального уровня ряда биохимических показателей сыворотки крови, свидетельствующих о нарушении функции печени (аминотрансфера-зы, билирубин) и почек (креатинин, азот мочевины). Применение 2-этилтиобензимидазола гидробромида и 5-этокси-2-этилтиобензимидазола способствует ускорению нормализации биохимических показателей. Терапевтический эффект антигипоксантов отмечали на 3-7 сут их курсового применения.

А Б

Рис. 11. Влияние 2-этилтиобензимидазола гидробромида (метапрот) и 5-этокси-2-этилтиобензимидазола (этомерзол) на развитие эндогенной интоксикации при отравлении карбофосом в дозе 1,0 ЛД50, лейкоцитарный индекс интоксикации по Островскому (М ± ш) (А) и по Кальф-Калифу (М ± т) (В) * — р < 0,05 в сравнении с интактными крысами, ** - р < 0,05 в сравнении с

отравленными крысами.

Интоксикация карбофосом также усиливала процессы перекисного окисления липидов, о чем свидетельствовал повышенный уровень малонового диальдегида (МДА) в крови. На фоне курсового применения антигипоксантов отмечали нормализацию уровня МДА к 7-м сут после отравления, тогда как в контрольной группе на 7-е сут уровень МДА был в 2 раза выше нормы. На 3-е сут после отравления происходило падение уровня восстановленного глутатиона (ВГ), свидетельствуя о нарушении окислительного го-

меостаза. На фоне применения антигипоксантов к 7-м сут концентрация ВГ достигла нормальных величин.

Степень выраженности эндогенной интоксикации оценивали по лейкоцитарному индексу интоксикации в контрольной группе и на фоне фармакологической защиты (рис. 11).

Таким образом, антигипоксанты 2-этилтиобензимидазола гидробромид и 5-этокси-2-этилтиобензимидазол прекращают развитие эндогенной интоксикации при отравлении карбофосом.

Изучение последствий отравлений этиленгликолем и дихлорэтаном показало, что характер их нейро-, гепато- и нефротоксического действия совпадает с таковым при отравлении карбафосом. В случае курсового (10 дней) применения 2-этилтиобензимидазола гидробромида и 5-этокси-2-этилтиобензимидазола (25-50 мг/кг) оказывали защитное действие, оцениваемое как по физической выносливости, так и по биохимическим показателям, характеризующим состояние паренхиматозных органов, системы крови. Как правило, положительный эффект прямых антигипоксантов начинал реализо-вываться на 3-й сут после начала их назначения и был максимально выражен на 7-10 сут курсового применения препаратов. Антитоксическое действие препаратов на систему перекисного окисления липидов и антиоксидантную систему реализуется посредством нормализующего влияния на процессы свободно-радикального окисления (снижение показателей МДА и повышение уровня ВГ).

Заключение

По мере пролонгации вибрации в митохондриях изученных органов кролика (печень, почка) происходят регуляторные переключения интенсивности и эффективности процессов окисления и синтеза макроэргов (Воробьева В.В., Шабанов П.Д., 2008, 2013). Вследствие снижения активности НАД-зависимого звена дыхательной цепи опосредованно через такой лиганд G-белок-сопряженных рецепторов (G-protein coupled receptor - GPCR, подтип GPR 91), как янтарная кислота (Не W. et al., 2004) начиналась экспрессия фактора HIF-la (Hypoxia Inducible Factor). Как известно, транслокация данного фактора в ядро (Ткачук В.А., Авакян А.Э., 2008; Semenza G.L. 2000; Stroka D.M et al., 2001) стимулирует экспрессию широкого спектра HIF-1 зависимых генов-мишеней и синтез защитных адаптивных белков (Ben-Dov C.et al., 2008), мобилизирующих активность ФАД-зависимого звена дыхательной цепи. Это способствует доставке кислорода через механизмы усиления транспорта глюкозы, продукции АТФ, ионного транспорта, клеточной пролиферации, активизацию эритропоэза и ангиогенеза. В совокупности вышеперечисленные механизмы создают новое стационарное состояние энергетического обмена в тканях в условиях воздействия экстремальных факторов, характеризующееся доминированием ФАД-оксидазного перед НАД-оксидазным путем окисления. Достоверность подобного механизма адаптации клетки к стрессу (Воробьева В.В., Шабанов П.Д., 2008, 2013) подтверждается тем фактом, что во всех изученных нами тканях кролика (печень,

почка), крыс (сердце, печень, почка) идентифицирован Н1Р-1 фактор (Бетеп-га О.Ь., 2000; Б^ока Б.М е1 а1., 2001). Генерализованные нарушения в сопрягающих системах ФАД- и НАД-зависимых участков дыхательной цепи митохондрий указывают на формирование низкоэнергетического сдвига в энергообеспечении изученных тканей. Янтарная кислота поддерживает сопряженность транскрипционной экспрессии индуцируемых гипоксией генов и работы дыхательной цепи. Именно в присутствии янтарной кислоты восстанавливается индукция фактора НИМ альфа и генов-мишеней (Бетепга ОХ., 2000; Бй-ока О.М е! а1., 2001). Доказанная эффективность субстратных антигипо-ксантов (янтарной и глутаминовой кислоты) и блокатора кальциевых каналов в моделях вибрации подтверждает то, что в условиях гипоксии, вызванной воздействием такого экстремального фактора как вибрация для реализации всего комплекса адаптивных реакций необходимо, прежде всего, поддержание сукцинатоксидазного окисления (Воробьева В.В., Шабанов П.Д., 2008, 2013).

Как известно одним из определяющих эффектов 2-этилтиобензимидазола гидробромида является способность активировать геном клеток с усилением синтеза РНК и белка (Смирнов А.В., 1993; Зарубина И.В., Шабанов П.Д., 2004; Шабанов П.Д. и др., 2010), что находит отражение в анаболическом и репарационном эффектах, проявившихся в виде гепато- и нефропротекции в моделях интоксикации бытовыми токсикантами. Наиболее выраженный активирующий эффект 2-этилтиобензимидазола гидробромида отмечен в органах с короткоживущими белками (печень и почка) (Шабанов П.Д. и др., 2010; Зарубина И.В., 2011). Быстро обновляемые белки играют важную роль в предотвращении дезадаптации систем и органов в ответ на различные патологические факторы. Среди белков, усиленно синтезируемых в печени и почках под влиянием 2-этилтиобензимидазола гидробромида, основное значение для поддержания физической работоспособности имеют ферменты глюконеогенеза, определяющие утилизацию продуцируемой молочной кислоты и ресинтез расходуемых углеводов. Кроме того, глюконео-генез в тесном сопряжении с глюкозо-аланиновым циклом и обменом глута-мина препятствует образованию лактата и аммиака в мышцах и участвует в нейтрализации и выведении азотистых продуктов. Применение антигипо-ксантов 2-этилтиобензимидазола гидробромида и 5-этокси-2-этилтиобензимидазола на фоне воздействия токсикантов, очевидно, способствовало морфофункциональному восстановлению тканей печени и почек, что нашло отражение в соответствующей динамике комплекса биохимических показателей в моделях интоксикации карбофосом, этиленгликолем и дихлорэтаном (Воробьева В.В. и др., 2012,2013).

ВЫВОДЫ

1. Длительное воздействие вибрации вызывает развитие биоэнергетической гипоксии в тканях и может рассматриваться в качестве экспериментальной модели гипоксического типа клеточного метаболизма. Данная мо-

дель удобна для изучения патофизиологических феноменов и оценки эффективности лекарственных препаратов (антигипоксантов, вибропротекторов) в условиях воздействия экстремальных факторов.

2. На уровне системы энергопродукции тканей печени и почки воздействие локальной и общей вибрации лишено специфики и проявляется общей дисфункцией системы энергопродукции тканей по типу низкоэнергетического сдвига с активизацией системы окисления янтарной кислоты и торможением НАД-зависимого звена дыхательной цепи митохондрий.

3. Субстратные антигипоксанты (препараты на основе митохондриаль-ных субстратов янтарной и глутаминовой кислоты), блокаторы кальциевых каналов (фенигидин) и их комбинации препятствуют формированию низкоэнергетического сдвига на уровне систем энергопродукции тканей, нормализуют клеточные и популяционные характеристики сукцинатдегидрогеназного статуса лимфоцитов, восстанавливают активность антиокислительных систем.

4. Фармакологические эффекты субстратных (янтарная и глутаминовая кислоты) и непрямых антигипоксантов (фенигидин) и их комбинаций сопровождаются восстановлением морфологических нарушений в тканях печени и почки вследствие экспериментальной вибрации, свидетельствуя об их вибро-протективной фармакодинамике.

5. В отличие от субстратных и непрямых антигипоксантов пиридин-3-карбоновая кислота усугубляет неблагоприятные последствия вибрации, что проявляется чрезмерным угнетением сукцинатзависимой биоэнергетики и возникновением дополнительных повреждений клеточных, сосудистых и стромальных элементов тканей экспериментальных животных.

6. Субстратные антигипоксанты (препараты на основе митохондриаль-ных субстратов янтарной и глутаминовой кислоты) и их комбинации способствуют оптимизации структуры и состояния клеточной популяции лимфоцитов, оцененного по их энергетическому статусу, и предупреждают рассогласованность ведущих параметров популяционной изменчивости клеточного пула лимфоцитов.

7. Действие субстратных (янтарная и глутаминовая кислоты) и непрямых (фенигидин) антигипоксантов в отдельности и в комбинации проявляют вибропротективные свойства при общей и локальной вибрации, а также при их сочетанном действии с другими экстремальными факторами среды (предельной физической нагрузкой, переохлаждением, иммобилизацией).

8. Острое отравление бытовыми ядами карбофосом, дихлорэтаном и этиленгликолем снижает переносимость физической нагрузки, повышает активность печеночных ферментов (АсАТ, АлАТ), показатели азотистого обмена (уровень общего билирубина, креатинина и азота мочевины), перекисного окисления липидов (содержание малонового диальдегида) и снижают активность антиокислительных систем (концентрацию восстановленного глутатиона) в крови, нарушают микроциркуляцию, реологические свойства крови и газообмен тканей.

9. Прямые антигипоксанты 2-этилтиобензимидазола гидробромид и 5-этокси-2-этилтиобеизимидазол при курсовом применении (10 дней) восстанавливают переносимость физической нагрузки и нарушенные биохимические показатели в крови, оказывая антитоксическое действие.

10. Применение эрготропных фармакологических средств (митохондиальные субстраты, прямые и непрямые антигипоксанты) является эффективным способом защиты при повреждающем действии на ткани внутренних органов общей и локальной вибрации, при их сочетанном действии с другими экстремальными факторами среды (предельной физической нагрузкой, переохлаждением, иммобилизацией), а также использовании бытовых ядов (карбофоса, дихлорэтана, этиленгликоля).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Разработана оригинальная модель гипоксического состояния клеточного метаболизма вследствие воздействия общей вибрации для оценки энергопро-тективного действия фармакологических средств защиты от вибрации (вибропротекторов). Описаны характеристики модели, возможности ее использования в экспериментальной фармакологии.

С помощью модели вибрационно-опосредованного гипоксического состояния клеточного метаболизма оценено действие субстратных антигипо-ксантов (янтарная и глутаминовая кислоты), блокаторов кальциевых каналов (фенигидин) и пиридин-3-карбоновой кислоты на энергетический метаболизм при воздействии локальной и общей вибрации. Доказаны вибропротек-тивные свойства субстратных антигипоксантов (янтарная и глутаминовая кислоты), возрастающие при комбинировании с блокаторами кальциевых каналов и уменьшающиеся при добавлении пиридин-3-карбоновой кислоты.

В основе положительного вибропротективного действия изученных препаратов лежат биоэнергетические феномены, связанные с оптимизацией энергопродукции и энергопотребления, нарастающего при суммационном действии вибрации. Это позволяет рекомендовать субстратные антигипоксанты, блокаторы кальциевых каналов и их комбинации для лечения больных вибрационной болезнью. Так как пиридин-3-карбоновая кислота на фоне неблагоприятного воздействия вибрации вызывает дополнительные функциональные и морфологические повреждения, рекомендовано заменить данный препарат на другие вибропротекторы.

Изучение механизмов защитного действия 2-этилтиобензимидазола гидробромида и 5-этокси-2-этилтиобензимидазола в моделях интоксикации бытовыми ядами (карбофосом, этиленгликолем и дихлорэтаном) также позволяет оптимизировать схемы лечения больных за счет включения в них веществ эрготропного действия.

Список основных работ по теме диссертации

1. Воробьева В.В. Фармакологическая коррекция экспериментальной вибрационно обусловленной биоэнергетической гипоксии кар-диомиоцитов / В.В. Воробьева, П.Д. Шабанов // Патогенез. - 2008. - Т. 6, №3,-С. 51-52.

2. Воробьева В.В. Функциональная активность системы энергопродукции миокарда кролика при воздействии общей вибрации / В.В. Воробьева, П.Д. Шабанов // Рос. физиол. журн. им. И.М. Сеченова. -2009. - Т. 95, № 1. - С. 19-26.

3. Воробьева В.В. Экзогенная янтарная кислота уменьшает вибрационно-опосредованные нарушения энергетического обмена в кардиомиоцитах кролика / В.В. Воробьева, П.Д. Шабанов // Рос. физиол. журн. им. И.М.Сеченова. - 2009. - Т. 95. № 8. - С. 857-864.

4. Воробьева В.В. Эффективность нифедипина в комбинации с янтарной кислотой при экспериментальной биоэнергетической гипоксии кардиомиоцитов, обусловленной вибрацией / В.В. Воробьева // Достижения клинической фармакологии в России : 2-я науч.-практич. конф. - М., 2009. - С. 24.

5. Воробьева В.В. Вибрационная модель гипоксического типа клеточного метаболизма, оцененная на кардиомиоцитах кролика / В.В. Воробьева, П.Д. Шабанов // Бюл. эксперим. биол. и медицины. — 2009. - Т. 147, № 6. - С. 712-715.

6. Воробьева В.В. Сукцинатдегидрогеназная активность лимфоцитов кролика при экспериментальной общей вибрации / В.В. Воробьева // Механизмы функционирования висцеральных систем: VII-я Всерос. конф., посвящ. 160-летию И.П. Павлова. - СПб. : ФИН РАН, 2009. - С. 107-109.

7. Воробьева В.В. Изменение оснащенности митохондрий миокарда эндогенными субстратами в зависимости от вибрации и схем фармакологической защиты in vivo / В.В. Воробьева // Экспериментальная и клиническая фармакология : материалы 3-й междунар. науч. конф. - Минск, 2009.-С. 26-28.

8. Vorobieva V.V. Vibration model for hypoxic type of cell metabolism evaluated on rabbit cardiomyocytes / V.V. Vorobieva, P.D. Shabanov // Bull. Exp. Biol. Med. - 2009. - Vol. 147, N6. - P. 768-772.

9. Воробьева В.В. Морфофункциональные изменения миокарда кролика при воздействии общей вибрации и после фармакологической защиты янтарной кислотой / В.В. Воробьева, П.Д. Шабанов // Вести. Санкт-Петербург, ун-та. Сер. 11. - 2010. - Вып. 3. - С. 201-207.

10. Воробьева В.В. Изучение механизма кардиопротективиого эффекта нифедипина при воздействии вибрации у кроликов / В.В. Воробьева, П.Д. Шабанов // Эксперим. и клин, фармакология. - 2010. - Т. 73,№6.-С. 5-9.

11. Воробьева, В.В. Блокаторы медленных кальциевых каналов L-типа поддерживают энергетический обмен в кардиомиоцитах

кролика при воздействии общей вибрацин / В.В. Воробьева, П.Д. Шабанов // Рос. физиол. журн. им. И.М.Сеченова. - 2010. — Т. 96, № 6. — С. 573-581.

12. Воробьева, В.В. Биоэнергетические феномены при стресси-ругощем воздействии локальной вибрации и защитном действии янтарной кислоты / В.В. Воробьева, П.Д. Шабанов // Мед.-биол. и соц.-психол. пробл. безопасности в чрезвыч. ситуациях. — 2010. — № 4, ч. 1. — С. 87-92.

13. Воробьева, В.В. Применение нифедипина в модели вибрационной болезни / В.В. Воробьева, П.Д. Шабанов // Современная фармацевтическая наука и практика: традиции, инновации, приоритеты : тез. Всерос. науч.-практ. конф., посвящ. 40-летию фармакол. фак-та Самарского гос. мед. ун-та. - Самара, 2011. - С. 191-192.

14. Воробьева В.В. Морфологические изменения миокарда кролика на фоне вибрации и фармакологической защиты / В.В. Воробьева, В.Г. Хоробрых, П.Д. Шабанов // Морфол. ведомости. - 2011. - № 1.-С. 27-35.

15. Воробьева В.В. Фармакология вибрационно-опосредованных нарушений энергетического обмена в миокарде / В.В. Воробьева, П.Д. Шабанов // Обз. по клин, фармакол. и лекарств, терапии. - 2011. - Т. 9, № 1. - С. 3-44.

16. Воробьева В.В. Янтарная кислота сохраняет некоторые гомео-статические показатели организма при воздействии многофакторного стресса в эксперименте / В.В. Воробьева, П.Д. Шабанов // Современные проблемы военной медицины, обитаемости и профессионального отбора : тез. Всерос. науч.-практ. конф., посвящ. 90-летию проф. И.Д. Кудрина. -СПб., 2011.-С. 165.

17. Воробьева, В.В. Защитные эффекты метапрота при остром отравлении карбофосом / В.В. Воробьева, И.В. Зарубина, П.Д. Шабанов // Актуальные проблемы токсикологии и радиобиологии : тез. Рос. науч. конф.-СПб., 2011.-С. 194.

18. Воробьева, В.В. Защитные эффекты метапрота и этомерзо-ла в экспериментальных моделях отравлений бытовыми ядами /

B.В. Воробьева, И.В. Зарубина, П.Д. Шабанов // Обз. по клин, фармакол. и лекарств, терапии. - 2012. - Т. 10, № 1. - С. 3-22.

19. Воробьева В.В. Защитные эффекты метапрота и этомерзола при отравлении карбофосом / В.В. Воробьева, И.В. Зарубина, П.Д. Шабанов // Эксперим. и клин, фармакология. - 2012. - Т. 75, № 8. - С. 2530.

20. Воробьева В.В. Влияние общей вибрации на функции дыхательной цепи печени кроликов / В.В. Воробьева, Н.К. Мазина, П.Д. Шабанов // Вестн. Санкт-Петербург, ун-та. Cep.ll. - 2012. - Вып. 4. -

C. 152-161.

21. Воробьева, В.В. Стрессирующее воздействие локальной вибрации на энергетический обмен сердца, печени и почки крыс / В.В.

Воробьева, П.Д. Шабанов // Рос. физиол. журн. им. И.М.Сеченова. -2012. - Т. 98, № 2. - С. 233-239.

22. Воробьева, В.В. Влияние общей вибрации на функции дыхательной цепи паренхиматозных органов кроликов в эксперименте / В.В. Воробьева, В.Г. Хоробрых, П.Д. Шабанов // Обз. по клин, фарма-кол. и лекарств, терапии. - 2012. - Т. 10, № 4. - С. 16-29.

23. Воробьева В.В. Метаболические протекторы метапрот и этомерзол в комплексном лечении отравлений ФОС / В.В. Воробьева, И.В. Зарубина, П.Д. Шабанов // Мед.-биол. и соц.-психол. пробл. безопасности в чрезвыч. ситуациях. - 2013. - №1. - С. 66-73.

24. Воробьева, В.В. Экспериментальное обоснование использования блокаторов кальциевых каналов при вибрационной болезни / В.В. Воробьева, Н.К. Мазина, П.Д. Шабанов // Медицина труда и пром. экология. - 2013. - № 2. - С. 37-41.

25. Воробьева В.В. Защитные эффекты этомерзола в модели интоксикации дихлорэтаном / В.В. Воробьева // Обз. по клин, фармакол. и лекарств, терапии. - 2013. - Т.11, спецвыпуск,- С. 35-36.

26. Воробьева В.В. Защита метапротом от токсических эффектов карбофоса / В.В. Воробьева // Обзоры по клин, фармакологии и лекарств, терапии. - 2013. — Т.11, спецвыпуск.- С. 36-37.

27. Воробьева В.В. Вибрация и вибропротекторы / В.В. Воробьева, П.Д. Шабанов. - СПб.: Информ-навигатор, 2014. - 410 с. (монография).

Список сокращений

АлАТ - аланинаминотранфераза

АсАТ - аспартатаминотрансфераза

МДА - малоновый диальдегид

НАД - никотинамидадениндинуклеотид

СДГ - сукцинатдегидрогеназа

ФАД - флавинадениндинуклеотид

ЩУК - щавелевоуксусная кислота

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ЯК - янтарная кислота

МНН - международное непатентованное название

Тираж 120 экз. Подписано в печать 30.05.2014 г. Формат 60x84 1/16 Объем 1,25 п.л. Заказ № 41

Типография СПбГПМУ (194100, Санкт-Петербург, ул. Литовская, 2)