Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Фармакогенетическое значение и этнические особенности полиморфизма гена VKORCI, кодирующего субъединицу 1 витамин к эпоксид редуктазы

НЛПРАВЧХРУКППИСИ

Загорская Валентина Леонидовна

ФАРМАКОГЕНЕТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ И ЭТНИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНА УКОЯС!, КОДИРУЮЩЕГО СУБЪЕДИНИЦУ 1 ВИТАМИН К ЭПОКСИД РЕДУКТАЗЫ

14.00.25 Фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

О2ОНТ2008

Москва 2008

003447506

Работа выполнена в ГОУ ВПО ММА им. И.М. Сеченова Росзрава на кафедре клинической фармакологии и пропедевтики внутренних болезней

Научный руководитель:

Академик РАМН, доктор медицинских наук,

профессор Кукес Владимир Григорьевич

Научный консультант:

кандидат биологических наук Игнатьев Илья Владимирович

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Жердев Владимир Павлович

Доктор биологических наук, профессор Носиков Валерий Вячеславович

Ведущая организация: ГОУ ВПО Российский Государственный Медико-стоматологический Университет Росздрава (РГМСУ)

Защита диссертации состоится « » 2008 г. в ч на заседании

диссертационного совета Д.001.024.01 при ГУ Научно исследовательский институт фармакологии имени В.В. Закусова РАМН по адресу: 125315 Москва, Балтийская ул. 8.

С диссертацией можно ознакомиться в ученой части ГУ НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН по адресу: 125315 Москва, Балтийская ул. 8.

Автореферат разослан « » 2008 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета Доктор медицинских наук

Вальдман Елена Артуровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время в развитых странах основной причиной смертности являются заболевания сердечно-сосудистой системы (ЗССС). По мере того, как постепенно снижается возраст людей, страдающих данными патологиями, эта проблема все больше затрагивает трудоспособное население. Происходит беспрецедентный рост социально-экономической значимости заболеваний сердечно-сосудистой системы во всем мире [В1а1уе1 а], 1992].

Когда говорят о смертности в результате заболеваний сердечно-сосудистой системы, имеют в виду, в первую очередь, различного рода тромбоэмболические осложнения (ТЭО). Поэтому предотвращение тромбоэмболических осложнений является основной целью терапии заболеваний сердечно-сосудистой системы. Уменьшение их частоты способно значительно снизить как общую смертность в результате заболеваний сердечно-сосудистой системы, так и инвалидизацию трудоспособного населения, а значит, привести к снижению нагрузки на здравоохранение [Ше§^'а, 2007].

Терапия, направленная на предотвращение тромбоэмболических осложнений, основывается на комплексном применении тромболигических и антикоагулянтных лекарственных средств (ЛС). Главную роль в профилактике ТЭО играют непрямые антикоагулянты, которые применяются в пероралыюй форме (ПНА). Считается, что длительный прием пероральных непрямых антикоагулянтов (варфарина, аценокумарола, синкумара, прокумона и др.) в индивидуально подобранной дозе способен практически полностью исключить риск развития тромбоэмболии. Эффективность данных ЛС доказана в ходе многочисленных мультицентровых клинических исследований [\Уа(1е1шз а а1., 2007]. Однако существует серьезная проблема применения пероральных непрямых антикоагулянтов, которая заключается в высокой частоте развития

нежелательных лекарственных реакций (HJIP), в основном, в виде феномена чрезмерной гинокоагуляции и вызываемых им внутренних кровотечений.

Терапевтический эффект любого JIC зависит от его фармакокинетики и фармакодинамики в организме. Фармакокинетика определяется, в основном, особенностями метаболизма (биотрансформации) данного ЛС, а фармакодинамика характеризуется состоянием мишени. Все эти процессы зависят от большого числа различных факторов [Daly et al., 2003].

К настоящему моменту среди клиницистов сложилось понимание того, что важным, а зачастую и главным фактором, определяющим лекарственный ответ организма на воздействие большинства JIC, являются генетические особенности конкретного пациента [Середенин С.Б., 2004]. В первую очередь речь идет о полиморфизме генов, кодирующих белки системы биотрансформации JIC и молекулы-мишени JIC [Кукес В.Г., 2007].

Большинство ПНА метаболизируются системой цитохрома Р450, конкретно ее изоформой 2С9 (CYP2C9). Для гена, кодирующего данный белок, известны полиморфные маркеры, ассоциированные с изменением эффективности работы данной структуры (эти полиморфизмы представлены аминокислотными заменами) [Kessler, 2006]. Вопрос генетического полиморфизма CYP2C9 достаточно хорошо изучен. Методики индивидуализации фармакотерапии ПНА на основе идентификации аллельных вариантов CYP2C9*2 и CYP2C9*3 хорошо отработаны на различных этнических группах, и в настоящее время во всем мире ведется активная работа по внедрению их в клиническую практику

Большинство специалистов сходятся во мнении, что вторым по значимости после CYP2C9 является ген, кодирующий первую субъединицу белкового комплекса витамин К эпоксидредуктазы (VKORC1). В ряде работ показано, что некоторые полиморфизмы в данном гене ассоциированы с изменением сродства кодируемой им молекулы к ПНА [Geisen et al., 2005; Loriot et al., 2006; Jiang et al., 2007].

Анализ имеющихся литературных данных навел нас на предположение о том, что болышшешо полиморфизмов гена VKORC1, о которых пишут исследователи в связи с изучением их роли в терапии пероральными непрямыми антикоагулянтами, могут бы гь сцеплены между собой. Поэтому из всего списка полиморфизмов мы выбрали один - G3673A и исследовали именно его.

Цели и задачи работы. Целью работы явилось фармакогенетическое исследование по изучению ассоциации полиморфного маркера G3673A гена VKORC1 с особенностями ответа на терапию варфарииом.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Провести идентификацию аллелей и генотипов полиморфного маркера G3673A гена VKORC1 и сопоставить их частоты в группе популяционцого контроля и в клинической группе больных, принимающих варфарин;

2. Проверить, выполняется ли закон Харди-Вайнберга в исследованных группах и входящих в них подгруппах;

3. Оценить взаимосвязь аллелей и генотипов с развитием геморрагии при приеме варфарина;

4. Оценить взаимосвязь аллелей и генотипов с выходом показателя международного нормализованного отношения (MHO) за пределы терапевтического диапазона.

Научная новизна. Впервые изучена частота аллелей и генотипов полиморфного маркера G3673A гена VKORC1 у русских и показано отсутствие ассоциации данного полиморфного маркера с мерцательной аритмией - наиболее частого показания к применению варфарина. Впервые в России изучена роль полиморфизма гена VKORC1, как фактора риска развития геморрагий и выхода показателя MHO за пределы

терапевтического диапазона у больных мерцательной аритмией при приеме

5

варфарина. Разработан простой и экономически доступный тест для идентификации аллелей полиморфного маркера С3673А гена УКОЯС! на основе метода полимеразной цепной реакции и полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПЦР-ПДРФ), рассчитаны прогностическая ценность и специфичность отрицательного и положительного результатов подобного тестирования. Полученные в работе частоты аллелей и генотипов полиморфного маркера С3673А гена УКОЯС! могут представлять интерес для теоретической популяционной генетики.

Практическая значимость работы. Результаты работы составили основу проводимого проспективного клинического исследования по оптимизации терапии варфарином на основе ее индивидуализации с учетом генетических особенностей пациентов (в совокупности с ранее полученными данными по ассоциации генетического полиморфизма СУР2С9 с особенностями ответа на варфарин у больных с мерцательной аритмией). Данное исследование имеет большое значение для практического здравоохранения России, поскольку позволит принципиально изменить подход к применению варфарина в сторону его расширения.

Апробация работы. Основные результаты доложены и обсуждены на заседании кафедры клинической фармакологии и пропедевтики внутренних болезней ММА им. И.М.Сеченова (25 марта 2008 г.), на международной научной конференции «Лекарственные средства и биологически активные соединения» (Гродно, 2007), на научно-практической конференции «Клинико-фармакологические подходы в оптимизации фармакотерапии» (Москва, 2006) и на XI Международном симпозиуме «Новые технологии восстановительной медицины и курортологии» (Салоники, 2006).

Публикации. По материалам работы опубликовано 7 печатных работ в журналах и сборниках материалов конференций, в том числе 3 статьи, из них - 1 статья в научном журнале, рекомендованном ВАК РФ.

6

Структура н объем диссертации. Диссертация построена по стандартной схеме, состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, результатов и их обсуждения, заключения, выводов "и списка литературы. Материал диссертации изложен на 102 страницах машинописного текста и содержит 25 таблиц и 6 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Описание клинической группы. В исследование были включены 78 больных (42 мужчины и 36 женщин) с мерцательной аритмией (МА). Средний возраст 63±11 года. На момент обследования все больные получали варфарнн (Nycomed, Норвегия) в подобранной дозе более одного месяца. Дозировка препарата была подобрана под контролем MHO. После подбора индивидуальной дозы контроль MHO проводили один раз в месяц вместе с осмотром врача. Стабильный терапевтический уровень гипокоагуляцнн считали достигнутым при показателе международного нормализованного отношения (MHO), находящемся в диапазоне от 2,0 до 3,0.

Описание контрольной группы. Контрольная группа включала в себя 59 практически здоровых людей без МА и каких-либо видимых патологий (35 мужчин и 24 женщины), набранных на добровольной основе Средний возраст 50±15 лет.

Определение показателя MHO. Определение MHO проводилось с помощью тромбопластнна фирмы «Технологический стандарт» (Россия) с международным индексом чувствительности 1,3.

Генотипирование. Генетическое тестирование проводили методом ПЦР-

ПДРФ. На первой стадии фрагменты гена, содержащие полиморфные участки,

амплифицировали на программируемом термостате «Терцик МС2», производства

7

НПФ «ДНК-Технология» (Россия). Затем продукты ПЦР подвергали обработке эндонуклеазой рестрикции II типа (рестриктазой) Mspl. Специфичные праймеры подобраны с помощью программы PrimerSelect 4.05©1993-2000 DNASTAR Inc. и синтезированы в ЗАО «Синтол» (Россия). Подбор проводился на матрице из банка данных NCBI, содержащей полную последовательность гена VKORCI (A Y587020).

Последовательность праймеров •

VC3673-F1 5'-CCAGAAGGGTAGGTGCAACAGTAA- 3'

VC3673-R2 5-TCACCAAGACGCTAGACCCAATG- 3'

Рестриктаза Mspl закуплена в ЗАО «СибЭнзим» (Россия). Промежуточные и окончательные результаты выявляли с помощью электрофореза в вертикальных акриламидных гелях (5% гель длиной 5 см для продуктов амплификации и 10% гель длиной 15 см для продуктов расщепления рестриктазами при напряженности электрического поля 10 В/см). Время, необходимое для разделения фрагментов ДНК подбирали экспериментально. Длины фрагментов анализировали путем сравнения с маркерной ДНК. После окончания электрофореза гели окрашивали раствором бромистого этидия (50 нг/мл) и анализировали в ультрафиолетовом свете (312 нм).

Статистическая обработка результатов. Статистический анализ проводился с использованием статистической программы Past, version 1.34 (http://folk.uio.no/ohanmier/past). Для определения статистической значимости различий частот аллелей и генотипов в группах больных применялся критерий ч2, для аллелей применялась поправка Йейтса на непрерывность (вводилась вручную). Относительные риски рассчитывались с помощью программы-калькулятора [Bland et al., 2000]. Значения чувствительности, специфичности, предсказательной ценности положительного (PPV) и отрицательного (NPV)

результатов теста рассчитывались по общепринятым формулам [Флетчер Р., 1998].

Проведение исследования одобрено этическим комитетом ГКБ № 23 им. «Медсантруд» г. Москвы и признано легитимным Комитетом по этике Ассоциации медицинских и фармацевтических вузов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Проверка соответствия частот аллелей и генотипов полиморфного маркера С3673А гена УКОЯС! соотношению Харди-Вайнберга).

В наше исследование были включены две выборки, в которых проводилось генетическое тестирование по идентификации аллелей и генотипов полиморфного маркера С367ЗА гена УК О КС I (таблица 1).

Таблица 1.

Частоты аллелей и генотипов полиморфного маркёра С3673А гена \ KORCl в изученных

группах

Аллель/ генотип Контрольная группа N = 59/181 Общая клиническая группа N = 78/156 Выборка из обшей клинической группы2 N = 54/108

3673в 0,5678 0,5962 0,5833

3673А 0,4322 0,4038 0,4167

3673вв 0,3051 0,3205 0,3148

3673СА 0,5254 0,5513 0,5370

3673АА 0,1695 0,1282 0,1482

Примечания:

1 при указании численности групп сначала указано число генотипов (пациентов) а затем, через дробь, число аллелей

2 Выборка из общей клинической группы включала в себя только пациентов с генотипом СУР2С9*1*1 по локусу СГР2С9

Прежде чем проводить расчеты по проверке статистической достоверности между группами по частотам аллелей и генотипов изучаемого полиморфного маркера, необходимо оценить, выполняется ли в каждой группе или подгруппе закон Харди-Вайнберга.

В контрольной выборке различия между наблюдаемым числом генотипов и ожидаемым, рассчитанным по числу соответствующих аллелей, на основе соотношения Харди-Вайнберга, оказались статистически недостоверными (р =0,864). Это позволяет сделать вывод о том, что размер контрольной выборки вполне соответствует задачам нашего исследования и позволяет проводить сравнительные расчеты с другими выборками.

В общей клинической выборке закон Харди-Вайнберга также выполняется (р = 0,441 ), поэтому она также подходит для дальнейших расчетов по различиям в частотах аллелей и генотипов.

При дальнейших расчетах, согласно задачам исследования, общая клиническая группа двумя различными способами подразделялась на две подгруппы. В первом случае больные делились на тех, у кого развивались геморрагии при приеме варфарина, и на тех, у кого геморрагии не развивались. Во втором случае шло разделение на больных, у которых наблюдался выход показателя MHO за пределы терапевтического диапазона (MHO > 3), и на тех, у кого такого выхода не наблюдалось (MHO £3).

Несмотря на вычленение из общей клинической группы небольших по численности подгрупп, различающихся по лекарственному ответу, соотношение Харди-Вайнберга во всех этих подгруппах также выполнялось, что позволяет проводить сравнение между данными подгруппами по частотам аллелей и генотипов изучаемого полиморфного маркера.

Согласно литературным данным, полиморфизм гена VKORC1 - это не единственный наследственный фактор, предрасполагающий к развитию

геморрагии при терапии варфарином [Daly et al., 2003; Gage et al, 2008]. Не менее важным является также полиморфизм гена CYP2C9 [Peyvandi et al., 2004; Lonot et al., 2007; Michaud et al, 2008]. Для оценки независимой роли полиморфною маркера G3673A гена VKORC1 необходимо было вычленить для анализа из общей клинической группы больных, которые имеют генотип CYP2C9*1*1 по гену CYP2C9 (т.е. не имеют функционально-дефектных аллелей данного гена) (см. таблица 1, последняя колонка).

Причем в данной подгруппе также необходимо провести разделение на больных с геморрагиями и без таковых и на больных с выходом MHO за пределы терапевтического диапазона и без такового.

Проведенная проверка показала, что, несмотря на малый размер выделенных подгрупп, соотношение Харди-Вайнберга в них выполняется, а значит, данные подгруппы пригодны для дальнейших расчетов достоверности различий в частотах аллелей и генотипов исследуемого полиморфного маркера.

Наконец, необходимо проверить, не имеется ли неравновесия но сцеплению между полиморфным маркером G3673A гена VKORC1 и полиморфными маркерами гена CYP2C9, потому что, в случае наличия такого неравновесия, возможные ассоциации для гена VKORC1 могут быть следствием сцепления, а не отдельного эффекта данного гена [Rieder et al., 2005]. Для проверки этого необходимо оценить достоверность различий частот аллелей и генотипов полиморфного маркера G3673A гена VKORC1 между общей клинической выборкой и подгруппой пациентов с генотипом CYP2C9*l/*I. Результаты проверки приведены в таблице 2.

Таблица 2.

Оценка достоверности различий частот аллелей и генотипов полиморфного маркёра СЗ673.4 гена УКОНС1 между общей клинической выборкой и подгруппой пациентов с

генотипом СУР2С9*1*1

Аллель/ генотип Общая клиническая группа N = 78/156 Пациенты с генотипом СГР2С9*1*1 N = 54/108 ч2 Р

3673в 0,5962 0,5833 0,007 0,935

3673А 0,4038 0,4167

3673вС 0,3205 0,3148 0,108 0,947

3673СА 0,5513 0,5370

3673АА 0,1282 0,1482

Различия между общей клинической выборкой и подгруппой пациентов с генотипом СУР2С9*1*1 в частотах аллелей и генотипов полиморфного маркера С3673А гена УКОЯС1 статистически не достоверны (р = 0,935 для аллелей; р= 0,947 для генотипов), поэтому можно констатировать отсутствие неравновесия ио сцеплению между вышеназванными полиморфными маркерами. А значит, все ассоциации, которые будут вытекать из дальнейших расчетов, относятся к гену УКОЯС1 и не являются следствием генетического сцепления.

2. Полиморфный маркер С3673Л гена УКОЯС! и МА.

Хотя нет никаких данных, указывающих на возможную взаимосвязь генетического полиморфизма УКСЖС! и мерцательной аршмии, мы обязаны проверить наличие таковой.

Во-первых, это необходимо сделать с точки зрения чистоты эксперимента,

так как, в случае существования такой ассоциации, паша клиническая выборка

12

оказывается нерелевантной - ведь тогда получится, что все возможные ассоциации для полиморфизма гена VKORC1 могут либо быть следствием влияния данного заболевания, либо наоборот, замаскированы данным заболеванием. Во-вторых, в случае, например, гена CYP2C9 в свое время была выявлена ассоциация с таким маркером сердечнососудистой патологии, как гипертрофия левого желудочка, при том, что такой эффект был неожиданностью, возможность его обнаружения не предполагалась, и до сих пор малопонятно, какова его физиологическая природа [Sychev et al., 2007].

Таблица 3.

Сравнительный анализ частот аллелей и генотипов полиморфного маркера G3673A гена VKORC1 между контрольной группой и группой больных с МА (общая клиническая

rp> una)

Алл ель/ генотип Контрольная группа N = 59/118 Общая клиническая группа N = 78/156 ч2 Р

3673G 0,5678 0,5962 0,121 0,728

3673А 0,4322 0,4038

3673GG 0,3051 0,3205 0,459 0,795

3673GA 0,5254 0,5513

3673АА 0,1695 0,1282

В любом случае, анализ возможной ассоциации полиморфного маркера 03673А гена УКСЖС! с развитием МА был нами выполнен, его результаты представлены в таблицах 3 и 4 (с учетом возможного эффекта гена СУР2С9, мы выполнили анализ, как для общей клинической выборки, так и для подгруппы пациентов с генотипом СУР2С9*1/*1).

Нам не удалось обнаружить статистически значимых различий в частотах аллелей и генотипов полиморфного маркера С3673А гена УКСЖС 1 ни между

контрольной группой и группой больных МА, ни между контрольной группой и подгруппой больных мерцательной аритмией с генотипом СУР2С9*1/*1.

Таблица 4.

Сравнительный анализ частот аллелей и генотипов полиморфного маркера а367ЗА гена УКОЯС! между контрольной группой и подгруппой больных с МА, имеющих генотип

СУР2С9*1/*1

Аллель/ генотип Контрольная группа N = 59/118 Группа больных с генотипом С¥Р2С9*1/*1 N = 54/108 ч2 Р

3673в 0,5678 0,5833 0,010 0,919

3673А 0,4322 0,4167

3673СС 0,3051 0,3148 0,096 0,953

3673СУА 0,5254 0,5370

3673АА 0,1695 0,1482

3. Полиморфный маркер С3673А гена УКОЛ С 1 и развитие геморрагий при терапии варфарииом у больных с МА.

Мы провели сравнение частот аллелей и генотипов полиморфного маркера 03673А гена УКОЯС1 между подгруппами больных с геморрагиями и без таковых, выделенных из общей клинической группы. Аналогичный анализ был проведен также для больных с генотипом СУР2С9*! *1 (см. таблица 5).

В общей клинической группе ассоциации полиморфного маркера С3673А гена УКОЯС1 с развитием геморрагий при терапии варфарииом у больных с МА не наблюдается, а если из их числа исключить всех больных, имеющих функционально-дефектные аллели гена СУР2С9, то есть вести расчет только среди больных с генотипом СУР2С9*1/*1, ассоциация появляется.

Таблица 5.

Сравнительный анализ частот аллелей и тютнпов полиморфною маркер С36 73Л гена УКОЯа у больных с геморрагиями и без таковых в подгруппе больных с генотипом

СУР2С9*1*1

Алл ель/ генотип Больные с геморрагиями N = 8/16 Больные без геморрагий N = 46 / 92 ч2 Р

3673в 0,3125 0,6304 4,436 0,035

3673А 0,6875 0,3696

3673вС 0,1250 0,3478 9,382 0,009

3673О А 0,3750 0,5652

3673/Ы 0,5000 0,0870

Из этого можно сделать вывод о том, что генетический полиморфизм СУР2С9 является более значимым наследственным фактором, приводящим к нарушению биотрансформации варфарина, поэтому в общей клинической выборке он маскирует эффект генетического полиморфизма УКОК.С1 Если же исключить СУР2С9 обособленное влияние, то эффект УКСЖС1 четко проявляется.

Таким образом, нами выявлена ассоциация полиморфного маркера С3673А гена УКОЯС1 с развитием геморрагий при терапии варфаршюм у русских больных с МА. Причем аллель 367ЗА и генотип 3673АА являются факторами риска, предрасполагающими к развитию геморрагий (отношение шансов СЖ, которое служит мерой относительного риска, составило 3,753 при доверительном интервале С195% от 1,202 до 11, 720 для аллеля 3673А и 10,500 при доверительном интервале С195о/о от 1,872 до 58,881 для генотипа 3673АА, соответственно).

Поскольку в настоящий момент широко дискутируется вопрос о том, полиморфизм какого гена более важен в клиническом плане [АяиПатИе й а1.,

15

2006; Kessler, 2006; Cho et al., 2007], полученные нами результаты имеют большую практическую и теоретическую ценность. Очевидно, что продукту гена CYP2C9 принадлежит ведущая роль в формировании лекарственного ответа на терапию ПНА (и, в частности, варфарином) И хотя полученные нами результаты также ставят полиморфизм гена VKORC1 на второе место после гена CYP2C9 в качестве причины развития геморрагии при терапии ПНА, мы считаем, что это в достаточной степени условно. В целях индивидуализации терапии варфарином, необходимо проведение генетического тестирования по обоим генам. Только такой комплексный подход может быть в должной мере результативен.

С другой стороны, хочется отметить тот факт, что имеются также пациенты, у которых в генотипе отсутствуют условно дефектные аллели как гена CYP2C9, так и гена VKORC1. В проведенном нами исследовании был только один такой больной, но, с учетом численности нашей выборки, можно предположить, что доля таких больных в общей популяции составит не менее 12%. Поскольку геморрагии, возникающие при терапии ПНА, представляют серьезную опасность для больного, такой процент является вполне достаточным, чтобы привлечь внимание.

Мы полагаем, что генетическое тестирование, основанное на идентификации аллелей и генотипов локусов CYP2C9 и VKORC1, проводимое перед назначением варфарина, уже способно в значительной степени снизить риск развития геморрагий. Поэтому его необходимо как можно быстрее внедрять в клиническую практику. Ведь варфарин и подобные ему JIC - это реальный шанс повысить продолжительность и качество жизни работоспособного населения, снизить смертность от различного рода тромбоэмболий. Высокий процент HJIP, возникающих сегодня при терапии варфарином (до 20%) - это серьезный барьер на пути широкого внедрения данного J1C.

Мы рассчитали диагностическую ценность генетического тестирования по идентификации генотипа 3673АА гена VKORC1. Прогностическая

чувствительность положительного теста составила 50%, чувствительность - 50%, прогностическая ценность отрицательного теста - 91% и специфичность - 91%, таким образом, диагностическая эффективность данного теста составила примерно 70%.

С одной стороны, полученные цифры выглядят довольно скромно (хотя, что касается специфичности и прогностической ценности отрицательного теста, это не так). Однако генетическое тестирование на выявление генотипа 3673АА гена VKORCI - это, в своем роде, тест «второго плана». Первую роль мы отводим генетическому тестированию по локусу CYP2C9. При таком подходе мы считаем полученные показатели вполне достаточными для внедрения данного теста в клиническую практику.

Что же касается частот аллелей н генотипов полиморфного маркера G3673A гена VKORC1 среди русских, то, согласно нашим данным, их значения находятся в соответствии с частотами для других европеоидных этносов [Сычев с соавт., 2007; Scordo et al., 2001].

4. Полиморфный маркер G3673A гена VKORC1 и выход показателя MHO за пределы терапевтического диапазона

MHO — один из основных клинических показателей эффективности терапии непрямыми антикоагулянтами [Сычёв, 2004; Loriot et al., 2006; Benusiglio et al., 2007]. Исходя из вышеописанного, можно сделать предположение о том, что данный показатель будет также зависеть от того, какие аллельные варианты генов CYP2C9 и VKORC1 присутствуют у каждого конкретного больного, подвергаемого терапии ПНА.

Мы провели сравнение частот аллелей и генотипов полиморфного маркера G3673A гена VKORC1 между подгруппами больных, у которых наблюдался выход за терапевтические значения MHO и тех, у которых этот показатель был в

17

пределах нормы, выделенных из общей клинической группы. Аналогичный анализ был проведен также для больных с генотипом CYP2C9*I*l (см. таблицу 6).

Таблица 6.

Сравнительный анализ частот аллелей и генотипов полиморфно! о маркер G3673A гена VKORC1 у больных с выходом за терапевтические значения МНО (>3) и без такового (<3) в подгруппе больных с генотипом CYP2C9*1*1

Аллель/ генотип МНО>3 N = 24 / 48 МНО<3 N=30/60 чг Р

3673G 0,4792 0,6667 3,124 0,077

3673А 0,5208 0,3333

3673GG 0,2500 0,3667 7,081 0,029

3673GA 0,4583 0,6000

3673АА 0,2917 0,0333

В общей клинической группе ассоциации полиморфного маркера G3673A гена VKORC1 с выходом МНО за пределы терапевтического диапазона при терапии варфарином у больных с мерцательной аритмией не наблюдается, а если из их числа исключить всех больных, имеющих функционально-дефектные аллели гена CYP2C9, то можно наблюдать тенденцию к ассоциации (р=0,077) аллеля 3673А с выходом показателя МНО за пределы терапевтического диапазона. Причем для генотипа 3673АА уже имеется не тенденция, а четкая ассоциация (р=0,029).

Таким образом, аллель 3673А и генотип 367ЗАА являются факторами риска, предрасполагающими к выходу показателя МНО за пределы терапевтического диапазона (поскольку для аллеля у нас не имелось четкой ассоциации, мы рассчитали OR только для генотипа 367ЗАА, оно составило 11,941 при доверительном интервале Cl9S% от 1,351 до 105,549). Поскольку размеры нашей

клинической выборки невелики, влияние генетического полиморфизма CYP2C9, также как и в случае с геморрагиями маскирует эффект генетического полиморфизма VKORC1. Мы полагаем, чхо на выборке большего размера эффект влияния генетического полиморфизма VKORC1 на развитие выхода показателя MHO за пределы терапевтического диапазона проявится, независимо от влияния генетического полиморфизма CYP2C9.

Мы рассчитали диагностическую ценность генетического тестирования по идентификации генотипа 367ЗЛА гена VKORC1 для прогнозирования риска выхода показателя MHO за пределы терапевтического диапазона. Прогностическая чувствительность положительного теста составила 88%, чувствительность - 26%, прогностическая ценность отрицательного теста — 63% и специфичность - 97%, таким образом, диагностическая эффективность данного теста составила примерно 62%.

ВЫВОДЫ

1. Частоты аллелей и генотипов полиморфного маркера G3673A гена VKORC1 у русских незначительно отличаются от таковых среди прочих европеоидов.

2. Полиморфный маркер G3673A гена VKORC1 не ассоциирован с развитием мерцательной аритмии у русских.

3. Полиморфный маркер G3673A гена VKORC1 не сцеплен с полиморфными маркерами гена CYP2C9 у русских.

4. Полиморфный маркер G3673A гена VKORC1 ассоциирован с развитием геморрагий при терапии варфарином у русских с мерцательной аритмией, имеющих генотип CYP2C9*]/*!, причем аллель 367ЗА и генотип 3673АА являются факторами риска развития геморрагий.

5. Полиморфный маркер G3673A гена VKORC1 ассоциирован с выходом показателя международного нормализованного отношения (MHO) за пределы терапевтического диапазона при терапии варфарином у русских с мерцательной аритмией, имеющих генотип CYP2C9*]/*], причем генотип 3673АА является фактором риска выхода показателя MHO за пределы терапевтического диапазона.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Загорская, В Л. Генетические аспекты применения антикоагулянта варфарина у больных с сердечнососудистой патологией [Текст] / B.JI. Загорская, В.Г. Кукес, ДВ. Байдак // Материалы XI Международного симпозиума «Новые технологии восстановительной медицины и курортологии» - 2006.- С. 40-41.

2. Байдак, Д.В. Случай кумаринорезистентности у больного с постоянной формой мерцательной аритмии [Текст] / Д.В.Байдак, ВЛ.Загорская, И.В Игнатьев, Р.Е.Казаков, И.А.Мазеркина, Д.А.Сычев // Материалы научно-практической конференции "Клинико-фармакологические подходы в оптимизации фармакотерапии" - 2006. - С. 21 - 22.

3. Сычев, Д.А. Генетическая основа кумаринорезистентности: новый взгляд на старый фармакогенетический феномен [Текст] / Д.А.Сычев, И В.Игнатьев, В.Г.Кукес, И.Э.Коман, Д.В.Байдак, ВЛЗагорская // Медицинская генетика. - 2006. - № 5. - С. 9 - 11.

4. Байдак, Д.В. Фармакогенетическое тестирование как реальная возможность повышения безопасности при применении непрямых антикоагулянтов [Текст] / Д.В.Байдак, Д.А Сычев, ВЛ.Загорская, И.В.Игнатьев, Р.Е.Казаков, В.Н.Каркищенко, В.Г.Кукес // Биомедицина. - 2006. - № 3. - С. 117 - 118.

5 Сычев, Д А. Генетическая основа кумаринорезистентности: новое понимание старой проблемы [Текст] / Д.А.Сычев, Д.В.Байдак,

20

ВЛ.Загорская, И.В.Игнагьев, Р.Е.Казаков, В.Г Куксс // Ведомости Научного центра экспертизы средств медицинского применения. - 2006. -№2.-С 50 -52.

6. Загорская, В.Л. Генотип 3637АА полиморфного маркера в3673А гена УКСЖС1 ассоциирован с развитием кровотечений при применении варфарина у больных с генотипом СУР2С9*1/*1 [Текст] / ВЛ.Заюрская, И.В Игнатьев, Е.С.Кропачева, Р.Е Казаков, Д.А.Сычев, Ю.А.Михеева, Е.П.Панченко, В.Г.Кукес // Лекарственные средства и биологически активные соединения. Материалы международной научной конференции. -Гродно. - 2007. - С. 54 - 55.

7. Сычев, Д А. Значение фармакогенетических исследований системы биотрансформации и транспортеров для оптимизации фармакотерапии сердечно-сосудистыми лекарственными средствами [Текст] / Д.А.Сычев, Г.В.Раменская, И.В.Игнатьев, Е С.Кроначева, Е П.Панченко, Н.А.Гасанов, А.Н.Леванов, А В.Антонов, ВЛ.Загорская / Материалы 3-го съезда фармакологов России. «Фармакология практическому здравоохранению». Санкт-Петербург, 23-27 сентября 2007 г // Психофармакология и биологическая наркология. - 2007. - Т. 7 (спец. выпуск), ч. 2. - С. 1972.

8. Загорская В.Л., Кукес В.Г., Байдак Д.В. Генетические аспекты применения антикоагуляита варфарина у больных с сердечнососудистой патологией. // Материалы XI Международного симпозиума «Новые технологии восстановительной медицины и курортологии» -2006,- с. 40-41.

ПНА

ЛС

НЛР

ПЦР

ПДРФ

п.н.

ДНК

тэо

зссс

мно

МА

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

пероральные непрямые антикоагулянты

лекарственное средство

нежелательные лекарственные реакции

полимеразная цепная реакция

полиморфизм длин рестрикционных фрагментов

пара нуклеотидов - мера длины фрагмента двунитевой ДНК

дезоксирибонуклеиновая кислота

тромбоэмболические осложнения

заболевания сердечнососудистой системы

международное нормализованное отношение, показатель,

характеризующий свертываемость крови, чем он выше, тем

свертываемость ниже

мерцательная аритмия

Подписано в печать 10 09 2008 Формат 60x90/16 Бумага мелованная Печ л 1 Тираж 100 экз. Отпечатанов в типографии "Графос" г Москва, проспект Маршала Жукова, 1

Актуальность проблемы

В настоящее время в развитых странах основной причиной смертности являются заболевания сердечно-сосудистой системы (ЗССС), значительно опережая в этом все другие причины. Причем, по мере того, как постепенно снижается возраст людей, страдающих данными патологиями, эта проблема все больше и больше затрагивает трудоспособное население. Таким образом, происходит беспрецедентный рост социально-экономической значимости ЗССС во всем мире [17, 64].

Когда говорят о смертности в результате ЗССС, имеют в виду, в первую очередь, различного рода тромбоэмболические осложнения (ТЭО). Поэтому предотвращение ТЭО является главной задачей в терапии ЗССС. Уменьшение частоты ТЭО способно значительно снизить как общую смертность от ЗССС, так и инвалидизацию трудоспособного населения, а значит, привести к экономии колоссальных финансовых средств и снижению нагрузки на системы здравоохранения государств [69].

Терапия, направленная на предотвращение ТЭО, основывается на комплексном применении тромболитических и антикоагулянтных лекарственных средств (JIC). В случае, когда процесс тромбоэмболии уже запущен, необходимо проведение экстренной терапии тромболитиками и прямыми антикоагулянтами. Если же говорить о непосредственной профилактике ТЭО, то главную роль необходимо отвести непрямым антикоагулянтам.

Непрямые антикоагулянты применяются, в основном, в пероральной форме (ПНА). К настоящему моменту принято считать, что длительный прием ПНА в индивидуально подобранной дозе способен практически полностью исключить риск развития ТЭО. Таким образом, значительно увеличивается продолжительность и повышается качество жизни больных с ЗССС [45].

Эффективность ПНА доказана в ходе многочисленных мультицентровых клинических исследований, и не подлежит сомнению [105]. Однако существует серьезная проблема оптимизации терапии ПНА. Заключается она в высокой частоте развития нежелательных лекарственных реакций (HJIP) при приеме ПНА (в основном, в виде феномена чрезмерной гипокоагуляции и вызываемых им внутренних кровотечений).

Терапевтический эффект любого Л С зависит от его фармакокинетики и фармакодинамики в организме. Фармакокинетика определяется, в основном, особенностями метаболизма (биотрансформации) данного JIC, а фармакодинамика характеризуется состоянием мишени. Все эти процессы зависят от большого числа различных факторов, каждый из которых, в той или иной степени, влияет на их протекание [29].

К настоящему моменту среди клиницистов сложилось понимание того, что важным, а зачастую и главным фактором, определяющим лекарственный ответ организма на воздействие абсолютного большинства JIC, являются генетические особенности конкретного пациента. В первую очередь речь идет о полиморфизме генов, кодирующих белки, осуществляющие биотрансформацию JIC, молекулы-мишени JIC, а также осуществляющих регуляцию этих структур.

Большинство ПНА метаболизируются через систему цитохрома Р 450, изоформа 2С9 (CYP2C9). Для гена, кодирующего данный белок, известны полиморфные маркеры, ассоциированные с изменением эффективности работы данной структуры (эти полиморфизмы представлены аминокислотными заменами) [45, 69]. Вопрос генетического полиморфизма CYP2C9 достаточно хорошо изучен. Методики индивидуализации фармакотерапии ПНА на основе идентификации аллелей CYP2C9*2 и CYP2C9*3 хорошо отработаны на различных этнических группах, и в настоящее время во всем мире ведется активная работа по внедрению их в клиническую практику. При этом исследователи, изучающие данные вопросы, отмечают в своих работах наличие большого числа людей, у которых развитие HJIP при приеме ПНА происходит на фоне нормальной работы системы биотрансформации данных J1C. Соответственно, высказываются гипотезы о том, что ген CYP2C9. далеко не единственный наследственный фактор, ассоциированный с изменениями характера лекарственного ответа человеческого организма на терапию ПНА. Ведется активный поиск других генов-кандидатов, прямо или косвенно вовлеченных в этот процесс [28, 29].

Большинство специалистов сходятся во мнении, что вторым по значимости после CYP2C9 геном-кандидатом, является ген, кодирующий первую субъединицу белкового комплекса витамин К эпоксидредуктазы (VKORC1). В ряде работ показано, что некоторые полиморфизмы в данном гене ассоциированы с изменением сродства кодируемой им молекулы к ПНА [34,41,61,74].

Анализ имеющихся литературных данных навел нас на предположение о том, что большинство полиморфизмов гена VKORC1, о которых пишут исследователи в связи с изучением их роли в терапии ПНА, могут быть сцеплены между собой. Поэтому из всего списка полиморфизмов мы выбрали один - G3673A и исследовали именно его.

Цели и задачи работы

Целью данной работы явилось изучение ассоциации полиморфного маркера G3673A гена VKORC1 с величиной индивидуальной подобранной дозы варфарина - типичного представителя ПНА.

Для достижения обозначенных целей были поставлены следующие задачи:

1. Провести идентификацию аллелей и генотипов полиморфного маркера G3673A гена VKORC1 в группе популяционного контроля и в клинической группе;

2. Провести проверку выполнимости закона Харди-Вайнберга для исследованных групп и входящих в них подгрупп;

3. Проверить достоверность различий в частотах аллелей и генотипов полиморфного маркера G3673A гена VKORC1 между клинической и контрольной группами;

4. Оценить взаимосвязь аллелей и генотипов с развитием геморрагий при приеме варфарина;

5. Оценить взаимосвязь аллелей и генотипов с выходом показателя MHO за пределы терапевтического диапазона.

Научная новизна и практическая значимость работы

В нашей работе впервые изучена частота аллелей и генотипов полиморфного маркера G3673A гена VKORC1 среди русских и показано отсутствие ассоциации данного полиморфного маркера с мерцательной аритмией у русских. Впервые в России изучена роль полиморфизма гена

VK0RC1, как фактора риска развития геморрагии и выхода показателя MHO за пределы терапевтического диапазона у больных мерцательной аритмией при приеме варфарина. Разработан простой и недорогой тест для идентификации аллелей и генотипов полиморфного маркера G3673A гена VKORC1 на основе метода ПЦР-ПДРФ, рассчитаны прогностическая ценность и специфичность отрицательного и положительного результатов подобного тестирования. Результаты данной работы, в совокупности с ранее полученными в нашей лаборатории данными по ассоциации генетического полиморфизма CYP2C9 с развитием геморрагий и выходом показателя MHO за пределы терапевтического диапазона у больных с мерцательной аритмией при приеме варфарина, легли в основу проводимого в настоящий момент проспективного клинического исследования по оптимизации терапии варфарином на основе ее индивидуализации с учетом генетических особенностей пациентов. В случае успешного завершения, данное исследование будет иметь огромное значение для практического здравоохранения России, поскольку будет принципиально изменен подход к применению ПНА - в сторону его расширения. Полученные в нашей работе частоты аллелей и генотипов полиморфного маркера G3673A гена VKORC1 могут представлять интерес для теоретической популяционной генетики.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

выводы

1. Частоты аллелей и генотипов полиморфного маркера G3673A гена VKORC1 у русских незначительно отличаются от таковых среди прочих европеоидов.

2. Полиморфный маркер G3673A гена VKORC1 не ассоциирован с развитием мерцательной аритмии у русских.

3. Полиморфный маркер G3673A гена VKORC1 не сцеплен с полиморфными маркерами гена CYP2C9 у русских.

4. Полиморфный маркер G3673A гена VKORC1 ассоциирован с развитием геморрагий при терапии варфарином у русских с мерцательной аритмией, имеющих генотип CYP2C9*!/* 1, причем аллель 367ЗА и генотип 3673АА являются факторами риска развития геморрагий.

5. Полиморфный маркер G3673A гена VKORC1 ассоциирован с выходом показателя международного нормализованного отношения (MHO) за пределы терапевтического диапазона при терапии варфарином у русских с мерцательной аритмией, имеющих генотип CYP2C9*1/*1, причем генотип 3673АА является фактором риска выхода показателя MHO за пределы терапевтического диапазона.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Данная работа представляет заключительный этап ретроспективного исследования по изучению связи генетических особенностей пациентов с риском тромбоэмболии с развитием геморрагии при применении у данных пациентов непрямого антикоагулянта варфарина. Эта работа является достаточно важной, так как результаты данного исследования дают толчок к непосредственному развитию персонализированной медицины. В настоящий момент дан старт проспективному исследованию по изучению эффективности применения генетического типирования для снижения числа HJ1P при применении варфарина в составе терапии у пациентов с риском тромбоэмболии.

В отличие от других препаратов, мнения различных авторов по поводу варфарина, в целом, сходятся. То есть все признают ведущую роль полиморфизма генов CYP2C9 и VKORC1 в развитии геморрагий при терапии варфарином. Имеются, правда, данные о других генах-кандидатах, но они пока отрывочные и не подтвержденные репликативными исследованиями.

При этом важность одного из этих двух генов носит четкий этноспецифичский характер. Для одних этносов первостепенен полиморфизм гена CYP2C9, для других - VKORC1.

Поскольку мы стремимся сделать варфарин доступным для более широкого применения в нашей стране, вопрос эффективности и безопасности данного JIC стоит в центре нашего внимания. Ранее наш коллектив уже докладывал об ассоциации полиморфизма гена CYP2C9 с развитием геморрагий при терапии варфарином. Вместе с тем, было выявлено значительное количество больных, у которых при наличии генотипа *1/*1 по гену CYP2C9 развивались геморрагии. Поэтому и было принято решение изучить роль другого генетического фактора - полиморфизма гена VKORC1.

С одной стороны, результаты нашей работы совпадают с данными других авторов, показавших роль полиморфизма гена VKORC1 в развитии HJIP при приеме варфарина. С другой, большинство ставят данный ген на первое место, считая эффект гена CYP2C9 второстепенным. Мы же, наоборот, отводим первое место гену CYP2C9, считая полиморфизм гена VKORC1 вторичным. Вероятно, наблюдаемые различия объясняются этническими особенностями. В нашей работе впервые в России изучается клиническое значение гена VKORC1. Требуются репликативные исследования, на большем числе пациентов, для окончательно выяснения роли генетических факторов в развитии геморрагий при применении варфарина у русских.

Так или иначе, оба вышеозначенных гена должны рассматриваться клиницистами как факторы, определяющие начальную дозу варфарина при подборе индивидуальной дозы. Кроме того, наличие функционально дефектных аллелей этих генов в генотипе пациента должно служить сигналом того, что такой пациент требует к себе повышенного внимания со стороны врача.

На основании полученных нами результатов мы рекомендуем проведение генотипирования по генам CYP2C9 и VKORC1 перед назначением варфарина. Это, на наш взгляд, позволит значительно ускорить подбор индивидуальной дозы и снизит риск развития геморрагий. Тогда данное JIC станет доступным для более широкого круга пациентов, в том числе в амбулаторных условиях (до сих пор титрование индивидуальной дозы проводится только в условиях стационара).