Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Фармако-токсикологические свойства новых комплексов и композиций эссенциальных микроэлементов меди, кобальта, марганца, ванадия и лития с аминокислотами и олигопептидами

На правах рукописи Для служебного пользования Экз. № О.Хг

РГБ ОД

1 8 ОЕВ 2СЛ?

ЗАЛЯШОТДИНОВА ЛУИЗА НАИЛЬЕВНА

ФАРМАКО -ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА НОВЫХ КОМПЛЕКСОВ И КОМПОЗИЦИЙ ЭССЕНЦИАЛЬНЫХ МИКРОЭЛЕМЕНТОВ МЕДИ, КОБАЛЬТА, МАРГАНЦА, ВАНАДИЯ И ЛИТИЯ С АМИНОКИСЛОТАМИ И ОЛИГОПЕПТИДАМИ

14.00.25- фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискаиие ученой степени доктора медицинских наук

г,Ц!

Казань-2001

Работа выполнена в Казанском государственном медицинском университете

Научные консультанты: доктор медицинских наук,

профессор Р.Х.Хафизьянова доктор медицинских наук, профессор Р.Ф.Байкеев

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

почетный профессор И.Е.Зимакова доктор медицинских наук, профессор К.М.Резников доктор медицинских наук, профессор А.Г. Муляр

Ведущая организация: Российский государственный медицинский университет

Защита состоится " 8 " февраля 2002 г в 9:30 час. на заседании диссертационного Совета Д.208.034.01 Казанско государственного медицинского университета по адресу: 420012, г.Каза! ул.Бутлерова, д.49

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанско государственного медицинского университета (420012, г.Казань, ул.Бутлерова, дУ корп. Б)

Автореферат разослан " ¿f " января 2002 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета доктор медицинских наук, профессор

С

А.П. Киясо

РМс /3>. О

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы. Эссенциальные микроэлементы наряду с заменимыми аминокислотами, кофакторами, жирными кислотами, играют жную роль в регуляции нормальных метаболических процессов. Ионы (кроэлементов соединяются с ДНК, образуют активные металлоферменты и другие таллосодержащие протеиды, играют существенную роль на стадиях репликации, анскрипции и трансляции генов, влияют на рост и жизнедеятельность организма Эйнгорн,1978; А.П.Авцын и др., 1991; F.H.Nielsen, 1996; S.Chan et al., 1998).

Дисбаланс микроэлементов вносит вклад в патогенез различных заболеваний, менение содержания и соотношения микроэлементов имеет значение при емиях, опухолевом процессе, туберкулезе, коллагенозах, нейродегенеративных оцессах, атеросклерозе и многих других заболеваниях (Л.П.Волкотруб, В.Яковлева,1988; А.П.Авцын, 1991; О.А.Громова, 2001; P.K.Eegon,1999; )ominova, 1999; J.T.Saari,1999; D.S. McMillan et al.,2000). Но если витамины, цельные незаменимые аминокислоты, их производные и смеси, жирные кислоты троко используются в фармакотерапии различных заболеваний, то арсенал карственных средств, содержащих эссенциальные микроэлементы, за ключением препаратов железа, незначителен и, в основном, представлен органическими соединениями.

Из микроэлементов внимание исследователей привлекают литий и переходные таллы 4 периода таблицы Д.И.Менделеева, в частности, медь, кобальт, марганец, оадий как обладающие уникальным спектром биологической активности и тсобностыо образовывать координационные соединения (К.Б.Яцимирский, 1979; Ювсенян с соавт.,2000; P.C.Joshi,1998; S.Oikawa,1999; M.Kato et a.,2000).

Большая часть биометаллов существует в организме в виде биокомплексов с зличными лигандами, причем аминокислоты прочнее связываются с кроэлементами, чем простые пептиды, и активно транспортируются в клетку .Б.Яцимирский, 1979; М.Хьюз, 1983; C.W.Schwietert, J.P.McCue, 1999; L.Huffman, T.V. O'Halloran, 2001).

Поэтому синтез новых комплексов и создание композиций меди, кобальта, рганца, ванадия и лития с аминокислотами и олигопептидами и изучение их элогических свойств является актуальным.

Диссертация выполнена по плану НИР КГМУ (№ госрегистрации 01.20.00. 578).

Цель исследования. Экспериментальное обоснование и разработка нового юса противоопухолевых и антианемических средств на основе оригинальных к1плексов и композиций меди, кобальта, марганца, ванадия и лития с L-ипокислотами и олигопептидами.

Задачи работы:

1. Осуществить поиск новых комплексов и композиций микроэлементов с инокислотамн, проявляющих противоопухолевую активность, установить

зависимость между природой комплексообразователя, лигандного окружения ат< металла, токсичностью и выраженностью цитотоксического эффекта на опухоле! клетки.

2. Провести сравнительную оценку противоопухолевой активности перевивных опухолях in vivo и гемотоксического эффекта комплексов и композш в сопоставлении с циклофосфаном, метотрексатом, фторафуром, глицифоном.

3. Изучить химиотерапевтическую эффективность наиболее активн соединений и композиций на перевивных опухолях in vivo (опухоль Эрлиха, сари 37, лим^осаркома Плисса) в сравнении с известными противоопухолевы средствами.

4. Провести оценку антипролиферативной активности новых комплексо композиций микроэлементов с аминокислотами в сопоставлении с платидиаы на клеточных линиях опухолей человека SKOV-3 и MCF-7 и изучить некотор аспекты механизма их антибластического действия.

5. Изучить чувствительность биопсийного и операционного материа полученного от больных раком яичников III-IV стадий, к лития метиояинат; композиции №3 в сравнении с представителями различных класс противоопухолевых средств.

6. Оценить влияние лития метионината и композиции №3 на синдр постлучевой миелосупрессии.

7. Исследовать влияние новых комплексов и композиций на течо гемолитической, дизэритропоэтической анемий, выявить наиболее эффектив! соединение с антианемической активностью и изучить некоторые сторо механизма его действия.

8.Изучить влияние длительного воздействия наиболее активных комплекс (лития метионината и оксигенированного гистидината кобальта) и композит меди, кобальта, марганца с аминокислотами на организм здоровых животных

Научная новизна. Экспериментально обоснована перспективность пош противоопухолевых и антианемических средств среди новых оригиналы! комплексов и композиций меди, кобальта, марганца, ванадия и литш аминокислотами.

Впервые оценены фармако-токсикологические свойства новых комплексо композиций микроэлементов с L-аминокислотами. Установлены противоопухоле! и антианемическая активности, токсичность и зависимость этих эффектов, как микроэлементного состава, так и природы аминокислотных и пептидных ляган/ в комплексах и композициях. Выявлены наиболее эффективные соединенш композиции.

Показано, что аминокислотный комплекс лития (препарат №8) и композии микроэлементов с аминокислотами проявляют антибластомную активность перевивных опухолях животных, клеточных линиях опухолей человека. Препа} №8 по эффективности не уступает широко используемым противоопухолев! средствам, значительно менее токсичен и может быть применен в сочетанш

'чевой терапией. Результаты наших исследований свидетельствуют, что >мпозиция меди, кобальта, марганца с природными аминокислотами (композиция :3), наряду с антибластомным и антианемическим действием, проявляет ресспротективную и радиосенсибилизирующую активности. В реализации гханизма антибластомного действия препарата №8 важное значение имеет гасобность соединения подавлять окислительно-восстановительные процессы в сухолевых клетках, композиции №3 - угнетать синтез нуклеиновых кислот. Оба >епарата снижают уровень цАМФ в опухоли.

Выявлено наиболее эффективное соединение с антианемической и диопротекторпой активностью - аминокислотный комплекс кобальта (препарат 27), который по фармакотерапевтической активности на моделях гемолитической дизэритропоэтических анемий сопоставим с цианокобаламином, но не имулирует опухолевый рост.

Результаты исследований расширяют теоретические представления о юлогической активности соединений меди, кобальта, марганца, ванадия и лития.

Научно-практическая ценность работы. Результаты работы обосновывают • зможность создания на основе литий-, медь- и ванадийсодержащих шнокислотных комплексов и композиций природных аминокислот с медью, фганцем, кобальтом и литием препаратов, обладающих противоопухолевой тивностью.

Выявление зависимости структуры комплексов, состава композиций и юлогической активности позволяет осуществлять направленный синтез и крывает новый класс противоопухолевых препаратов.

Рекомендуется дальнейшее углубленное доклиническое изучение лития ггионината как потенциального противоопухолевого средства; оксигенированного стидината кобальта — антианемического, радиопротекторного; композиции №3 -к средства адъювантной терапии онкологических больных. Результаты хледований указывают на целесообразность дальнейшего изучения ютивоопухолевых свойств композиции №4, меди бисметилметионината, сованадата, комплекса ванадия с гидразидом изоникотиновой и аспарагиновой слот.

По материалам диссертации получено одно авторское свидетельство с грифом для служебного пользования, 5 патентов и приоритет по заявке на изобретение.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Аминокислотные комплексы лития, меди, ванадия и композиции меди, бальта, марганца проявляют противоопухолевую активность. Наибольший тибластомный эффект достигается комплексированием лития с гистидином, ¡тионином, меди с метилметионином, ванадия с гидразидом изоникотиновой слоты и аспарагиновой кислотой.

2. Лития метионинат и композиция №3 оказывают цитотоксическое действие опухолевых клетки в экспериментах in vitro с использованием суспензионных еточных тест-систем, проявляют противоопухолевые свойства на клеточных

линиях опухолей человека in vitro, перевивных опухолях in vivo, на биопсийно.> постоперационном материале от больных раком яичников III-IV стадии. Ош сравнении с известными антибластомными средствами значительно менее токспч и не уступают им по эффективности как в экспериментах in vitro, так и in vivo.

В механизме реализации противоопухолевого действия аминокислоты« комплекса лития и композиции №3 лежит их способность угнетать окислителы восстановительные процессы в опухолевых клетках, подавлять ДНК и РН синтезирующую активности клеток, снижать уровень ц-АМФ в опухоли.

3. Оксигенированный гистидинат кобальта (препарат №27) проявл; выраженную противоанемическую активность на моделях гемолитическсн дизэритропоэтических анемий, сопоставимую с таковой цианокобалами; отличается более быстрым наступлением эффекта, не вызывает полицитем] Препарат оказывает защитное действие при свинцовой интоксикации животны радиопротекторное действие при лучевом воздействии; в отличие цианокобаламина, не стимулирует опухолевый рост. В механизме реал man противоанемического действия соединения имеют значение t мембранопротекторные, антиоксидантные свойства и стимулирующее влияние костно-мозговое кроветворение.

4. Препараты №8 и №27 малотоксичны, композиция №3 относитель безвредна при однократном внутрибрюшинном введении, их курсовое введение вызывает выраженных патологических изменений в организме здоровых живогш

5. Аминокислотные комплексы лития, кобальта и композиции меди, кобал ь марганца, лития и аминокислот с низкой токсичностью являются перспектив»! классом для поиска эффективных противоопухолевых и антианемическ лекарственных средств.

Апробация работы. Основные положения диссертационной рабо доложены и обсуждены на Всероссийской конференции "Научная работа-как ост творческого роста преподавателя" (Волгоград, 1993), Российской научн конференции "Антигипоксанты и актопротекторы: итоги и перспективы " (> Петербург, 1994), Всероссийской конференции "Актуальные вопро экспериментальной и клинической фармакологии", (Смоленск, 1994), II, III, IV Российском национальном Конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 1995 - 199 1 -м Съезде Российского научного общества фармакологов (Волгоград, 1995); IV Vth и Vlth International Symposium on Oncology Pharmacy Practice (Hamburg, 19' Sidney, 1997, Washngton, 1998); Third spring meeting "New insights Hematology"(Venice,l996); Российской научной конференции, посвященной летию со дня рождения проф. И.В.Заиконниковой (Казань, 1996), Internatío Symposium "Antidepressants therapy at the dawn of the of the 3 rd Millenium"(Castr France, 1997); III International Congress of Pathophysiology (Lahti, 1998),на XII International Congress of Pharmacology (München,1998); Всероссийск конференции с международным участием "Актуальные пробле; экспериментальной и клинической фармакологии"(С.-Петербург, 199

[еждународдюй конференции "Фармация в XXI пеке: инновации и традиции"(С,-етербург, 2000); заседаниях предметно-проблемной и центральной проблемной эмиссий КГМУ (2000, 2001); International Workshop "Modern Development of Tagnetic Resonance Imaging and Spectroscopy. Basic Physics and Applications in ledicine and Biology" (Kazan,2001).

Публикации. Опубликовано 45 работ, в том числе 1 авторское свидетельство грифом "Т", 6 патентов и приоритет по заявке на изобретение.

Структура и объем работы. Диссертация объемом 367 страниц состоит $ введения, обзора литературы, главы - материалы и методы, 5 глав результатов эбственных исследований, выводов, практических рекомендаций, приложения, казателя литературы, включающего 546 источников, из них 281 иностранных 1торов. Диссертация содержит 45 рисунков и 92 таблицы.

Материалы и методы исследования.

Эксперименты выполнены на 2160 нелинейных и 357 линейных мышах Balb, CS7Bl/6, DBA/2), 1064 белых крысах, на клеточных тест-системах, перевивных неточных линиях опухолей человека SKOV-3 и MCF-7, биопсийном и перационном материале от больных раком яичников 1I1-1V стадий.

Объектом исследования явились 37 новых комплексов и композиций, одержаших литий, ванадий, марганец, кобальт, медь и аминокислоты, лигопептиды, синтезированные в научно-исследовательской лаборатории эординационных соединений КРУ д.х.н., проф.А.В.Захаровым, к.х.н., в.н.с. .Г.Штырлиным, к.х.п., доцентом З.П.Сапрыковой, к.х.н., н.с. ПА. Назмутдиновой. 'зучаемые соединения представлены гомолш андными комплексами меди, лития, ксованадия, марганца и оксигенированного кобальта (1, 4-а, 6, 8, 9,10, 11-14, 19, 7), гетеролигандными комплексами меди и оксованадия (2, 1-а, 2-а, 7, 15-17, 20-5)(табл.1) и композициями десяти природных аминокислот (валин, лейцин, золейцин, фенилаланин, триптофан, лизин, метионин, гистидин, серии, 1утаминовая кислота) с медью, марганцем, кобальтом и литием, отличающимися

0 микроэлементному составу и содержанию аминокислот (1-7) (табл.2).

Первичную оценку биологической активности исследуемых веществ и эмпозиций проводили путем изучения острой токсичности для мышей и крыс vl.А.Беленький, 1963)(токсичность ванадийсодержащих комплексов определялась эвместно с к.м.н. А.Р. Госмановым); цитотоксичности в отношении опухолевых петок in vitro (Б.Е.Айземан и др., I960; R.Bona et al, 1987); влияния препаратов а степень гемолиза эритроцитов in vitro в условиях гипотонического и зободнорадикального воздействия (A.D.Inglot et al., 1968; JI.В. Половинкин и р., 1994).

Антибластомную активность новых комплексов и композиций исследовали

1 экспериментальных моделях перевивных опухолей мышей: асцитной и солидной пухоли Эрлиха, саркоме 37; лимфосаркоме Плисса крыс. Трансплантацию опухолей существляли общепринятыми методами (Г.Н.Першин, 1971; З.П.Софьина и р., 1980). Штаммы опухолей получены из банка РОНЦ. В качестве препаратов

сравнения использовали циклофосфан, метотрексат, фторафур и глицифон.

Противоопухолевую активность наиболее эффективных композиций комплексов оценивали на клеточных линиях опухолей человека SKOV-3 и MCI in vitro по их влиянию на окислительно-восстановительную активность опухолев клеток с помощью МГГ-теста (T.Mosmann, 1983; М.С.Alley et al., 1988) и пролиферативную активность опухолевых клеток радиометрическим методом включению в опухолевые клетки 3Н-тимидина и 3Н-уридина (по 10.0 мкКи/mj объеме 20мкл) с использованием стекловолокошюго фильтра Filtermat и харвестс Tomtec (USA) для отмывания от несвязанного 3Н-тимидина и 3Н-уридина. Фшн пропитывали твердым сцинтилляционным покрытием Meltilex А. Учет связанн радиоактивности производили на ß-счетчике Microbeta Plus. 1450 фирмы Wal (Finland) ( выполнено при консультации профессора Н.С. Сергеевой , МНИОИ i П.Н.Герцена).

Влияние лития метионината и композиции №3 на морфологическую структ) лимфосаркомы Плисса и регионарных лимфатических узлов оценивали, изу срезы, окрашенные гематоксилин-эозином и по ван Гизону (Г.А. Меркулов, 196 На микропрепаратах при помощи морфометрической сетки случайного ш; проводилось определение площади некроза опухоли (С.Б.Стефанов, 1974), состоят лимфатических узлов исследовалось по схеме ВОЗ (А. Котье и др.,197. Микропрепараты консультировались на кафедре патологической анатомии КГК доцентом, д.м.н. Д.Э.Цыплаковым.

Содержание ц-АМФ в крови и опухоли определяли радиохимическим метод (A.G.Gilman, 1970). Радиоактивность просчитывали в жидкостном сцинтиллятс "ЖС-8" на радиоспектрометре "Delta-300" (США).

Свободные радикалы в гепаринизированной плазме и в опухоли определя по парамагнитным центрам методом ЭПР на радиоспектрометре ER-200 D ("Brukc Германия), оснащенном компьютером "Aspect-2000" при 140±0.2 К. В качестве Э1 спинового зонда использовали водный раствор TEMPO (2,2,6, тетраметшшиперидин-1-оксил) в концентрации 5х10"3М (Л. Берлинер,1979).

Времена спин-решеточной (Tt) и спин-спиновой (Т2) релаксации сыворот крови и опухоли животных определяли при 310± 1 К на ЯМР-релаксометре "Minisf РС-120" ("Bruker", Германия) п =19,5 МГц. Для измерения времени использовали последовательность 180°-i -90°, а для измерения Т2-последовательнос импульсов Карра-Персела-Мейбума-Гилла.

Измерение самодиффузии молекул воды выполняли на ЯМР-релаксометр( резонансной частотой для протонов 60 МГц с импульсным градиентом магнитне поля с максимальной амплитудой 40 Тл/м. Применяли импульсн) последовательность "стимулированное эхо" ( J.Karger,1969; А.И.Маклаков и д 1987). Измерения производились при 310±0,2 К.

Спектры ЯМР-'Н высокого разрешения растворов композиций аминокисл с микроэлементами и супернатантов асцитической жидкости после ннкубаи композиций с опухолевыми клетками регистрировались на спектрометре Va ri

nity 300 (USA) на частоте 300 МГц. Химические сдвиги в спектрах измеряли носительно внутреннего эталона 2,2-диметил-2-силапентан-5-сульфоната натрия )SS) и диоксана при температуре 293 К и идентифицированы (В.С.Христофоров Др., 1997).

Оценку чувствительности материала, полученного от онкологических больных, препарату №8 и композиции №3 в сравнении с фарморубицином, платидиамом, фбоплатином, 5-фторурацилом, этопозидом и Тио-ТЭФ проводили с ¡пользованием модифицированного МТТ-теста (О.А.Куриляк, 1993) и 3Н-[мидинового теста.

Оценка влияния препарата №8 и композиции №3 на центральную нервную (стему осуществляли с применением ориентировочно-исследовательской реакции мышей (J.R. Boissier et al., 1964), определения мышечного тонуса и координации шжений (N.W.Dunham et al., 1957); влияния на судорожный и токсический эффекты )разола (Н.К.Барков, В.В.Закусов, 1973). Изучали взаимоотношение с фкотическим средством - гексеналом, нейролептиком - галоперидолом /ГД.Машковский с соавт.,1993). Влияние на устойчивость животных к гипоксии дснивали по продолжительности жизни в герметически закрытом сосуде, после ¡едения натрия нитрита (Н.В.Кораблев, П.И.Лукиенко,1976) и натрия фторида 5.А.Шугаев, Н.С.Андросов, 1968). Стресспротективные свойства изучали на оделях иммобилизационного стресса (И.И. Брехман, О.И.Кириллов, 1968) и ^избегаемого стресс-воздействия — плавательного теста (R.Porlsot et al., 1977; ЛО.Русаков, A.B. Вальдман,1983).

Антианемическую активность комплекса кобальта и композиций оценивали 1 традиционных экспериментальных моделях анемии крыс, вызванных введением шянокислого фенилгидразина, нитрата свинца и общим у -облучением. Для эделирования гемолитической анемии солянокислый фенилгидразин вводили эдкожно в дозе 30 мг/кг/сутки ежедневно на протяжении четырех дней 1.В.Лазарев, 1954). Дизэритропоэтическую анемию у крыс вызывали ежедневным здкожным введением свинца нитрата в дозе 50 мг/кг/сут в течение 7 дней ГМ.Явербаум, 1988). Для моделирования апластической анемии вызывали острую /чевую болезнь у крыс общим однократным у -облучением в дозе 4,5 Грей (исто-BiK у -излучения-Со60, мощность дозы 0,444 Гр/мин) на гамма-терапевтической :тановке АГАТ-Р1 (Р.П.Пулатов,1969). Дозиметрический контроль за дозой мучения производился с помощью дозиметра VA-J—18(Германия)(совместно с м.н. Н.Э.Бакировой).

Для оценки влияния комплексов и композиций, проявляющих эотивоопухолевую активность, на гемопоэз и эффективности композиций и >мплексов на моделях анемий исследовали показатели периферической крови ровень гемоглобина, число эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, ретикулоцитов, матокрит, лейкоцитарную формулу) (А.Н.Альтгаузен,1964). При оценке [тианемической активности рассчитывали цветовой показатель (ЦП), индексы штроцитов: Ср.ОЭ- средний объем эритроцита, ССГЭ- среднее содержание

гемоглобина в эритроците, СКГЭ- среднюю концентрацию гемоглобина эритроците ( Г.И.Козинец ,1998). Исследования костного мозга проводили пут подсчета числа ядросодержащих клеток костного мозга (ОККМ)( H.W. Geran 1956), а также подсчета миелограммы и парциальной эритробластограмл общепринятыми методами (М.Г.Абрамов,1985; В.В.Меньшиков,198 Е.Б.Владимирская. 1993). Функциональную активность нейтрофилой оценивал! спонтанном и стимулированном тесте восстановления нитросинего тетразол (А.Н.Маянский, 1988).

Изучение эритропоэтической активности сыворотки крови животнь получавших препарат №27, проводили по методу Krystal.A. в модификации Т. Монаковой и H.A. Сеткова (1989). Стандартом эритропоэтина служил коммерческ препарат "Epoetin ALFA" (Epogen, США) с активностью 2000 ЕД/м Радиоактивность отдельного образца измеряли на жидкостном сцинтилляционт счетчике Beckman LS 1801 (Германия).

Кроме того, на модели острой лучевой болезни крыс было проведе исследование влияния препаратов № 8,27, композиции №3 и цианокобаламина постлучевое восстановление организма подопытных животных с учет< выживаемости по 30-дневному тесту и средней продолжительности жиз (Р.А.Бесядовский и др.,1978).

Для обоснования безвредности комплексов лития, кобальта и ком поз иц проведены исследования по изучению подострой токсичности на крысах п внугрибрюшинном введении лития метионината в дозах, соответствующих 1/5С 1/10 DL50, гистидината кобальта в 1/20 DLJ0 и композиции №3 в до: соответствующей терапевтической. В конце курса инъекций регистрировались o6ui состояние, поведение животных и прирост массы тела, оценивались функционалы! активность почек по реакции на водную нагрузку, некоторые биохимическ показатели крови, состояние периферической крови, коэффициенты масс внутренн органов; измерялась температура тела и регистрировалось время выполнен "норкового рефлекса".

При моделировании острой лучевой болезни, изучении стресспротективн активности на модели иммобилизациошюго стресса и в серии опытов по изучеш безвредности препаратов №27, 8 и композиции №3 при многократном введен здоровым животным определялись содержание общего белка, глюкозы, обще холестерина, общего билирубина, железа, мочевины, мочевой кислоты, креатинш триглицеридов, активность сывороточных ферментов: аланинаминотрансфера и аспартатаминотрансферазы, а-амилазы, у-глутамилтранспептидаз лактатдегидрогеназы на биохимическом анализаторе Cobas Mira Plus 1997 ("Rochc и тимоловая проба с использованием реактивов Био-Ла-Тест "Тимоловая проб ("Лахема"). Некоторые биохимические исследования выполнены на базе ЦПУ КГМУ совместно с к.б.н., с.н.с. И.Х.Валеевой: определение общ ангиоКислительной активности сыворотки, определение активное антиоксидантных ферментов - пероксидазы и каталазы сыворотки (Т.Попоп

p.,1971; М.А.Королюк и др., 1988); определения уровня диеновых конъюгзтов и одержания малонового диальдегида в сыворотке и гомогенатах органов И.Д.Стальная, 1977; Э.Н.Коробейникова, 1989), определение содержания идроперекисей липидов в плазме крови (В.Б.Гаврилов и др., 1983).

Статистическая обработка результатов исследований производилась с спользованием t-критерия Стьюдента, пакета компьютерных программ "Aspect-ООО , таблиц Генеса (1964). Альтернативные реакции оценивались методом Фишера Д.И.Закутинский, 1960). Построение графиков и таблиц осуществлялось с спользованием компьютерной программы Excel/ Windows.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты экспериментов по изучению острой токсичности новых омплексных соединений лития, ванадия, марганца, кобальта и меди показали, что минокислотные комплексы лития относятся к малотоксичным соединениям, оединения ванадия - к умеренно- и малотоксичным, комплексы марганца и кобальта к малотоксичным и меди - к умеренно и высокотоксичным согласно классификации [.К.Сидорова ( Н.Ф.Измеров и др., 1971). В отличие от соединений меди, среди оторых наиболее токсичными оказались гомолигандный аминокислотный, ипептидный и трипептидный комплексы, дипептидный комплекс оксаванадия в яду соединений ванадия оказался наименее токсичным. Гетеролигандные омплексы ванадия, содержащие в своей структуре гидразид изоникотиновой ислоты (ГИНК) и аминокислоты по параметрам острой токсичности близки к минокислотным гетеролигандным комплексам. При сопоставлении аналогичных минокислотных комплексов переходных металлов 4 периода по токсичности их южно расположить в следующем порядке: комплекс меди> марганца> кобальта = анадия (табл.1).

Токсичность новых комплексов лития, ванадия, марганца и кобальта для сивотных была ниже, чем у неорганических соединений соответствующих [икроэлементов (лития карбоната, ванадата, марганца хлорида и кобальта хлорида) В.В. Гацура, А.С.Саратиков, 1977; J.L. Domingo et al., 1985; D.J.Sanchez et.al, 1993). Остановлено, что модификация молекулы соединения с использованием в качестве елатирующего агента ГИНК, константа устойчивости которого имеет тот же орядок, что и у глицина (А.Альберт, 1989), не приводила к изменению токсичности омплексов ванадия по сравнению с ванадийсодержагцими аминокислотными омплексами.

При оценке острой токсичности комплекса кобальта (препарата №27) при днократном внутрибрюшинном введении была выявлена видовая специфичность: 1ыши оказались более чувствительны к токсическому воздействию, чем крысы Р<0.05), что характерно и для соединений кобальта на основе тетраминов И.Ю.Попова, 1993).

Таблица 1

Параметры острой токсичности новых соединений меди, лития,

марганца, кобальта, ванадия, цинка для мышей при однократном внутрибрюшинном введении (мг/кг) и их цитотоксичность на опухолевые

клетки in vitro.

№ Соединения Лабораторный шифр препарата ДМТ ДЛ50 ДЯ.оо Кц*

1 Си (His)2 1 5.0 16.0 ±2.8 35.0 -

2 Cu(His)(Mct) 2 10.0 30.0 ±4.5 70.0 -

3 Cu(A!a-Met)(H20)3 3 10.0 23.0 ±2.7 35.0 -

4 Cu(Giy-Gly-Gly)Na2 4 5.0 13.0 + 3.1 35.0 -

5 Си (Met)z-2His H 1-a 150.0 210.0± 9.0 270.0 1.7

6 Си (His)(Thr) 2-a 40.0 62.0 + 3.3 80.0 1.7

7 Си (p-ala-p-ala)2 5-a 20.0 54.0 + 6.0 100.0 -

8 Си (S-Me-Mei)2 6 10.0 34.0± 4.4 80.0 1.6

9 Си (His)(S-Me-Met) 7 40.0 67.0± 3.3 80.0 1.6

10 Zn(His): 3-a 25.0 80.0± 7.4 125.0 -

11 LiHis 4-a 500.0 1650.0±157.0 2500.0 1.5

12 LiMet 8 875.0 1350.0 ±96.3 2000.0 1.6

13 Li2 Na2 ATP 9 800.0 1320.0 ±68.8 1600.0 1.1

14 Mn2HisH 10 100.0 150.0 ± 6.7 200.0 1.1

15 VO(Thr)2 11 114.0 144.9 ± 12.2 229.0 0.8

16 VO(His), 12 94.0 202.7 + 17.8 330.0 0.9

17 VO(Cys)2 13 62.0 151.4 ± 6.5 201.0 0.8

18 VO(Ser), 14 69.0 148.9 ± 13.8 208.0 1.3

19 VO(His)(Ser) 15 61.0 84.3 ± 5.1 123.0 0.7

20 VO(His)(Cys) 16 96.0 128.5 ± 12.4 192.0 0.8

21 VO(His)(Thr) 17 96.0 118.3+ 13.0 192.0 0.8

22 (VOWGIy-GlyH)2(OH)2 18 92.0 230.0 ±36.4 368.0 "

23 VO(HINA)2 19 85.0 112.2 ± 18.0 136.0 1.0

24 VO(HlNA)(Ser) 20 88.0 167.9 ± 10.2 234.0 -

25 VO(HINA)(Gly-Gly) 21 75.0 134.3 ± 7.7 186.0 0.9

26 VO(HINA)(His) 22 72.0 143.3 ± 39.1 215.0 0.9

27 VO(HINA)(Thr) 23 52.0 90.4 ± 11.8 129.0 -

28 VO(HINA)(Asp) 24 81.0 169.9 ± 11.1 216.0 1.8

29 VO(HINA)(Glu) 25 140.0 157.9 ± 11.9 246.0 1.3

30 VOSO2-H2O 26 27.0 86.2 ± 9.7 137.0 1.0

31 Co2(His)402 27 150.0 225.0 ± 16.6 300.0 1.0

* индекс цитотоксичности (отношение % поврежденных клеток в опыте

контролю)

Комплексные соединения кобальта с мстионином, аспарагином, описанные в 1тературе, также проявляют низкую токсичность, однако недостатком этих >единепий, препятствующим их внедрению в широкую клиническую практику, ¡ляется нестабильность их физико-химических свойств (3. Салиходжаев и э.,1991). В этом аспекте отличительной особенностью препарата №27 является 'абильность комплекса, которая достигается его оксигенированием.

Введение тестируемых соединений в токсико-летальных дозах вызывало содную картину отравления животных, которая сопровождалась их общим нстением. Смерть мышей наступала от угнетения дыхания в первые четверо суток )слс инъекции препаратов. Соединения меди и ванадия вызывали у животных мрею. Клиника интоксикации мышей исследуемыми комплексными соединениями гди, ванадия, кобальта, марганца, лития была сходна с таковой соответствующих ^органических веществ, что указывает на важность и ведущее значение икроэлемента в картине отравления. Эти результаты согласуются с данными 1тературы для других органических и неорганических соединений металлов ¡.П.Латяева и др., 1989; Б.И.Любимов, 1984).

Композиции аминокислот с металлами значительно менее токсичны, чем >мплексы отдельных микроэлементов с аминокислотами и олигопептидами абл.2).

Таблица 2

Параметры острой токсичности новых композиций аминокислот с микроэлементами для мышей при однократном внутрибрюшинном введении (мг/кг)

№№ ДМТ ДЛ50 ДЛ юо

ком-ции

1 4415.0 >5000 -

2 4490.0 >5000 -

3 4750.0 5300.0 + 236.0 7085.0

4 780.0 3000.0 ±428.0 6220.0

5 4650.0 >5000 -

6 2000.0 3600.0 ±351.8 6000.0

7 500.0 2750.0 ±38.2 6000.0

Проведенные исследования позволяют рассматривать композиции №1, №2, >3,№5, №6 как относительно безвредные, а композиции №4 и №7 как практически : токсичные. Наличие в составе композиций №4 и №6 лития приводило к )вышению их острой токсичности для мышей по сравнению с композициями №3 №5, (аналогичными по аминокислотному составу). При увеличении в 1мпозициях аналогичных по микроэлементному составу (Си2+, Мп2 , Со2+) (№3, '.7) содержания мегионина происходило повышение токсичности.

Композиции №3, №4, №6 и №7 в токсико-летальных дозах вызыва. однотипную картину интоксикации животных с симптомами угнетения ЦН появлением у них птоза, каталепсии.

Высокая эффективность препаратов платины при лечении злокачественш новообразований (М.А.Преснов и др., 1986; Н.И.Переводчикова, 199 П.И.Олийниченко и др., 2000) и сведения о цитотоксичности в отношен! опухолевых клеток неорганических и органических соединений лития, ванадь марганца, кобальта и меди (T.F. Cruz et al.,1995; D.Dilorenzo étal., 1996; I.H.Hall al., 1993; E.M. Tyobeka, R.W.Becker, 1990; D.X..West et al, 1993; Z.Wing et s 2000) явились стимулом для оценки противоопухолевой активности hobi комплексов и композиций аминокислот с микроэлементами. Для скрининга hobi соединений с потенциальной противоопухолевой активностью оценива. повреждающее действие исследуемых комплексов и композиций на опухолеш клетки в экспериментах in vitro. Результаты наших исследований позволи. установить, что прямое цитогоксическое действие на опухолевые клетки оказыва1 новые комплексные соединения лития, ванадия и меди, а также некотор! композиции аминокислот с микроэлементами. Среди монолигандш. бисаминокислотных, гетеролигандных аминокислотных и дипептидного комплекс оксованадия повреждающим действием на опухолевые клетки асцита яичника кр| обладал препарат №14 (биссеринат оксованадия). Гетеролигандные комплекс оксованадия, содержащие в качестве лигандов ГИНК и аминокислот (аспарагиновую и глутаминовую кислоты) , проявляли цитотоксическое действ на опухолевые клетки в различных концентрациях и длительности инкубации соединениями. Сравнительный анализ противоопухолевых свойств нош. гомолигандных, гетеролигандных комплексов ванадия, гомолигандного комплек оксованадия с ГИНК, оксованадата с ванадил сульфатом, для которого описа антиканцерогенная активность (H.Tompson et al, 1984), и изониазидом позвол! выявить высокую цитотоксическую активность отдельных новых соединени Гетеролигандный комплекс ванадия с ГИНК и аспартатом, в отличие от ванад! сульфата, проявил выраженный противоопухолевый эффект in vitro (CLJ0= 10 ' N

Все исследумые аминокислотные комплексы лития, меди и гетеролиганднь комплекс оксованадия, содержащий ГИНК и дипептид глицил-глицин, оказыва: повреждающее действие на опухолевые клетки асцита Эрлиха in vitro. Усилен цитотоксического эффекта с удлинением времени инкубации с препарате выявлялось лишь для лития метионината (препарат №8).

В ходе экспериментов было установлено, что цитотоксический эффе композиций аминокислот с микроэлементами на опухолевые клетки зависит : только от микроэлементного состава, но и от содержания аминокислот. Уменьшен содержания фенилаланина и триптофана, увеличение метионина в соста композиций №3 и №4 приводило к исчезновению цитотоксического эффекта.

При анализе изменений аминокислотного состава супернатанта, полученно после инкубации асцитической опухолевой жидкости с композициями аминокисл

микроэлементами методом Ч1-ЯМР высокого разрешения установлено, что при вствительности опухолевых клеток к цитотоксическому действию композиций в тернатантс происходило уменьшение концентрации глутаминовой кислоты, серина летионина.

Изучение влияния нового оригинального комплекса кобальта, лития и четырех вых композиций микроэлементов с аминокислотами на лабилизацшо мембран итроцитов в условиях осмотического и свободно-радикального гемолиза позволило явить, что наибольшее защитное действие на мембрану эритроцитов на обеих делях оказывал препарат №27 в широком диапазоне концентраций: отЮ 7М до 3М и от 10"5М до 10'3М соответственно (Р<0.05). Эти факты, а также отсутствие нцентрационно-зависимого протекторного эффекта у препарата №27, позволяют кдючить возможность его коллоидно-осмотического защитного эффекта на мбрану эритроцитов. На обеих моделях гемолиза мембранопротекторными ойствами обладали аминокислотный комплекс лития (препарат №8) в нцентрации 10"5М (Р<0.05) и композиции № 3 и №5 в отдельных концентрациях.

Результаты оценки химиотерапевтнческой эффективности композиций и 1МПлексов на животных с перевивными опухолями показали, что ютивоопухолевую активность проявляют аминокислотные комплексы меди, лития композиции, в состав которых входят Си, Со, Мп и Li. Имелась корреляция между )фективпостыо этих комплексов и композиций в экспериментах in vivo на ¡пштных с асцитной опухолью Эрлиха и результатами оценки цитотоксичности in tro на клетках этого штамма опухоли. Из комплексных соединений меди ютивоопухолевую активность проявляли гетеролигандные аминокислотные 'мплексы меди(П) (препараты №1-а, 2-а, 7) и гомолигандный комплекс меди репарат№6), содержащий в качестве лиганда метальное производное метионина, дипептидные, трипептидные и гомолигандные комплексы были не активны абл.З). Наиболее выраженный эффект регистрировался у бисметилметиошшата зди (II), который тормозил рост солидных опухолей (опухоль Эрлиха и саркома ') на 58-73 %% (Р<0.05), устранял гиперхромную анемию, лейкоцитоз и юмбоцитопенню, сопровождаюище рост опухоли у мышей.

Как и соединения меди, противоопухолевую активность in vivo проявили пшокислотные комплексы лития. На модели опухоли Эрлиха, нечувствительной i многим цитостатикам (циклофосфану, метотрексату, фторафуру), но 'вствительной к глицифону, аминокислотные комплексы марганца, кобальта и ;соваиадия не оказывали контактного противоопухолевого действия.

Таблица с

Влияние новых комплексных соединений меди, кобальта, марганца, лигия, ванадия на рост асцитной опухоли Эрлиха у мышей.

№п/п Группы животных Объем асцитической жидкости в брюшной полости (в мл) Коэфф. Прирос -та кР

М±т Т, % тормож ения Р

1. Контроль (опухоль Эрлиха, 9-е сутки) 3,43+0,92 - - -

2. Препарат №1 (3,4 мг/кгх 8-9) 3,95±0,83 +15,2 >0,05 +5

3. Препарат №2 ( 6,0 мг/кгх8-9) 2,60+1,10 24,2 >0,05 -3

4. Препарат №3 (4,6 мг/кг х8-9) 5,23+1,20 +52,5 >0,05 +3

5. Препарат №4 (2,6 мг/кгх8-9) 3,76±0,90 +9,6 >0,05 -1

6. Контроль (опухоль Эрлиха, 8-е сутки) 4,24±0,28 - - -

7. Препарат № 1-а(40 мг/кгх5-6) 1,11+0,45 73,8 <0,001 -15,7

8. Препарат № 2-а (12 мг/кгх7-8 1,98+0,52 53,3 <0,001 -1,8

9. Препарат №3-а (16 мг/кгх7-8) 3,65+0,76 13,9 >0,05 +15,5

10. Препарат №4-а (300 мг/кгх7-8) 1,44+0,40 66,0 <0,001 -9,7

11. Препарат №5-а (10 мг/кг х7-8) 4,04±0,68 4,7 >0,05 +8,1

12. Кошроль (опухоль Эрлиха, 7-е сутки) 4,68+0,92 - - -

13. Препарат №7 (13 мг/кгхб-7) 5,66+0,81 +20,9 >0,05 -4,5

14. Препарат №10 (30 мг/кгх7-8) 6,84±1,20 +46,2 >0,05 +1,1

15. Препарат №14 (30 мг/кг х7-8) 5,18±1,22 +10,7 >0,05 -2,3

16. Препарат №27 (45 мг/кгх7-7) 4,00±0,82 14,5 >0,05 +1,1

17. Контроль (опухоль Эрлиха,7-е сутки) 3,81+0,85 - - -

18. Препарат №8 (27 мг/кгх 6-7) 2,45+0,39 35,7 >0,05 -3,5

19. Препарат №8 270 мг/кгх 6-7 1,43+0,35 62,5 <0,05 +7,4

20. Циклофосфан (20 мг/кгх 12) 25,3 >0,05

21. Фторафур (130мг/кгх 7) опухоль не чувствительна

22. Контроль (опухоль Эрлиха, 8-е сутки) 2.95±0.40

23. Глицифон (ЗОмг/кг х 6) Глицифон (бОмг/кгх 10) 2.20+0.66 25,.5 81,0 >0.05 <0.01

24. Метотрексат (0.65 мг/кг х 6) 2.67+0.29 9,5 >0.05

Из исследуемых композиций контактной и резорбтивной противоопухолевой ктивностыо обладали композиция №3, содержащая в своем составе медь, кобальт марганец, и композиция №4, содержащая помимо этих трех микроэлементов и итий, которая в дозах, равных 1/5 Л Д50 и ДМТ, подавляла рост асцитной опухоли рлиха на 55-79,6%(Р<0.05). Композиция №2 проявляла только резорбтивную ктивность. Композиции №1 и №7, отличающиеся от композиции №3 содержанием етионина, не были эффективны на данном штамме опухоли (табл.4).

Таблица 4

Влияние композиций аминокислот с микроэлементами в дозах, равных 1/5

и 2/5 ДМТ, на рост асцитной и солидной опухоли Эрлиха у мышей.

№ Группы Объем % Масса %

№ асцита(мл) ТРО1 опухоли (г) ТРО1

н/ и М+ш М+ш

1. Контроль (опухоль Эрлиха, 8 сутки) 4,37±1,17 0,98±0,13

2. Композиция №1 - - 0,75+0,12 23,6

3. Композиция №2 3,50+0,75 19,9 0,53±0,10 46,0*

4. Композиция №3 1,88+0,34 57,0* 0,46±0,10 53,5*

5. Композиция №4 3,31±0,43 24,2 0,55+0,06 44,0*

7. Композиция №7 3,22+0,97 26,0 -

Примечание: 1 - % торможения роста опухоли, * - Р<0.05

Трудности химиотерапевтического лечения больных со злокачественными овообразованиями связаны с высокой токсичностью, низкой избирательностью ротивоопухолевого действия и выраженными побочными эффектами на различные кани и органы большинства антибластомных средств (А.Акимов, ГЛ.Гершанович, 1999; П.И.Олийниченко и др, 2000; G.Bonadonna, i.Hortobadyi, 1997). Это требует одновременной оценки противоопухолевой ффективности и побочного действия, прежде всего на кроветворение, при изучении овых соединений. Сравнительная оценка влияния на кроветворение исследуемых омплексов и композиций позволила выявить вещества (препараты №6, 4-а, 8) и ом позиции (№3 и 4) без выраженного гемотоксического действия при лечении ми животных-опухоленосителей.

Исследования противоопухолевого действия отдельных представителей минокислотных комплексов и композиций аминокислот с микроэлементами на леточных линиях опухоли яичника человека - SKOV-3 и рака молочной железы еловека - MCF -7 в опытах in vitro показали, что из них наибольший ротивоопухолевый эффект проявляют бисметилметионинат меди и метионинат ития (табл.5).

Таблица

1С50 композиций № 3,4, 6, препаратов ванадия, меди, лития, кобальта и платидиама для клеток опухоли человека БКОУ-З

Время инкубации 24 часа 72 часа

Тест МТТ 3Н-ти- 3Н-ури- МТТ 3Н-ти- JH-

Препарат (концентрация) мидина дина мидина уриди-на

Композиция №3(мг/мл) - 4,8 4,0 7,2 2,8 2,5

Композиция №4(мг/мл) - 4,3 3,1 4,8 2,3 1,2

Композиция №6(мг/мл) - 4,8 3,6 6,5 7,3 1,3

Оксованадат (М) 10"4 9x10"6 7x10б 1,5х10"5 6x10"6 9x10"6

Препарат №6 (мкг/мл) 170,0 20,0 20,0 20,0 <3,0 10,0

Препарат М»27(мкг/мл) - - - - - -

Платидиам (мкг/мл) 2,4 0,3 0,9 1,4 <0,05 0,2

Препарат №8 (мкг/мл) - 48,0 120,0 <7,0 32,0 45,0

Антибластомная активность бисметилметионината меди (препарат № сопровождалась нарушением синтеза нуклеиновых кислот в опухолевых клетка Так же, как и препарат сравнения платидиам, новый комплекс меди в болыш степени нарушал синтез ДНК и в меньшей- синтез РНК. У аминокислотно комплекса лития противоопухолевый эффект in vitro превосход1 антипролиферативную активность, что дает возможность предположить, ч нарушение синтеза НК не является определяющим в механизме действия это соединения, в отличие от препаратов платины.

Антипролиферагивная активность композиции №3 сопровождала! равнозначным подавлением синтеза ДНК и РНК и была значительно выше, чс угнетающее влияние на активность окислительно-восстановительных процесс! опухолевых клеток (табл.5).

Учитывая эффективность и низкую токсичность, технологичность получеш: оригинальность химической структуры и состава для дальнейших углубленнь исследований нами были отобраны лития метионинат (препарат №8) и композит №3.

Оценка химиотерапевтической эффективности лития метионината композиции на лимфосаркоме Плисса позволила выявить, что композиция №3 ] эффективности не уступала антиметаболиту фторафуру. В отдельной cepi экспериментов было показано, что композиция вызывает излечение 20% животш с этой опухолью. У леченых животных в опухоли определялся очаговый склерс уменьшение зон митоза; происходило инкапсулирование опухолей.

Препарат.№'8 превосходил по антибластомной активности препарат сравнен

|>торафур (табл.6). В отличие от лития оксибутирата, подавление роста опухоли зри применении которого сопровождалось общетоксическим действием на организм кивотных-опухоленосителей и последующей гибелью 70% опытных животных, тития метионинат хорошо переносился животными и не вызывал явлений интоксикации.

Таблица 6

Влияние курсовог о введения лития метионината и композиции №3 на рост перевивных опухолей мышей и крыс .

Штамм опухоли % торможения роста опухолей Пр-т №8 Комп.№3 Фтора- Лития фур оксибут.

Опухоль Эрлиха солидная (мыши) 63,6* 53.5* -

Опухоль Эрлиха асцитная (мыши) 62,7* 57.0*

Лимфосаркома Плисса (крысы) 64,1* 51,1* 37,3* 44,1*

Саркома 37 солидная (мыши) 48,2* -

* - Р<0.05

По данным морфологических исследований структура лимфосаркомы кивотных, леченных лития метионинатом, не претерпевала существенных гзменений. Препарат проявлял антиметастатическое действие, предупреждая летастазирование опухоли в регионарные лимфоузлы.

В механизме действия многих противоопухолевых препаратов важное итчение придается их способности влиять на процессы свободнорадикалыюго жисления в опухолевых клетках (Е.В.Савина и др.,2000; Izutani R.et al, 1998; Weijl vf.I. et al.,1998). Результаты ЭПР-исследований содержания свободных радикалов CP) в плазме и опухоли показали, что лития метионинат и композиция №3, также сак и антиметаболит фторафур, не увеличивали образование СРс g»2.00 в шмфосаркоме Плисса. Результаты этих исследований свидетельствуют о том, что фотивоопухолевая активность лития метионината и композиции микроэлементов ; аминокислотами, так же как и у антиметаболитов (фторафура и 5-фторурацила), ie обусловлена влиянием на содержание CP в опухоли.

Роли цАМФ в процессах пролиферации и дифференцировки клеток придается >ольшое значение (JI.М.Берштейн и др.,1993;K.N. Prasad et al.,1993; v1.E.Cvijic,K.V.Chin ,1997;T.Chen, 1999;V.Macchia et al., 2001). Аминокислотный сомплекс лития и композиция №3 достоверно снижали концентрацию ц-АМФ в тухолях леченных животных по сравнению с нелеченными (табл.7).

Таблица

Содержание ц-АМФ (икмоль/мг белка) в опухоли леченных и нелеченных крыс с лимфосаркомой Плисса.

№ п/п Группы животных ц-АМФ (пкмоль/мг белка)

М±т Р %

1 Контроль 1477,0 ±90,3

2 Препарат №8 (100 мг/кгх14-15) 1157,0 ±74,3 <0,05 78,3

3 Композиция №3 (430мг/кгх14-15) 988,6 ± 82,3 <0,05 66,9

Исследование механизма противоопухолевого действия препаратов позволил выявить удлинение времен релаксации Т, и Т2 на водных протонах и уменьшенн коэффициента самодиффузии воды (Ds) в опухоли по сравнению с нормальным тканями у нелеченных животных, что можно объявить различиями в содержани парамагнитных ионов, потребленного кислорода из клеточно-связанной водь способствующими увеличению свободных перекисных радикалов в опухоли стимулированию опухолевого роста. Времена релаксации отражают степен гипоксии клеток и уровень пролиферации клеток, последний связан с концентрацие кислорода, растворенного в воде (К. Krynicki., 1966; С.И.Аксенов, 198< L.I.GerasimovaL.I. 1990). Исследуемые препараты и фторафур в процессе терапи достоверно укорачивали времена релаксации (Т, и Т2) на 24,3-29,7% и 41,7-42,4'! соотвественно и увеличивали самодиффузию воды в опухоли в 2,1-2.5 раза п сравнению показателями нелеченных животных.

При оценке чувствительности операционного или биопсийног

материала, полученного от больных раком яичников III-IV стадий, к воздействш лития метионината и композиции, было установлено, что опухолевые клетк больных чувствительны к цитотоксическому воздействию аминокислотног комплекса лития в условиях in vitro, причем цитотоксический эффект, оцененны по МТТ-тесту, превосходил антипролиферативный (1С50= 3.6 ± 0.8 мкг/мл).

Таблица

Значение 1С50 лития метионината для клеток рака яичников человека (МТТ-тест, инкубация в препаратом -72 часа)

№ опухолевого обрили 4 5 6 7 8 9 10 10а 11 11а

iCso (мкг/мл) 5.5 3.2 5.1 7.5 5.1 0.8 0.8 0.8 3.4 3.5

Наиболее чувствительны к аминокислотному комплексу лития были опухоли ольных, подвергшихся 3-6 курсам химиотерапии (№9,10,Юа). При оценке увствительности опухолевых клеток к известным противоопухолевым средствам ыло установлено, что лишь антибиотик фарморубицин в концентрации 2 мкг/ (Л,соответствующей терапевтически эффективной дозе (ТЭД), также как лития [етионинат, был эффективен во всех десяти случаях. В данной серии экспериментов карбоплатину в концентрации 50 мкг/мл опухолевые клетки больных раком ичников были чувствительны в 80 % случаев (Р>0.05), к платидиаму в онцентрации 5мкг/мл - в 75% (Р>0.05), к фторурацилу (50 мкг/мл) - в 60% случаев Р<0.05), к этопозиду (100мкг/мл) - в 50% (Р<0.05), к тиофосфамилу (12,5 мкг/мл) 8,3% (Р<0.05), т.е. препарат №8 может оказаться полезным при резистентности пухолей к фторурацилу, этопозиду и тиофосфамиду.

Композиция №3 незначительно влияла на окислительно-восстановительную ктивность опухолевых клеток и нарушала репликацию ДНК в опухолевых клетках, »тот эффект препарата был более выражен на резистентных к цитостатикам пухолях.

При лечении злокачественных новообразований химиотерапия как правило очетается с лучевой терапией, которая часто вызывает угнетение кроветворения D.Gardara etal., 1991; М.Л.Акимов, М.Л.Гершанович, 1999; К.М.Максутов, к.З.Зурдинов, 1999). Исследуемый комплекс и композиция в онкологических кснериментах корригировали нарушения кроветворения у животных, вызванные пухолевым ростом, и при длительном курсовом введении здоровых животных не арушали гемопоэз. На основании этого, были проведены исследования по оценке лияния препаратов на постлучевое восстановление кроветворения у крыс. Лития [етионинат не оказывал радиозащитного действия, но способствовал ностлучевой епарации костного мозга и восстановлению картины периферической крови, габл.9 и 10), корригировал нарушения азотистого, липидного и углеводного обмена, овышал антиокислительную активность сыворотки леченных животных.

Гемостимулирующее действие аминокислотного комплекса лития, вероятно, еализуется через активацию пролиферации плюрипотентных стволовых клеток и овышение пострадиационной стромальной продукции гемопоэтических факторов оста. Так, по данным ряда авторов, препараты лития увеличивают продукцию нтерлейкина-2, колоннестимулирующего фактора мононуклеарными клетками ериферической крови in vitro и число мультипотентных колониеобразующих леток костного мозга при облучении в экспериментах in vivo (V.S. Galliccho, N.K. lughes, 1991; R.M. Johnke, R.S. Abernathy, 1991; K.P. Hoeflich, J.Lio, 2000). По-идимому, лечебный эффект препарата №8 при острой лучевой болезни обусловлен е только его гемостимулирующими свойствами, но и мембраностабилизирутощим ействием, а также антиоксидантными свойствами.

Композиция №3 проявляла радиомиметическое действие.

Таблица

Влияние препарата №8 и композиции №3 на гематологические показатели крыс __на 12 сутки после облучения, М±т. _

Показатель Ингакшые КЬтроль (обручение) Облучение +препараг№8 (15 мг/кгх4) Облучение+ композиция N¿3 (220мг/кгх4)

Гемоглобин, г/л 93.80+0.16 63.88± 10.59* 63.67+2.56* 27.83i9.6*

^мгооцшы, 1012/л 5.50+0.74 3.0210.27* 5.64+0.28** 2.55+0.49*

Гематокриг, % 40.3811.58 28.57+0.30 * 33.74i2.16* 15.26±5.38*+

Лейкощлы, Ю7л 9.03510.660 2.680+0.120* 3.890+0.080* ** 2.29+0.28*

Тромбоцнти 109/л 312.50+33.75 106.16+33.89* 118.90+10.00 * 85.5±19.7*

GKKM 588.70+85.64 108.60+21.70* 321.37+39.75 184.64+20.32*

Примечание: *и **- Р<0.05 по сравнению с интактной и контрольно группой соответственно; +и *- Р< 0,1 по сравнению с интактной и контрольно группой здесь и таблицах 10, 13 и 14.

Таблица 1

Влияние препарата №8 на восстановление различных клеточных популяций в костном мозге бедренной кости крыс, облученных в дозе 4.5 Гр (18 -ый день

после облучения)(М+.т)

Показатели йшшные Кет прешь (у-облучение) у-облучешеН-препарат№8 (15 мг/кг)

СЖКМ бедренной косги,х 10 9/л _ 117.6±17.1 57.1+8.1* 95.8±10.3**

Миелобласт-миелоциг ,xl 0 9/л 10.00HD.17 5.57+0.56 * 7.47+0.18* **

Палочкоадфные +сегменгоядернью нейтрсфть!, хЮ 9/л 19.96iD.43 4.13+0.51 * 23.18+0.61 **

Лимфоииные клегки,х 109/л 3292110.6 28.55+1.83 22.61+4.32

Все эршроидные клегки, хЮ % 33.28±1.27 13.22+2.46 * 27.97+3.32 **

Фармако-токсикологическая оценка лития метионината показала, что та к л как и у лития оксибутирата, замена неорганического аниона на органически приводит к снижению острой токсичности почти 3.6 раза но сравнению с литие карбонатом. В отличие от лития оксибутирата, в спектре фармакологическс

[ктивности которого преобладает отчетливый седативный компонент Т.А.Замощина, А.С.Саратиков,1984; Б.И.Любимов,1984), проявляющийся в :нижении двигательной активности животных(в дозах 50, 100 мг/кг и >), аминокислотный комплекс лития не влиял на ориентировочно-исследовательскую »еакцшо мышей. Характерно, что также как и лития оксибутират, новый комплекс [ития не вызывал мышечной релаксации и нарушения координации движения, т.е. ак называемый "нейротоксический эффект" у препарата отсутствует. Лития ютионинат потенцировал эффект депримирующих средств и уменьшал судорожную 1Ктивность коразола, как и лития оксибутират (Б.И.Любимов,1984). В отличие от гития оксибутирата и литиевой соли ацетил-аспартата (А.А.Пентюк и др., 1984; /.РеЦоуе1.а1., 1996; И.А.Григорьев, 1997), препарат не проявлял антигипоксических, :трссспротективных и антидепрессивных свойств.

По данным литературы, соли лития оказывают неблагоприятное воздействие 1а почки, гонады, щитовидную железу, вызывают сдвиги липидного и углеводного >бмена, нарушения сердечного ритма, гемолиз эритроцитов (Т.Я.Хвиливицкий и ф.,1977; С. С^епвеп е1 а1., 1978; Т.А. С^епзэоп, 1976; С.С.Оареп, 1992; Б. лррап, 1982). В отличие от неорганических солей, лития ме гионинат при длительном фименении здоровым животным не оказывал выраженных побочных эффектов.

Курсовое введение соединения не влияло на картину периферической крови. Изменения биохимических показателей крови касались углеводного обмена, /меньшение содержания глюкозы сопровождалось снижением активности амилазы. 1!удя по изученным биохимическим показателям крови и морфологическим ^следованиям структуры мозга, почек, печени, сердца, селезенки, кишечника, гонад сомплекс лития существенно не нарушал состояние жизненно важных органов, /меньшение выделительной функции почек в реакции на водную нагрузку не ;о провождал ос ь изменением содержания креатинина и мочевины сыворотки крови шытных животных.

Наши совместные исследования с фармакологами Мордовского осударственного университета показали, что лития метионинат не только не )бладает аритмогенным действием, а напротив, проявляет антиаритмические :войства, описанные и для лития оксибутирата (Г.Я.Авруцкий и др., 1984; П.А. "аленко-Ярошевский и др., 1984; Ю.Л.Нуллер, 1984). У композиции № 6, юдержащей литий и переходные металлы, выявлена противоаритмическая (ктивность, которая сопоставима или превосходит таковую эталонных :ротивоаритмических средств (новокаинамида, обзидана и изоптина), что юслужило основанием к ее патентованию.

Оценка подострой токсичности для крыс композиции аминокислот с медью, юбальтом и марганцем показала, что она при длительном месячном введении :пособствует увеличению содержания гемоглобина и тромбоцитов периферической фови, в лейкограмме увеличивает долю лимфоцитов и моноцитов; не нарушает функциональную активность почек и печени, повышает уровень холестерина в фови, последнее характерно для лекарственных средств анаболического типа

действия (В.В.Меньшиков, 1982), что нельзя исключить и для композици содержащей в своем составе аминокислоты (А.Вретлинд, А.Суджян, 199С Изменения показателей периферической крови у животных сохранялись спустя мео после отмены препарата.

Композиция №3 проявляла стресспротективные свойства; антигипоксантш свойства, увеличивая выживаемость крыс на 50%(Р<0.05) на модели циркуляторлс гипоксии; достоверно повышала исследовательскую реакцию животных. Все э' указывает на целесообразность изучения нейротропных свойств композиции №3

Оценка фармакотерапевтической эффективности комплекса кобальта композиций на модели гемолитической анемии, вызванной введение фенилгидразина, позволила выявить, что исследуемые комплекс кобальта композиции, содержащие в своем составе кобальт, марганец, медь и лити проявляют антианемическое действие, выраженность которого зависит от соста! исследуемых композиций. Два из них - комплексное соединение кобальта композиция №3 не уступали по эффективности препарату сравнения цианокобаламину (табл.11). При этом лечение препаратом №27 крыс с анемис приводило к более раннему восстановлению показателей периферической кров Препарат №27, в отличие от препаратов сравнения - цианокобаламина и вамин корригировал не только показатели красной крови, но и число тромбоцитов животных с анемией, вызванной введением фенилгидразина (табл. 12).

Среди композиций микроэлементов с аминокислотами наиболс эффективными при лечении гемолитической анемии оказались композиции №3 №5, содержащие в своем составе кобальт, медь и марганец. Композиция №-содержащая литий помимо этих микроэлементов, корригировала лиш эритроцитопению. Нами установлена способность смеси аминокислот дл парентерального питания "Вамина" восстанавливать содержание эритроцитов крови у крыс с экспериментальной гемолитической анемией с последующи развитием эритроцитоза.

Таблица 11

Влияние новых композиций и комплекса кобальта на уровень гемоглобина в периферической крови крыс на модели анемии, вызванной введением солянокислого фенилгидразина ( 13-й день эксперимента), г/л

Группы животных М ±П1 к исходным % Р к контролю ЧЬ Р кциано-кобалампну % Р к вампну % Р

Исходные данные 112.6+ 1.4

Контроль 78.7 ± 1.8 б 9,9 <0.001

Цианокобплам! и 96.7 ± 1.4 85,9 <0.001 122,8 <0.001

Влмпн 87.3 ±3.3 77.5 <0.001 110.9 <0.05 90.3 <0.05

Композиция №3 107.5+3.6 95.9 >0,05 137,1 <0.001 111.6 <0.05 123, <0,01

Композиция №4 82.8 ±9.3 73.5 <0.01 105,3 >0.05 85.6 >0.05 94.8 >0.05

Композиция N»3 96.9 ±8.4 86.1 0.08 123.2 0.07 100.2 >0.05 111.0 >0.05

Композиция №6 79.7 ±8.7 70.8 <0.01 101,3 >0.05 82,4 0 07 120.3 <0.01

Препарат N»27 105.0±4.2 93.3 >0.05 133.4 <0.001 108.6 0,08 120.3 <0.01

ю и)

Таблица 12

Влияние новых композиций и комплекса кобальта на количество тромбоцитов периферической крови крыс на модели анемии, вызванной введением солянокислого фенилгидразина (20-й день эксперимента), х Ю9/л.

Группы животных М ±111 к исходным % р к контролю % Р к циано-ко балами ну % Р к В амину % Р

Исходные данные 331.43 ±4.30

Контр оль 89.50 ±5.23 27.0 <0.001

Цпанокобпллмнн 190.00 ±15.04 57.3 <0.001 212,3 <0,001

Вамнн 162.00 ±22.30 48.9 <0.001 181.0 <0.05 85.3 >0.05

Композиция №3 98.67+ 11.23 29.8 <0.001 110,3 >0.05 51.9 <0.001 60.9 <0.05

Композиция №4 96.33+ 14 20 29.1 <0001 107,6 >0.05 50.7 <0.01 59.5 <0.05

Композиция №5 97,50 ± 12.70 29.4 <0.001 Ш.9 >0.05 513 <0.05 60.2 <0.05

Композиция №6 98,40 ± 14.23 26.7 <0.001 109.9 >0.05 51.8 <0.05 60.7 <0.05

Препарат №27 328.30 ±28,64 99.1 >0.05 366,8 <0.001 172.8 <0.05 202.7 <0.05

ю ■й.

На модели анемии, вызванной свинца нитратом, исследуемые композиция №3 и препарат №27 проявляли антианемическую активность. Препараты сравнения цианокобаламин и вамин корригировали эритроцитопению, но не оказывали влияния на гемоглобинопеншо, возникающие у крыс при воздействии нитрата свинца ^рис. 1,2). Отсутствие нормализации уровня гемоглобина при использовании цианокобаламина выявлено на этой модели и в работах других авторов Ш.С.Сабденова, А.Т.Алданазаров, 1960). Терапевтический эффект препарата №27 эазвивался раньше, чем у композиции №3 и проявлялся сразу после завершения <урса лечения им. По фармакотерапевтической активности на модели свинцовой шемии препарат №27 и композиция №3 в использованных дозах превосходили лрепараты сравнения и, в отличие от известных препаратов кобальта, не вызывали зазвития полицитемии.

Дни после завершения введения нитрата свинца

-Интактные Контроль

---Цианокобаламин - - Вамин

......Гюепаоат №27 -Композиция №3

Рис. 1. Изменение количества эритроцитов у крыс с анемией, вызванной итратом свинца, леченных цианокобаламином, вамином, препаратом №27 и змпозицией №3 (в % к интактным). • - Р<0.05; * - Р< 0.1

Возможно, лечебный эффект препарата №27 связан с повышением продукции адогенного эритропоэтина, активность которого в плазме при свинцовой анемии тчительно снижается (О.П.Кулиш, 1973; G.Czekay, K.Bauer, 1993).

100 -U

90 -

80 -

%

70 -

60 -

50

40

0

8

16

26

50

Дни после завершения введения нитрата свинца

— Интактиые

- Цианокобаламин • - Гюепаоат №27

Контроль Вамин

Композиция №3

Рис. 2. Изменение уровня гемоглобина у крыс с анемией, вызванной нитрат( свинца, леченных цианокобаламином, вамином, композицией №3 и препаратом Ж (в % к интакшым). •- Р<0.05.

Следует отметить, что препарат №27 и композиция №3 значителы превосходили по эффективности препарат сравнения вамин на моде.1 дизэритропоэтической анемии.

Пострадиационная анемия является частым осложнением лучевой тераш онкологических больных и трудно поддается лечению антианемически\ препаратами. Из известных антианемических лекарственных средст цианокобаламин с этой целью не используется из-за возможной стимулящ опухолевого роста (А. Д. Острянина, И.М.Нейман, 1971; Schwietert С. W., McCue J.! 1999). Отличительной особенностью нового аминокислотного комплекса кобаль явилось отсутствие влияния на рост асцитных опухолей животных пролиферативную активность клеток опухолей человека в концентрациях 0,07 7,6 мкг/мл in vitro (табл.3,5).

Для моделирования постлучевого нарушения кроветворения на\ использовалась модель острой лучевой болезни крыс, сопровождающаяся развитие костномозгового синдрома (Н.Г.Чигарева, И.Н.Морозова, 1990; К.М.Максуто А.З.Зурдинов, 1999).

Известно, что смертность при остром лучевом воздействии обусловлена, первую очередь, инфекционными осложнениями из-за развития выражение лейкопении (O.K. Гаврилов и др., 1987, Ю.И.Москалев,1991). Но, крол количественных изменений, лейкоциты претерпевают и качественные изменени Согласно данным литературы, изменение фагоцитарной активности связывают выходом в периферическую кровь новых клеток, трансформированных в зрель клетки уже после облучения (О.К.Гаврилов и др., 1987). В наших экспериментах облученных животных отмечалось снижение уровня лейкоцитов более чем на 50°

мена нормальной "лнмфоидной" картины крови на относительный нейтрофилез, арушение функциональной активности лейкоцитов. У животных параллельно нижался индекс активации нейтрофилов. При анемии, вызванной общим гамма-блучением, происходило уменьшение числа ядросодержащих элементов костного озга крыс, вероятно, вследствие их интерфазной гибели. Анализ парциальной ритробластограммы на третий день после гамма-облучения свидетельствовал о цижении относительного содержания наиболее радиочувствительных эритроидных редшественников - проэритробластов на 54.9% (Р<0.05) и базофильных ритробластов на 15,2% (Р<0.05).

Таблица 13

Влияние оксигенированного гистидината кобальта на гематологические показатели крыс при острой лучевой болезни (12-ый день после облучения), М±т.

Показатели Интактные Облучение (контроль) Облучение + препарат №27 15 мг/кгх4

Гемоглобин, г/л 80.46±2.96 47.7516.06* 79.0014.03"

Эритроциты, х10|2/л 6.06+0.45 3.4310.65* 6.8810.81**

Цветовой показатель 0.40+0.02 0.4210.03 0.34Ю.03

Гематокрит,% 44.73+1.66 35.8611.17* 46.5612.85**

СКГЭ,% 17.73+0.65 12.81+0.28* 16.00+0.86**

ССГЭ, пг 12.38+1.08 10.1510.70 11.36Ю.44

СрОЭ, мкм^ 77.74+6.69 118.74114.00* 78.1816.95**

Ретикулоциты,%о 0.50±0.37 0.4010.30 2.6910.66* **

Тромбоциты, х109/л 414.0+30.0 106.3132.7* 481.0193.7**

Лейкоциты, хЮ% 9.75±1.97 2.3510.29* 8.5810.84**

ОККМ 468.44± 78.70 222.50125.68* 312.85129.40+ **

Исследуемый комплекс кобальта корригировал постлучевую анемию в широком гапазонедоз (от 1/20 до 1/50 ОЦ0). В дозе, соответствующей 1/20 ОЦ0, устранял ; только анемию, но и лейко-, и тромбоцитопению; и полностью восстанавливал ункциональную активность нейтрофилов, нарушенные при у-облучении. Это юйство гистидината кобальта, вероятно, обусловлено способностью этого препарата имулировать пролиферацию стволовой клетки крови.

Комплексное соединение кобальта приводило к активации костномозгового юветворения у крыс, подвергнутых у -облучению, которое проявлялось звышением общей клеточности костного мозга, с ускорением созревания жтроидных предшественников, свидетельством чему явилось увеличение носит'ельиого числа созревающих клеток и снижение процента зрелых форм, »впадающее по времени с ретикулоцитарным кризом в периферической крови, од воздействием препарата нормализация эритропоэза происходила наряду с

восстановлением других ростков кроветворения, о чем свидетельствова.! одновременная коррекция лейко- и тромбоцитолении в периферической крови нормальное лейко-эритробластическое соотношение клеток костного мозга животных.

Таблица 1

Влияние аминокислотного комплекса кобальта на парциальную эритробластограмму крыс, подвергнутых у-облучению в дозе 4,5 Гр (12-е сутк

после облучения ), М ± т (%).

Показатель Исходные данные Контроль (облучение) Облучение+препа-раг №27 15 мг/кг х 4

Проэритробласты 2.15 ±1.05 2.87 ± 1.66* 1.48±0.46+"

Эритробласты базофильные 31.20 ± 3.15 49.95 ± 0.98* 16.00 ±3.25* **

Эритробласты полихроматофильные 68.21 ±4.09 41.37+ 1.55* 83.16 ±4.74* **

Эритробласты оксифильные 1.30 ±0.52 3.56 ±1.08* 0.36 ±0.26* **

Лейко-эритробластическое соотношение 1.47 ±0.23 0.95 ±0.07+ 1.24 + 0.15*

На основании результатов исследования можно предположить, что в осно антианемического действия препарата кобальта может лежать повышение синте эндогенного эритропоэтина и активация костномозгового кроветворения на уров стволовой клетки крови (А.Сог1ас11 е! а1, 1994;У.Т. Но, У.К , 1996).

В отличие от препарата сравнения цианокобаламина, препарат кобальта только корригировал костномозговой синдром, но и способствовал постлучево> восстановлению организма крыс. Он в отличие от препарата сравнения цианокобаламина, полностью предотвращал гибель облученных животных.

Препарат кобальта нормализовал содержание продуктов перекисно окисления липидов и общую антиокислительную активность сыворотки крови крь проявляя антиоксидантные свойства. Одновременно он корригировал р: биохимических показателей сыворотки крови крыс, что согласуется с данныи литературы о способности соединений кобальта при облучении нормализова нарушенный обмен веществ (С.С.Азизова и др.,1986; Г.А.Блбенко,197 З.Салиходжаев, 1488; Ф.Х.Сейфуллин и др., 1986).

Таким образом, лечебное введение препарата №27 при постлучевой анемии у >ыс приводило к восстановлению ряда функций организма облученных животных, тот эффект препарата кобальта может быть обусловлен не только :мостимулирующими свойствами, но и мембраностабилизирующими и птюксидантными свойствами.

По литературным данным, препараты кобальта проявляют ряд побочных [>фектов, что в значительной мере ограничивает их широкое клиническое пользование. Так, описано неблагоприятное действие кобальтсодержащих эенаратов на сердце, печень, почки, нервную систему, на сперматогенез. Кобальт его соединения вызывают значительные сдвиги белкового и липидного обмена, ^организацию ферментативной активности ряда энзимов, дисбаланс патологических показателей (Н.В.Гринь и др.,1992;Н.1ли, M.A.Correia,1994 и др.)

Изучение длительного воздействия нового аминокислотного комплекса )бальта на организм здоровых животных свидетельствовало о хорошей зреносимости препарата.

В отличие от неорганических солей кобальта, курсовое введение <сигснированного гистидината кобальта не влияло на активность сывороточных ерментов: лактатдегидрогеназы, аспартат- и аланинаминотрансфераз, гамма-[утамилтранспептидазы. Содержание в сыворотке крови опытных животных очевины, общего белка, глюкозы, общего билирубина также не отличались от итактных значений после 30-тикратного курса введения препарата №27.

Препарат №27 при месячном курсе введения не приводил к статистически «чимым изменениям коэффициента масс печени, селезенки, сердца, легких, гменников, мозга, гипофиза, надпочечников, тимуса. Длительное введение эепарата №27 не изменяло функцию почек, оцененную по реакции на водную сгрузку, однако регистрировалось увеличение относительной массы почек и ¡держания креатинина сыворотки крови. Уровень мочевины при курсовом введении <сигенированного гистидината кобальта не изменялся. В опытах по изучению эдострой токсичности препарата оксигенированный гистидинат кобальта не ,r.i[,iвал изменения коэффициента массы сердца при длительном введении. По шным литературы при воздействии токсических доз неорганического кобальта, ожет развиться кардиомиопатия (Э.К. Орджоникидзе, А.В.Рощин, 1991, .М.Суворов и др., 1992). Нами совместно с сотрудниками кафедры фармакологии [ордовского государственного университета показано отсутствие аритмогенного зйствия у препарата №27.

В доступной литературе сведения о влиянии соединений кобальта на процессы ;рекисного окисления липидов весьма противоречивы. По данным ряда авторов, ^органические соли кобальта активировали процессы ПОЛ в эритроцитах и ткани :чени крыс (K.Furono et al., 1996; J.Gutierres Correa, A.O.Stoppani,1993). Некоторые эединения кобальта, напротив, проявляли антиоксидантное действие Г.А.Шамсутдинова и др., 1994; H.Keino et al., 1993; T.N. Lin et al.,i996).

Наши исследования показали, что препарат №27 не обладал прооксидантным

действием при тридцатидневном курсе введения здоровым животным.

Известно, что соединения кобальта, проявляя выраженну противоанемическую активность, вызывают гиперплазию красного костного моз1 появление очагов экстрамедуллярного кроветворения, следствием чего являет развитие истинной полицитемии с последующими осложнениями. Курсовое введен препарата №27 вызывало изменения ряда гематологических показателей (увеличен! содержания гемоглобина и эритроцитов) в периферической крови крыс, аналогич) другим соединениям этого микроэлемента. При этом, препарат №27 не влиял I процентное соотношение клеток костного мозга, в отличие от других соединен! кобальта. Терапевтический курс введения аминокислотного комплекса кобальта: влиял на эритропоэтическую активность сыворотки здоровых мышей.

Таким образом, аминокислотный комплекс кобальта и композиция № обладая низкой токсичностью и стабилизирующим действием на мембра! эритроцитов в условиях модельного повреждения, являются эффективными п[ лечении гемолитической фенилгидразиновой и свинцовой анемии. Препарат Ж также обладал противоанемической активностью на модели анемии крыс, вызванш ионизирующим излучением. Оксигенированный гистидинат кобальта, являя! прочным хелатным комплексом, с низкой токсичностью и большей широте терапевтического действия на моделях экспериментальных анемий, чем описаннь кобальтсодержащие соединения (коамид, кодиамид), кроме того способствов; восстановлению ряда функций организма после лучевого воздействия, в отличие ( природного кобальтсодержащего соединения - цианокобаламина, защищал от гибе; облученных животных. В противоположность цианокобаламину и описанным литературе соединениям кобальта, изучаемый нами оксигенированный гистидин; кобальта не вызывал гиперплазии костного мозга, развития полицитеми повышения гематокрита при лечебном введении и, наряду с этим, не проявл) выраженного токсического воздействия на организм животных при многократне воздействии. В отличие от цианокобаламина новый аминокислотный компле] кобальта не стимулировал опухолевый рост.

ВЫВОДЫ

1. Токсичность, противоопухолевая и антианемическая активность новь координационных соединений лития, ванадия, марганца, кобальта и меди аминокислотами и олигопептидами определяется природой комплексообразовате; и структурой лиганда:

- с увеличением атомной массы комплексообразователя токсичност повышается. Комплексы лития - малотоксичны, ванадия, марганца, кобальта малотоксичны и умереннотоксичны, меди - умеренно и высоко токсичш Координация лития, ванадия, кобальта с органическими лигандами приводит снижению их токсичности,

- среди комплексных соединений лития, ванадия, кобальта и меди выявлены )единения с противоопухолевой и антианемической активностью. В ряду едьсодержащих аминокислотных и олигопептидных комплексов для проявления ггибластомного эффекта важны октаэдрическая структура комплекса и ковалентное 1язывание комплексообразователя с двумя атомами кислорода, а также цитирование с двумя аминогруппами.

2. Токсичность, мембранотропная, антианемическая и противоопухолевая стивность композиций аминокислот с микроэлементами зависит от их икроэлементного состава и содержания отдельных аминокислот в их составе, эмпозиции №1, 2, 3, 5 и 6 - относительно безвредны, №4 и 7 - практически не жсичны. Наличие в составе композиций лития помимо меди, кобальта и марганца 5еспечивает проявление антибластомной активности (№2, 4 и 6) и снижение 1тианемической. В композициях, содержащих медь, кобальт и марганец, ютивоопухолевая активность зависит от концентрации метионина (№1, 3 и 7), пианемическая - от содержания фенилаланина и триптофана (№3 и №5).

3. Лития метионинат - препарат №8 проявляет цитотоксический эффект на 'спензионных опухолевых клеточных тест-системах, антибластомное действие на :ревивных опухолях животных (асцитной и солидной опухоли Эрлиха, саркоме 37 .пней, лимфосаркоме Плисса крыс), клеточных линиях опухолей человека (SKOV-MCF-7), операционном и биопсийном материале от больных раком яичников III' стадии. Препарат №8 эффективен при резистентности опухолевых клеток больных lkom яичника к Тио-ТЭФ, 5-фторурацилу, этопозиду.

Препарат подавляет окислительно-восстановительные процессы и нарушает штез ДНК и РНК в опухолевых клетках. Препарат №8, тормозя рост лимфосаркомы лисса, препятствует метастазированию опухоли в лимфоузлы. Динамика физико-шических параметров в опухоли в ходе терапии лития метионинатом фактеризуется снижением содержания ц-АМФ, замедлением прироста оффициента самодиффузии Ds воды, уменьшением 'Н-ЯМР (Т, и Т2) времен таксации при сохранении уровня свободных радикалов в опухолевой ткани.

Препарат №8 корригирует синдром постлучевой миелосупрессии в сперименте.

4. Композиция №3 обладает противоопухолевой активностью, проявляет диосенсибилизирующее, стресспротективные свойства. Ее противоопухолевое йствие связано с подавлением пролиферативных процессов в опухолевых клетках.

5. Оксигенированный гистидинат кобальта - препарат №27 на моделях молитической, дизэритропоэтической и пострадиационной анемий проявляет фаженную противоанемическую активность, в отличие от цианокобаламина не имулирует опухолевый рост. Препарат в лечебном режиме введения при у-шучении устраняет синдром постлучевой миелосупрессии и защищает от гибели ¡лучейных животных. Препарат №27 проявляет мембранопротекторные, тиоксидантные свойства и стимулирует костно-мозговое кроветворение при лучении.

6. Композиция №3, препараты №8 и 27 малотоксичны при однократп применении животным и безвредны при длительном 30-тикратном введенш терапевтических дозах.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Рекомендуется продолжить доклиническое изучение лития метионината 1 потенциального антибластомного средства, оксигенированного гистидината кобал как потенциального антианемического и радиопротекторного средства, композш №3 как потенциального средства адъювантной терапии опухолей.

2. Целесообразно продолжить направленный синтез и поиск нов противоопухолевых средств среди глутамат, серии и мстионинсодержаш комплексов меди, лития и аспартатсодержащих комплексов оксованадия.

3. Необходимо продолжить дальнейшее углубленное изучен противоопухолевых свойств композиции №4 и бисметилметионината меди.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Гистидинат (у-амино-а-5-имидазолилпропионат)лнтия, проявляют противоопухолевую активность/ Р.Х.Хафизьянова, В.Г.Штырлин, И.С.Мокринск А.В.Захаров , Л.Н.Залялютдинова и др.// Авторское свидетельство СССР с гриф "ДСП" № 1786805 от 8.09.92.

2. Залялютдинова Л.Н., Хафизьянова Р.Х., Мокринская И.С. Оце! безвредности длительного применения композиции аминокислот и микроэлемент в сравнении с метионином // Тез.док.Всероссийской конф. " Научная работа -1 основа творческого роста преподавателя ".- Волгоград, 1993. - С.28-29.

3. Мокринская И.С.,Хафизьянова Р.Х. ,Залялютдинова Л.Н. и др.По! малотоксичных противоопухолевых средств среди композиций аминокислот олигопептидов с микроэлементами// Тез.док. Всероссийской конф." Научная раб< - как основа творческого роста преподавателя ".- Волгоград, 1993. - С.50.

4. Залялютдинова Л.Н., Хафизьянова Р.Х., Мокринская И.С. Влияние нов комплексов соединений аминокислот с микроэлементами на функционалы активность почек // Тез.докл. IV Всероссийской научной конф. " Фармаколо) водно-солевого обмена",- Чебоксары, 1993.- С.65-66.

5. Хафизьянова Р.Х.,Залялютдинова Л.Н. Антигипоксантная активность ное композиции аминокислот с микроэлементами и вамина при гемическо? циркуляторной гипоксиях // Тез. Российской научной конф." Антигипоксанть актопротекторы: итоги и перспективы ".- С.-Петербург, 1994.- С. 103.

6. ЗалялютдиноваЛ.Н., Хафизьянова Р.Х. Аминокислотные комплексы лип

некоторые аспекты их нейротропной активности // Тез.Всероссийской конф. " ипуальные вопросы экспериментальной и клшгической фармакологии." -Смоленск, 994.- С.44-45.

7. Хафизьянова Р.Х., Залялютдинова JI.H. Антибластомная активность минокислотных комплексов лития // Тез.докл. II Российского нац. Конгресса " [еловек и лекарство".- Москва, 1995.-С.198.

8. Залялютдинова JI.H., Хафизьянова Р.Х., Штырлин В.Г. и др. Перспективы оиска новых лекарственных средств среди композиций аминокислот с [икроэлементами // Тез.съезда РНОФ." Фундаментальные исследования как основа оздания лекарственных средств ".-Волгоград, 1995.-С.162.

9. Khafizianova R., Zalyalutdinova L.N. Compositions of amino acids with miroelements - new ways of antitumoral drugs producing // Journal of Oncology Phar-îacy Practice Vol. 1,1995,-P.24.

10. Госманов A.P., Хафизьянова P.X., Залялютдинова JI.H. Противомикробная ктивность новых комплесных соединений оксаванадия (IV) // Тез. III Российского ац.конгресса "Человек и лекарство" .- Москва, 1996.- С. 17.

11. Залялютдинова JI.H., Хафизьянова Р.Х., Байкеев Р.Ф. Создание [алотоксичных актибластомных средств на основе композиций аминокислот с [икроэлементами // Тез. III Российского нац.конгресса "Человек и лекарство" .Москва, 1996,- С.22.

12. Хафизьянова Р.Х., Залялютдинова JI.H., Бакиров Р.Ф. Противоязвенная ктивность нового аминокислотного комплекса лития в эксперименте // Тез. III оссийского нац.конгресса "Человек и лекарство" .- Москва, 1996,- С.55.

13. Zalyalutdinova L.N., Baykeev R.Fr., Chafizianova R.Ch., Imanaev R.M. Corn-arable chemotherapy of Pliess lymphocarcoma by using the composites of the minoacids with trace elements and phthorofur // Third spring meeting " New insights l hematology.- Venice, 1996.- C.43.

14. Хафизьянова P.X., Залялютдинова JI.H.,Госманов A.P. Токсикологическая арактеристика комплексных соединений ванадия (IV), (V) с биолигандами // 1атериалы Российской научной конф., посвященной 75-летию со дня рождения роф. И.В.Заиконниковой " Фармакология и токсикология фосфорорганических и ругих биологически активных веществ". Выпуск 3.- Казань, 1996,- С.143.

15. Хафизьянова Р.Х., Залялютдинова Л.Н., Садыкова Н.Э. [ротивоанемическая активность новых композиций аминокислот с икроэлементами // Материалы Российской научной конф., посвященной 75-летию о дня рождения проф. И.В.Заиконниковой " Фармакология и токсикология юсфорорганических и других биологически активных веществ". Выпуск 3.-:азань,1996,- С. 144.

16. Штырлин В.Г., Залялютдинова JI.H., Захаров А.В. и др. Синтез и иологическая активность новых комплексов и композиций аминокислот с икроэлементами // Материалы Российской научной конф., посвященной 75-летию о дня рождения проф. И.В.Заиконниковой " Фармакология и токсикология

фосфорорганических и других биологически активных веществ". Выпуск 3 Казань,1996.- С.156.

17. Залялютдинова JI.H., Хафизьянова Р.Х. Влияние новых композит аминокислот с микроэлементами на опухолевый рост // Тез. IV Российского На Конгресса " Человек и лекарство",- Москва, 1997,- С.38.

18. Залялютдинова Л.Н., Хафизьянова Р.Х., Абдрахманова Н.Г. и др. Оцсн] противоанемического действия новых препаратов метаболического типа // Тез. I Российского Нац. Конгресса" Человек и лекарство".-Москва, 1997.-С.161.

19. Хафизьянова Р.Х., Залялютдинова Л.Н.,Госманов А.Р.и д Антимикобактериальное действие новых композиций оксованадия (IV) биолигандами // Тез. IV Российского Нац. Конгресса " Человек и лекарство' Москва, 1997.- С.209.

20. Khafizianova R., Zalyalutdinova L.N., Mourzagaleeva G. et al . The saert for antidepressants among low-toxicity nonanticholinesterase phosphoorganic compoum (NPOC) and new compositions aminoacids with trace elements (CATE) // Abstract bo( " Antidepressants therapy at the dawn of the of the 3 rd Millenium".- Castres-Franc 1997,- P.39.

21. Khafizianova R., Mourzagaleeva G., Mocrinskaya I, Zalyalutdinova L. et i Antitumor properties of new complex compounds of cooper (II) with aminoacids at oligopeptids // Journal of Oncology Pharmacy Practice.- 1997, Vol.3.- P.25.

22. Залялютдинова Л.Н., Хафизьянова P.X., Валеева И.Х. и д Стресспротективные свойства новой композиции аминокислот с микроэлемента'* //Материалы научной конф., поев. 35-летию ЦНИЛ КГМУ " Современные метод исследования в клинике и эксперименте".- Казань, 1997.- Ч.1.- С.38-39.

23. Залялютдинова Л.Н., Хафизьянова Р.Х., Садыкова Н.Э. Моделирован! пострадиационной гнпопластической анемии у крыс // Материалы научной коне] поев. 35-летию ЦНИЛ КГМУ " Современные методы исследования в клинике эксперименте".-Казань, 1997,- 4.1.- С.39-40.

24. Госманов А.Р., Залялютдинова Л.Н., Хафизьянова Р.Х. и др. Оцеш влияния соединения ванадия - препарата №8 на активность фосфатаз пр длительном введении // Материалы научной конф., поев. 35-летию ЦНИЛ КГМУ Современные методы исследования в клинике и эксперименте",- Казань, 1997 - Ч. 1 С.29-30.

25. Хафизьянова Р.Х., Госманов А.Р., Алханова Н.А., Залялютдинова JI.1 Мурзагалеева Г.Н. Гипогликемическин эффект нового производного ванадия i модели аллоксанового диабета крыс // Там же, С.72-73.

26. Хафизьянова Р.Х., Штырлин В.Г., Залялютдинова Л.Н., Захаров А.В. др. L- метионинат ( L-a -амино-у - метилмеркаптобутират) лития, проявля-кнщ противоопухолевую и про i ивоязвенную активность //Патент №94011588 от 10.09.9

27. Хафизьянова Р X., Бакиров Р.Ф., Залялютдинова Л.Н. Сравните и,н; оценка антиульцерогеиного действия нового комплексного соединения лпгия дибунола с известными противоязвенными средствами // Тез. V Российского накко

опгресса " Человек и лекарство",- Москва, 1998,- С.631.

28. Хафизьянова Р.Х, Залялютдинова Л.Н, Бакирова Н.Э., Абдрахманова Н.Г. ерапевтическая эффективность нового комплексного соединения кобальта на одели радиационной анемии у крыс // Тез. V Российского национ. Конгресса " еловек и лекарство".- Москва, 1998.- С.631.

29. Zalyalutdinova L.N, Khafizianova R.Kh, Mourzagaleeva G.N. Antiblastomic :tivity of new compositions of amino acids with oxovanadium(IV) // Journal of Oncol-iy Pharmacy Practice.- 1998, vol.4, №1.- P.53.

30. Gallyamov R, Khafizianova R, Zalyalyutdinova L. et el. Influence of new jmposition amino acid with trace elements on reactivity of rat airways // Pathophysiol-?y.- 1998,- Vol.5, supp.l,- P.255.

31. Khafizianova R, Gosmanov A, Zalyalutdinova L, Mourzagaleeva G, Kiyasov . Evalution of eflectivicness of vanadium compound on alloxan-induced diabetic rats / Pathophysiology.- 1998.- Vol.5, supp.l,- P.176.

32. Zalyalutdinova L.N, Khafizianova R.Kh, Baykeev R.Fh, Imanaev R.M. Speci-city of antiblastomic activity and mechanism of action of new compositions of "ninoacids with trace elements (CATE) // Archives of Pharmacology.- 1998.- Vol.358,

(supp.2),- P.536.

33. Gallyamov R, Khafizianova R, Minnebayev M, Zalyalyutdinova L. et al. ifluence of new compounds on the tone smooth muscle airways of rats after radiation / Archives of Pharmacology.- 1998,- Vol.358, №1 (supp.l),- P.332.

34. Khafizianova R, Zalyaloutdinova L, Bakirov R. et al. Experimental compa-ible evalution of antiulcer activity of compounds with metabolic type of action // Arrives of Pharmacology.- 1998,- Vol.358, №1 (supp.2),- P.363.

35. Хафизьянова Р.Х, Костин Я.В, Напалкова С.М, Елаева Е.Е, Мурзагалеева Н, Залялютдинова Л.Н, Серпов Л.Н. Противоаритмическая активность новых эмпозиций на основе природных аминокислот // Тезисы Всероссийской конф. с еждународным участием " Актуальные проблемы экспериментальной и ппнической фармакологии".- С.Петербург,1999.- С.215.

36. Хафизьянова Р.Х, Залялютдинова Л.Н, Бакирова Н.Э.. Фармакокоррекция острадиационной анемии комплексными соединениями микроэлементов в ксперименте // Тезисы Всероссийской конф. с международным участием " ктуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии".-.Петербург, 1999,- С.221.

37. Бакирова Н.Э., Залялютдинова Л.Н, Хасанов Р.Ш. и др. Изменение екоторых биохимических показателей при моделировании острой лучевой болезни крыс// Материалы IV научно-практической конференции молодых ученых.- Казань, 999.- С. 19-20.

38. Хафизьянова Р.Х., Захаров А.В, Назмутдннова Г.А., Госманов А.Р., jTb/рлин В.Г., Киясов А.П., Мурзагалеева Г.Н, Залялютдинова Л.Н. и др. Новое омплексное соединение ванадия с гндразидом нзоникотиновой кислоты, бладающее антидиабетическим 1ействием и проявляющее антимикобактериальную

активность // Заявка на изобретение №99104168, приоритет от 10.03.99

39. Патент РФ №2125874 от 10.02.1999. Бюлл.изобретений ,№4,1999.-С.47 Композиция аминокислот с микроэлементами, обладающая антибластомиой антигипоксической активностью // Штырлин В.Г., Хафизьянова Р.Х., Залялютдино J1.H и др.

40. Патент РФ №2146927 от 27.03.2000. Бюлл .изобр.№9. Препарат для лечен: рака кожи и предраковых заболеваний кожи // Студенцова И.А., Мокринская И.( Романов В.И., Гараев P.C., Хафизьянова Р.Х., Залялютдинова Л.Н.и др.

41. Патент РФ №215196 от 27. 06.2000. Бюлл.изобр. №18. Композит аминокислот с микроэлементами, обладающая противоопухолево антидепрессивной и противоаритмической активностью// Залялютдинова Л1 Захаров A.B., Штырлин В.Г. и др.

42. Патент РФ№2151773 от 27.06.2000. Бюлл.изобр. № 18. Тетракис-(] гистидинато)^ - пероксидикобальта(Ш) и его антианемическая, радиопротек-торн и антиаритмическая активность// Залялютдинова Л.I I., Хафизьянова Р.Х., Штырл! В.Г. и др.

43. Хафизьянова Р.Х., Залялютдинова Л.11,, Бакирова Н.Э., Мурзагалеева Г.] Патогенетическое обоснование применения кобальтсодержащих препаратов лечении анемии // Казан, мед. журнал.-2000,- №6.-С.507-511.

44. Залялютдинова Л.Н., Байкеев Р.Ф., Яхин Р.Г. и др. Влияние композит аминокислот с микроэлементами на содержание парамагнитных центров у животш, с лимфосаркомой Плисса // Abst. of International Workshop " Modem Developmc of Magnetic Resonance Imaging and Spectroscopy. Basic Physics and Applications Medicine and Biology", Kazan-June 11-13, 2001.- P.81

45. Патент РФ № 2173553 от 20.09.2001. Композиция аминокислот микроэлементами, обладающая противоаритмической активностью // Хафизьяно; Р.Х., Костин Я.В., Штырлин В.Г., Захаров A.B., Назмутдинова Г.А., Напалкова С.IV Елаева Е.Е., Залялютдинова Л.Н. и др.