Автореферат и диссертация по медицине (14.00.09) на тему:Энзиматические нарушения иммунокомпетентных клеток у детей с атопическим дерматитом и методы их коррекции

На правах рукописи

РГБ ОД

1 5 ИЮЛ 2002

Шакина Наталья Александровна

ЭНЗИМАТИЧЕСКИЕ НАРУШЕНИЯ ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ КЛЕТОК У ДЕТЕЙ С АТОПИЧЕСКИМ ДЕРМАТИТОМ И МЕТОДЫ ИХ

КОРРЕКЦИИ.

14.00.09 - педиатрия

14.00.36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Красноярск - 2002

Работа выполнена в Красноярской государственной медицинской академии

Научный руководитель:

доктор медицинских наук Куртасова JI.M.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Филиппов Е.С. доктор медицинских наук Смирнова C.B.

Ведущая организация: Новосибирская государственная медицинская академия

Защита состоится " /Р " _2002 г.

в часов на заседании диссертационного совета Д 208.037.01

в Красноярской государственной медицинской академии (660022, г. Красноярск, Партизана Железняка, 1).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Красноярской государственной академии (г. Красноярск, Партизана Железняка, 1).

Автореферат разослан " 2002 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Гончарук З.Н.

60'/ Л7.-2Х.0

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. В последние годы отмечается рост распространенности атопического дерматита у детей. По данным ВОЗ в разных странах атопиче-ским дерматитом страдают от 10 до 28% детей. В общей структуре аллергических заболеваний атопический дерматит занимает одно из ведущих мест. Лечение и реабилитация детей с атопическим дерматитом становится в настоящее время одной из актуальнейших проблем педиатрии.

Острота проблемы атопического дерматита обусловлена не только его высокой распространенностью в детской популяции, но и ранним началом, быстротой развития хронических форм, приводящих к снижению социальной адаптации и инвалиди-зации ребенка (Торопова Н.П., Синявская О.А.,1999, Балаболкин И.И., 2000, Огоро-допа Л,М„ 2001, Смирнова Г.И., 2001).

К настоящему времени накапливается все больше сведений о ключевой роли иммунной системы в патогенезе атопического дерматита. Не вызывает сомнения факт, что от функциональной активности иммунокомпетентных клеток зависит динамика и исход аллергического воспаления ( Гущин И.С., 1998; Ревякина В.А., 2001). При этом, известно, что в основе функциональных проявлений лимфоцитов лежат их метаболические реакции. Так уже через несколько секунд после контакта лимфоцита с антигеном или митогеном в клеточной мембране наступает ряд метаболических изменений. Доказана зависимость экспрессии на лимфоцитах крови CD/ и CDs'1" - антигенов от внутриклеточной концентрации аденозина и аденозиндифосфорной кислоты ( Порядин Г.В. с соавт., 1995). Установлено, что у людей с врожденной ферментопа-тией по глюкозо-6-фосфатдегидрогеназе скорость реакции бластгрансформации лимфоцитов значительно замедляется (Tuttle S. et al.,2000).

Высокую значимость в поддержании функциональной активности иммунокомпетентных клеток имеют глутатион и ферменты глутатионового метаболизма. Обнаружено, что глутатион может непосредственно модулировать пролиферацию Т-лимфоцитов (Lawler J.M., Demaree S.R., 2001).

Особо актуальным представляется изучение метаболизма иммунокомпетентных клеток у детей. Именно у них можно ожидать наиболее значимые динамические изменения в клетке связанные с бурными темпами процессов роста, дифференциров-ки, с одной стороны, и быстротой возникновения обменных нарушений на клеточном

уровне вследствие воздействия патологических факторов с другой.

Однако метаболические механизмы регуляции ^Е-зависимого восиаления у детей с аллергодерматозами остаются практически не изученными, а имеющиеся в литературе единичные сведения носят неоднозначный, а порой и противоречивый характер. В большинстве исследований изучены уровни активности только отдельных ферментов, что не позволяет определить в целом метаболическую ситуацию в имму-нокомпетентных клетках.

До настоящего времени остается неизвестным влияние структурно-метаболических изменений лимфоцитов крови на клинико-морфологическую картину атопического дерматита у детей. До сих пор не определены метаболические критерии экссудативной и пролиферативной формы воспалительного процесса в коже у больных атопическим дерматитом. Не исследована возможность использования показателей активности метаболических ферментов, как объективных маркеров тяжести аллергического процесса, полноты ремиссии, риска возникновения инфекционных осложнений у детей с атопическим дерматитом. Не изучены возможности коррекции метаболических нарушений в иммунокомпетентных клетках при атоническом дерматите у детей.

Следовательно, изучение ферментного профиля лимфоцитов крови и разработка методов коррекции нарушений метаболического статуса иммунокомпетентных клеток при атопическом дерматите у детей представляется обоснованным и целесообразным.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ. Изучение особенностей метаболической активности лимфоцитов крови при различных клинических формах атопического дерматита у детей и разработка с учетом выявленных энзиматических нарушений дифференцированных методов иммунореабилитации.

Для реализации поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

1. Исследовать состояние показателей клеточного и гуморального иммунитета у детей с атопическим дерматитом и их взаимосвязь с изменениями активности ферментов лимфоцитов крови.

2. Изучить особенности уровней активности метаболических ферментов лимфоцитов крови у детей с атопическим дерматитом в зависимости от возраста.

3. Установить характер клинических проявлений атопического дерматита при раз-

личных вариантах метаболических нарушений в иммунокомпетентных клетках. 4. Разработать схему метаболической иммунореабилитации детей с атопическим дерматитом на основе выявленных особенностей иммунного статуса и активности метаболических ферментов лимфоцитов крови.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые при комплексной оценке метаболического статуса лимфоцитов крови у детей с атопическим дерматитом выявлены изменения ферментного профиля в динамике 1&Е - зависимого воспаления, которые зависят от характера течения заболевания. Определены метаболические маркеры экссудативной формы и пролиферативной формы атопического дерматита у детей.

Впервые установлено, что в период клинической ремиссии атопического дерматита активность метаболических ферментов не восстанавливается до уровня, наблюдаемого у здоровых детей, что указывает на необходимость проведения в данный период реабилитационных мероприятий, направленных на нормализацию энзимати-ческого статуса иммунокомпетентных клеток.

Впервые показано, что степень снижения или увеличения активности НАД- и НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ лимфоцитов крови может служить количественной мерой эффективности метаболической реабилитации у больных атопическим дерматитом.

Впервые разработан дифференцированный подход к метаболической реабилитации детей с атопическим дерматитом и показана высокая клиническая эффективность глицирама и янтарной кислоты для коррекции энзиматических нарушений в иммунокомпетентных клетках у данной категории больных.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. В результате проведенных исследований получены новые данные о закономерностях структурно-метаболических изменений в иммунокомпетентных клетках у больных атопическим дерматитом, что дополняет фундаментальные исследования по изучению механизмов иммунологических реакций у здоровых детей и при патологии.

Разработанная модель метаболической реабилитации больных атопическим дерматитом позволила в 3,73 (Р<0,001) раза уменьшить число рецидивов, в 3,5 (Р<0,001) раза снизить число дней болезни в году и в 2,77 (Р<0,001) раза удлинить сроки ремиссии у данной категории больных.

Показатели активности НАД- и НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ лимфоцитов

крови могут быть использованы в качестве объективных маркеров, позволяющих контролировать течение заболевания на метаболическом уровне.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Показатели активности НАД- и НАДФ-зависимых дегидрогеназ в лимфоцитах крови объективно отражают динамику течения атопического дерматита у детей.

2. При атоническом дерматите уровни активное™ НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ в лимфоцитах крови зависят от возраста детей и варианта течения воспалительного процесса в коже

3. Разработанная схема метаболической реабилитации детей с атопическим дерматитом, включающая применение глицирама при экссудативной форме атопического дерматита и янтарной кислоты при пролиферативном варианте течения заболевания имеет высокую клиническую эффективность.

ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ В ПРАКТИКУ. Результаты исследования внедрены в практику I детского отделения клиники НИИ медицинских проблем Севера СО РАМН, детского аллергологического отделения Краевого легочно-аллергологического центра при Краевой клинической больнице (г Красноярск), кли-нико-иммунологического отделения Краевого центра по профилактике и борьбе со СПИД и другими инфекционными заболеваниями (г. Красноярск).

По данным рабагы подготовлены и изданы методические рекомендации "Применение биолюминесцентного метода оценки активности НАД- и НАДФ-зависимых дегидрогеназ лимфоцитов крови в клинической практике".

Основные положения исследования включены в учебный процесс на кафедре клинической иммунологии, кафедре детских болезней лечебного факультет Красноярской государственной медицинской академии и в лекционный курс на кафедре биохимии и физиологии человека Красноярского государственного университета.

АПРОБАЦИЯ МАТЕРИАЛОВ ДИССЕРТАЦИИ. Основные результаты диссертации доложены и обсуждены на Итоговых научных конференциях Института медицинских проблем Севера СО РАМН (Красноярск, 2000; 2001), на Всероссийском семинаре "Нейроинформатика и ее приложение" (Красноярск, 1995); на межрегиональной конференции "Проблемы информатизации региона" (Красноярск, 1995 ); на V научной конференции с международным участием "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2001" (Санкт-Петербург, 2001); на Всероссийской научной конференции с

международным участием "Север - Человек: Проблемы сохранения здоровья" (Красноярск, 2001); на научной сессии общего собрания Сибирского Отделения РАМН (Новосибирск, 2001); на заседании Проблемной комиссии по педиатрии (Красноярск, 2002).

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 5 в центральной печати.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация изложена на 164 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов исследования, 5 глав, содержащих результаты собственных исследований и их обсуждение, заключения, выводов и практических рекомендаций. Работа иллюстрирована 40 рисунками и 15 таблицами. Список литературы состоит из 239 источников (из них отечественных-12 8, иностранных-111).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Обследованы 169 детей (98- мальчиков и 71-девочка) в возрасте от 1 года до 11 лет с атопическим дерматитом методом случайной выборки по мере обращения в / клинико-иммунологическое отделение Краевого центра по профилактике и борьбе со Спид. Контрольную группу составили 107 здоровых детей соответствующих возрастов. В течение 2-х месяцев, предшествующих обследованию, дети не болели и не получали профилактических прививок.

Формулировка клинического диагноза проведена в соответствии с классификацией атопичсского дерматита Всероссийской научно-практической программы "Ато-пический дерматит у детей: диагностика, лечение и профилактика", Москва, 2000г.

Тяжесть клинических проявлений атопического дерматита оценивали по системе SCORAD (шкала атопического дерматита) с учетом площади поражения, интенсивности кожного процесса, выраженности зуда и нарушений сна (1997). У всех наблюдаемых больных отмечалось изолированное средней степени тяжести течение атопического дерматита ( индекс SCORAD 40,6 ± 3,7 ). Частота рецидивов заболевания в среднем составляла 3,92 ± 0.67 раз в год.

Аллергологическое обследование включало сбор аллергического анамнеза, проведение кожных скарификационных проб с бытовыми, эпидермальными и пыльцевыми аллергенами по стандартной методике. Учитывались результаты не ниже умеренно выраженных (++, +++, ++++), сомнительные и слабоположительные пробы

в расчет не принимались. Уровень общего иммуноглобулина класса Е в сыворотке крови оценивали моноклональными антителами согласно инструкции по применению иммуноферментной тест-системы АОЗТ " Биоиммуногсн " г. Москва. Специфические иммуноглобулины класса Е (бытовые, пищевые, эпидермальные, пыльцевые) в сыворотке крови определялись моноклональными антителами согласно инструкции по применению иммуноферментной тест- системы АО "Аллерген" г. Ставрополь.

Исследование иммунологических показателей, ферментного статуса лимфоцитов периферической крови проводились у наблюдаемых детей в период клинической ремиссии. Анализ полученных результатов проводился по группам в зависимости от позраста ребенка, клинической формы заболевания и мегода метаболической коррекции.

Для оценки эффективности метаболической иммунореабилитации у детей с атопическим дерматитом проведено открытое рандомизированное клиническое исследование методом случайной рандомизации. 88 наблюдаемых больных были распределены на 2 группы. Из них у 44 человек проводилась метаболическая реабилитация, а 44 ребенка не получали метаболической терапии. Сравниваемые группы были сопоставимы по возрасту, полу, тяжести и исходным иммунологическим и метаболическим параметрам. В качестве контроля использовали показатели здоровых детей соответствующих возрастов. Среди больных, которым проводилась метаболическая иммунореабилитация, 20 детей с экссудативной формой атопического дерматита получали глицирам по авторской схеме. 24 ребенка с пролиферативной формой заболевания получали янтарную кислоту по авторской схеме. Клинико-иммунологическое обследование, определе1ше активности НАД(Ф)- и ФАД-зависимых дегидрогеназ в лимфоцитах периферической крови у больных проводилось до лечения, через 2 недели после лечения и в динамике через 3 месяца, 6 месяцев и 12 месяцев после лечения. Длительность катамнестического наблюдения составила 1 год. Побочных реакций и осложнений при лечении янтарной кислотой и глицирамом у больных не отмечалось.

Клиническая эффективность метаболической иммунореабилитации оценивалась по следующим критериям: уменьшение числа рецидивов, удлинение периода ремиссии, сокращение количества дней болезни в году

Выделение общей фракции лимфоцитов из венозной крови осуществляли в градиенте плотности фиколл-верографин ( р=1,077 ), используя метод Воушп А

(1968). Концентрацию выделенных лимфоцитов определяли на счетчике "Рюо5са1е Р8-4" (Венгрия). Чистота выделения лимфоцитов составляла 94,5 ± 0,6%, жизнеспособность лимфоцитов соответствовала 98-100%.

Методом непрямой иммунофлюоресценции с моноклональными антителами, коньюгированными с флюоресцеином ( РИС) серии СБ фирмы " Дако " определяли Т-лимфоциты (СБз+), В-лимфоциты ( СБ 2Г) и субпопуляции Т- хелперов (СБ 4+ ) и Т-супрсссоров/цитотоксических лимфоцитов ( СЭ^). Для оценки функционального состояния иммунной системы вычисляли иммунорегуляторный индекс (процентное соотношение числа СО/ к числу СГ)8+). Просчет образцов лимфоцитов проводили на люминесцентном микроскопе при увеличении 10x90.

Содержание иммуноглобулинов классов А, М, Б в сыворотке крови изучалось методом радиальной иммунодиффузии по МапсЫш 0.(1968). Концентрация ЦИК в сыворотке крови определялась в реакции с полиэтиленгликолем по методике НаБкоуа У.(1978).

Фагоцитарную активность нейтрофилов периферической крови изучали в реакции с частицами латекса. Рассчитывали процент фагоцитирующих нейтрофилов и фагоцитарное число, т.е. среднее число поглощенных одшш пейтрофилом частиц.

Для оценки метаболической ситуации в лимфоцитах крови исследовали уровни активности следующих НАД- и НАДФ-зависимых дегидрогеназ: глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ), глицерол-3-фосфатдегидрогеназы (ГЗФДГ), лактат-дегидрогеиазы (ЛДГ), малатдегидрогеназы (МДГ), малик-фермента (НАД-ФМДГ ), НАД- и НАДФ -зависимых глутаматдегидрогеназ (НАДГДГ и НАДФ-ГДГ, соответственно), НАД- и НАДФ- зависимых изоцитратдегидрогеназ (НАД-ИЦДГ и НАДФИЦДГ, соответственно), глутатионредуктазы (ГР). Уровни ЛДГ, МДГ, НАДГДГ и НАДФГДГ определяли в реакциях восстановления и окисления ( Обр. ЛДГ, Обр. МДГ, Обр. НАДГДГ, Обр. НАДФГДГ, соответственно ). Определение активности НАД- и НАДФ-зависимых дегидрогеназ в лимфоцитах крови проводили методом А.А.Савченко и Л.Н.Сунцовой (1989). Для исследования использовали ферментативный препарат НАДФ«Н : ФМН-оксидоредуктазу - люциферазу из РЬоШЬас-1епит 1ео{>паЙи ( получен в Институте Биофизики СО РАН, г. Красноярск). Измерение уровня биолюминесценции проводили на биолюминомегре БЛМ 8801 (Россия). Активность дегидрогеназ выражали в ферментативных единицах (1Е=1мкмоль/мин

на 104 клеток).

Активность сукцинатдегидрогеназы (ФАД-зависимой дегидрогеназы) в лимфоцитах крови оценивали цитохимическим методом по Р.П.Нарциссову (1969). Подсчет проводился под масляной иммерсией, увеличение 10x90 и заключался в подсчете гранул формазана в 100 клетках мазка. Коэффициент активности фермента определялся как среднее количество гранул на 1 клетку.

По результатам исследования в пакете электронных таблиц MS Excel 7,0 была сформирована база данных, на основе которой с помощью пакетов прикладных программ SPSS 8,0 и "Statistica 6,0" производился статистический анализ. Для всех данных определяли среднее арифметическое значение ( X ), среднее квадратическое отклонение ( S ), ошибку средней арифметической (m). Проверку гипотезы о статистической достоверности двух выборок проводили с помощью критерия Манна-Уитни. Для исследования силы взаимосвязей показателей вычислялся коэффициент корреляции. Достоверность различий коэффициентов корреляции оценивали с помощью Т-критерия Стьюдента. Результаты статистической обработки сведены в таблицах и использованы в рисунках.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Результаты иммунологических исследований показали, что во всех наблюдаемых возрастных группах детей с атопическим дерматитом изменения носят комбинированный характер. В иммунограмме отмечается повышенный удельный вес абсолютного и относительного содержания В-клеток с одновременным снижением процентного количества Т-кле-гок в периферической крови. Нарушения в Т-клеточном звене проявляются уменьшением содержания CD4+ и повышением абсолютного числа CD8+- клеток. При оценке гуморального звена иммунитета установлено повышение общего IgE во всех возрастных группах. Кроме того, у наблюдаемых детей имеет место снижение числа активных фагоцитов на фоне, сохраненной ими поглотительной способности.

Изучая ферментативную активность лимфоцитов крови у детей с атопическим дерматитом, выявили зависимость уровней активности исследуемых НАД-и НАДФ-зависимых дегидрогеназ от возраста наблюдаемых больных. Так, у больных младшего возраста изменения митохондриальной энергетики определяются высоким уровнем активности МДГ, НАДИЦДГ, НАДФИЦЦГ при выраженном уменьшении агтока ин-

термедиатов через Обр.НАДИЦДГ и Обр.ПАДФГДГ с лимонного цикла на реакции аминокислотного обмена. В то же время отмечается понижение интенсивности первых реакций гликолиза за счет снижения уровня анаэробной реакции ЛДГ, что сочетается с низкой активностью ГЗФДГ, поставляющей продукты катаболизма липидов на гликолиз.

Необходимо отметить, что только у детей раннего возраста установлена недостаточная активность Обр.МДГ. Это отрицательно сказывается на работе малатаспар-татного шунта. Снижение его работы отражается не только на энергетической функции митохондрий (через понижение поступления водорода в митохондрии), но и на состоя1ши окислительно-восстановительного потенциала цитоплазмы.

Кроме того, в данной возрастной группе выявлена высокая активность Г6ФДГ, осуществляющей ключевую реакцию пентозофосфатного цикла. При этом продуктом пентозофосфатного цикла являются рибозо-5-фосфат и НАДФН, которые используются для макромолекулярного синтеза ( Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф.,1998; Moritz В. et al„ 2000; Reddy G.B. et al., 2001).

В средней возрастной группе сохраняется высокий уровень Г6ФДГ, отмечается усиление субстратного потока по циклу Кребса за счет повышенной активности МДГ и увеличения поступления продуктов аминокислотного обмена в результате повышения НАД- и НАДФ-зависимого окислительного дезаминирования глутаминовой кислоты.

В то же время в данной возрастной группе, обращает внимание, увеличение значимости в биоэнергетических процессах вспомогательных и шунтирующих дегид-рогеназных реакций как доноров водорода в цикле трикарбоновых кислот, что отражает несостоятельность митохондриальной энергетики в иммунокомпетентных клетках.

Метаболический статус лимфоцитов у детей с атопическим дерматитом старшего возраста существенно отличается от метаболического состояния иммунокомпетентных клеток у больных раннего и среднего возраста. Ферментный профиль лимфоцитов у детей в старшей возрастной группе характеризуется, во-первых, снижением активности МДГ, НАДИЦДГ, НАДГДГ, что отражает низкую интенсивность субстратного потока по циклу трикарбоновых кислот в значительной степени определяющего функциональное состояние митохондрий. Кроме того, отмечается пониже-

ние шунтирования малик-ферментом медленных участков цикла Кребса и резкое падение уровня ГЗФДГ на фоне повышения активностей обратных ЛДГ и МДГ. Подобное состояние ферментативных реакций в иммунокомпетентных клетках характеризует превалирование анаэробных процессов над аэробными, что является энергетически менее выгодным. Во-вторых, ферментный профиль лимфоцитов характеризуется снижением уровня ключевой реакции пентозофосфатного цикла Г6ФДГ и, в связи с этим, возможным ингибированием рибозо-5-фосфат и НАДН-зависимых пластических процессов. В-трстьих, ферментный профиль лимфоцитов характеризуется понижением уровня реакции восстановления глутатиона. Между тем, доказано, что глута-тион играет основную роль в пролиферативной активности лимфоцитов ( Кнорре Д.Г., Мызина С.Д., 1998; Bailey S.M. et al., 2001; Richard M.J. et al., 2001).

Изучение активности оксидоредуктаз при экссудативной и при пролиферативной формах атонического дерматита позволило установить их принципиальные различия по внутриклеточным энергопродуцирующим и пластическим метаболическим реакциям в иммунокомпетентных клетках.

Экссудативная форма заболевания характеризуется снижением уровней анаэробных процессов ( понижение активности анаэробной реакции ЛДГ ) и повышением интенсивности субстратного потока по циклу трикарбоновых кислот (активация МДГ, НАДИЦДГ), а также высокой активности Г6ФДГ.

Изучение уровней активности НАД- и ФАД-зависимых дегидрогеназ лимфоцитов крови при пролиферативной форме атопического дерматита показало повышение уровня гликолиза (активация Обр. ЛДГ и Обр. МДГ ) и снижение аэробных процессов ( ингибированис СДГ, МДГ и НАДИЦДГ ), что сочеталось с резким падением активности Г6ФДГ.

Проведенный корреляционный анализ показал, что у больных атопическим дерматитом изменяется не только активность исследуемых оксидоредуктаз, но и их координированность в клетке, меняется взаимозависимость между ферментами, появляются новые связи, изменяется их направленность и интенсивность.

Обращают на себя внимание, возрастные различия корреляционных связей между исследуемыми энзимами в лимфоцитах крови. Так, в младшей возрастной группе выявляется значительное количество взаимосвязей между исследуемыми ферментами. При этом особенным для метаболизма лимфоцитов крови у детей данной возрас-

тной группы является полное выпадение из системы корреляционных связей МДГ и появление сильных положительных взаимосвязей ГР с ферментами, отражающими интенсивность пластических процессов в клетке- с Г6ФДГ (г=0,95 Р<0,001) и Обр. НАДГДГ ( г=0,93 Р<0,001 ), а также с оксидоредуктазами энергетического профиля -с ОбрЛДГ (г=0,88 Р<0,001) и ГЗФДГ (г=0,72 Р<0,001).

Корреляционная картина в лимфоцитах крови у больных средней возрастной группы характеризуется большим количеством взаимосвязей между исследуемыми оксидоредуктазами. Однако, в отличие от системы корреляционных связей у детей раннего возраста, в данной возрастной группе больных НАДФ-зависимые ферменты взаимосвязаны между собой более тесно.

У больных атопнческим дерматитом в старшей возрастной 1руппе уровень корреляционной зависимости между энзиматическими показателями по сравнению с корреляционной картиной у детей младшего и среднего возраста отличается снижением числа корреляционных связей и появлением конкурентных взаимоотношений между внутриклеточными компартментами.

Результаты корреляционного анализа показали у больных атоническим дерматитом тесные взаимосвязи ферментного статуса лимфоцитов с иммунологическими параметрами крови. При этом, следует отметить, что во всех исследуемых возрастных группах детей взаимозависимости между метаболическими показателями лимфоцитов и иммунологическими параметрами крови были самыми разнообразными и практически не определялось одинаковых корреляционных взаимосвязей между данными показателями.

Таким образом, полученные нами данные убедительно показали у больных атопическим дермапггом метаболическую несостоятельность иммунокомпетентных клеток, которая тесно взаимосвязана с клиническими проявлениями заболевания. Установленный нами механизм изменений метаболических процессов в иммунокомпетентных клетках у детей с атопическим дерматитом определяется нарушениями соотношения между уровнями активности пластических и биоэнергетических процессов, что приводит к появлению конкурентных взаимоотношений между цитоплазматиче-ским и митоходриальным компартментами лимфоцитов у больных атопическим дерматитом и, в конечном варианте, к нарушению соотношения между анаэробными и аэробными процессами.

Выявлена достоверная зависимость характера перестройки ферментного профиля лимфоцитов крови от клинической формы заболевания, что позволило определить метаболические типы нарушений в иммунокомпетентных клетках при экссуда-тивной и нролиферативной формах атопического дерматита у детей.

Наряду с этим установлено, что в период клинической ремиссии атопического дерматита активность НАД- и НАДФ-зависимых дегидрогеназ в лимфоцитах крови не восстанавливается до уровня, наблюдаемого у здоровых детей. Вероятно, данное обстоятельство является одной из возможных причин, обусловливающих рецидив заболевания, и может служить критерием для проведения метаболической иммунореа-билитации, направленной на восстановление внутриклеточного метаболизма иммунокомпетентных клеток.

В то же время, учитывая выявленную зависимость метаболических изменений в иммунокомпетептных клетках от возраста детей, клинической формы заболевания, метаболическая коррекция у больных атопическим дерматитом должна быть строго дифференцированной.

При экссудативной форме атопического дерматига для компенсации энергетического напряжения и сбалансированности взаимодействия пластических и энергетических функций иммунокомпетентных клеток использовали глицирам. При пролифе-ратнвной форме атопического дерматита для которой характерна шикая энергообеспеченность иммуноцитов, прежде всего за счет резкого снижения активности СДГ-маркерного фермента митохондрий на фоне сохранения компенсаторных метаболических возможностей клетки показана метаболическая коррекция янтарной кислотой. Результаты исследований показали положительное влияние этих препаратов на метаболические параметры иммунокомпетентных клеток и клинико-иммунологические показатели, как в ближайшем, так и отдаленном периодах наблюдения ( рис.1 ).

Так, у больных получавших глицирам происходит увеличение активности ГЗФДГ, что приводит к более насыщенному поступлению продуктов катаболизма липидов на гликолиз. Более полно потребляется наработанный пируват, так как снижается прямая реакция ЛДГ. Возрастает роль шунтирования медленных участков цикла Крсбса через повышение активности шунтирующего фермента НАДФМДГ. Повышается активность НАДИЦЦГ лимитирующей уровень реакций цикла трикар-боновых кислот (рис.2-5). В то же время снижение гиперактивности Г6ФДГ, ответст-

Дети с атоническим дерматитом Дети с атоническим дерматитом не

юлучившие курс метаболической терапии получавшие метаболической терапии

Рис. 1. Отдаленные клинические результаты иммунореабшштации

ш

□

стойкий клинический эффект в течение 12 месяцев уменьшение числа рецидивов заболевания состояние без перемен

мкЕ

15-

12

9"

3"

0

Ж

1

=¥

II

Г6ФДГ 11АДГДГ

Рис. 2. Динамика уровней активности НАД(Ф) - зависимых дегидрогеназ у больных атопическим дерматитом, получавших глицирам.

мкЕ

50

40

30

20

10

1

й

л +

ЛДГ

МДГ

Рис. 3. Динамика уровней активности НАД(Ф) - зависимых дегидрогеназ у больных атопическим дерматитом, получавших глицирам.

- контрольные показатели

- исходные показатели

- показатели через 0,5 месяца

- показатели через 3 месяца

- показатели через 6 месяцев

- показатели через 12 месяцев

* - достоверность различии с показателями контрольной группы;

6

- достоверность различий с показателями до лечения.

Рис. 4. Динамика уровней активности НАД(Ф) - зависимых дегидрогеназ у больных агоническим дерматитом, получавших глицирам.

Рис. 5. Динамика уровней активности НАД(Ф) - зависимых дегидрогеназ у больных атопическим дерматитом, получавших глицирам.

- контрольные показатели Щ - показатели через 3 месяца

- исходные показатели Щ - показатели через 6 месяцев

- показатели через 0,5 месяца - показатели через 12 месяцев ^ - достоверность различий с показателями контрольной группы; * - достоверность различий с показателями до лечения.

венной за наработку интермедиатов для реакций макромолекулярного синтеза на фоне повышения уровней энзимов биоэнергетической направленности предполагает повышение снабжения метаболитами энергетических структур лимфоцитов. Такое перераспределение ведет к усилению функциональной активности иммуноцитов.

В группе больных, не получавших глицирам, не отмечалось положительной динамики в изменениях энзиматических параметров при наблюдении через 1,5 мес.,3 мес. и 6 мес. относительно исходных данных и аналогичных показателей в контрольной группе. Так наблюдалась гиперактивация ключевого фермента пентозофосфатно-го цикла по сравнению с показателями контрольной группы на всем прагяжении наблюдения, отмечалось увеличение НАДГДГ в 3,2 раза по сравнению с контрольными данными. Оставался существешю повышенным уровень МДГ в течение динамического наблюдения по сравнению с данными контрольной группы. В то же время , как уровни ГЗФДГ и НАДФМДГ оставались значительно сниженными по сравнению с контрольными показателями (Рис. 6-9).

Результаты исследований метаболических параметров лимфоцитов крови у больных атопическим дерматитом получавших янтарную кислоту показали повышение активности МДГ. Более чем в 3 раза (Р<0,001) после лечения возрастала активность СДГ, в 2,9 раза увеличился уровень НАДИЦЦГ (Р<0,001). Подобные изменения активности энзимов лимонного цикла отражают повышение интенсивности субстратного потока в одном из наиболее важных внутриклеточных метаболических циклов и активацию аэробных энергетических процессов.

Активация субстратного потока по циклу трикарбоновых кислот в лимфоцитах крови у больных атопическим дерматитом после реабилитации янтарной кислотой определяется, во-первых, повышением уровня аэробной реакции ЛДГ, что, по-видимому, компенсирует в данной группе больных субстратную недостаточность гликолиза, во-вторых, более чем 3-кратным увеличением активности НАДГДГ, отражающей приток на реакции цикла Крсбса продуктов аминокислотного обмена.

Кроме того, после курса янтарной кислоты у детей с атопическим дерматитом повышалась активность Г6ФДГ, характеризующей не только высокий уровень окислительно-восстановительных реакций пентозофосфатного цикла, но и увеличение наработки интермедиатов для реакций макромолекулярного синтеза.

Результаты исследования активности изучаемых НАД- и ФАД-зависимых

мкЕ 15 12 9 61 3 О

Рис. 6.

И

I.

I

Г6ФДГ НАДГДГ

Дииамика уровней активности НАД(Ф) - зависимых дегидрогеназ у больных атопическим дерматитом, не получавших глицирам.

мкЕ

50

40

30

20

10

1

i

I

£

* *

1

1

лдг

мдг

Рис. 7. Динамика уровней активности НАД(Ф) - зависимых дегидрогеназ у больных атопическим дерматитом, не получавших глицирам.

- контрольные показатели

- исходные показатели

- показатели через 1,5 месяца

- показатели через 3 месяца

- показатели через 6 месяцев

- показатели через 12 месяцев

* - достоверность различий с показателями контрольной группы;

- достоверность различий с показателями до лечения.

мкЕ

4-

-I"

1

О

II

Ж

т*: ^ ^ аЦ

II

ГЗФДГ НАДФМДГ

Рис.8. Динамика уровней активности НАД(Ф) - зависимых дегидрогеназ у больных атопическим дерматигом, не получавших глицирам.

мкЕ 150 120 90. 6030-

1

Й1§!

.1 *

я *

1

Обр. лдг

Обр.МДГ

Рис. 9. Динамика уровней активности НАД(Ф) - зависимых дегидрогеназ у больных атопичсским дерматитом, не получавших глицирам.

- контрольные показатели

- исходные показатели

- показатели через 1,5 месяца

- показатели через 3 месяца

- показатели через 6 месяцев

- показатели через 12 месяцев

^ - достоверность различии с показателями контрольной группы; * - достоверность различий с показателями до лечения.

т5

дегидрогеназ лимфоцитов крови у больных не получавших янтарную кислоту , не выявили в динамике наблюдения статистически значимых различий в уровнях исследуемых оксидоредуктаз по сравнению с исходными показателями. Однако в данной группе больных отмечалось резкое падение уровней СДГ и НАДИЦДГ, а также понижение активности ЛДГ относительно параметров контрольной группы. Необходимо отметить, у больных не получавших янтарную кислоту сохранение на всем протяжении динамического наблюдения более высоких показателей ГЗФДГ и существенное повышение уровней анаэробной ЛДГ и Обр.МДГ но сравнению с контрольными данными.

Влияние глицирама и янтарной кислоты сказывается не только на уровне активности НАД- НАДФ-зависимых дегидрогеназ, но и на системе корреляционных связей, обнаруженных между исследуемыми ферментами. Во всех группах больных, получавших метаболическую терапию, установлено отчетливое снижение числа связей после лечения по сравнению с исходной корреляционной картиной до лечения. В то же время при сравнении показателей степени скоррелировашюсти и среднего коэффициента корреляции обнаружено, что после лечения отмечается более высокий средний коэффициент корреляции. Обращает на себя внимание большая однотипность фермент-ферментных взаимозависимостей после проведенного лечения в сравнении с исходными корреляционными связями до лечения.

Анализ полученных данных показал, что улучшение энзиматического статуса лимфоцитов крови отражает положительную динамику исследумых иммунологических показателей.

Результаты проведенных исследований продемонстрировали, что наиболее оптимальный метаболический статус в иммуноцитах отмечен через 3 месяца после одного курса проводимой метаболической терапии. Однако спустя 6 месяцев после проведенного лечения намечалась тенденция к нестабильности метаболического состояния иммунокомпетентных клеток, которая нарастала к 12 месяцам наблюдения. Это свидетельствует о необходимости курсового использования препаратов корригирующих клеточный обмен и целесообразности проведения повторного курса метаболической терапии через 6 месяцев после первого курса.

Сравнительное исследование установило, что в группе больных получивших два курса янтарной кислоты, в динамике наблюдения через 12 месяцев уровни актив-

ности исследуемых оксидоредуктаз, за исключением Обр.ЛДГ, соответствуют нормативным параметрам. В то время как метаболические показатели лимфоцитов крови в группе больных, получивших 1 курс янтарной кислоты, имели различия с контрольными величинами. Однако, следует отметить, что изменения исследуемых метаболических показателей в данной группе больных были менее существенными, чем исходные значения аналогичных показателей до лечения.

Между тем, в сравниваемых группах различия касались не только уровней активности исследуемых оксидоредуктаз, но и степени их скоррелированности в лимфоцитах, о чем свидетельствуют результаты проведенного корреляционного анализа. Так, установлено увеличение числа и разнообразия корреляционных связей между метаболическими параметрами в группе больных получивших один курс янтарной кислоты, что отражает напряженность реакций внутриклеточного метаболизма по сравнению с больными, получившими два курса янтарной кислоты. При этом, необходимо отметить, в группе больных, получивших два курса янтарной кислоты выраженную однотипность взаимодействий между исследуемыми дегидрогеназами.

Рис.10. Количество обострений Рис.И. Число дней болезни Рис.12. Длительность ремиссии (мес.)

Катамнестическое клиническое наблюдение позволило установить отдаленные положительные результаты метаболической иммунореабилитации у больных атопи-ческим дерматитом. Применение глицирама и янтарной кислоты в 2,77 (Р<0,001) раза удлиняло продолжительность клинической ремиссии, в 3,5 (Р<0,001) раза сокращало число дней болезни в году и в 3,73 (Р<0,001) раза снижало количество рецидивов заболевания (Рис.10-12). При этом, следует отметить, что клиническая эффективность метаболической реабилитации оказалась выше в группе больных получивших два курса метаболической терапии (91,67%±7,96) по сравнению с группой больных полу-

чивших один курс (75%± 2,5 Р<0,05).

Таким образом, результаты проведенного комплексного динамического наблюдения позволили установить нарушения энзиматического статуса лимфоцитов крови в период клинической ремиссии и разработать метаболические методы иммунореаби-литации, направленные на восстановление внутриклеточных обменных процессов в иммунокомпетентных клетках, которые как показали проведенные исследования имеют высокую клиническую эффективность.

ВЫВОДЫ

1. Показатели активности НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ, определяющих энергопродуцируюгцие процессы в митохондриях и уровни рибозо-5-фосфат и НАДН-зависимых реакций макромолекулярного синтеза в лимфоцитах крови объективно отражают клиническую картину атопического дерматита и зависят от возраста детей и варианта течения воспалительного процесса.

2. У больных атопическим дерматитом изменения в иммунном статусе, проявляются В-лимфоцитозом, снижением количества Т-клеток с нарушением их субпо-пуляционного состава, понижением содержания активно фагоцитирующих нейтро-фильных гранулоцитов и увеличением концентрации общего ^Е в сыворотке крови.

3. Возрастные изменения показателей ПАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ лимфоцитов крови выражаются у детей младшего возраста повышением активности Г6ФДГ, стимуляцией аэробного дыхания (повышение МДГ, НАДИЦДГ, НАДФИЦДГ) на фоне снижения анаэробной реакции ЛДГ и роли малатаспартатного шунта в энергетике клетки. В средней возрастной группе сохраняется высокий уровень Г6ФДГ, остается пониженной активность Обр. ЛДГ, а стимуляция ферментных реакций в митохондриях осуществляется за счет НАД- и НАДФ-зависимого окислительного дезаминирования глутамииовой кислоты. У больных старшего возраста отмечается резкое падение активности Г6ФДГ и преобладание анаэробного дыхания над аэробным, что энергетически является менее выгодным.

4. Ферментный профиль лимфоцитов крови при экссудативной форме атопического дерматита характеризуется стимулированием энергопродуцирующих реакций в митохондриях ( через МДГ, НАДИЦДГ ), снижением окисления продуктов обмена аминокислот ( через НАДГДГ ) в цикле трикарбоновых кислот, более полным потреблением наработанного пирувата (через ЛДГ) и увеличением наработки субстра-

тов для реакций макромолекулярного синтеза (через Г6ФДГ).

5. Энзиматические особенности лимфоцитов при пролиферативной форме заболевания определяются понижением субстратного потока по циклу трикарбоновых кислот ( снижение уровней МДГ, СДГ, НАДИЦЦГ ), повышением активности мала-таспартатного шунта, экономией пирувата за счет снижения активности обратной реакции ЛДГ, увеличением активности ГЗФДГ, что приводит к более насыщенному поступлению продуктов метаболизма липидов и жирных кислот на гликолиз и резким снижением уровня ключевой реакции пентозофосфатного цикла.

6. У больных атопическим дерматитом в период клинической ремиссии сохраняются нарушения энзиматического статуса иммунокомпетентных клеток, что является объективным критерием для проведения метаболической иммунореабилитации. При экссудативной форме атопического дерматита для коррекции нарушений внутриклеточного обмена иммунокомпетентных клеток показано применение глицирама. При пролиферативной форме заболевания для метаболической реабилитации целесообразно использовать янтарную кислоту.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ:

1. Учитывая установленные нами изменения активности НАД и НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ лимфоцитов крови в период клинической ремиссии, у больных атопическим дерматитом следует считать необходимым проведение метаболической реабилитации в данную фазу заболевания.

2. Целесообразно в качестве метаболического корректора при экссудативной форме у детей с атопическим дерматитом использовать глицирам, при пролиферативной форме заболевания назначать янтарную кислот.

3. При проведении метаболической реабилитации у больных атопическим дерматитом преимущество имеет курсовая терапия препаратами корригирующими внутриклеточной обмен иммунокомпетентных клеток. При этом повторный курс метаболической терапии необходимо проводить через 6 месяцев после первого курса.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Нейросетевая классификация лиц с аллергиями по уровню метаболических процессов в лимфоцитах // Тез. докл. 3 Всероссийского рабочего семинара "Нейроин-форматика и ее приложения". - Красноярск, 1995.-С.47 ( в соавт. с A.A. Савченко, Д.А. Россиевым ).

2. Нсйросетевая классификация по активности внутриклеточных ферментов в лимфоцитах // Тр. межрегиональной конференции "Проблемы информатизации региона".- Красноярск Д995.-С.479 ( в соавт. Д.А. Россиев, A.A. Савченко ).

3. Хемилюминесцентный анализ функциональной активности лейкоцитов крови у детей с рецидивирующим обструктивным бронхитом и атопическим дерматитом // Патол.физиол. и эксперим.терапия.-1997.-№ 2.-С.32-34 ( в соавт. с JI.M. Куртасовой, A.A. Савченко).

4.Информативность хемилюминесцентного анализа функциональной активности лейкоцитов крови у детей с респираторными вирусными инфекциями, рецидивирующим обструктивным бронхитом и атопическим дерматитом // Журн. инфекционной натологии.-1997- № 2-3.-С.34-37 ( в соавт. с JI.M. Куртасовой, A.A. Савченко).

5. Оценка функциональной активности лейкоцитов крови у детей с иммунопатологическими состояниями с помощью хемилюминесцентного анализа // Бюлл. лабораторной службы.,1998.-№6.-С.37-44 (в соавт. Л.М. Куртасовой, A.A. Савченко, Г.Б. Сургутской).

6. Иммунологические показатели крови и активность НАД(Ф)-зависимых дегидро-геназ лимфоцитов у детей с аллергическими заболеваниями // Вестник новых медицинских технологий,-1999.-Т.6, № 1.-С.46-49. ( в соавт. с Д.А. Россиевым, A.A. Савченко).

7. Метаболическая активность иммунокомнегентных клеток крови у больных атопическим дерматитом // Медицинская иммунология.-2001.-Т.З, № 2.-С.165 ( в соавт. с Л.М. Куртасовой, A.A. Савченко).

8. Особенности хемилюминесцентного ответа нейтрофильных гранулоцитов крови у больных атопическим дерматитом // Север-Человек: Проблемы сохранения здоровья. Тез. докл. Всероссийской научной конференции с международным участием. -Красноярск, 2001.- С.255-257 (в соавт. с Л.М. Куртасовой, A.A. Савченко).

9. Применение биолюминесцентного метода оценки активности НАД- и НАДФ-зависимых дегидрогеназ лимфоцитов крови в клинической практике // Методические рекомендации для врачей. - Красноярск, 2002.-22с. ( в соавт. с Л.М. Куртасовой, A.A. Савченко).

СПИСОК СОКРАЩЕНИИ

АТФ - аденозинтрифосфат

ГЗФДГ - глицерол-3-фосфатдегидрогеназа (НАД-зависимая)

аГЗФДГ - глицерол-3-фосфатдегидрогеназа (ФАД-зависимая)

Г6ФДГ - глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа

ГР -глутатионредуктаза

ЛДГ - лактатдегидрогеназа

МДГ - малатдегидрогеназа

НАД - иикотинамиддинуклеогид

НАДГДГ - НАД-зависимая глутаматдегидрогеназа

НАДФГДГ - НАДФ -зависимая глутаматдегидрогеназа

НАДИЦДГ - НАД-зависимая изощпратдегидрогеназа

НАДФИДДГ - НАДФ-зависимая изощпратдегидрогеназа

НАДФМДГ - НАДФ-зависимая декарбоксилирующая малатдегидрогена за

(малик - фермент)

НАДФГДГ - НАДФ-зависимая глутаматдегидрогеназа

Обр.ЛДГ - обратная лактатдегидрогеназа

Обр.МДГ - обратная малатдегидрогеназа

Обр.НАДГДГ - обратная НАД-зависимая глутаматдегидрогеназа

Обр.НАДФГДГ - обратная НАДФ-зависимая глутаматдегидрогеназа

СДГ - сукцинатдегидрогеназа

ГР - глутатионредуктаза

ФИ - фагоцитарный индекс

ФЧ - фагоцитарное число

ЦИК - циркулирующие иммунные комплексы

1ц А - иммуноглобулины класса А

Е - иммуноглобулины класса Е

1§ в - иммуноглобулины класса в

^ М - иммуноглобулины класса М