Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Энергетический обмен и метаболическая функция печени при адаптации организма к холоду

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ РЕГИОНАЛЬНОЙ ПАТОЛОГИИ И ПАТОМОРФОЛОГИИ

?Г6 ОД

У 3 ф£3 13е:? На правах рукописи

КОЛПАКОВ Аркадий Ростиславович

ЭНЕРГЕТИЧЕСКИЙ ОБМЕН И МЕТАБОЛИЧЕСКАЯ ФУНКЦИЯ ПЕЧЕНИ ПРИ АДАПТАЦИИ ОРГАНИЗМА К ХОЛОДУ

14.00.16 - патологическая физиология 03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Новосибирск -1997

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте биохимии Сибирского отделения РАМН (Новосибирск)

Научный консультант:

Академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор Л.Б.Панин

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор А.В.Ефремов доктор медицинских наук, профессор В.Ю.Куликов доктор медицинских наук, профессор Т.А.Короленко

Защита диссертации состоится 1997 г.

в ¿О час, на заседании Диссертационного^совета Д 001.40.01 в НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН (630117, Новосибирск, ул. Академика Тимакова, 2; тел.: 8-(383-2)-32-31-56, факс: 8-(3832)-32-43-39

С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН

Автореферат диссертации разослан .¿А 1997 г.

Ведущая организация: Российская медицинская академия последипломного образования МЗ РФ

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д 001.40.01 доктор биологических наук

Е.Л.Лушникова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Действие на организм низких температур является одним из важнейших неантропогенных факторов, в значительной степени определяющим зоны проживания и характер жизнедеятельности людей в средних и высоких широтах. Даже кратковременное воздействие низких температур небезразлично для человека, длительное пребывание в условиях холода может привести к серьезным нарушениям функций организма (Gyilerap S. et al., 1993).

История изучения механизмов адаптации к холоду насчитывает много десятилетий, однако с углублением знаний в этой области и усилением методической базы науки перед исследователями встают все новые вопросы к появляются новые возможности их решения.

Исследования воздействии холода на организм человека всегда связаны с трудностями организационного и этического характера. Кроме того, на определяемые показатели неизбежно оказывают влияние факторы, отличающиеся между собой по механизму воздействия, такие, как физические нагрузки, характер питания, изменения светопериодики и другие (Reed H.L. et al. 1990). Это приводит к значительному сужению круга решаемых задач, и работ, в которых представлены результаты комплексных исследований, немного (Панин Л.Е., 1978, 1983;Тигранян Р.А., 1990; Куликов В.Ю., 1994).

Проведенные сотрудниками НИИ биохимии СО РАМН обследования зимовщиков Антарктиды и дрейфующих станций, участников высокоширотных экспедиций и жителей Крайнего Севера выявили значительные отличия всех видов обмена веществ от "среднестатистического стандарта". В результате этих исследований был выделен и описан "полярный метаболический тип", который характеризуется в первую очередь усилением лилидного и снижением углеводного обмена (Панин JI.E., 1978, 1983).

Активация липидного обмена сопровождается значительными эндокринно-метаболическими изменениями, в том числе и содержания различных фракций сывороточных липопротеинов. Роль этих высокомолекулярных частиц в адаптивных процессах остается малоизученной, но исследования последних лет обнаружили способность белковых компонентов липопротеинов - апопро-теинов - оказывать влияние на регуляторные процессы в клетке (Панин Л.Е и др., 1991,1995).

В биохимических исследованиях, проводимых у человека, для изучения доступны лишь жидкие среды организма. Биопсия. органов, проводимая у'больных по строгим показаниям (Trijbels J.M.F.

et al., 1988), является не правилом, а исключением при обследовании здоровых людей (Rusko Н. et al., 1980). За пределами допустимых экспериментов на людях-доброволыдах на помощь приходят математические модели (Holmer I., 1995) и эксперименты на животных.

В настоящее время изучение механизмов адаптации к холоду в эксперименте проводится на двух основных моделях: Харта - при постоянном длительном содержании животных при +5°С (Hart J.S., Jansky L., 1963) и Леблана - многократных, но коротких воздействиях холода (-20°С) (LeBlanc J., 1967). Одновременно существует большое количество вариантов этих моделей. Сложность интерпретации полученных в различных лабораториях данных состоит в том, что механизмы развития устойчивости к холоду в этих моделях отличаются между собой (LeBlanc J., 1992). Кроме того, исследования проводятся на разных видах животных и при различных сроках холодового воздействия (Banet М., 1988). Однако достаточно редко встречаются работы, в которых прослеживаются изменения организма в динамике процесса адаптации. Зачастую отличается и физиологическое состояние животных на момент взятия материала для исследований (Панов A.B., 1984). Поэн'му возникает необходимость проследить в стандартных условиях на животных одной линии процесс становления устойчивости организма к холоду.

Одна из центральных ролей в обеспечении энергетических потребностей организма при действии на него низких температур принадлежит печени, ее вклад в термогенез может достигать 25% дополнительной теплопродукции (Jansky L., 1971). Но данные о влиянии низких температур на энергетическое состояние печени неоднозначны и противоречивы, что может быть следствием методических особенностей проводимых экспериментов. Кроме того, обычно авторы ограничиваются в своих исследованиях митохондриаль-ным уровнем, не давая оценки эффективности адаптивных перестроек энергетических процессов на уровне организма.

Соотношением специфических и терморегуляторной функций органов в значительной степени определяется цена, которой организм расплачивается за развитие устойчивости к холоду (Панин Л.Е., 1978). Но вопрос о состоянии метаболических функций печени, в частности, способности к биотрансформации эндо- и ксенобиотиков на разных этапах адаптации к холоду, остается открытым. Имеющиеся экспериментальные данные о монооксигеназной системе печени, участвующей в I фазе метаболизма многих физиологически активных соединений, получены при различных

сроках и режимах низкотемпературного воздействия и поэтому достаточно противоречивы и не отражают динамики процесса холодовой адаптации (Семенюк А.В. и др., 1983; Matsuyama К. et al., 1983). Работ, посвященных изучению II фазы метаболизма в условиях холодового воздействия на организм, в литературе мы не встретили.

До сих пор остается спорным вопрос, в какой мере эффекты холодового воздействия, обнаруживаемые на изолированных органел-лах, отражают состояние энергетических процессов в целом организме. Параллельные исследования на субклеточных структурах и интактных клетках могут существенно помочь в отделении артефактов от подлинных процессов, протекающих in vivo.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение состояния энергетического обмена организма и участия печени в развитии метаболической адаптации к холоду, а также исследование связи между явлениями, регистрируемыми in vitro, с процессами, происходящими на уровне целого организма.

В ходе исследований предстояло решить следующие задачи:

1. Оценить состояние эндокринно-метаболических процессов у человека при длительном воздействии холода и у экспериментальных животных на модели Харта в различные сроки адаптации.

2. Оценить функциональное состояние митохондрий печени крыс в динамике холодовой адаптации.

3. Изучить роль переносчика адениннуклеотидов в регуляции ионного транспорта и энергозависимых функций митохондрий печени при воздействии холода на крыс.

4. Оценить состояние основных кислородпотребляющих процессов в печени в различные сроки холодового воздействия.

5. Изучить влияние длительного холодового воздействия на мо-нооксигеназную систему печени, на I и II фазы биотрансформации ксенобиотиков.

6. Исследовать связь между явлениями, регистрируемыми in vitro, с процессами, происходящими на уровне целого организма, сопоставив изменения электрического трансмембранного потенциала митохондрий (АЧР) и физико-химического состояния мембран митохондрий печени с ДО и состоянием мембран тимоцитов и трансмембранным электрическим потенциалом клеток периферической крови (лейкоцитов) в динамике адаптации к холоду.

Диссертация выполнена в соответствии с планом научно-исследовательской работы по теме: "Изучить роль адениннуклеотид-

транслоказы и сывороточных липопротеинов в регуляции энергетического обмена в печени при адаптации к холоду". Номер государственной регистрации 01.9.10 049382.

Научная новизна. Впервые на различных этапах арктического лыжного перехода проведены комплексные биохимические исследования с использованием нагрузочных проб, что позволило выявить изменения характера реагирования эндокринно-метаболических систем на охлаждение и физические нагрузки в течение похода, обнаружить уменьшение специфичности ответных реакций и расширение числа компонентов, включающихся в эти реакции.

Впервые в эксперименте проведены комплексные биохимические исследования динамики процесса холодовой адаптации с акцентом на энергетику печени и сопоставление полученных данных с показателями состояния других систем организма. Выделены и прослежены фазы адаптивного процесса: начальная (1-8 сутки), критический период (9-15 сутки), фаза неустойчивой адаптации (3-4 недели), фаза устойчивой адаптации (5-7 недели), отличающиеся соотношением катаболических и анаболических процессов.

Впервые показано, что в различные фазы адаптации к холоду имеются характерные изменения активностей кислородпогреб-ляющих систем печени. Установлено, что наибольший вклад в усиление использования кислорода в течение всего адаптационного процесса вносит митохондриальное окисление, в критический период возрастает НАДФ Н-оксидазная активность эндоплазмагиче-ского ретикулума, не было обнаружено заметного усиления пере-кисных процессов, за исключением повышения ПОЛ в митохондриях в начальную фазу.

Впервые получены данные, показывающие изменения энергетического состояния печени крыс в динамике адаптации к холоду. Установлено, что на 10 сутки воздействия холода печень находится в низкоэнергетическом состоянии с низким содержанием АТФ и суммы адениннуклеотидов. В митохондриях снижаются дыхательный контроль и трансмембранный электрический потенциал, повышается ионная проводимость внутренних мембран, вследствие чего возрастает теплопродукция. Митохондрии печени адаптированных к холоду животных поддерживают содержание АТФ и пула адениннуклеотидов на уровне контроля, однако по ряду свойств они отличаются от митохондрий контрольных животных.

Впервые в эксперименте показана возможность участия аденин-нуклеотидтранслоказы (АНТ} в терморегуляторном ответе мито-

хондрий печени крыс, адаптируемых к холоду. Получены данные об участии длинноцепочечных ацил-КоА в увеличении катионной проницаемости митохондриальных мембран в результате взаимодействия с АНТ.

Впервые проведенные измерения и сопоставление трансмембранных потенциалов митохондрий печени, тимоцитов и лейкоцитов крови обнаружили однонаправленность изменений этих показателей в динамике холодовой адаптации, что является вкладом в решение методологической проблемы соотношения исследований in vitro и in vivo.

В проведенных впервые комплексных исследованиях активности ферментов I и II фаз метаболизма ксенобиотиков в различные сроки холодового воздействия выявлено усиление элиминации тест-препаратов в начальной фазе и в критический период адаптивного процесса.

В динамике адаптации показано увеличение содержания цито-хромов Р450 и Ъ5 в микросомах печени. Впервые при отсутствии экзогенных индукторов получены свидетельства изменения активности отдельных изоформ цитохрома Р450 в результате действия холода.

Впервые показано, что в различные фазы адаптации к холоду при одинаковой флотационной способности липопротеины отличаются величиной заряда, вязкостью липидов, белок-липидными взаимодействиями. Обнаруженные закономерные, обусловленные холодовым воздействием физико-химические перестройки плазменных липопротеинов объясняют изменения рецепторного захвата ли-попротеиновых частиц, и их регуляторного эффекта на метаболизм и ультраструктуры клетки, наблюдающиеся в условиях функционального напряжения организма.

Научно-практическая значимость. Исследования носят, в основном, фундаментальный характер. Проведение комплексных исследований в различные фазы адаптивного процесса дает возможность сопоставить результаты различных исследователей в области адаптации к холоду и объяснить некоторые имеющиеся противоречия.

Результаты исследований, показавших совпадение характера изменений трансмембранных потенциалов митохондрий печени и лейкоцитов, позволяют рекомендовать метод оценки трансмембранного потенциала лейкоцитов для апробации в клинике при диагностике заболеваний, связанных с нарушением митохондриальных функций, в частности, миопатий.

Обнаружение изменений физико-химических свойств сывороточных липопротеинов в условиях физиологических воздействий холода открывают новый подход к изучению региональных особенностей развития атеросклероза.

Данные об изменении скорости элиминации ксенобиотиков в условиях холодового воздействия необходимы для проведения рациональной фармакотерапии у лиц с различными сроками пребывания на Севере.

Обнаружение повышения в условиях холодового воздействия активности изоформ семейства цитохрома Р4501А, ответственных за канцерогенез, ставит вопрос о продолжении исследований для выяснения биологической значимости феномена.

Результаты исследований, касающиеся механизмов реагирования человека на продолжительное действие холода и физические нагрузки, могут быть полезными при планировании, подготовке и проведении высокоширотных экспедиций, выборе оптимальных режимов работы в условиях среды с пониженной температурой.

Положения, выносимые на защиту

1. Продолжительное воздействие холода и интенсивных физических нагрузок на человека вызывает закономерные изменения показателей базального метаболизма, которые проявляются повышением содержания катехоламинов и усилением липидного обмена. Регуляторные системы организма становятся более лабильными, а метаболические реакции генерализованными, что направлено на лучшее приспособление организма к высоким энергозатратам в условиях действия холода и физических нагрузок.

2. Процесс адаптации к длительному воздействию умеренно низких температур (модель Харта) носит фазовый характер и включает фазу острой адаптации, критический период, фазы неустойчивой и устойчивой адаптации. Фазы определяются соотношением катаболических и анаболических процессов. Механизмы, восполняющие энергозатраты организма, находятся под контролем адаптивных гормонов (катехоламины и тирео-идные гормоны) и в разные периоды отличаются между собой.

3. Увеличение потребления кислорода в печени в различные фазы адаптивного процесса, в основном, обусловлено возросшей активностью митохондриального окисления. Дополнительный вклад в повышение использования кислорода вносят в фазу острой адаптации перекисные процессы в митохондриях, в критический период и в фазу неустойчивой адаптации - активация НАДФН-зависимого окисления в системе эндоплазматического ретикулума.

4. В критический период митохондрии печени крыс претерпевают изменения, повышающие их вклад в термогенез. Адаптация к холоду переводит печень в стабильное энергетическое состояние, которое на фоне возросших энергозатрат обеспечивается повышением окислительной способности митохондрий и увеличением их трансмембранного потенциала. Митохондрии печени адаптированных крыс, имея сходные показатели скоростей дыхания с митохондриями контрольных животных, отличаются более высокой энерги-зацией.

5. В критический период адаптации адениннуклеотидтранслоказа участвует в формировании неспецифической катионной поры, повышающей проницаемость внутренней мембраны митохондрий и увеличивающей диссипацию энергии.

6. Интенсификация обменных процессов, направленных на повышение энергопродукции в условиях воздействия холода на организм, вызывает закономерные изменения способности печени к биотрансформации биологически активных веществ; в критический период активность ферментов, метаболизирующих эндо- и ксенобиотики, возрастает.

7. Усиление использования липидов при адаптации организма к низким температурам сопровождается стойким увеличением содержания в крови ЛПОНП и ЛПНП. Липопротеины сыворотки крови адаптируемых к холоду крыс, имея с липопротеинами контрольных животных одинаковые флотационые характеристики, отличаются от них величинами зарядов, вязкостью липидов, характером белок-липидных взаимодействий.

8. Направленность изменений трансмембранного электрического потенциала (Д*Р) интактных клеток периферической крови и ти-моцитов при адаптации экспериментальных животных совпадает в.. -целом с динамикой ДН* митохондрий печени, отражая общее состояние биоэнергетических процессов в организме.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на II Всесоюзной конференции "Важнейшие теоретические и практические вопросы терморегуляции", Минск, 1986; XI Всесоюзном симпозиуме "Биологические проблемы Севера", Якутск, 1986; IV Всесоюзной научной конференции "Адаптация человека к климато-географическим условиям и первичная профилактика", Новосибирск, 1986; Республиканском симпозиуме "Особенности липид-ного обмена в условиях Сибири и Дальнего Востока", Чита, 1987; Всесоюзном симпозиуме по биохимии липидов, Алма-Ата, 1987; IV Всесоюзном Съезде патофизиологов "Нарушение механизмов ре-

гуляции и их коррекция", Кишинев, 1989; Всесоюзной конференции памяти А.Д.Слонима "Система терморегуляции при адаптации организма к факторам среды", Новосибирск, 1990; VIII Международном конгрессе по приполярной медицине, Канада, 1990; Организационном Международном конгрессе по патологической физиологии, Москва, 1991; ХХШ сессии Общего собрания СО РАМН, Новосибирск, 1992; Республиканском симпозиуме "Монооксигеназная система. Теоретические и прикладные аспекты", Ташкент, 1992; IX международном симпозиуме "Microsomes and Drug Oxidation", Израиль, 1992; IV конференции "Биоантиоксидант", Москва, 1993; V Европейской конференции ISSX, Франция, 1993; VII Всероссийском симпозиуме "Эколого-физиологические проблемы адаптации", Москва, 1994; II Съезде физиологов Сибири и Дальнего Востока, Новосибирск, 1995; X Международном конгрессе по приполярной медицине, США, 1996.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 39 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 364 страницах машинописного текста. Состоит из введения и 4-х глав, включающих обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов и выводов. Список литературы включает 217 отечественных и 295 зарубежных работ. Диссертация иллюстрирована 30 таблицами и 35 рисунками.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Изучение метаболических реакций на холод у человека.

Влияние постоянного холодового воздействия на метаболические реакции у человека прослежено на участниках тренировочного лыжного похода экспедиции газеты "Комсомольская правда" в районе Воркуты. Продолжительность перехода 18 суток, протяженность маршрута 350 км. Температура воздуха без учета ветровой нагрузки составила -36 -38° С, температура в палатке - на 5-6 градусов выше. В течение суток лыжники совершали 5-8 часовых переходов. Большая физическая нагрузка приводила к локальному перегреву, усилению потоотделения и ухудшению изолирующих свойств одежды. Вес рюкзаков составлял 32-35 кг. Обследовано 19 человек, средний возраст 31,6±1,5 года. Обследование проведено в три этапа: до похода, через 10 дней похода и сразу после его окончания. Были выделены следующие варианты исследований:

1)"Тепло, покой". Состояние, приближенное к основному обмену. До похода - состояние 1, после похода - состояние 6. Испытуемые в плавках находились в состоянии покоя в течение часа в помещении при температуре воздуха +26° С.

2)"Тепло, физическая нагрузка". При температуре +26° С испытуемый в течение 5 минут выполнял степ-тест: 20 подъемов в минуту на ступеньку высотой 22,5 см. До похода - состояние 2, после похода - состояние 7.

3)"Холод, покой". Испытуемый переходил в помещение с температурой воздуха +13° С и находился там в состоянии покоя в течение часа. До похода - состояние 3, после похода - состояние 8.

4)"Холод, физическая нагрузка". Выполнение степ-теста при +13°С. До похода - состояние 4, после похода - состояние 9.

Кровь брали из локтевой вены в конце каждого периода. . Все исследования проводились в утренние часы натощак. Взятие крови в середине похода проводилось в палатке, после ночного сна, и это состояние с определенной долей условности может быть приравнено к состоянию "Холод, покой" (состояние 5).

Обследование пловцов - членов Ассоциации марафонского зимнего плавания проводилось в октябре-ноябре 1991г. на озере Иссык-Куль. Взятие крови проводилось в утренние часы до и после тренировочного заплыва (температура воды 8-10° С). Интенсивность плавательной нагрузки подбиралась индивидуально и составляла 60-70% от максимальной. Длительность пребывания в воде колебалась от 20 минут до 1,5 часа. Обследовано 19 человек.

2. Эксперименты на животных.

Исследования проведены на крысах-самцах Wistar массой 180 -250 граммов в модели длительной адаптации к холоду по Харту (Hart J.S., Jansky L., 1963). Животные находились в индивидуальных металлических клетках: опытные - при температуре +5° С, контрольные - при +25° С. В клетках поддерживался световой режим: 12 часов свет - 12 часов темнота. Крысы содержались на стандартном сбалансированном рационе, кормление осуществлялось два раза в сутки в течение одного часа в 9 и 19 часов. Вода ad libitum. В экспериментах для выделения микросом использовали животных после 18 часового голодания, для выделения митохондрий "сытых" - взятых в опыт через 4 часа после отнятия кормушки. Температуру тела измеряли в прямой кишке электротермометром ТПЭН-1 в одно и то же время суток (утром).

Животные были взяты в эксперимент через 1, 5, 10, 15,21,28, 35, 42 и 49 суток пребывания на холоде одновременно с кон-

трольными животными. Небольшая серия экспериментов была проведена при коротком холодовом воздействии: 2 и 5 часов. При исследовании метаболической функции in vivo мы увеличили интервал в начальный период холодовой адаптации (1, 8, 15 суток) для уменьшения влияния последствий взятия крови.

Материал обрабатывался с использованием следующих методов:

1.Содержаниекатехоламинов в сыворотке ив моче определяли флюорометрически (Меньшиков В.В., 1974).

2. Определение содержания кортикостерона в плазме крови крыс проводили методом конкурентного связывания гормона белками без предварительной экстракции (Тинников А.А., Бажан Н.М., 1984).

3. Содержание других гормонов определяли с помощью стандартных радиоиммунных наборов.

4. Определение скорости гликолиза в гемолизате эритроцитов участников похода, в печени и мышце бедра крыс проводили по методу Т.А.Третьяковой и Л.Е.Панина (1978), позволяющему оценить состояние лимитирующих звеньев.

5. Содержание глюкозы в сыворотке крови людей определяли орто-толуидиновым методом, в крови животных глюкозоокси-дазным методом с помощью наборов "Новоглюк".

6. Определение гликогена в печени проводили по методу F.B.Lima et al. (1981) после фиксации ткани в жидком азоте.

7. Определение неэстерифицированных жирных кислот в плазме проводили по модифицированному методу W.G.Duncombe(1969).

8. Для определения содержания триглицеридов и холестерина использовали стандартные наборы реактивов "Био-Ла-Тест".

9. Определение содержания ацетона и эндогенного этанола в сыворотке крови проводилось хроматографически по методике, описанной С.И.Шишкиным с соавт. (1988).

10. Митохондрии печени выделяли по методу E.C.Weinbach (1961).

11. Потребление кислорода определяли полярографически (Кон-драшова М.Н. и др., 1973).

12. Белок измеряли по методу Лоури (Lowry О.Н. et al., 1951).

13. Трансмембранный электрический потенциал тимоцитов и лейкоцитов, а также на внутренней мембране изолированных митохондрий определяли с помощью проникающего зонда-катиона: 4-(п-диметиламиностирил)-1-метилпиридиния (ДСМ) (Добрецов Г.Е., 1989; Косников В.В.,1990).

14. Поглощение митохондриями ионов кальция определяли рН-метрически (Rossi G.S. et al., 1969) с помощью иономера ЭВ-74.

15. Катионную проницаемость внутренней мембраны митохондрий оценивали спектрофотометрически по изменению оптической плотности суспензии органелл при 546 нм (Brierley G.P., 1970; Панов A.B. и др., 1980).

16. Протонная проводимость внутренней мембраны митохондрий изучалась также в условиях анаэробиоза по методу P.Mitchell, J.Moyle (1968).

17. Общий энергетический статус печени оценивали по состоянию системы адениннуклеотидов in vivo методом, носящим название Freeze clampsing method и подробно описанным в работе R.P.Faupel et al. (1972).

18. Содержание адениннуклеотидов после кислотной экстракции определяли энзиматически (Hohorst Y.J. et al., 1959) на спектро-флюориметре MPF-4 фирмы Hitachi (Япония).

19. Функциональную активность монооксигеназ печени in vivo оценивали по фармакокинетике антипирина и по содержанию метаболитов антипирина в моче, определяемых методом об-ращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (оф-ВЭЖХ) с ультрафиолетовой детекцией на хроматографе "Мшшхром-1А" (Рахманов И.А. с соавт., 1989). Антипирин вводили внутрибрюшинно в дозе 18 мг/ кг массы животного (Аширметов А.Х., Краковский М.Э., 1990). Кровь брали из хвоста через 1; 1,5; 2,5 и 3 часа.

20. Микросомы были выделены методом дифференциального центрифугирования (Tata J.R., 1969). Среда выделения 150 шМ KCl, 10 mM трис-HCI, (pH 7,4).

21. Цитохромы Р-450 и Ь5 определяли по методам, описанным T.O.Omura, R.S.Sato, (1964).

22. Активность НАДФН-цитохром с (Р 450) редуктазы, НАД Н-цитохром с редуктазы и НАД Н-цитохром Ь5 редуктазы определяли по E.G.Hrycay et al. (1975).

23. Изучение II фазы биотрансформации проводили с использованием изониазида как маркера активности ацетилирования. Изо-ниазид вводили внутрибрюшинно в дозе 100 мг/кг. Кровь брали из хвостовой вены через 1,5; 2; 2,5 и 3 часа. Концентрацию изониазида в плазме определяли по методу А.В.Морозова с соавт. (1991).

24. Липопротеины (ЛП) сыворотки крови крыс получали методом дифференциального центрифугирования (Havel R.J. et al., 1955) на ультрацентрифуге "Beckman", модель L5-75, при 140 000 g.

25. Процентное содержание ЛП определяли методом элюирова-ния участков диск-электрофореграмм тритоном Х-100 (Маграче-ва Е.Я., 1973; Поляков Л.М., Панин Л.Е., 1975).

26. Содержание суммарной фракции ЛПОНП и ЛПНП в сыворотке крови определяли турбидиметрическим методом (Климов А.Н. и др., 1966).

27. Физико-химические свойства ЛП исследовали флуоресцентными методам, описанными в монографии Г.Е.Добрецова (1989).

28.Тимоциты выделяли по стандартной методике (Коношенко Г.И., МоховаЕ.Н., 1983).

29. Для выделения лейкоцитов из крови крыс был использован метод, предложенный P.Eggleton et al. (1989).

30. .Определение МДА и диеновых конъюгатов проводили спек-трофотометрически (Каган В.Е. и др., 1986).

31.Содержание токоферола определяли флуорометрическим методом (Teylor S.L. et al., 1976).

Все измерения флуоресценции выполнены на спектрофлуоримет-ре MPF-4 Hitachi (Япония) в круглой кювете диаметром 0.5 см. Спектрофотометрические - на спектрофотометрах Hitachi-556, 557.

Экспериментальные данные обрабатывали статистически с использованием простого и парного критериев Стьюдента и непараметрических методов (критерия Колмогорова-Смирнова, Фишера, критерия знака). Корреляционный анализ проведен с использованием пакета программ "Microstat" на IBM PC/XT.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение эндокринно-метаболических реакций на холод у человека

Участники лыжного похода в течение 18 суток находились под воздействием холода и интенсивных физических нагрузок. Поэтому схема обследования была составлена с расчетом обнаружения действия каждого из этих факторов на организм.

Проведенные исследования выявили закономерные особенности эндокринно-метаболических показателей в каждом указанном физиологическом состоянии, которые зависили от характера реакций на предъявляемую нагрузку.

Степ-тест в условиях температурного комфорта до похода (состояние 2) вызывал, по сравнению с состоянием покоя, повышение содержания адреналина и кортизола в крови, а также суммарных ЛП. Несколько снижалось содержание лактата, что объясняется увеличением его поглощения работающими мышцами.

Умеренное охлаждение (состояние 3) приводило к значительному увеличению содержания норадреналина, а также НЭЖК и пирува-та. Увеличение содержания в крови НЭЖК свидетельствует о подключении более энергоемких субстратов для получения необходимого количества энергии в условиях пребывания на холоде.

Сочетанное воздействие холода и физической нагрузки (состояние 4) приводило к повышению содержания в крови катехолами-нов, ТТГ, МДА, ХС, суммарных ЛПОНП и ЛПНП. Об усилении углеводного и липидного обменов свидетельствуют положительные корреляционные связи между НЭЖК и лактатом (г= 0,505), НЭЖК и ПВК (г = 0,603), между адреналином и лактатом (г = 0,508).

Таким образом, наши данные показывают, что метаболические сдвиги в ответ на физическую нагрузку в условиях температурного комфорта в наибольшей степени обусловлены действием адреналина, тогда как ответная реакция на холод контролируется, в основном, норадреналином.

Для состояния 5 характерно очень высокое содержание в крови СТГ, кортизола, суммарных катехоламинов, в основном, за счет адреналина - показатель высокого уровня обменных процессов и напряжения эндокринной системы на 10 сутки постоянного холо-дового воздействия. Значительно снижалось содержание суммарных ЛП, что можно рассматривать как результат многодневного перехода, в условиях которого повышено использование высокоэнергетических субстратов липидной природы. В спектре ЛП произошло увеличение ЛПВП. Таким образом, в состоянии 5 прослеживаются реакции на постоянное воздействие холода и нагрузок, направленные на усиление энергообеспечения человека в условиях похода.

Исследования, проведенные сразу после похода, позволили зафиксировать многообразную перестройку гормонально-метаболических реакций человека, основной чертой которых является их направленность на обеспечение энергией всех жизненно важных функций. На рис. 1 приведено сравнение метаболических показателей в состояниях, приближенных к основному обмену, до похода (состояние 1) и после него (состояние 6). Изучавшиеся параметры представлены в условных величинах, за единицу приняты показатели в первом метаболическом состоянии. Достоверная разница между показателями отмечена как Р<0,05.

Даже в состоянии физического покоя и температурного комфорта в крови лыжников поддерживается высокое содержание катехоламинов, что отражает специфическую адаптивную реакцию сйм-

Р<0.05 Сумма КАЧ

Р<0.05

ТГ\ ох\ \ м

Р<0.05 НЭЖК N ч

ч\

Р<0.05 Сум. ЛП л^^ \

ЛПВПЗ Р<0.05 ЛПВП2 » ЛПНП

ЛПОНП ^ / Адр/Норадр ^

^л Инсулин р<0.05 . -ц корт/инс р<о.05

---, АКТГ/корт.

Глюкоза кропи ' Пируеат

Латктат * Лакт/пирув

-«—Состояние 6 ■ 'Состояние 1

Норадре^а

алии реналин

Тли

'Глик/глюк

(лик/г, к/Г-6-Ф

Р<0.05

Гли^ФДФ

Р<0.05

Рис.1. Эндокринно-метаболические показатели у лыжников до (состояние 1) и после (состояние 6) похода. Условные единицы. Р< 0,05 - разница между состояиями

патоадреналовой системы на холод (Фурдуй Ф.И., 1986).

В послепоходных обследованиях эндокринно-метаболические реакции лыжников как отдельно на физические нагрузки и на охлаждение, так и на их сочетанное воздействие, отражают высокую степень напряженности регуляторных и эффекторных механизмов. В этих состояниях (7, 8,9) отмечалось увеличение содержания ТТГ, тнреовдных гормонов, инсулина, катехоламинов не только по сравнению с соответствующими им предпоходными состояниями (2, 3,4), но и с состоянием покоя (6).

После похода было усилено использование липидов на энергетические нужды, о чем свидетельствовало снижение содержания в крови НЭЖК, холестерина, суммарных ЛП. Несмотря на высокое содержание катехоламинов, содержание глюкозы в крови не изменилось, что объясняется ее усиленной утилизацией под влиянием инсулина. Высокие энерготраты, не компенсируемые в полной мере питанием (в среднем каждый лыжник потерял в весе 3,6±0,6 кг, Р<0,05), привели к ослаблению антиоксидантной системы (содержание токоферола снижено) и, как следствие, некоторому увеличению содержания МДА, что можно рассматривать как плату организма за адаптацию к условиям похода.

В отличие от предпоходных состояний, энергетические реакции на охлаждение или степ-тест (состояния 7, 8) носили менее дифференцированный характер, и в их регуляцию вовлекались ТТГ и тиреоидные гормоны. Эти данные свидетельствует о том, что за 18 суток похода организм не достиг состояния стабильной адаптации, но в нем сохранился эндокринно-метаболический след, благодаря которому даже незначительная для тренированных людей нагрузка вызывала выраженную опережающую реакцию, направленную на усиление энергетического обмена.

В интерпретацию данных, полученных во время исследований, определенную трудность вносили сами условия экспедиции, в частности, локальный перегрев во время движения, рацион питания, не восполнявший энергозатрат. Кроме того, участники похода имели различный опыт выживания в экстремальных условиях. В связи с этим индивидуальные показатели иногда отличались большими отклонениями от средних значений в группе. Поэтому было проведено обследование группы пловцов - членов Ассоциации марафонского зимнего плавания. Эта категория спортсменов отличается высокой устойчивостью к холоду, а нахождение в воде исключало возможность локального перегрева.

Плавание в холодной воде, несмотря на его регулярность, не перестало быть сильным раздражителем. Но результаты обследования показали некоторые различия в изменениях концентраций гормонов и метаболитов на нагрузку у пловцов и лыжников, главными из которых были: снижение инсулина на нагрузку, а не повышение его, увеличение ТТГ и снижение ТЗ. Кроме того, обращало внимание значительное увеличение содержания токоферола в крови, что можно рассматривать как положительный признак высоких адаптивных резервов организма. Содержание кортизола было очень высоким (1175 ±98 нмоль/л) и не изменялось в ответ на нагрузку. Это может быть обусловлено десинхронизацией биологических ритмов пловцов вследствие отсутствия у них достаточного времени для адаптации после прибытия на Иссык-Куль (В.А.Матюхин и соавт., 1986), а также высокой солнечной активностью 1991 г. и именно дней обследования пловцов (В.И.Хаснулин, 1992). Значительно выше, чем у лыжников, было содержание глюкозы (р < 0,05), а также процентное содержание ЛПОНП. Другие изучавшиеся показатели у пловцов не отличались от таковых у лыжников.

Таким образом, проведенные исследования продемонстрировали, что и для лыжников на финише 18 суточного перехода в условиях зимней тундры, и для спортсменов, занимающихся марафонским зимним плаванием, холод продолжал оставаться существенным раздражителем, вызывающим значительные изменения биохимических показателей. Однако в зависимости от продолжительности холодового воздействия и устойчивости организма к холоду характер и степень выраженности реакций на охлаждение отличались. В реакциях каждого испытуемого: и лыжника, и пловца присутствовал элемент ответа на предшествующую .физическую нагрузку. С целью выделения холодового компонента дальнейшие исследования проводились на животных на модели Харта, при которой исключалась физическая нагрузка. Кроме того, эти эксперименты дали возможность изучить более глубокие механизмы адаптивных реакций организма на холод.

Исследование механизмов адаптации на модели Харта 1.Общее состояние животных. Наблюдения показали, что крысы достаточно хорошо переносили условия содержания на холоде в изолированных металлических клетках. Но в отдельных сериях исследований были отмечены случаи гибели животных (5-7%, или 12 на 20-30 крыс) на 8-12 день холодового воздействия. Мыобра-

гили также внимание, что через 3-4 недели значительно улучшается, по сравнению с контрольными животными, шерстный покров адаптируемых крыс.

2. Изменения массы тела в динамике холодовой адаптации. Масса животных в начале холодовой экспозиции не отличалась от массы контрольных животных. В конце срока холодовой адаптации (7 недель) масса тела контрольных крыс превышала, но недостоверно массу тела адаптированных. Однако изменения массы тела крыс, содержавшихся на холоде, были неравномерны: в первую неделю масса увеличивалась незначительно, затем (до конца 3-й недели) существенно нарастала, в период с 21 по 35 сутки у крыс наблюдалась стабилизация или даже тенденция к снижению массы, и на последних сроках холодового воздействия вновь регистрировалось увеличение массы тела.

3. Изменения температуры ядра тела крыс в динамике холодового воздействия. В экспериментах наблюдались колебания температуры животных. Изменения выражались, в основном, в двух постоянно повторяющихся периодах снижения температуры: на первые -третьи сутки и на 8-12 сутки пребывания на холоде. Обычно на 3 неделе холодового воздействия температура ядра тела возвращалась к контрольным значениям. Колебания температуры наблюдались и в другие сроки холодовой адаптации, но они не были постоянны во всех сериях экспериментов. На рис. 2 приведен график изменения температуры ядра тела экспериментальных животных.

4. Состояние эндокринной системы. В ходе исследований изучалась суточная экскреция норадреналина и адреналина с мочой, а также было проведено определение инсулина, тироксина (Tí), трийодти-ронина (Тз), кортикостерона в сыворотке крови.

Наиболее ранним проявлением реакции эндокринной системы на холодовое воздействие явилось снижение содержания в крови Ti (табл. 1) и повышение экскреции катехоламинов, в частности, норадреналина (рис. За), сосудистый эффект которого может существенно повлиять на теплопотери с поверхности тела (Мошкин М.П., Жигулина Е.И., 1990). Увеличение экскреции адреналина происходило с 5 суток (рис. 36) и до конца эксперимента оставалось выше исходного уровня. Пик выделения обоих катехоламинов наблюдался на 10 сутки. Максимум содержания в крови Тз приходился на 15 сутки, когда, судя по величине экскреции, продукция норадреналина уже снизилась до контрольных величин. Синергизм катехоламинов и тиреоидных гормонов в реакции организма на холод известен (Sato Т. et al., 1986), нам удалось проследить последова-

Рис. 2. Изменения температуры ядра тела крыс в.динамике холодового воздействия по горизонтали - сутки адаптации, по вертикали - температура (°С). * - Р< 0,05 по сравнению с контролем

Рис.3. Суточная экскреция с мочой норадреналина (а) и адреналина (б) у крыс при длительном холодовом воздействии. По горизонтали -сутки адаптации, по вертикали - нанограммы катехоламинов температура * - Р < 0,05 по сравнению с контролем

тельность их включения в адаптивный процесс. В конце срока наблюдения эндокринная система переходит в новое состояние, при котором усиление метаболизма обеспечивается повышенным содержанием адреналина иТ4.

Увеличение экскреции катехоламинов и содержания тиреоидных гормонов у экспериментальных животных в основном совпадало с изменениями содержания этих гормонов у участников лыжного похода, но из тиреоидных гормонов у лыжников наиболее лабильным был трийодтиронин. У пловцов-марафонцев его содержание также быстро менялось в ответ на предъявляемую нагрузку. Такие отличия могут объясняться особенностями обменных процессов и характера воздействий у людей и животных.

Таблица 1

Содержание трийодтиронина и тироксина в сыворотке крови крыс в различные сроки адаптации к холоду (нмоль/л), п=6

I сроки холодового воздействия (сутки)

I 0 I 1 I 5 I 10 I 15 I 21 I 28 I 42 I 49

Тз М т 1,19 0,10 1,03 1,26 1,06 1,63* .0,07 0,12 0,12 0,18 1,53 0,25 1,63 1,23 0,24 0,12 1,06 0,08

Т4 М ш 26,7 3,03 17,6* 22,8 53,2* 39,7 2,19 2,20 5,72 7,73 44,6* 7,99 54,6* 45,4* 1,29 6,02 41,0 6,60

* - достоверные отличия от контроля (р < 0,05)

Существенных отличий от контроля в содержании кортикосте-рона в сыворотке крови крыс в течение адаптационного периода обнаружено не было. Изменения носили характер затухающих колебаний, и в конце срока наблюдения содержание кортикостерона равнялось контрольным величинам. Увеличение содержания инсулина было зарегистрировано на 5 сутки холодового воздействия, в другие сроки наблюдения его содержание не отличалось от контроля.

5. Изменения содержания, структуры и заряда липопротеинов сыворотки крови крыс при длительном холодовом воздействии. Регуляторная роль сывороточных липопротеинов в последние годы стала предметом особого внимания исследователей. Помимо классической липидтранспортной функции, у этих частиц и их

белковых компонентов - апопротеинов - обнаружены и подтверждены в экспериментах способности влиять на многие клеточные процессы, принимать участие в адаптивных реакциях организма (Панин Л.Е., 1983; Поляков Л.М., 1996). Изменения концентрации липопротеинов в сыворотке и их спектра были показаны при различных экстремальных воздействиях (Останина Л.С.,1984).

Комплексное исследование сывороточных липопротеинов крыс в различные сроки воздействия холода показало, что уже через сутки изменяется спектр ЛП как результат снижения процентного содержания ЛПНП и увеличения ЛПВПг. Процентное содержание ЛПОНП было максимальным на 5 и 10 сутки (5,76% и 6,16%, соответственно, в контроле - 1,17%) и оставалось повышенным до конца срока наблюдения. Увеличение содержания суммарной фракции ЛПОНП и ЛПНП происходило к 15 суткам холодовой адаптации (75,6 мг% против 47,4% в контроле) и также сохранялось на высоком уровне. Характер количественных изменений липопротеинов сыворотки крови крыс в целом совпадал с наблюдавшимся нами увеличением содержания ЛПОНП у пловцов и суммарных ЛП у лыжников после похода в ответ на охлаждение.

Способность липопротеинов взаимодействовать с клеткой во многом определяется их физико-химическими свойствами. Исследования, проведенные с применением флуоресцентных зондов, обнаружили, что при одинаковых с липопротеинами контрольных животных флотационных характеристиках липопротеины крыс, находящихся на холоде, отличаются величинами поверхностного заряда, вязкости липидов: и показателями белково-липидных взаимодействий. В динамике адаптации к холоду эти отличия не всегда совпадали с изменениями содержания ЛП и не были связаны с активацией перекисного окисления липидов.

6. Состояние энергетического обмена у крыс в различные сроки холодовой адаптации. Энергетический гомеостаз является одной из важнейших функциональных систем организма. Лабильность звеньев этой системы обеспечивает относительно постоянный уровень макроэргов в условиях меняющихся'потребностей организма в энергии при самых различных воздействиях на него, в том числе и холода. Формирование "полярного метаболического типа" связано с некоторым иингибированием углеводного и активацией липидного обменов (Панин Л.Е., 1983). Ряд показателей, характеризующих эти процессы, был определен у животных в динамике адаптации к холоду.

Изменения в содержании глюкозы носили волнообразный характер (табл. 2): подъем через сутки, снижение ниже контрольных значений через 5 суток, существенный подъем на 10 сутки, возвращение, близкое к контролю, на 15 сутки, повторный подъем на 21-28 сутки и последующее установление на уровне исходных значений.

Таблица 2

Содержание глюкозы, НЭЖК, ацетона в сыворотке крови и д.ц.ацил-КоА в печени крыс (М+ш), п = 6 - 24

Сутки Глюкоза, НЭЖК д.ц.ацил- Ацетон

ммоль/л мкмоль/л -КоА нмоль/г мг/л

Контроль 8,4±0,31 284 ±23,3 23,5±1,4 0,28±0,06

1 10,2±0,79* 182 ± 25,9* 43,3±1,9* 1,01±0,16*

5 7,1 ±0,63* 413 ±112,1 34,2±3,4 1,01±0,18*

10 10,1±0,37* 265 ±53,4 29,6±1,4 0,93±0,18*

15 9,8±0,85 328 ±60,7 32,6±2,8 0,52±0,15

21 13,2±0,55* 179 ±24,7* 21,7±1,6 -

28 12,8±0,61* 335 ± 62,9 25,9±4,5 -

42 9,2+0,61 333 ±37,6 24,8±3,5 0,66±0,18*

49 9,9±0,43 297 ±91,8 27,8±3,0 -

*- р < 0,05 по отношению к контролю

Изучение состояния гликогенолиза и гликолиза на гомогена-тах печени и скелетных мышц в динамике холодовой адаптации не выявило увеличения их вклада в энергетику организма.

Наибольшей энергоемкостью как субстраты окисления обладают липиды. Их вклад в энергетический обмен особенно возрастает в условиях функционального напряжения организма (Л.Е.Панин, 1983). В крови животных отмечались значительные колебания содержания НЭЖК в различные сроки адаптации (табл. 2): снижение на 1, 10, 21 сутки, повышение на 5, 15, причем, отличия были не столько по сравнению с контролем, как по сравнению с предыдущим или последующими сроками обследования. В первые три недели повышение содержания НЭЖК совпадало со снижением содержания в крови глюкозы и наоборот, что свидетельствует о поиске системами организма оптимального вари-

анта адаптации. В конце срока наблюдения колебания в содержании НЭЖК были минимальны.

Промежуточными продуктами обмена жирных кислот являются кетоновые тела, к числу которых относится ацетон. Хрома-тографическое определение содержания ацетона в сыворотке крови крыс показало его увеличение практически во все периоды наблюдения (табл. 2). Об активации липидного обмена в условиях холодового воздействия свидетельствуют и повышение содержания в ткани печени длинноцепочечных ацил-КоА в 1 - 15 сутки (табл. 2), и увеличение в сыворотке крови, начиная с 15 суток содержания суммарных ЛПОНП и ЛПНП, важнейших энергетических субстратов организма.

7. Состояние основных кислородпотребляющих систем клеток печени в динамике адаптации к холоду. Увеличение потребления кислорода гомойотермными животными в ответ на понижение температуры окружающей среды - одна из наиболее характерных реакций, которая прослеживается в течение всего периода пребывания на холоде как на уровне целого организма (Исаакян Л.А., 1972), так и в отдельных органах и тканях (УМеЬ Ь & а1., 1975). В конечном итоге, вся энергия, используемая организмом, превращается в тепло, за исключением той части, что идет на синтетические процессы и внешнюю работу (НеМпшегС. е1 а1., 1989).

Значительная часть исследований, посвященных изучению механизмов повышения устойчивости к холоду, проведена на скелетной мускулатуре и бурой жировой ткани. Но и внутренние органы принимают активное участие в адаптации. В первую очередь, следует назвать печень, ее вклад в дополнительный тер-могенез может составлять 25% (.Ташку Ь., 1971) при одновременном выполнении присущих только ей функций: поставка "на экспорт" большого количества соединений, синтез которых требует расхода макроэргов, метаболизм эндо- и ксенобиотиков и т.д. (Панин Л.Е., 1983). Поэтому дальнейшие наши исследования были направлены на более глубокое изучение процессов, происходящих в печени, при адаптации организма к холоду.

Увеличение потребления кислорода тканью печени при воздействии холода на организм является хорошо установленным фактом (ГоББа Б. е1 а1., 1994). Использование кислорода клеткой идет по трем основным путям: оксидазные реакции в митохондриях, реакции оксигеназного типа в эндоплазматическом ретикулу-ме и перекисное окисление липидов (Лукьянова Л.Д. и соавт.,

1982). Нами проведена оценка состояния этих кислородпотребляю-щих систем клеток печени в динамике адаптации к холоду.

Полярографические исследования гомогенатов выявили изменения скоростей эндогенного дыхания, окисления субстратов и после добавления разобщителя по сравнению с контролем в различные сроки холодового воздействия. Наибольшими скорости потребления кислорода были на 10 сутки и в конце срока наблюдений. Изменения носили фазовый характер и не всегда совпадали с изменениями, регистрируемыми на субклеточных структурах.

Фазовый характер имели и изменения дыхательной активности митохондрий (табл. 3, 4). Это видно из разнонаправленных по отношению к контролю изменений скоростей дыхания особенно в первые 3 недели адаптации. Уже через сутки усиливалась дыхательная активность митохондрий, увеличивались скорости поглощения кислорода в МС-4 и МС-3 при окислении глутамата с малатом (табл. 3). На 5 сутки скорости дыхания снижались, особенно при окислении сукцината (табл. 4). Наибольшие изменения в состоянии дыхательной цепи митохондрий наблюдались на 10 сутки: возрастали скорости потребления кислорода на обоих субстратах, снижался дыхательный контроль. В то же время фосфорилирующая активность митохондрий была высокой. В последующие дни в зависимости от Окисляемых субстратов показатели постепенно возвращались к уровню контроля (сукцинат) или (глутамат с малатом). Через 6 недель митохондрии печени адаптированных животных при окислении глутамата с'малатом характеризовались высокими скоростями дыхания в активном (МС-3) и в разобщенном состояниях и высоким дыхательным контролем, что свидетельствует об активации дыхательной цепи.

В эндоплазматическом ретикулуме основными потребителями кислорода являются НАДФ Н- и НАД Н-зависимые системы транспорта электронов. На 10 и 15 сутки имела место избирательная активация НАДФН-зависимых реакций, которая к концу срока наблюдения возвращалась к исходному уровню. Было зарегистрировано примерно двукратное увеличение содержания цитохрома Р450 на 10 - 15 сутки с последующим снижением. Существенных изменений в цепи свободного окисления НАД.Н мы не обнаружили, за исключением увеличения с 10 суток содержания цитохрома Ь5, сохраняющегося до конца срока.

Содержание первичных продуктов ПОЛ - диеновых конъюгатов в гомогенате печени через сутки снижалось по сравнению с контролем, а в более поздние сроки холодового воздействия не

Таблица 3

Параметры окислительного фосфорилирования митохондрий печени в динамике длительного воздействия холода на крыс (глутамат ЮмМ ималат2мМ), п= 5-7

сутки нанограмм О/ мин на мг белка дыхат. V фосф..

контроль АДФ/О нмоль АДФ/

У(МС-4) У(МС-З) У(ХКФ) мин мг белка

контроль 11,5 ±0,4 44,5 ± 2,8 59,0 ± 4,3 3,5 ± 0,1 2,36 ± 0,12 113,5 ± 7,4

1 17,6 ± 1,9* 55,1 ± 2,9* 62,7 ± 5,8 3,4 ± 0,2 2,42 ± 0,18 145,0 ± 19,5

5 9,5 ± 1,9 36,0 ± 6,9 50,4 ±8,0 3,4 ± 0,1 2,34 ± 0,13 87,9 ± 6,4

10 15,3 ± 1,2* 58,9 ±8,0* 76,4 ±9,7* 3,1 ± 0,2* 2,59 ± 0,15 158,4 ±23,9*

15 13,1 ± 0,3* 47,3 ± 2,6 67,2 ± 7,9 3,3 ± 0,1 2,48 ± 0,51 143,4 ±31,6

21 13,7 ±0,3 52,9 ± 3,0 76,1 ±2,0 3,5 ± 0,2 2,41 ± 0,14 137,9 ± 16,4

28 12,8 ± 1,4 53,6 ± 6,6 64,1 ±8,8 3,8 ± 0,3 2,16 ± 0,18 116,8 ± 7,7

35 10,9 ±2,0 46,9 ± 3,5 69,3 ± 6,7* 4,0 ± 0,4* 2,19 ± 0,16 130,2 ± 5,1

42 12,1 ± 1,0 50,9 ± 2,4* 66,2 ±5,4* 3,9 ± 0,2* 2,12 ± 0,06* 115,8 ± 5,2

* - Р < 0,05 по сравнению с контролем

Таблица 4

Параметры окислительного фосфорилирования митохондрий печени в динамике длительного воздействия холода на крыс (сукцинат ЮмМ), п= 5-7

сутки нанограмм О/ мин на мг белка дыхат. V фосф.

контроль АДФ/О нмоль АДФ/

У(МС-4) У(МС-З) У(ХКФ) мин мг белка

контроль 36,6 ±2,4 127,8 ± 7,2 180,0 ± 8,0 3,5 ± 0,1 1,44 ± 0,05 184,0 ± 11,9

1 .37,9 ±8,6 135,9 ±31,9 192,1 ±45,9 3,5 ± 0,1 1,62± 0,11* 220,2 ±30,8

5 33,5 ± 2,6 105,9 ± 10,9* 149,8 ± 1,3* 3,3 ± 0,1 1,33 ± 0,07 140,5 ± 11,3

10 49,8 ± 5,9* 146,7 ±23,1 263,7 ± 44,3* 2,9 ± 0,3* 1,43 ± 0,07 209,8 ± 23,1

15 34,3 ± 6,2 103,6 ± 25,9 157,1 ± 16,4* 2,9 ± 0,2* 1,44 ± 0,03 149,2 ±20,6

21 46,6 ± 6,0 135,1 ± 13,3 190,6 ± 19,4 2,8 ± 0,8 1,40 ±0,07 189,1 ± 15,6

28 39,9 ±3,6 128,4 ± 19,6 186,7 ± 3,1 3,2 ± 0,2* 1,41 ± 0,06 181,0± 18,5

35 41,2 ±6,4 137,4 ±20,4 198,2 ±35,3 3,5 ± 0,2 1,34 ± 0,12 184,1 ± 18,1

42 37,6 ± 3,8 125,6 ± 18,3 193,3 ±38,2 3,4 ± 0,2 1,48 ± 0,03 200,7 ± 14,8

* - Р < 0,05 по сравнению с контролем

отличалось от него. В микросомах на протяжении всего периода наблюдений значимых изменений содержания продуктов ПОЛ не происходило. И только в митохондриях печени через сутки воздействия холода имело место увеличение содержания диеновых конъюгатов.

Таким образом, в различные сроки холодового воздействия меняется соотношение активностей кислородпотребляющих процессов в печени, являясь отражением фазового характера адаптивного процесса. Увеличение потребления кислорода митохондриями печени прослеживается в течение всего периода наблюдений, в ранние сроки холодовой адаптации оно может быть обусловлено дополнительно активацией перекисных процессов в митохондриях, на 2-3 неделях - активацией НАДФН-зависимого окисления в системе эндоплазматического ретикулума.

8. Энергетическое состояние печени и роль адениннуклеотидтран-слоказы в регуляции энергизации и ионной проводимости митохондрий печени при разных сроках воздействия холода на крыс. Подавляющее большинство процессов, протекающих в печени как синтетических, так и метаболических, идут с потреблением адено-зинтрифосфата, который образуется в митохондриях. Перенос адениннуклеотидов через внутреннюю мембрану митохондрий осуществляет аденинуклеотидтранслоказа (АНТ), которая также контролирует проводимость мембраны для К+ и Н+, что существенно сказывается на способности митохондрий выполнять энергозависимые функции (Панов A.B., 1987).

В динамике адаптации животных к холоду в печени проводилось определение содержания адениннуклеотидов и неорганического фосфата, величин энергетического заряда (Аткинсона) и потенциала фосфорилирования. Снижение содержания АТФ происходило на 5, АДФнаЮ сутки. На 10 сутки холодовой адаптации система адениннуклеотидов характеризовалась самым низким энергетическим состоянием, при котором суммарное содержание адениннуклеотидов и макроэргов было минимальным и значительно возрастало содержание АМФ и неорганического фосфата (табл. 5). Через б недель содержание АТФ в печени не отличалось от контроля, но повышалось содержание АДФ и АМФ. В другие сроки наблюдения отдельные составляющие системы адениннуклеотидов также отличались от контрольных величин. Величина потенциала фосфорилирования была снижена по сравнению с контролем уже через сутки, сохранялась на таком уровне до 15 суток пребывания животных на холоде, затем возрастала до контрольных значе-

ний, но к концу срока наблюдения вновь уменьшается. Энергетический заряд Аткинсона на протяжении всего периода воздействия холода был ниже, чем в контроле.

Таблица 5

Содержание адениннуклеотидов (АН), неорганического фосфата (Фн) (нмоль/г ткани) и показатели системы адениннуклеотидов: фосфатный потенциал (ФП) и энергетический заряд (ЭЗ) печени крыс при воздействии холода. (М± ш, п = 6 -7)

контроль Сутки 10 42

АТФ 2392 ± 86 1592 ±311* 2136 ± 131

АДФ 776± 39 516±129* 978 ± 53*

АМФ 217 ± 13 404± 89* 310 ± 32*

сумма АН 3394±113 2513 ± 351* 3529 ± 213

Фн 2429±139 3413 ± 184* 2516 ± 134

ФП 1,29 ±0,04 0,95 ± 0,05* 0,88 ±0,05*

ЭЗ 0,82 ±0,01 0,71 ± 0,06* 0,77 ± 0,004*

- р < 0,05 по отношению к контролю

Таким образом, во все сроки наблюдения, включая последний, 6 недель, состояние системы адениннуклеотидов печени отличалось от контроля, причем, наибольшие изменения выявлены на 10 сутки.

Для исследования молекулярных механизмов адаптации к холоду АНТ представляет особый интерес, поскольку по составу и некоторым своим свойствам очень походит на мембранный белок митохондрий бурой жировой ткани - термогенин, называемый также белком-разобщителем (Адш1а Н. е1 а1., 1987). Имеющиеся отдельные сообщения свидетельствуют об изменении состояния АНТ митохондрий печени крыс при холодовом воздействии (Мак 1.Т. е1 а1., 1983).

Роль АНТ в регуляции ионного транспорта и энергозависимых функций митохондрий печени прослежена при двух сроках (10 и 42 дня) холодовой адаптации крыс. На рисунке 4 представлена кинетика осмотического набухания неэнергизованных (в присутствии олигомицина) митохондрий в среде с ЫШС!, отражающая протонную проводимость внутренней мембраны. На 10 сутки воздействия холода происходило увеличение Непроводимости, которое сохранялось до конца периода наблюдения.

0.0 2.5 3.0 7.3 10.0

Время инкубации(минуты)

Рис.4. Протонная проницаемость митохондрий печени крысы при воздействии холода. 1 - контроль, 2-10 суток воздействия холода, 3-6 недель адаптации. МХ - митохондрии, КАТ - карбоксиатрактилазид, ХКФ - разобщитель. Стрелками отмечено внесение добавок.

На 10 сутки наблюдалось увеличение проницаемости внутренней мембраны и для К+ (рис. 5), но через 6 недель скорость набухания митохондрий становилась меньше, чем в контроле. На участие транслокатора в регуляции энергизации митохондрий в разные сроках адаптации к холоду указывает влияние АДФ и карбоксиатрак-тилозида на скорость набухания. В разные сроки холодовой адаптации эффекты воздействия этих лигандов АНТ отличаются. На 10 сутки влияние АДФ на протонную проницаемость уменьшается, сохраняясь, как в контроле, на калиевую. Однако на 42 сутки проводимость мембраны для К+ почти не изменяется от добавления АДФ и карбоксиатрактилозида, тогда как их влияние на протонную проницаемость подобно действию на митохондрии контрольных животных, т.е. длительная холодовая адаптация приводит к изменению соотношения К+- и Н+- проницаемости внутренней мембраны митохондрий печени.

Изменения специфической ионной проводимости внутренней мембраны митохондрий под влиянием АДФ существенно сказываются на величине кальциевой емкости, отражающей энергозависимые функции митохондрий. АДФ в конечной концентрации 50 мкМ более, чем в 2 раза, увеличивал Са2+- емкость преинкубиро-ванных с олигомицином митохондрий контрольных животных. Степень увеличения Са2+- емкости под влиянием АДФ менялась в различные сроки холодового воздействия. На 5 и 28 сутки действие АДФ не отличалось от контроля, на 10 - 15 и на 35-49 сутки влияние АДФ достоверно меньше. Увеличение концентрации АДФ до 90 мкМ приводило к равному эффекту в контроле и при воздействии холода, что может быть обусловлено конкуренцией за места связывания на АНТ.

На ранних сроках адаптации такими конкурентами АДФ могут быть длинноцепочечные ацил-КоА (д.ц.ацил-КоА), действие которых на транслокатор показано А.В.Пановым и В.А.Вавилиным (1983). В наших исследованиях содержание в печени д.ц.ацил-КоА было повышено на 1 - 15 сутки холодового воздействия (табл. 2). Изменения соотношения К+- и Н+- проницаемостей на поздних сроках может быть связано с увеличением содержания сывороточных ЛПОНП, белковый компонент которых, как показали наши более ранние исследования, способен повышать преимущественно протонную проницаемость мембран изолированных митохондрий (Панин Л.Е. и др., 1991).

Повышение К+- и Н+- проницаемостей и эффекты лигандов АНТ на 10 сутки воздействия холода говорят в пользу того, что в этот

10.0 -

7.3 -

2.5

■Л5 15

Время инкубации (минуты)

10.0

Рис.5. Проницаемость для ионов калия митохондрий печени крысы при воздействии холода. 1 - контроль, 2-10 суток воздействия холода, 3-6 недель адаптации. МХ-митохондрии, КАТ- карбоксиатрактилазид. Стрелками отмечено внесение добавок.

период (когда снижается температура тела животного), АНТ функционирует как неспецифическая ионная пора, способствуя разобщению окислительного фосфорилирования в митохондриях печени и увеличению выработки тепла. Это согласуется с данными Н.Н.Брустовецкого и соавт. (1986), проведших исследования на митохондриях печени сусликов, выходящих из состояния гибернации.

Через б недель холодового воздействия температура тела животных находилась на уровне контроля. В это время содержание АТФ в ткани печени не отличалось от контрольных величин, но фосфатный потенциал и энергетический заряд оставались сниженными; параметры окислительного фосфорилирования при окислении сукцината совпадали с данными у животных, находящихся в тепле, но скорость окисления НАД-зависимых субстратов была повышена, возрастали Са2+- емкость и ДЧ'. Все это свидетельствует о качественном отличии митохондрий адаптированных животных от контроля.

9. Фармакокииетика антипирина и изониазида у крыс в динамике холодовой адаптации. Важной стороной любого адаптивного процесса является цена, которой организм расплачивается за развитие устойчивости к тому или иному неблагоприятному фактору. Интенсификация обменных процессов, неизбежно приводит к накоплению в организме продуктов, метаболизм которых происходит в печени с участием ферментов I и II фаз биотрансформации. В наших исследованиях было обнаружено повышение содержания в сыворотке ацетона, являющегося одновременно субстратом окисления и индуктором цитохрома Р450ПЕ1 (Гуляева Л.Ф. и др., 1994). Увеличение вклада печени в термогенез при воздействии холода на животных, повышение содержания цитохромов Р450 и Ь5 и активация НАДФ Н-зависимого окисления в системе эндоплазматиче-ского ретикулума поставили вопрос о состоянии специфических функций, связанных с метаболизмом эндо- и ксенобиотиков. Для оценки состояния систем биотрансформации печени в условиях холодового воздействия в качестве тест-препаратов были взяты антипирин и изониазид.

Изучение фармакокинетических параметров антипирина (АП), метаболизм которого в печени идет при участии цитохрома Р450, и изониазида (ИН), метаболизм которого связан с М-ацетилтрансфе-разой, проводилось за ■ неделю до помещения животных в холо-довую камеру (контроль), а также через 1, 8, 15, 22 и 35 суток адаптации к холоду.

Полученные данные свидетельствуют об ускорении элиминации АП на 8 сутки адаптации (Т1/2 - 1,47± 0,05 часа, контроль - 2,07± 0,18 часа, р < 0,05) и увеличении объема распределения препарата на 15 - 22 сутки, вследствие чего наблюдалось увеличение общего клиренса АП. Усиление метаболизма АП совпадало по срокам с повышением общего количества цитохрома Р450 в микросо-мальной фракции печени и активности некоторых его изоформ (Сгошоуа О.А. е1 а1., 1992).

На поздних сроках воздействия обнаружено значительное изменение спектра метаболитов АП в моче - на 22 сутки за счет снижения норантипирина (норАП), на 35 сутки - увеличения 4-гидроксианти-пирина (4-ОНАП) и снижения (3-НМАП) 3-гидроксиметилантипи-рина, что свидетельствует о перераспределении активностей изоформ цитохрома Р450, продуцирующих эти метаболиты. Продукция 4-ОНАП у крыс является "маркерной" для подсемейства Р-4501А (Гуляева Л.Ф. и соавт., 1994). Обнаружение повышения в условиях холодового воздействия активности данной изоформы цитохрома, участвующей в канцерогенезе и обычно индуцируемой лишь ксенобиотиками метилхолантренового ряда, ставит вопрос о продолжении исследований в этом направлении для выяснения биологической значимости феномена.

Фармакокинетика ИН также претерпевала существенные изменения в процессе адаптации крыс к холоду. К 8 суткам холодового воздействия наблюдалось возрастание скорости элиминации препарата (Тт - 0,94± 0,13 часа, контроль - 1,12± 0,15 часа, р < 0,05). К 15 суткам увеличивался объем распределения, а в дальнейшем обнаруживалась тенденция к его снижению. Общий клиренс препарата уже через сутки был выше контроля на 15% и оставался повышенным на 30-50% в течение всего периода наблюдения.

Таким образом, использование АП и ИН как тест-препаратов, отражающих преимущественно активность систем метаболизма ксенобиотиков в печени, выявило ускорение элиминации обоих препаратов (возрастание Ке1, С1 и снижение Т1/2), что свидетельствует о повышении активности реакций как I, так и II фазы биотрансформации. К концу срока наблюдения скорость метаболизма препаратов возвращалась к исходному уровню. На 3 и 4 неделях адаптации к холоду происходило увеличение объема распределения препаратов. В эти же сроки наблюдалось максимальное повышение клиренса. Динамика объема распределения и связанное с ним однонаправленное изменение клиренса ксено-

биотиков, возможно, обусловлены усилением кровотока через печень и увеличением относительной массы органа (Мак 1.Т. й а!., 1983)

Ускорение элиминации лекарственных препаратов свидетельствует об однонаправленном характере реагирования ферментных систем биотрансформации и отсутствии угнетения метаболической функции печени при данной модели холодового воздействия. Одновременно полученные данные о состоянии биотрансформирую-щей способности печени в условиях холодового воздействия указывают на необходимость учета фактора изменения скорости метаболизма лекарственных веществ для рациональной фармакотерапии у лиц с различными сроками пребывания на Севере. 10. Траисмембраиный потенциал лейкоцитов крови как показатель напряженности адаптивных перестроек биоэнергетических процессов при действии холода. Поиски логической связи между биохимическими параметрами изолированных митохондрий и состоянием обмена в живых клетках представляют одну из труднейших ее проблем (Бокеева Л.Е., Брустовецкий Н.Н., 1993). Возможным подходом к решению этой задачи является проверка обнаруженных на митохондриях феноменов на целых клетках, выделение которых проводится в более щадящем режиме, чем митохондрий. В динамике адаптации к холоду крыс Вистар были определены трансмембранные электрические потенциалы митохондрий печени (ДТк) и сопоставлены с суммарными потенциалами на плазматической и митохондриальной мембранах тимоцитов и лейкоцитов крови (АТт и Д*РЛ). Выявлена однонаправленность их изменений (рис. 6): снижение через 2-24 часа, восстановление к 5 суткам и снижение на 10 сутки воздействия, совпадающее с периодом снижения температуры тела. К 15 суткам АТм восстанавливался, а с 28 до 49 превышал контрольные значения, что совпадало с увеличением дыхательного контроля и свидетельствовало о повышении способности митохондрий печени адаптированных к холоду крыс выполнять энергозависимые функции. Трансмембранные потенциалы тимоцитов и лейкоцитов также постепенно возрастали с 15 суток, и к 28 суткам АТЛ не отличались от контроля, но ДТт до конца наблюдений, (7 недель) так и не достигали контрольных значений.

По данным М.ОоиЬегп (1991), и в митохондриях бурой жировой ткани максимальное снижение Д¥ приходится на 10 сутки, а у адаптированных животных показатель возрастает, не достигая кон-

ДТ. мВ

2Ù0

150

т n

1

V

r'»-

Й*

r

JLJ_L

----Г

—Г

1-

J ■ /

44-

--Ï'

40

50

0 2 5 24 5 10 20 30

ч а сы сутки

Продолжительность холодового воздействия Рис. б. Трансмембранный электрический потенциал (АН*) митохондрий печени (1), тнмоцитов(2) н лейкоцитов крови (3) крыс в динамике адаптации к холоду.

• - Р < 0,05 по сравнению с хонтролем

г

трольного уровня. Следовательно, на ранних стадиях адаптивного процесса, в условиях напряжения систем организма характер изменений биоэнергетических процессов совпадает в митохондриях бурой жировой ткани, специализирующейся на выработке тепла, в печени, только на определенных этапах адаптации включающейся в дополнительную теплопродукцию, а .также в лейкоцитах и тимоци-тах, реальный вклад которых в усиление термогенеза пока трудно оценить, А4? лейкоцитов, видимо, может отражать общую направленность изменений энергетических процессов в организме при адаптации к холоду, поэтому представляется перспективным определение ДЧ'л при обследовании человека, в том числе - при диагностике заболеваний, связанных с нарушением митохондриаль-ных функций.

Таким образом, в результате экспериментальных исследований на модели Харта были выделены следующие фазы адаптации к холоду:

1. Фаза острой адаптации (1-8 сутки), для которой характерно преобладание катаболических процессов. В этот период стратегия выживания сводится к включению срочных программ адаптации, усилению теплообразования путем расходования имеющихся резервов, в результате чего замедляется рост животных. Несовершенство функциональной (сосудистой) и физической (шерстный покров) изоляции приводит в первые - третьи сутки к высоким потерям тепла и снижению температуры тела. Увеличение продукции катехоламинов (в первые сутки - норадреналина, к 5-м - адреналина) вызывает активацию кислородпотребляющих процессов, липолиза, дыхательной активности митохондрий. В этой фазе разобщение дыхания и фосфорилирования не наблюдается. Компенсация теплопотерь идет по несовершенному пути - через предварительный синтез АТФ (Хаскин В.В., 1984). Во второй половине фазы - к 5 суткам - высокая теплопродукция восполняет теплопотери -температура восстанавливается. Одновременно в организме истощаются пластические ресурсы, накапливаются промежуточные продукты обмена.

2. Критический период (9-15 сутки). Выживание в условиях постоянного действия холода возможно только при переходе на долгосрочную . программу, связанную с наработкой структур, обеспечивающих повышенную продукцию тепла и его сохранение. В критический период отмечается максимальная продукция катехоламинов и тиреоидных гормонов. Последние, наряду с теплопродукцией, стимулируют и синтез белка. Об усилении

анаболических процессов свидетельствуют ускорение роста животных, увеличение содержания митохондриальных цитохро-мов (Жигачева Н.В., Мохова E.H., 1978), цитохромов эндоплаз-матического ретикулума. Повышается активность систем биотрансформации эндо- и ксенобиотиков в печени. Эти процессы требуют значительного расхода макроэргических соединений и протекают на фоне сохраняющихся высоких потребностей в теплопродукции. В критический период повышается проницаемость митохондриальных мембран для катионов, в результате разобщения окисления и фосфорилирования часть энергии окисляемых продуктов выделяется в виде тепла. Даже максимальная активация дыхательной цепи не обеспечивает одновременно напряженные эндо- и экзергонические процессы, в результате температура тела снижается. Возможна гибель животных.

3. Фаза неустойчивой адаптации (3-4 недели). В условиях жесткой конкуренции между экзергоническими и эндергоническими процессами выживают животные, способные решить это противоречие путем усиления окисления высокоэнергетических субстратов и некоторого уменьшения расхода АТФ на реакции, которые в конечном итоге не приводят к образованию тепла. Очевидно, в эту фазу происходит переключение метаболических процессов на преимущественное использование липидов. В крови повышается содержание ЛПОНП и ЛПНП. Снова замедляется рост животных, до контрольных значений уменьшается активность ферментов метаболизма эндо- и ксенобиотиков, но спектр цитохромов Р450 уже изменяется в соответствии с потребностями организма. Потери тепла с поверхности тела уменьшаются вследствие усиления роста шерсти. Содержание норадреналина снижается до контрольных значений, продукция адреналина и концентрация тиреоидных гормонов снижаются, но продолжают оставаться выше, чем в контроле. Скорости окисления субстратов в митохондриях находятся на уровне контроля, более предпочтительным для теплопродукции становится сукцинат (дыхательный контроль при его окислении снижен). Изменения в соотношении и направленности процессов отражаются на температуре тела - в эту фазу отмечается ее непостоянство.

4. Фаза, устойчивой адаптации (5-7 недели). Метаболические реакции в эту фазу контролируются повышенным содержанием адреналина и Tt. Выражен вклад изоляционного компонента (шерстный покров хорошо развит), поэтому потери тепла с поверхности тела снижены. Температура тела поддерживается на постоянном уровне. Восстанавливается рост животных. Увеличе-

ние относительной массы печени (Мак 1.Т. е1 а1., 1983) и кровотока через орган Чапеку Ь., 1971) обусловливают повышение скорости элиминации биологически активных соединений.

Вследствие изменения проницаемости митохондриальных мембран для Н+ и К+ повышается энергизация митохондрий, о чем свидетельствуют повышение Са2+- емкости и АН*. Активность окислительного фосфорилирования, особенно при использовании НАД-зависимых субстратов возрастает, что позволяет поддерживать содержание АТФ на уровне контроля. Однако это, по-видимому, не компенсирует полностью возросшие при длительном действии холода энергетические затраты организма, т.к. фосфатный потенциал и энергетический заряд, определяемые в ткани печени, снижены.

ВЫВОДЫ

1. На этапе предпоходного обследования метаболические сдвиги в ответ на действие физической нагрузки в условиях температурного комфорта в наибольшей степени были обусловлены действием адреналина, ответные реакции на холод контролировались, в основном, норадреналином.

2. Продолжительное интенсивное воздействие холода в сочетании с физическими нагрузками на организм человека вызывает изменения базального метаболизма, проявляющиеся активацией липидно-го обмена и повышением содержания катехоламинов в крови.

3. Для лыжников на финише 18 суточного перехода в условиях зимней тундры и для спортсменов, занимающихся марафонским зимним плаванием, холод продолжал оставаться существенным раздражителем, вызывающим значительные изменения биохимических показателей, характер которых имел свои особенности. В отличие от предпоходных состояний, энергетические реакции на охлаждение или физическую нагрузку носили менее специализированный характер, и в их регуляцию вовлекались уже не только ка-техоламины, но и другие гормоны (ТТГ, Тз, Т4). На этом фоне дозированные нагрузки выполняют роль пусковых механизмов, вызывая выраженные метаболические ответы, не носящие дифференцированного характера. У лиц с высокой устойчивостью к холоду острое холодовое воздействие вызывает быструю реакцию системы ти-реоидных гормонов, усиление расхода трийодтиронина.

4.В модели по Харту процесс адаптации животных к холоду носит фазовый характер и включает: фазу острой адаптации (1-8 сутки), критический период (9-15 сутки), фазу неустойчивой адаптации (3-4 недели), устойчивой адаптации (5-7 недели). На ранних сроках холодовой адаптации частичное уменьшение теплопотерь обеспечивается сосудосуживающим эффектом норадреналина, позднее в адаптивных реакциях начинает преобладать метаболический компонент, который обеспечивается, в частности, адреналином и тире-оидными гормонами.

5.В критический период митохондрии печени находятся в низкоэнергетическом состоянии, снижаются фосфатный потенциал и энергетический заряд ткани печени, возрастает ионная проницаемость внутренней мембраны митохондрий, увеличиваются скорости дыхания в активном и разобщенном метаболических состояниях, снижается дыхательный контроль митохондрий, содержание аде-ниннуклеотидов печени; митохондрии печени адаптированных к холоду животных обладают повышенной способностью через 5-7 недель пребывания животных на холоде повышается Са2+- емкость митохондрий печени, их способность выполнять энергозависимые функции повышается.

6. Повышение проницаемости внутренней митохондриальной мембраны для протонов связано с участием переносчика аденин-нуклеотидов (АНТ) в поддержании ионного гомеостаза митохондрий при холодовом воздействии на организм. В критический период АНТ функционирует как ионная пора, что усиливает диссипацию энергии. На поздних сроках адаптации при сохранении высокой проницаемости митохондриальной мембраны для протонов калиевая проводимость снижена.

7. Направленность изменений трансмембранного электрического потенциала (ДЧ*) интактных клеток периферической крови и тимо-цитов совпадает в целом с динамикой ДЧ* митохондрий печени, отражая общее состояние биоэнергетических процессов в организме, что позволяет рекомендовать метод оценки трансмембранного потенциала лейкоцитов для апробации в клинике.

8. В течение процесса адаптации наблюдаются фазовые изменения физико-химических характеристик сывороточных липопротеинов всех классов. При одинаковых с липопротеинами контрольных животных флотационных характеристиках липопротеины крыс, находящихся на холоде, отличаются величинами поверхностного заряда, вязкости липидов и показателями белково-липидных взаимодействий. В динамике адаптации к холоду эти отличия не всегда

совпадали с изменениями содержания ЛП и не были связаны с активацией перекисного окисления липидов.

9. Активность ферментных систем I и II фаз метаболизма ксенобиотиков в печени возрастает к 8 суткам холодового воздействия и возвращается к уровню, близкому к исходному, е конце срока адаптации. Угнетения метаболической функции печени в условиях модели Харта не обнаружено.

10. На 8 - 15 сутки холодового воздействия в печени возрастает количество цитохромов Р450 и Ь5, повышается НАДФН-оксидазная активность, НАД Н-оксидазная активность не изменяется. В динамике адаптации к холоду при отсутствии экзогенных индукторов химической природы происходит изменение активности отдельных изоформ цитохрома Р450, сохраняющееся до конца периода наблюдения.

Считаю своим долгом выразить глубокую благодарность научному консультанту, директору Института биохимии СО РАМН, академику РАМН Льву Евгеньевичу Панину за помощь и совет на всех этапах выполнения работы.

Искренне^ благодарен сотрудникам Института биохимии СО РАМН П.Е.Влощинскому, О.В.Добронравовой, И.Е.Колосовой,

H.Г.Колосовой, Л.С.Останиной, А.А.Розуменко, В.Н.Соловьеву, Т.Ю.Старовой, Т.А.Третьяковой, Т.Г.Филатовой, И.Г.Шабалиной, сотрудникам Института молекулярной патологии и экологической биохимии СО РАМН В.А.Вавилину и О.А.Громовой за участие в проведении совместных исследований.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

I. Влияние длительного лыжного перехода на адаптацию человека к холоду. //Тез. докл. II Всес. конф. "Важнейшие теоретические и практические проблемы терморегуляции". Минск, 1986,-С.227. (Соавт. Панин JI.E., Розуменко A.A., Влощинский П.Е., Останина Л.С., Третьякова Т.А.)

2.. Изменения липидного спектра сывороток крови у людей во время тренировочного лыжного похода. //Тез. докл. XI Всес. симп. Биологические проблемы Севера. Якутск, 1986. С. 36. (Соавт. Останина Л.С., Влощинскйй П.Е., Розуменко A.A., Панин Л,Е.)

3. Состояние энергетического обмена у участников полярной экспедиции газеты "Комсомольская правда" во время тренировочного похода. //Тез. докл. IV Всес.научн.конф. Адаптация человека

к климато-географическим условиям и первичная профилактика. Новосибирск, 1986, С.56. (Соавт. Панин JI.E., Розуменко А.А., Влощинский П.Е., Останина JI.C., Третьякова Т.А., Шпаро Д.И., Малахов М.Г.)

4. Состояние процессов гликолиза в эритроцитах людей во время длительного лыжного перехода в условиях Заполярья //Тез. докл. XI Всес. симп. Биологические проблемы Севера. Якутск, 1986. С. 57-58. (Соавт. Третьякова Т.А., Филатова Т.Г., Влощинский П.Е., Розуменко А.А., Панин JI.E.)

5. Изменения липидов сывороток крови у людей после длительной физической нагрузки в условиях холода //Тез. докл. Республ. симп. "Особенности липидного обмена в условиях Сибири и Дальнего Востока". Чита, 1987, С.52 (Соавт. Останина JI.C., Влощинский П.Е., Розуменко А.А., Панин JI.E.)

6. Изменения липидов сывороток крови у участников полярной экспедиции газеты "Комсомольская правда" во время длительного лыжного похода. //Тез. докл. Всес. симп. по биохимии липидов. Алма-Ата, 1987, С.164. (Соавт. Останина Л.С., Розуменко А.А., Медведков В.П., Влощинский П.Е., Панин Л.Е.)

7. Природа адаптационных изменений митохондриального аппарата печени в экстремальных состояниях. //Тез. IV Всесоюзн. Съезда патофизиологов. Нарушение механизмов регуляции и их коррекция. Кишинев, 1989, С. 663. (Соавт. Добронравова О.В.)

8. Физико-химические характеристики мембран и фосфорили-рующая активность митохондрий в динамике холодового воздействия //Тез. докл. Всесоюз. конф. памяти А.Д.Слонима "Система терморегуляции при адаптации организма к факторам среды". Новосибирск,- 1990 Т 2,- С.81-83. (Соавт. Колосова Н.Г., Добронравова О.В.)

9. Energy metabolism changes in participants of a transarctic skitrek. //Abstr. of VIII Intern. Congr. on Circumpolar Health. Cañada, 1990, P. 58. (Соавт. Панин Л.Е., Останина Л.С., Третьякова Т.А.)

10. Changes in endocrine activity in participants of a transarctic skitrek //Ibid, P.59 (Соавт. Панин Л.Е., Влощинский П.Е., Колосова И.Е.)

11. Влияние апопротеинов липопротеинов очень низкой и высокой плотности на катионную проницаемость и потенциал внутренней мембраны митохондрий печени крыс //Биологические мембраны,- 1991. Т 8, N 7.-С. 743-748. (Соавт. Панин Л.Е., Кузь-менко Д.И., Колосова Н.Г., Добронравова О.В.)

12. Oxidative phosphorylation and lipid peroxidation in liver in cold adaptation. //Abstr. Const. Congr. Intern. Society for Pathoph. Moscow, 1991, P. 261. (Соавт. Panin L.E., Dobronravova O.V., Kolosova N.G.)

13. Измерение трансмембранного электрического потенциала митохондрий с помощью флуоресцентного зонда ДСМ // Биофизика,- 1991. Т.36,- Вып. 5.- С. 802-804. (Соавт. Колосова Н.Г.)

14. Функции митохондрий печени в динамике холодовой адаптации. //В кн.: Проблемы терморегуляции и температурной адаптации. Новосибирск, 1992, С. 74-82. (Соавт. Панин JI.E., Колосова Н.Г., Добронравова О.В.)

15. Состояние потребляющих кислород систем печени крыс при адаптации к холоду //Тез. докл. Респ. симп. "Монооксигеназная система. Теоретические и прикладные аспекты". Ташкент, 1992, С.13-14. (Соавт. Громова О.А., Колосова Н.Г., Панин JI.E.)

16. Effects of exposure to cold on cytochromes P450 and mono-oxygenase activities in rat liver microsomes //J.Basic Clin.Physiol. Pharmacol.1992, Vol.3,Suppl.P.189.(CoaBT.GromovaO.A., Polyakova N.E., Kozlovskaya N.E., Vavilin V.A., Grishanova A.Yu., Lyakhovich V.V.)

17. Влияние токоферола на состояние митохондрий печени при холодовом воздействии //Тез. докл. IV конф. "Биоантиоксидант". Москва, 1993, Т 2, С. 82-83. (Соавт. Колосова Н.Г., Панин JI.E.)

18. Expression of the rat liver CYP IA1 following cold exposure //5-th European ISSX Meeting. Proceedings. France, 1993, Vol.3, P. 194. (Соавт. Gromova O.A., Gulyaeva L.F., Lyakhovich V.V.)

19. Механизмы адаптации человека и животных к холоду //Вестник Российской Академии медицинских наук, 1993, N 8, С. 29-31. (Соавт. Влощинский П.Е., Колосова Н.Г.)

20. Induction of hepatic cytochromes P450 during cold exposure //The III World Congress of the Int. Society for Adaptive Medicine. Tokyo, Japan, 1993, Abstr., P. 80. (Соавт. Gromova O., Gulyaeva L., Kozlovskaya N., Vavilin V., Lyakhovich V.)

21. Antioxidant prevents rat liver mitochondria response to cold //Ibid. P. 80. (Соавт. Kolosova N., Panin L.)

22. Rat liver metabolic capacity in cold acclimation.//Ibid. P.81. (Соавт. Gromova О., Kolosova N., Kolpakov M., Panin L.)

23. Механизмы повышения энергизации митохондрий печени крыс при адаптации к холоду //Мат. VII Всеросс. симп. "Эколого-физиологические проблемы адаптации". Москва, 1994, С. 322-323. (Соавт. Шабалина И.Г., Колосова Н.Г.)

лг>

24. Фармакокинетика антипирина и изониазида у крыс в динамике холодовой адаптации //Бюлл.эксперим. биол.мед., 1994, Т. 118,N9, С. 279-280. (Соавт. Колпаков М.А.,Панин Л,Е.)

25. Трансмембранный потенциал и физико-химическое состояние мембран тимоцитов и митохондрий печени при адаптации к холоду //Биол.мембраны, 1995, Т 12, N 6, С. 609-615. (Соавт. Колосова Н.Г., Шабалина И.Г., Панин Л.Е.) "

26. Изменения содержания, структуры и заряда липопротеинов сыворотки крови крыс при длительном холодовом воздействии //Биофизика, 1995, Т 40, N 2, С.422-427. (Соавт. Колосова Н.Г., Добронравова О.В.)

27. Changes in the content, structure and charge of lipoproteins of the rat blood serum on prolonged exposure to cold //Biophysics, 1995, V 40, N 2.- P.40I-406. (Соавт. Kolosova N.G., Dobronravova O.V.)

28. Role of ATP/ADP-antiporter in regulation of energization and ion permeability of liver mitochondria from cold-exposed rats //Biochemistry (Moscow), Eng. Tr., 1995, Vol.60, No 3, P. 317-322. (Соавт. Shabalina I.G., Solovyov V.N., Panov A.V.,Panin L.E.)

29. Energy state of rat liver in dynamics of cold acclimation // Biochemistry (Moscow), Eng. Tr.,1995, V.60, N 3, P.323-329. (Соавт. Shabalina I.G., Solovyov V.N., Kolosova N.G., Panin L.E.)

30. Энергетическое состояние печени крыс в динамике адаптации к холоду //Биохимия, 1995, Т. 60, вып. 3, С. 441-449. (Соавт. Шабалина И.Г., Соловьев В.Н., Колосова Н.Г., Панин Л.Е.)

31. Роль переносчика адениннуклеотидов в регуляции энергиза-ции и ионной проводимости митохондрий печени при воздействии холода на крыс//Биохимия, 1995, Т. 60, вып. 3, С. 432-440. (Соавт. Шабалина И.Г., Соловьев В.Н., Панов А.В., Панин Л.Е.)

32. Энергетическое состояние печени и миокарда крыс при воздействии холода //Бюлл. СО РАМН, 1995, N 3, С. 79-84. (Соавт. Шабалина И.Г., Преображенская В.К., Соловьев В.Н., Макарова С.И., Панин Л.Е.)

33. Изменения гликолиза, гликогенолиза и содержание некоторых гормонов в крови и моче у крыс в различные сроки холодовой адаптации//Вопр. мед. химии, 1995, Т. 41, N 4, С. 14-18. (Соавт. Панин Л.Е., Старова Т.Ю., Третьякова Т.А., Колосова И.Е., Соловьев В.Н.)

34. Содержание токоферола и перекисное окисление липидов в тканях крыс Вистар в динамике адаптации к холоду //Вопр. мед. химии, 1995, Т.41, N 6, С.16-19. (Соавт. Колосова Н.Г., Панин Л.Е.)

35. Метаболизм антипирина у крыс в динамике холодовой адаптации //II Съезд физиологов Сибири и Дальнего Востока: Тез. науч. сообщ. Новосибирск, 1995,4.1, С.66-67. (Соавт. Вавилин В.А., Суслякова О.В., Колпаков М.А.)

36. Длительная адаптация крыс к холоду и токоферол //Там же, С. 211-212. (Соавт. Колосова Н.Г.)

37. Кислородпотребляющие системы печени крыс при адаптации к холоду //Там же, С. 212-213. (Соавт. Колосова Н.Г., Громова О.А., Шабалина И.Г., Панин JI.E.)

38. Роль переносчика адениннуклеотидов в регуляции энер-гизации и протонной проводимости митохондрий печени при разных сроках воздействия холода на крыс //Там же, Ч. 2, С. 482483. (Соавт: Шабалина И.Г., Макарова С.И., Панин JI.E.)

39. Metabolic adaptation of man to physical loading in environments of winter tundra // X International Congress on Circumpolar Health. Abstr., Anchorage. USA, 1996, N. 210. (Соавт. Panin L.E., Vloshchinsky P.E., Ostanina L.S.)

Подписано в печать 29.11.96 г. Формат бумаги 60x84/16. Усл.печ.л.2,0. Заказ № 1. Тираж 100 экз.

Типография СО РАМН, I997 г.

630117. Новосибирск, ул. Акад. Тимакова, 9

Соискатель

А.Р.Колпаков