Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Эндотелиопротективные свойства производных ГАМК при недостаточности половых гормонов

0У4

На правах рукописи

РОБЕРТУС АЛЕКСАНДРА ИГОРЕВНА

ЭНДОТЕЛИОПРОТЕКТИВНЫЕ СВОЙСТВА ПРОИЗВОДНЫХ ГАМК ПРИ НЕДОСТАТОЧНОСТИ ПОЛОВЫХ ГОРМОНОВ

14.03.06. фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ВОЛГОГРАД 2010

3 О СЕН 2010

004609692

Работа выполнена на кафедре фармакологии и биофармации факультета усовершенствования врачей, КИИ Фармакологии ГОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет Росздрава»

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Тюренков Иван Николаевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

Дудченко Галина Петровна

доктор медицинских наук Решетько Ольга Вилоровна

Ведущая организация: НИИ Фармакологии имени В.В. Закусова РАМН

Защита состоится «___»_2010 г. в_часов

на заседании Диссертационного совета Д 208.008.02 при ГОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет Росздрава» (400131, Россия, г. Волгоград, пл. Павших борцов, 1).

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ГОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет Росздрава» по адресу: 400131, Россия, г. Волгоград, пл. Павших борцов, 1.

Автореферат разослан «_»_2010 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, доктор медицинских наук,

профессор А.Р.Бабаева

Актуальность темы

Согласно демографическим данным всемирной организации здравоохранения, в XXI веке предполагается значительное увеличение численности пожилого населения. В связи с этим большинство женщин более трети своей жизни будут проводить, находясь в постменопаузе. Уже сейчас приблизительно 95% всех женщин в индустриально развитых странах доживают до этого периода [Casaclang-Verzosa et al, 2010]. Постменопауза характеризуется постепенным угасанием функции половых желез и снижением уровня женских половых гормонов. С другой стороны, в последние годы отмечается рост гинекологических заболеваний, таких как доброкачественные и злокачественные опухоли матки и ее придатков, эндометриоз и другие, требующих радикального оперативного вмешательства, что приводит к омоложению контингента женщин с недостаточностью половых гормонов (Hill') [Р. Collins 2007]. Снижение уровня половых гормонов в результате возрастного угасания функции яичников или вследствие овариоэктомии ведет к развитию климактерического синдрома, росту сердечно-сосудистых заболеваний, причем при хирургической менопаузе риск сердечно-сосудистых осложнений (ССО) наиболее высокий, так как нет физиологической адаптации организма к новым условиям [Salpeter SR et all. 2006, К. Denton 2007].

Наблюдаются различные нейроэндокринные и сосудистые нарушения : активация симпатической и ренин-ангиотензин-альдостероной системы [Wenzel R. R. et all. 2006], повышение уровня холестерина и липополипро-теинов низкой плотности, активация перекисного окисления липидов (окси-дативный стресс), возрастание уровня фибриногена, вязкости, свертываемости крови и ухудшение реологии крови [Miller V. M., 2009], понижение стрессоустойчивости, все это в конечном итоге ведет к развитию эндотели-альной дисфункции (ЭД) и сердечно-сосудистыми заболеваниями [Vitale С. et all, 2008, Coylewright M., 2008, F. Gungor et all. 2009]. Взаимосвязь между Hill , а также ЭД и ростом заболеваемости и смертности от ишемической болезни сердца, артериальной гипертензии, хронической сердечной недостаточности в период менопаузы у женщин очевидна.

Для профилактики ЭД и ССО при Hill представляется логичной заместительная гормональная терапия, но она себя оправдала в неполной мере, так как высок процент грозных осложнений. Поэтому поиск средств профилактики эндотелиальной дисфункции и сердечно-сосудистых осложнений продолжается [Minkin M. J., 2007, Сметник В. П., 2008]. Учитывая поливалентность действия производных гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК) и в частности, влияние на многие патогенетические механизмы, ведущие к нарушению функции эндотелия: симпатоингибирующее, антиишемическое, анти-стрессорное и антиоксидантое действие, а также, принимая во внимание спектр их психотропного, ноотропного действия, коррекции тревожно-депрессивной симптоматики - можно предположить, что данные соединения i могут оказаться эффективными средствами профилактики и лечения сердечно-сосудистых осложнений, обусловленных НПГ и психо-эмоциональным

состоянием. Исходя из вышеизложенного, представляется перспективным провести исследование эндотелиопротективных свойств производных ГАМК, в условиях недостаточности половых гормонов. Целью исследования является экспериментальное обоснование применения производных ГАМК в качестве эндотелиопротекторов при НПГ. Задачи исследования.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

1. Изучить влияние производных ГАМК и препаратов сравнения на ва-зодилатирующую функцию эндотелия при НПГ.

2. Изучить влияния производных ГАМК на антитромботическую функцию эндотелия в условиях НПГ.

3. Изучить влияние производных ГАМК на основные параметры гемостаза крови животных с НПГ.

4. Изучить противовоспалительную функцию эндотелия при НПГ и влияние на нее производных ГАМК.

5. Дать морфологическую оценку состояния эндотелия при НПГ и применении производных ГАМК.

Новизна исследования.

Впервые изучены эндотелиопротективные свойства у производных ГАМК (соединения РГПУ-189, РГПУ-147, фенибут, пикамилон) на фоне НПГ.

Впервые предложена комплексная методика, которая позволяет дать оценку вазодилатирующей функции эндотелия и косвенно оценить мощность и стабильность функционирования N0 системы эндотелия.

Впервые изучены тендерные различия в развитии ЭД при экспериментально вызванной недостаточности половых гормонов (ЭНПГ).

Впервые показана способность производных ГАМК улучшать вазодилатирукяцую, антитромботическую, противовоспалительную функции эндотелия, положительное влияние на основные параметры гемостаза. Научно-практическая ценность работы.

Полученные данные об эндотелиопротективном действии производных ГАМК (улучшении вазодилатирующей, антитромботической, противовоспалительной функции) расширяют понимание возможных механизмов их кар-диоваскулярного действия и свидетельствуют о перспективности разработки на основе соединения РГПУ-147 - кардиопротектора с эндотелиопротектив-ным действием, а на основе соединения РГПУ-189 -средства, улучшающего мозговое кровообращение, а также эндотелийзависимую вазодилятацию и антитромботический потенциал эндотелия.

Полученные сведения об эндотелиальной дисфункции мозговых сосудов при недостаточности половых гормонов требуют ее коррекции, в том числе и исследуемыми ГАМК-ергическими средствами.

Разработанный комплексный подход для оценки эндотелийзависимой ва-зодилатации, позволяет косвенно оценить мощность функционирования N0 системы, и оценить эндотелиотропные свойства исследуемых веществ, состояние эндотелиальной дисфункции (ЭЗВД, антитромботической, противовоспалительной функции).

Положения, выносимые на защиту:

1. НПГ приводит к развитию эндотелиальной дисфункции в большей мере у самок при хирургической кастрации, чем у самцов.

2. Производные ГАМК (соединение РГПУ-189, соединение РГПУ-147, фенибут, пикамилон) обладают эндотелиопротективными свойствами, что проявляется в улучшении его вазодилатирующей, антитромботической, противовоспалительной активности у животных на фоне НПГ.

3. Соединение РГПУ-189 обладает наибольшей эндотелиопротективной активностью, чем соединение РГПУ-147, фенибут и пикамилон, и является перспективным для дальнейшей разработки в качестве эндотелиопротективного средства.

4. Разработанный комплексный подход изучения эндотелиальной функции может использоваться для оценки эндотелиозависимой вазодилатации, позволяет косвенно оценить мощность функционирования N0 системы и выраженность эндотелиальной дисфункции, а также эндотелиотропное действие биологически активных веществ, Апробация работы.

Материалы работы докладывались и обсуждались на VII международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI веке» ( Москва, 2006), III международной медико-фармацевтической конференции студентов и молодых ученых (Черновцы, 2006), VIII международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке (РУДН, Москва,2007), III съезде фармакологов России (Санкт-Петербург, 2007), 14-ом всероссийском съезде сердечно-сосудистых хирургов (Москва, 2008), международной научной конференции «Гемореология и микроциркуляция» (Ярославль,2009), 65-ой, 66-ой, 67-ой открытой итоговой конференции студентов и молодых ученых Волгоградского Государственного Медицинского Университета (2007-2009) (диплом I степени среди молодых ученых(2009)). По материалам диссертации опубликована 21 печатная работа, в том числе 6 работ в журналах, рекомендуемых ВАК.

Объем и структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, 3 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка используемой литературы, включающего 226 источников, из них 76 отечественных и 150 зарубежных авторов. Диссертация изложена на 145 страницах машинописного текста, содержит таблиц -12, рисунков -38, схем - 1.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование было выполнено на 266 крысах самках и самцах, которые содержались в условиях вивария с естественным световым режимом, на стандартной диете лабораторных животных (ГОСТР 50258-92), с соблюдением Международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях, а также правил лабораторной практики при проведении доклинических иссле-

дований в РФ (ГОСТ 3 51000.3-96 и 51000.4-96) и Приказу МЗ РФ №267 от 19.06.2003г. «Об утверждении правил лабораторной практики» (GLP). Животные были получены из питомников «Столбовая», «Рапполово». Эксперименты были одобрены комитетом по этической экспертизе доклинических исследований ВолГМУ (протокол № 23-2007 от 14.11.07).

Были изучены эндотелиопротективные свойства следующих соединений -РГПУ-147 (50мг/кг), РГПУ-189 (15мг/кг), фенибут - (25мг/кг), пикамилон (ОАО «Фармстандарт-УфаВИТА») - 100мг/кг. Использовались наиболее эффективные дозы, выявленные при изучении нейропротекторной, антистрес-сорной, антиишемической и кардиотропной активности данных соединений. Первые три вещества синтезированы на кафедре органической химии Российского государственного педагогического университета им. А.Н. Герцена (Санкт-Петербург, Россия)1.

В качестве препаратов сравнения были использованы: сулодексид - 30 EBJI (единицы высвобождения липопротеинлипазы) (Alfa Wassermann , Италия) - препарат с доказанным ЭПД; мексидол (ООО «НПК»- «Фармасофт», Россия)-100 мг/кг. Способ введения всех перечисленных веществ - per os, в течении месяца, в первую половину дня. В качестве растворителя использовали 0,9% раствор хлорида натрия. Контрольным группам животных: ин-тактным, ложнооперированным (JIO) и животным с НПГ вводился физиологический раствор в эквивалентном объеме.

Работа выполнена в 3 этапа: Hai этапе изучены тендерные различия развития ЭД при НПГ YLa II этапе изучено влияние исследуемых соединений на ЭД при ЭНПГ; На III этапе изучено влияние исследуемых соединений на ЭД при возрастном нарушении гормонального фона у самок (ВHl 11).

ЭНПГ как модель нарушения функции эндотелия воспроизводилась: - у самок путем экстирпации матки с придатками; - у самцов удалением яичек. ЭД, связанная с возрастом изучалась на самках в возрасте старше 2 лет, с массой 270-300 г. Контроль эффективности кастрации производился с использованием цитологического метода определения стадии полового цикла. Для анализа разного уровня эндогенных эстрогенов после операции были выбраны три наиболее характерные фазы полового цикла: диэструс, проэст-рус и эструс (Розен, 1994), определение фаз проводили с помощью характерных морфологических признаков по влагалищным мазкам согласно описанию Я. Д. Киршенблата (1969).

Для исключения влияния эстрального цикла на активность различных звеньев регуляции кровообращения у групп JIO и интактных самок исследование выполнялось только в фазу диэструса, когда колебания гормонального фона минимальны.

' Выражаем искреннюю благодарность зав. кафедрой органической химии РГПУ им. А.И..Герцена, д.х.н., проф. Берестовицкой В.М., к.х.н., доц. Васильевой О.С. и всем сотрудникам кафедры за предоставленные для исследования вещества

На I, II и III этапах нашей работы был использован комплексный морфо-функциональный подход оценки состояния эндотелия, включающий в себя:

> оценку вазодилатирующей функции эндотелия в условиях блокады и модификации синтеза эндогенного N0;

У исследование антитромботической функции эндотелия; У анализ влияние на основные параметры гемостаза;

> изучение противовоспалительной функции эндотелия;

> исследование морфологического состояния эндотелия;

Известно, что проявление ЭД связывают в первую очередь с недостатком продукции или нарушением биодоступности N0. Принято считать, что продукцию N0 эндотелием in vivo достоверно отражает состояние эндоте-лииозависимой вазомоторной функции. Так как система синтеза N0 играет ключевую роль в функционировании эндотелия, и при этом, является наиболее уязвимой к действию повреждающих агентов - именно она и послужила объектом изучения при исследовании вазодилатирующей функции эндотелия сосудов головного мозга, отличающегося от других сосудистых областей более мощной N0- синтазной системой [Максимович Н.Е., 2005].

Вазодилатирующую функцию эндотелия оценивали в условиях модификации синтеза эндогенного N0 при внутривенном введении анализаторов в следующей последовательности - ацетилхолин (АЦХ) (0,01 мг/кг, Acros organics, США); L-аргинин (300 мг/кг, Acras organics, США); нитроглицерин (0,007мг/кг, MTX, Москва) и блокатор синтеза нитрооксида -нитро- L -аргинина (10 мг/кг, Acros organics, США). Регистрация изменений скорости мозгового кровотока (СМК) в проекции средней мозговой артерии в теменной области головного мозга крыс с помощью ультразвукового допплерографа, датчика УЗОП-010-01 с рабочей частотой 25МГц и рабочей компьютерной программы ММ-Д-K-Minimax Doppler v.1.7. (Санкт -Петербург, Россия). Каждое введение анализатора осуществлялось после возвращения СМК до исходного уровня. Мы предполагаем, что один и тот же датчик, размещенный над тканью органа, регистрирует скорость кровотока в определенной, сопоставимой по массе ткани, а не во всем органе. Скорость кровотока фиксировали в ус. ед.. При введении анализатора, мы регистрировали изменение СМК, а затем, по увеличению/уменьшению СМК в процентах по отношению к исходному уровню судили о расширении/сужении сосудов и косвенно об участии системы N0 в регуляции тонуса сосудов и кровообращения. В дополнении к этому анализировалась степень эластичности сосудистой стенки (индекс Гослинга-PI) и периферическое сопротивление (индекс RI) сосудов головного мозга. Программное обеспечение аппарата «Минимакс-Допплер-К» позволяет их вычислить, они являются относительными величинами и не имеют единиц измерения.

Для оценки мощности и стабильности эндотелиальной N0-синтазной системы был использован разработанный нами метод многократного введения АЦХ с применением двух методических приемов.

В первом случае осуществлялось 10-кратное введение АЦХ, в дозе 0,01 мг/кг, каждое повторное после восстановления кровотока в ответ на предыдущее введение анализатора. Второй методический прием выполнялся следующим образом, АЦХ мы вводили трехкратно в дозах: 0,01 мг/кг, 0,05 мг/кг, 0,1 мг/кг. По проценту прирост СМК по отношению к исходу после каждого введения АЦХ оценивали влияние исследуемых соединений на мощности и стабильности NO-синтазной системы эндотелия.

Исследование антитромботической функции эндотелия.

Исследование антитромботической активности соединений проводили на модели артериального тромбоза у крыс, вызванного поверхностной аппликацией 50% раствора хлорида железа (III) (Kurz K.D., 1990).На наркотизированных крысах (небуталом 40 мг/кг), на участок предварительно выделенной сонной артерии длиной около 1 см накладывали ватный диск, смоченный 50% раствором хлорида железа (0,025 мл). Для изоляции окружающих тканей под сосуд подкладывали пленку Parafilm. Выше места аппликации устанавливался ультразвуковой датчик аппарата Допплера. Регистрацию кровотока вели до полной окклюзии сосуда. По увеличению/снижению времени до полного прекращения кровотока от момента наложения раствора хлорида железа оценивали влияние исследуемых соединений на антитромботическую функцию эндотелия.

Исследования системы функционального состояния гемостаза и влияния на него производных ГАМК.

После курсового введения исследуемых веществ животные всех экспериментальных групп в течение 18 часов до эксперимента находились на свободном питьевом режиме при полной пищевой депривации. Забор крови производился из брюшной аорты под легким эфирным наркозом. Вязкость крови определяли на анализаторе крови реологическом АКР-2 (Россия) при различных скоростях сдвига (от 300 до Юс'1). Влияние веществ на агрегацию эритроцитов оценивали по индексу агрегации, рассчитываемому как отношение вязкости крови при скорости сдвига 10е'1 к вязкости крови при 300 с" (Dintenfass L., 1989). Влияние веществ на агрегацию тромбоцитов исследовали на двухканальном лазерном анализаторе агрегации тромбоцитов (модель 220 LA) научно-произодственной фирмы «Биола» (г. Москва, Россия) по методу Born G. (1962) в модификации Габбасова З.А. и соавторов (Габбасов З.А., Попов Е.Г., Гаврилов И.Ю. и др., 1989). Исследования проводили на богатой тромбоцитами плазме (Люсов В.А., Белоусов Ю.Б., 1971). В качестве индуктора агрегации использовали динатриевую соль аденозин-5-дифосфорной кислоты (АДФ) (фирмы «Reanal», Венгрия) в концентрации 5 мкМ . Определение фактора Виллебранда - как маркера дисфункции эндотелия - проводилось с помощью «Набора для определения фактора Виллебранда на агрегометре «Биола» (производство НПО РЕНАМ, Россия) на двухканальном лазерном анализаторе агрегации тромбоцитов научно-произодственной фирмы «Биола» (г. Москва, Россия).

Определение показателей гемостаза осуществлялось на прогаммируе-мом оптико-механическом коагулометре - Минилаб 701 с использованием наборов для определения протромбинового времени, тромбин-теста, фибриноген - теста, активированного частичного тромбопластинового времени (производство НПО РЕНАМ, Россия). Исследование системы функционального состояния гемостаза при НПГ проводилось также с помощью нового инструментального метода с использованием анализатора реологических свойств крови АРП-01 «МЕДНОРД», который обеспечивал автоматическую регистрацию параметров процесса свертывания крови.

Дополнительно в каждой серии экспериментов как маркеров повреждения эндотелия регистрировалось количество десквамированных (циркулирующих) эндотелиоцитов(ЦЭ) в крови. Метод определения ЦЭ [Hladovec J. 1978] основан на изоляции клеток эндотелия вместе с тромбоцитами с последующим осаждением тромбоцитов с помощью аденозиндифосфата (АДФ) [H.H. Петрищев, Т.Д. Власов,2001].

Для оценки воспаления сосудистой стенки и изучения влияния исследуемых соединений на данный показатель определяли уровень С-реактивного белка (СРВ) с помощью набора реагентов для качественного и полуколичественного определения содержания СРБ в сыворотке крови методом латекс - агглютинации (СРБ-Ольвекс; Ольвекс дианостикум, Россия). Анализ содержания липидов у животных с НПГ проводился следующим образом: концентрации общего холестерина определяли в сыворотке крови, а липопротеидов высокой плотности (ЛПВП) в супернатанте после преципитации липопротеидов, содержащих липопротеидов очень низкой плотности и липопротеидов низкой плотности с помощью наборов ОЛЬВЕКС ДИАГНО-СТИКУМ KaT.No: 013.004 - 100 мл с калибратором (определение ЛПВП), ОЛЬВЕКС ДИАГНОСТИКУМ кат. №№013.002, 013.012 или 013.022 (определение общего холестерина).

После завершения каждой серии экспериментов осуществлялось морфологическое изучение сосудов головного мозга. Животных наркотизировали введением этаминала-натрия в дозе 40 мг/кг, внутрибрюшинно. Далее крыс декапитировали, извлекали головной мозг, который и служил дальнейшим материалом для исследования. Материал фиксировали в течение 24 часов в 10% растворе нейтрального забуференного формалина (pH 7,4). Материал обезвоживали и заливали в парафиновые блоки по общепринятой гистологической методике. На роторном микротоме изготавливали срезы толщиной 3-5 мкм, которые окрашивали гематоксилином и эозином по стандартной методике [Лилли Р., 1969; Саркисов Д.С., Перов Ю.Л., 1996]. Гистологические препараты фотографировали цифровой камерой Canon (Japan, 5.0 мегапикселей) на базе микроскопа Axiostar plus (Карл Цейс, Германия) с использованием объектива хЮ; х40 и окуляра хЮ. Морфометрическую оценку осуществляли на базе компьютерной системы «ВидеоТестМорфо-4» (Россия, г. Санкт-Петербург) [Автандилов Г.Г. 2002].

Нами был предложен комплексный подход в оценке морфологического состояния эндотелия, включающий в себя следующие критерии: толщина

стенок сосуда; соотношение интима/медиа; явления стаза, тромбоза или первых признаков образования тромбов; наличие их десквамации, некроза; увеличение проницаемости эндотелия; пролиферация эндотелия.

С целью оценки изменения уровня гормонов в исследуемых группах при моделировании НПГ был использован иммуноферментный анализ (ИФА) с использованием автоматического ридера Е1х800. Измерение проводилось с использованием наборов: Прогестерон ELISA EIA-1561, Пролактин ELISA EIA-1291, Фолликулостимулирующий гормон ELISA EIA-1288, Эст-радиол ELISA EIA-2693, ( DRG Instruments GmbH, Германия).

Статистическая обработка результатов исследования проводилась с использованием параметрического t-критерия Стьюдента, непараметрического U-критерия Манна-Уитни, критерия Ньюмена-Кейлса, критерия Уилкоксона, критерия Крускуола-Уоллиса. Обработка данных производилась с помощью пакетов программ Microsoft Excel ХР, BioStat 2008 5.2.5.0. Статистически значимыми расценивались эффекты при р<0,05 [Гланц С., 1999; Реброва О.Ю., 2006].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Изучение вазодилатирующей функции сосуда у животных обоего пола при ЭНПГ. Суммированные данные об изменении СМК у интактных, JIO и животных с НПГ представлены в таблице 1.

Таблица 1.Изменение СМК интактных, ложнооперированных и животных с ЭНПГ обоего пола при введении анализаторов

Интакт самцы Интакт самю ЛО самцы ЛО самки ЭНПГ самцы ЭНПГ самки

исход мах исхо мах исход мах исход мах исход мах исход мах

А 19,64 27,8 17,69 25,98 20,7 30,25 18,3 27,68 18,83 24,56 17 20,22

Ц ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±

X 0,34 0,31 0,54 0,69 0,2 0,41 0,3 0,55 0,06 0,08 0,22 0,06

41,54 % 46,8% 46,1% 51,25% 30,4% * 18,9%

L 20,4 22,08 18,39 20,32 22,5 23,94 20,55 21,98 18,83 25,05 17,1 24,22

а ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±

Р 0,62 0,26 0,39 0,44 0,8 0,35 1,05 0,42 0,41 0,09 0,3 0,18

г 8,2% 10,2% 6,4% 6,95% 33 %* 41,63%*'*

H 20,2 32,4 18,95 30,38 22 33,82 20,55 32,18 19,3 30,61 17,7 27,62

Т ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±

Г 0,14 0,72 0,67 0,64 1,4 0,46 0,7 0,59 1.1 0,43 1,05 0,19

56,9% 59,9% 53,7% 56,6% 58,5% 56,04%

н 19,94 17,16 18,92 15,99 21,98 18,85 19,4 16,46 18,83 17,05 17 15,68

L ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±

а 0,22 0,36 0,61 0,24 1,6 0,82 0,62 0,39 0,19 0,49 0,74 0,59

Р г -13,9% -15,5% -14,3% -15,1% -9,45% -7,7 6%&

Примечание: исход - исходная СМК в ус.ед.(М±ш); мах - максимальная СМК в ответ на введение анализатора в ус.ед.(М±т); ЛО - ложнооперированные животные, Ацх - ацетилхолина, Ьарг - Ь-аргинина, нЬарг - нитро-Ь-аргинина, НТГ- нитроглицерин. различия статистически значимы по сравнению с группами интактных и ЛО животных (р< 0,05, непараметрический II-критерий Манна-Уитни); *- различия статистически значимы по сравнению с группой животных ЭНПГ - самцы (р< 0,05, непараметрический и-критерий Манна-Уитни), % - процент изменения СМК при введении анализатора по сравнению с исходным уровнем.

В ходе исследования было выявлено, что нарушения ЭЗВД наблюдаются как у самцов, так и у самок, однако в большей мере проявляются у последних. Необходимо отметить, что изменение СМК на фоне модификации выработки эндогенного N0 у интактных и ЛО крыс не зависит от пола животного и имеет одинаковую направленность и степень выраженности.

Увеличение СМК при введении ацетилхолина (АЦХ) составило в среднем 30,4% (у самцов с ЭНПГ) и 18,9% (у самок с ЭНПГ) от исходного уровня, что было значительно ниже по сравнению со скоростью церебрального кровотока животных без гормональной патологии, при этом наблюдается статистически значимая разница между приростом СМК у самок и самцов.

Введение Ь-аргинина самцам с ЭНПГ усиливало СМК на 33,05% и на 42,47% у самок с ЭНПГ. Полученные результаты на данном этапе эксперимента статистически значимо отличаются от результатов интактных (самцов и самок) и ЛО животных (самцов и самок) (р < 0,05) (Таблица 1). Вероятнее всего, это можно объяснить с помощью теории «Ь-аргининового парадокса», согласно которой, при ЭД, вследствие накопления АБМА, происходит нарушении транспорта Ь-аргинина в клетку и угнетение еМОБ. а введение экзогенного Ь-аргинина приводит к преодолению этих барьеров. При этом, у интактных животных введение экзогенного Ь-аргинина практически не вызывает вазодилатации. Также необходимо отметить, что сосудистый ответ на введение Л-аргинина у самок, статистически значимо отличается от прироста СМК у самцов (р < 0,05).

Проба с нитроглицерином показала, что эндотелийнезависимая вазоди-латация (ЭНЗВД) у животных всех экспериментальных групп сохранена и практически сопоставима.

После введения нитро-Ь-аргинина отмечалось падение СМК у группы самцов и самок с ЭНПГ составила 9,45% и 7,76%, соответственно. В то время как у интактных и ЛО животных СМК снизилось в среднем на 14,1% (у самцов) и на 15,3% (у самок) по сравнению с исходным уровнем (Таблица 1).

В тесте с многократным введением АЦХ (0,01 мг/кг) как у самок, так и у самцов с ЭНПГ, начиная с третьего-пятого введения АЦХ, отмечалось прогрессирующее снижение прироста СМК, причем у самок в большей степени. Тогда как в группах ЛО животных повторяющиеся введения АЦХ вызывали практически равное увеличение СМК во всех десяти пробах.

Также у животных с ЭНПГ наблюдаются статистически значимые изменения индексов Гослинга и Пурсело. В группе самцов и самок с ЭНПГ регистрировалось статистически значимое повышение сосудистого сопротивления на 18 % и 35 % (р<0,05), и увеличение жесткости сосудов на 38,9 % ( р<0,05) и 64 % ( р<0,01), соответственно, по сравнению с контролем. Большее возрастание значений индексов у самок также свидетельствует о более выраженном нарушении эндотелия.

Оценка влияния производных ГАМК на вазодилатируюшую функцию эндотелия при ЭНПГ. Результаты тестирования эндотелийзависимой вазодилатации (ЭЗВД) свидетельствуют, что НПГ приводит к нарушению в системе синтеза и высвобождения N0 (Рисунок 1).

При введении АЦХ животным, получавшим соединения РГПУ-189 и РГПУ-147, фенибут, пикамилон, мексидол и сулодексид было отмечено статистически значимое (р <0,01) повышение СМК, соответственно, на 46,81%; 34,87%; 31,2 %; 35,8%; 50,5% и 67,5% от исходного уровня СМК. При этом прирост СМК у первых 4-х групп был меньше, чем в группе ЛО животных и получавших мексидол и сулодексид, но значительно больше аналогичного показателя у животных группы ЭНЛГ без экспериментальной фармакотерапии (ЭФТ) (Рисунок 1).

Введение Ь-аргинина животным с ЭНПГ, получавшим соединения РГПУ-189, РГПУ-147, фенибут, пикамилон, мексидол и сулодексид усиливало СМК, соответственно, на 19,6%; 40,2%; 43,3%; 39,7%; 37,3% и 12,96% от исходного уровня, что было меньше, соответственно, на 60,9%; 40,4%; 37,18%; 40,7%; 43,2% и 67,5%, по сравнению с аналогичным показателем у контрольной группы (Рисунок 1). Это так же свидетельствует о наличии у изучаемых соединений эндотелиопротективной активности. На введение нитроглицерина (ЭНЗВД) отмечается практически равное увеличение СМК у животных всех экспериментальных групп.

У животных с ЭНПГ, получавших соединения РГПУ-189, РГПУ-147, фенибут, пикамилон, мексидол и сулодексид после введения нитро-Ь-аргинина отмечалось падение СМК на 28,82%; на 21,3%; на 24,4%; на 24,31%; на 28,5% и на 32,7% по сравнению с исходным уровнем, соответст-

Примечание: ЛО - лож-кооперированные животные; ЭНПГ - животные с экспериметально вызванной недостаточностью половых гормонов. *-различия статистически значимы по сравнению с группой ЛО животных, *-**• различия статистически значимы по сравнению с группой животных с ЭНПГ (р< 0,05, р< 0,01 непараметрический и-критерий Манна-Уитни).

Рисунок 1. Влияние изучаемых соединений па процент изменения тонуса сосуда при модификации синтеза эндогенного оксида азота у животных с ЭНПГ. Полученные результаты свидетельствуют о наиболее выраженном эндотели-опротективном действие среди производных ГАМК у соединения РГПУ-189.

Золотым стандартом при изучении эндотелийзависимой вазодилатации (ЭЗВД) является введение АЦХ. Маркером ЭД в таких исследованиях, является ослабление сосудорасширяющей реакции на введение АЦХ или ее извращение. Выявленные различия в выраженности сосудистого ответа между группами ЛО и животных с ЭНПГ без ЭФТ при введении АЦХ в нарастающих дозах, могут свидетельствовать о том, что НПГ приводит к сосудистой патологии с нарушением вазодилатарующей функции эндотелия (Рисунок 2).

венно (Рисунок 1).

[Шло Эзнпг а РГПУ-18Э В РГПУ-147 Н фенибут В пикамилон В мексидол а сулодексид

Введение АЦХ в нарастающих дозах показало способность исследуемых веществ положительно влиять на функциональные резервы эндотелия. В особенности это проявилось у производных ГАМК соединений РГПУ-189 и РПУ-147, которые по данному виду активности превосходили фенибут, пи-камилон были сопоставимы с препаратом сравнения мексидолом, но уступали сулодексиду (Рисунок 2).

Примечание: ЛО - ложноопе-рированные животные; ЭНПГ-животные с экспериментально вызванной недостаточностью половых гормонов. &.- различия статистически значимы по сравнению с группой ЛО животных, (р< 0,05, непараметрический и-критерий Манна-Уитни); *- , **- различия статистически значимы по сравнению с группой животных с ЭНПГ (р< 0,05, р< 0,01)

Рисунок 2. Влияние исследуемых соединений на СМК кастрированных крыс при введении АЦХ в нарастающих дозах при ЭНПГ.

Предполагается, что многократное введение АЦХ через короткий интервал времени позволит оценить скорость восстановления х-Ю-синтазной системы эндотелия, то есть стабильность и мощность её функционирования.

При многократном введении АЦХ (в одинаковой дозе 0,01 мг/кг) прирост СМК в группе ЛО животных оставался на одном и том же уровне, а у животных с ЭНПГ уже с 3-го введения происходило снижение прироста СМК вплоть до его полного отсутствия при 8-10-ом введении. Это может свидетельствовать об истощении системы синтеза N0, снижении ее мощности у животных с гормональной недостаточностью.

В группах животных с ЭНПГ, получавших соединения РГПУ-189, РГПУ-147, фенибут, пикамилон введение 1-ой дозы АЦХ, увеличивало СМК на 47,8%; 37,9%; 32,7% и 40,8% по сравнению с исходным уровнем, соответственно. Наблюдаемая разница статистически значимо превышала прирост СМК в группе животных с ЭНПГ, не получающих исследуемые вещества. Введение последующих доз (начиная с пятой) приводило к незначительному снижению прироста СМК в группе животных с ЭНПГ, получавших соединение РГПУ-189 (44%) и к более выраженному снижению прироста СМК у животных с ЭНПГ, которым вводили соединение РГПУ-147 (31%); фенибут (28%) и пикамилон (38,6%).

Несмотря на дальнейшее снижение прироста СМК в исследуемых группах, в отличие от группы с ЭНПГ без ЭФТ, прирост СМК сохранился даже при 10-ом введении - у животных с ЭНПГ, получавших соединения РГПУ-189 (39,5%) и РГПУ-141 (21%); фенибут (18%) и пикамилон (32,7%) (Рисунок 3). По влиянию на сохранность ЭЗВД соединение РГПУ-189 уступало сулодексиду, было сопоставимо с мексидолом, но превосходило соединение РГПУ-147, фенибут, пикамилон.

Примечание: ЛО - ложноопе-рированные животные; ЭНПГ-животные с экспериментально вызванной недостаточностью половых гормонов, ^-различия статистически значимы по сравнению с группой животных с ЭНПГ; *- различия статистически значимы по сравнению с 1 дозой; #- различия статистически значимы по сравнению с 5 дозой (р<0,05, непараметрический 11-критерий Манна-Уитни). Рисунок 3. Влияние исследуемых соединений на прирост скорости мозгового кровотока у животньрс с ЭНПГ при многократном введении АЦХ при ЭНПГ.

Таким образом, у ЛО животных наблюдалось стабильное увеличение СМК при многократном введении АЦХ, тогда как у животных с ЭНПГ без ЭФТ отмечалось прогрессирующее снижение прироста СМК в тех же условиях эксперимента (как при 10-кратном, так и при введении в нарастающих дозах). Все исследуемые аналоги ГАМК, но в большей степени соединение РГПУ-189, давали в несколько раз большее увеличение СМК по сравнению с контрольной группой, сопоставимое с мексидолом, но уступали сулодексиду.

Оценка эндотелиопротективного действия (ЭПД) производных ГАМК при активации и блокаде синтеза эндогенного оксида азота, у животных ВНПГ. При введении АЦХ соединения РГПУ-189, РГПУ-147, фени-бут, сулодексид увеличивают прирост СМК на 54%, на 48%, на 40,9% и на 65,6%, соответственно, по отношению к исходному уровню СМК(р< 0,05).

Примечание: ВНПГ животные с возрастной недостаточностью половых гормонов. *- ; **- различия статистически значимы по сравнению с группой животных с ВНПГ (р< 0,05; р< 0,01, непараметриче-: ский и-критерий Манна-Уитни)

Рисунок 4. Влияние изучаемых соединений на процент прироста/падения СМК на фоне модификации синтеза эндогенного оксида азота у животных с ВНПГ.

У животных с ВНПГ введение Л-аргинина вызывало прирост СМК на 63,3% по отношению к исходному уровню. В группах животных с ВНПГ, получавших производные ГАМК - РГПУ-189, РГПУ-147, фенибут и сулодексид СМК при введении Л-аргинина, увеличилась на 22,7%; 30,3% и 38,6% и 6,9%, соответственно, по сравнению с исходом(р< 0,05), это свидетельствует о наличии ЭПД у изучаемых соединений (Рисунок 4). ЭНЗВД во всех исследуемых группах ЭНЗВД была сохранена. При введении нитро-Л-аргинина падение СМК по отношению к исходному уровню наблюдалось в меньшей степени у животных с ВНПГ- 15,4%, а в большей степени у животных, которым

вводили сулодексид - 36,7%. Снижение СМК в группах с ВНПГ, которым вводили производные ГАМК, составило 28,7% (соединение РГПУ-189); 24,2% (соединение РГПУ-147) и 21,6% (фенибут).

Введение АЦХ в нарастающих дозах и при многократном введении животным с ВНПГ, также подтвердило, что наиболее выраженное ЭПД выявлено у соединения РГПУ-189 в сравнении с другими производными ГАМК. По мере увеличения выраженности сосудистого ответа их можно распределить в следующем порядке фенибут < РГПУ-147 < РГПУ-189 < сулодексид (Рисунок 5).

Рисунок 5. Влияние исследуемых соединений на скорость церебрального кровотока у животных с ВНПГ при введении АЦХ в нарастающих дозах (А) и при многократном введении АЦХ (В).

Примечание: к рисунку 5 А: *-; **- различия статистически значимы по сравнению с группой животных с ВНПГ (р< 0,05; р< 0,01, непараметрический U-критерий Манна-Уитни), &-различия прироста СМК между дозами статистически значимы (р< 0,05). К рисунку 5 В: ''-различия статистически значимы по сравнению с группой животных с ВНПГ; *- различия статистически значимы по сравнению с 1 дозой; *- различия статистически значимы по сравнению с 5 дозой (р<0,05, непараметрический U-критерий Манна-Уитни).

Оценка влияния производных ГАМК на антитромботическую функцию эндотелия при ЭНПГ. В норме интактный эндотелий выполняет роль атромбогенного барьера между стенкой сосуда и циркулирующей кровью, препятствует ее свертыванию и тромбообразованию [Балуда В.П.1992, Долгов В.В., Свирин П.В., 2005]. Однако, при повреждении эндотелия сосуда ан-титромботический потенциал эндотелия может меняться на тромбогенный.

Изучение антитромботической функции эндотелия (АФЭ) у животных обоего пола при ЭНПГ показало, что наибольшие изменения происходили у самок с ЭНПГ (большее увеличение индекса агрегации тромбоци-тов(ИАТ), снижение индекса дезагрегации тромбоцитов(ИД), снижение индекса агрегации эритроцитов(ИАЭ) по сравнению с аналогичными показателями у самцов), поэтому дальнейшие исследования по изучению влияния производных ГАМК на АФЭ было проведено на самках.

Изучение влияния производных ГАМК на скорость тромбообразования у животных с ЭНПГ при аппликации 50% раствора хлорида железа(Ш) на ад-вентицию сосуда [Angelillo-Scherrer А., 2004] показало, что все исследуемые соединения обладают противотромбической активностью, однако в большей мере это проявляется у соединения РГПУ-189 и сулодексида. У животных с ЭНПГ, получавших соединения РГПУ-189, РГПУ-147, фенибут, пикамилон,

мексидол и сулодексид время до полной окклюзии сосуда в 1,42; 1,3; 1,16; 1,33; 1,37 и 1,52 раза, соответственно, по сравнению с ЭНПГ (Рисунок 6).

Рисунок 6.

фднябут

Влияние изучаемых соединений на скорость образования тромба у животных с

ЭНПГ.

Примечание: Л0-группа ложноолериро-ванных животных, ЭНПГ-группа животных с экспериментально вызванной недостаточностью половых гормонов.

При ЭД происходит изменение эндотелиального потенциала на прокоа-гулянтный, провоспалительный, тромбогенный, что в совокупности приводит к нарушениям в системе гемостаза. Поэтому при изучении АФЭ целесообразно дать оценку изменениям как сосудисто-тромбоцитарного, так и коа-гуляционного гемостаза.

Влияние исследуемых соединений на сосудисто-тромбоцитарный гемостаз при ЭНПГ. У животных с ЭНПГ отмечается увеличение агрегации тромбоцитов, об этом свидетельствует статистически значимое увеличение индекса агрегации тромбоцитов (ИАТ) на 70,22%, увеличение скорости агрегации тромбоцитов на 102,22% по сравнению по сравнению с группой ЛО животных (р<0,05)(Рисунок 7).

60

45

40

35

ф 30

и 25

20

15

10

гало ш энпг

Е2 РГПУ-189 НРГПУ-147

0 Фенибут И Пикамилон

1М ексидол Ш Сулодексид

Рисунок 7. Влияние изучаемых соединений на индекс агрегации (А), индекс дезагрегации (В), на скорость агрегации тромбоцитов (С) крови у животных с ЭНПГ.

Примечание-. &- различия статистически значимы по сравнению с группой ложнооперированных животных,*-; **- различия статистически значимы по сравнению с группой ЭНПГ (р<0,05, р<0,01-непараметрический и-критерий Манна-Уитни).

Это также согласуется с данными об увеличении скорости тромбообра-зования, то есть ЭНПГ снижает тромборезистентность сосуда (Рисунок 7). Введение соединений РГПУ-189, РГПУ-147, фенибута, пикамилона, мекси-дола и сулодексида животным с ЭНПГ приводило к снижению ИАТ на 27,74%; 13,9%; 8,96%; 26,45%; 25,4% и 34,8% по сравнению с группой ЭНПГ без ЭФТ, соответственно (р<0,05).

При введении соединений РГПУ-189, РГПУ-147, фенибута, пикамилона, мексидола и сулодексида происходило увеличение индекса дезагрегации (ИД) на 21,83%; 11,94%; 5,53%; 18,67%; 22,6% и на 37,61% по сравнению с группой ЭНПГ без ЭФТ, соответственно (р <0,05) (Рисунок 7).

Одним из специфических маркеров дисфункции эндотелия является изменение уровня фактора Виллебранда, который влияет на адгезию тромбоцитов к субэндотелию. В группе животных с ЭНПГ, уровень ФВ статистически значимо превышает уровень ФВ у ЛО животных на 58,62% ( р<0,05). Это, в определенной мере, объясняет увеличение процессов адгезии и агрегации тромбоцитов и увеличение скорости тромбообразования, характерных при повреждении эндотелия. Введение животным с ЭНПГ, производных ГАМК -соединений РГПУ-189, РГПУ-147, фенибута, пикамилона, мексидола и сулодексида приводило к снижению уровня ФВ на 32,7%; 29,7%; 24,7%; 28,45%; 32% и на 51%, соответственно, по сравнению с контрольной группой.

Влияние исследуемых соединений на коагуляционный гемостаз при ЭНПГ. В коагуляционном гемостазе выделяют три последовательные стадии: 1 Образование "протромбиназы"; 2)образование тромбина; 3) образование фибрина. На фоне ЭНПГ происходят нарушения в сторону гиперкоагуляции( укорочение показателя активированного частично тромбопластинового времени (АЧТВ) на 42,7 % по сравнению с группой ЛО животных). При этом введение животным с ЭНПГ исследуемых веществ, приводило к повышению данного показателя на 28,42% (пикамилон)< 29,38% (фенибут) <38% (РГПУ-147) < 55,4% (РГПУ-189) < 56,26% (мексидол) < 76,04% (сулодексид) по сравнению с результатами теста у контрольных животных, что может свидетельствовать об их антикоагулянтной активности, способности повышать ан-титромботический потенциал эндотелия.

Рисунок 8. Влияние исследуемых соединений и препаратов сравнения на АЧТВ при ЭНПГ Примечание: & ,*- - различия статистически значимы по сравнению с группой ЛО животных, с группой животных с ЭНПГ ( р<0,05, непараметрический и-критерий Манна-Уитни);

Протромбиновое время (ПВ) характеризует вторую фазу коагуляцион-ного гемостаза, внешний путь свертывания крови, активность протромбино-

]||||||| ЛО ЭНПГ РГПУ-189 РГПУ-147 Фенибут Пикамилои Моксидол Сулодек;

вого комплекса (факторов V,VII, X). Значения показателя ПВ в группе ЛО животных статистически значимо отличается от показателя ПВ в группе животных с ЭНПГ, в сторону снижения последнего ( р<0,01, t-критерий Стью-дента), что свидетельствует о процессах гиперкоагуляции, происходящих на фоне моделируемой патологии. Введение животным с ЭНПГ, соединений РГПУ-189, РГПУ-147, фенибута, пикамилона, мексидола и сулодексида повышало показатель ПВ в плазме на 44,2%, 33,09%, 20,8% 46,17%, 48,2% и 59,6%, соответственно, по сравнению с группой ЭНПГ без ЭФТ ( р<0,05, t-критерий Стьюдента)(Рисунок 9).

Рисунок 9. Влияние изучаемых соединений на протромбиновое время (MHO) при ЭНПГ.

Примечание: s ,*- - различия статистически значимы по сравнению с группой ЛО животных, с фуппой животных с ЭНПГ( р<0,01, р<0,05 t-критерий Стьюдента).

Повышение значение ПВ на фоне введения исследуемых веществ у животных с ЭНПГ может говорить о наличии у них антикоагулянтной активности. Так как главным инициатором внешнего пути свертывания (характеризуется ПВ) является тканевой фактор (ТФ), который увеличивает прокоагулянтную активность эндотелия, то способность исследуемых веществ повышать ПВ может косвенно свидетельствовать об их влиянии на ТФ.

При введении животным с ЭНПГ соединений РГПУ-189, РГПУ-147, мексидола и сулодексида было отмечено увеличение значения временных показателей протромбиновой активности (г) в 2,2; 2,35; 2,1 и 3,1 раза по сравнению с контрольной группой, соответственно. Значение показателя к (временной показатель тромбиновой активности) у животных с ЭНПГ, получавших соединение РГПУ-189 и соединение РГПУ-147 увеличивалось по сравнению с к группы ЭНПГ без ЭФТ в 2,8 и 2,1 раза, соответственно.

Нарушение функции эндотелия, как правило, приводит к увеличению вязкости, что оказывает влияние на реологию крови и ведет к снижению скорости кровотока. В ходе проведенного исследования было обнаружено статистически значимое увеличение показателей вязкости крови, в группе с ЭНПГ по отношению к ЛО животным во всем диапазоне скоростей сдвига. Введение животным с ЭНПГ, соединения РГПУ - 189 приводило к снижению вязкости крови на 12,71% при низких скоростях сдвига (10с-1). Во всем остальном диапазоне скоростей сдвига введение вещества РГПУ-189 практически не влияло на снижение вязкости крови. Введение сулодексида приводило к статистически значимому снижению вязкости крови при скорости сдвига 100 с-1 (на 12%) и при скорости сдвига 10 с-1 (16,5%), по сравнению с показателями вязкости у животных с ЭНПГ без ЭФТ. Полученные результаты подтверждаются и значениями индекса агрегации эритроцитов (ИАЭ). Так введение животным с ЭНПГ, соединения РГПУ-189 и Сулодексид статистически значимо снижало ИАЭ на 8,1% и 16,57%, соответственно, по сравне-

У U nil

ЛО ЭНПГ РГПУ-119 РГПУ-147 Фекибуг Пикам клон Мвксидол Сулодексид

нию с группой животных с ЭНПГ. Другие производные ГАМК статистически значимо не влияли на данный показатель2.

Одним из биохимических маркеров нарушения функции эндотелия является содержание фибриногена в плазме крови. Увеличение данного показателя приводит к увеличению вязкости крови, усилению процессов тромбооб-разования. У животных в группе с ЭНПГ содержание фибриногена в плазме увеличивалось на 66,02% по сравнению с группой Л О животных (р<0,01). При введении животным с ЭНПГ соединений РГПУ-189, РГПУ-147, фенибу-та, пикамилона, мексидола и сулодексида наблюдалось снижение содержание фибриногена в плазме на 19,4 %; 7,18%; 11,47%; 11,77%; 16,4% и 20,48%, соответственно, по сравнению с показателем контрольной группы(Рисунок 10).

Рисунок 10. Содержание фибриногена у животных под влиянием исследуемых соединений. Примечание: * -различия статистически значимы по сравнению с группой ЛО животных, с группой животных с ЭНПГ (р<0,05, ^критерий Стьюдента)

Одной из характеристик процесса фибринообразования, наряду с содержанием фибриногена в плазме (г/л) может служить фибрин - тромбоцитар-ная константа сгустка (АМ) и константа тотального свертывания крови (Т). Соединения РГПУ-189 и РГПУ-147 снижали значение АМ на 9,9% и 10,8%, соответственно, и увеличивали время тотального свертывания крови на 52,0% (РГПУ-189) и на 57,3% (РГПУ-147) по сравнению с показателем группы ЭНПГ без ЭФТ (р < 0,05), что также свидетельствует об их антикоа-гулянтной активности.

Показатель тромбинового времени (ТВ) характеризует течение конечного этапа свертывания крови - скорость превращения фибриногена в фибрин. При ЭНПГ происходит снижение антикоагуляционной активности плазмы (ТВ сократилось на 25,7% , по сравнению с ЛО животными ( р <0,05). Введение животным с ЭНПГ, соединения РГПУ-189, мексидола и сулодексида, приводило к удлинению ТВ на 29,6%, на 31% и 43,3%, соответственно, по сравнению с показателем в контрольной группе (р <0,05).

Известно, что женские половые гормоны играют важную роль в защите эндотелия [Адашева Т.В., 2007]. При угасании репродуктивной функции, то есть при снижении продукции женских половых гормонов возрастают риски тромбоэмболических осложнений. Так в группе животных с ВНПГ без ЭФТ, образование тромба происходило к 17 минуте. А в группах животных с ВНПГ, которым вводили соединения РГПУ-189, РГПУ-147, фенибут и суло-дексид время полной окклюзии сосуда равнялось 26; 24; 22,5 и 28 минутам, соответственно (Рисунок 11). Это может свидетельствовать о нормализации

2 Исследование выполнено совместно с к.м.н. Науменко Л.В., Сысоевой В.А. За что выражаем искреннюю благодарность им и зав. кафедрой, ЗДН, член-корреспонденту РАМН , д.м.н., проф. Спасову A.A.

антитромботических свойств эндотелия на фоне введения изучаемых соединений при ВНПГ. _

Рисунок 11. Влияние изучаемых соединений на процесс тромбообра-зования при возрастной недостаточности половых гормонов

Примечание:*- различия статистически значимы по сравнению с группой животных с ВНПГ ( р<0,05, р<0,01 непараметрический II-критерий Манна-

Уитни).

Усиление процессов тромбообразования на уровне гемостаза при ВНПГ можно проиллюстрировать изучением процесса агрегации тромбоцитов. Ан-тиагрегантную активность в большей степени оказали соединение РГПУ-189 и сулодексид, введение, которых привело снижению скорости агрегации тромбоцитов и ИАТ (на 35,25% и 36,63%), увеличению ИД (на 22,09% и 41,97 %) у животных на фоне возрастной менопаузы (Рисунок 12).

ШВНПГ

3 РГПУ-189 К РГПУ-147 В Фенибут 0 Сулодексид

У / /// У ^ У /у / У

время образования тромба, мин

I — - - ВНПГ - - - - РГПУ-1ЯЗ -

-Ф«нивут--РГПУ-147 -

максимальным наклон

индекс агрегации

индекс дезагрегации

Рисунок 12. Влияние изучаемых соединений на агрегацию тромбоцитов у животных с возрастной недостаточностью половых гормонов.

Примечание: *-; **- различия статистически значимы по сравнению с группой животных с ВНПГ (р<0,05, р<0,01 непараметрический 11-критерий Манна-Уитни).

Нарушения функции эндотелия прежде всего затрагивают N0- синтаз-ную систему, что приводит к уменьшению продукции N0 и как следствие снижению противоспалительной функции эндотелия. Уровень СРБ является маркером воспаления и дисфункции эндотелия [М. .ГатваЬ е! а11, 2007] и коррелирует с риском развития сердечно-сосудистых заболеваний [Карпов Ю.А., 2003; Демихова Н.В., 2009].

В группе животных с ЭНПГ содержание С - реактивного белка (СРБ) в плазме увеличивалось в 3,3 раза по сравнению с группой ЛО животных (р<0,05), что может свидетельствовать о наличии воспалительного процесса на фоне моделируемой патологии (Рисунок 13). Введение животным с ЭНПГ соединения РГПУ - 189, РГПУ - 147, фенибута, пикамилона, мексидола и сулодексида статистически значимо снижало содержание СРБ на 41,37%; 34,48%; 27,58%; 47,58%; 41,2% и на 58,62%, соответственно, по сравнению с показателем животных с ЭНПГ без ЭФТ (р<0,05) (Рисунок 13).

Рисунок 13. Влияние изучаемых соединений на уровень С - реактивного белка у животных с НПГ.

Примечание: * -различия статистически значимы по сравнению с группой ЛО животных, с группой животных с ЭНПГ (р<0,05, непараметрический U-критерий Манна-Уитни)

В настоящее время повышение в крови количества циркулирующих эн-дотелиоцитов (ЦЭ) рассматривается как индикатор ЭД, который отражает степень повреждения эндотелия [Петрищев H.H., 2001; Хорева М.А. 2008]. В группе JIO животных количество ЦЭ в крови находилось в пределах нормы (3,0±0,9). В то же время, у всех животных с ЭНПГ было выявлено статистически значимое повышение уровня ЦЭ в 2,9 раза (8,7±0,83, р<0,01), что сви-

Группа ЦЭ /100 мкл

ЛО животные 3,0±0,9

ЭНПГ 8,7±0,83* *

РГПУ-147 б,0±0,71 #

РГПУ-189 5,3±0,81 #

Фенибут 7,2±1,01

Сулодексид 4,3±1,01##

Таблица 2. Влияние исследуемых соединений на количество циркулирующих эндотелиоцитов при ЭНПГ

Причемание: ЦЭ - циркулирующие эндотелиоциты; * р<0,01 - различия статистически значимы по отношению к группе ЛО животных;

р<0,05; т - р<0,О1 - различия статистически значимы по отношению к группе животных с ЭНПГ (и-критерий Манна-Уитни)_

Введение животным с ЭНПГ соединений РГПУ - 189, РГПУ - 147, фе-нибута снижало количество ЦЭ в плазме в 0,64; 0,45 и 0,17 раза (р<0,05), соответственно, при этом, уступая сулодексиду (ЦЭ снижалось вдвое).

Данные морфологического и морфометрического исследований свидетельствуют о развитии сосудистой патологии с воспалительными изменениями и повреждением эндотелиальной выстилки церебральных сосудов у животных с ЭНПГ, при этом большие патологические изменения наблюдались в группе самок с ЭНПГ. Введение животным с ЭНПГ исследуемых соединений приводило к снижению степени отека стенки сосуда, тромбозов, признаков воспаления и пролиферации эндотелия, уменьшению деструкции эндотелиоцитов. По степени уменьшения влияния ЭНПГ, как повреждающего фактора эндотелия, исследуемые соединения следует расположить следующим образом: сулодексид > РГПУ - 189 > РГПУ - 147 > фенибут (Таблица З)3. Оценка влияния соединения РГПУ-189 на уровень половых гормонов. ЭНПГ приводит к статистически значимому снижению концентрации эстрадиола (в 3,27 раза) и увеличению концентрации ФСГ в сравнении с группой ЛО животных. Введение соединения РГПУ - 189 не оказало влияния на уровень концентрации эстрадиола, пролактина, однако повлияло на снижение концентрации ФСГ (в 0,81 раза) в сыворотке крови животных с ЭНПГ.

3 Исследование выполнено совместно с доцентом, к.м.н. Снигуром Г.Л. За что выражаем искреннюю благодарность ему и зав. кафедрой, доценту, д.м.н., Смирнову A.B.

Таблица 3. Морфологические признаки состояния эндотелия сосудов головного мозга при световой микроскопии у интактных, ЛО и животных с ЭНПГ, получавших _ изучаемые соединения ___

интакт ЛО ЭНПГ РГПУ-189 РГПУ-147 С Ф

1.Толщина интимы сосуда 1,б± 0,07 1,632± 0,09 1,24± 0,11# 1,54± 0,09** 1,4± 0,08* 1,47± 0,07** 1,32±0, 08

2,Соотношение интима/медиа 0,43± 0,1 0,44± 0,11 0,64±0, 0б# 0,5 2±0, 03* 0,54± 0,01* 0,47± 0,05** 0,60±0, 04

З.Огек,плазморрагия стенки сосуда нет негг ++ + + + +

4.Признаки воспаления нет нет +++ + + + +

5. Стаз, тромбоз нет нет +++ + + + ++

6 Десквамация, некроз эндо-телиоцитов нет нет +++ + + + ++

7.Увеяичение проницаемости эндотелия нет нет -Н-+ + нет нет ++

8. Пролиферация эндотелия нет нет ++-)- + + + ++

9. Величина ЯЦО эндоте-лиоцитов 0,5 б± 0,01 0,5 8± 0,02 0,21± 0,03## 0,5 0± 0,01** 0,44± 0,05** 0,41± 0,03** 0,31±0, 04

10. Размер ядер 3,21± 0,16 3,44± 0,19 1,77± о,ш# 2,21± 0,16* 2,42± 0,17** 2,32± 0,15** 1,92±0, 14

Примечания: ЯЦО - ядерно-цитоплазматическое отношение; интакт - группа интактных животных; ЛО -группа ложнооперированных животных; ЭНПГ - животные с экспериментально вызванной недостаточностью половых гормонов, С-животные с ЭНПГ, получавшие сулодексид; Ф- животные с ЭНПГ, получавшие фенибут. *'•" - различия статистически значимы по сравнению с группой животных с ЭНПГ (р<0,05; рс0,01,1 - критерий Стьюдента ); *"1 **" различия статистически значимы по сравнению с группой ЛО и интактных животных ( р<0,05; р<0,01,1 - критерий Стьюдента)

Снижение уровня эстрогенов приводит к увеличению количества атеро-генных липопротеинов, которые являются потенциально провоспалительны-ми факторами, агентами, уменьшающими образование эндотелиальной N0-синтазы [Лутай М.И., 2004]. Комплексно изменения липидного спектра крови отражает индекс атерогенности (ИА). Введение животным с ЭНПГ соединений РГПУ-189 и РГПУ-147, пикамилона, мексидола и сулодексида приводило к статистически значимому снижению уровня ИА на 23% и 26% , 31,03%, 42,44% и на 48,74% по сравнению с ИА животных с ЭНПГ без ЭФТ, соответственно (р <0,05).

Выводы

1. Недостаточность половых гормонов как возрастного, так и хирургического генеза приводит к нарушению эндотелийзависимой вазодилатации, снижению антитромботической функции эндотелия, развитию воспаления и структурных нарушений эндотелия, то есть к формированию эндотелиальной дисфункции в большей мере выраженной у самок, чем у самцов.

2. Производные ГАМК (соединение РГПУ-189, соединение РГПУ-147, фенибут, пикамилон) улучшают эндотелийзависимую вазодилатацию, повышают мощность и стабильность функционирования N0 системы у животных с ЭНПГ и ВНПГ.

3. Производные ГАМК (соединение РГПУ-189, соединение РГПУ-147, фенибут, пикамилон) обладают антитромботическими (увеличивают время образования тромба), антиагрегантными (снижают индекс агрегации, ско-

рость агрегации и повышают индекс дезагрегации тромбоцитов, снижают уровень фактора Виллебранда) свойствами и проявляют антикоагулянтную активность (увеличивают АЧТВ, протромбиновое и тромбиновое время, снижают уровень фибриногена и вязкость крови).

4. Производные ГАМК способны снижать количество циркулирующих эндотелиоцитов, уменьшать соотношение интима/ медиа, увеличивать ядер-но-цитоплазматическое отношение, улучшать противовоспалительную функцию эндотелия (снижать уровень С- реактивного белка, ИА, уменьшать морфологические признаки воспаления).

5. Все исследуемые производные ГАМК оказывали эндотелиопротектив-ное действие, выраженное в разной степени. По мере его убывания исследуемые производные можно расположить в следующем порядке: РГПУ-189 > пикамилон> РГПУ-147>фенибут.

Список опубликованных работ по теме диссертации:

1. Тюренков И.Н. Допплерографическое изучение эндотелиальной дисфункции церебральных сосудов крыс при недостаточности половых гормонов/ И.Н. Тюренков, А.В.Воронков, А.И. Робертус, С.А. Воскресенский, Д.В. Куркин // Региональное кровообращение и микроциркуляция.-200 7.-T.2I.-M1.-C.175-176.

2. Воронков A.B. Изучение «Jt - аргининового парадокса» для оценки эндотелиальной функции в норме и патологии/А.Б.Воронков, А.И. Робертус, И.Н.Тюренков //Региональное кровообращение и микроциркуляция. .-2Q0S.-T.27.-Mi.-C.S4S8.

3. Тюренков И.Н. Оценка мощности эндотелиальной системы синтеза эндогенного N0, с помощью многократного введения ацетилхолина/И.Я. Тюренков, А.В.Воронков, А.И.Робертус, И.К.Зашпсниди, С.А.Воскресенский//Региональное кровообращение и микроциркуляция.-2009.-Т.29. -М8.-С. S0-53.

4. Тюренков И.Н. Изучение дисфункции эндотелия у животных с экспериментально вызванной недостаточностью половых гормонов / ИЛ. Тюренков, А.В.Воронков, А.И. Робертус//Кардиология.-2009.-М5.-С64 - 65.

5. Тюренков И.Н. Недостаточность половых гормонов. Эндотелиальная функция и ее коррекция эстрогенами/И.Н.Тюренков, А.В.Воронков, А.И. Робертус// Экспериментальная и клиническая фармакология,-2009.-Т. 72.-М6.-С.57-59.

6. Тюренков И.Н. Развитие эндотелиальной дисфункции при недостаточности половых гормонов// И.Н.Тюренков, А.В.Воронков, А.И, Робертус//Патологическая физиология и экспериментальная терапия.-2009.-№4.-С.ЗЗ-36.

7. Тюренков И.Н.Изучение скорости локального мозгового кровотока с модификацией синтеза эндогенного оксида азота на фоне недостаточности половых гормонов у крыс обоего пола/ И.Н.Тюренков, А.В.Воронков, А.И.Робертус, С.А.Воскресенский, Д.В.Куркин, А.А.Слиецанс, Г.В.Драгилев // Научные труды VII международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI веке» 23-26 ноября 2006 г., - Москва, 2006. - С. 510-511.

8. Воронков A.B. Влияние нового производного ГАМК на мозговой кровоток в условиях подавления и усиления синтеза эндогенного оксида азота на фоне ишемии мозга/ А.В.Воронков, А.И.Робертус, O.A.Воскресенский, Д.В. Куркин // Сборник трудов III Международной медико-фармацевтической конференции студентов и молодых ученых Черновцы,- Украина.- 2006.-С.115.

9. Тюренков И.Н. Влияние оварюктомии на мнестические и когнетивные процессы животных с оценкой эндотелиальной функции церебральных сосудов кастрированных крыс / И.Н.Тюренков, А.В.Воронков, А.И.Робертус, С.А.Воскресенский, Д.В.Куркин, А.А.Слиецанс // Научные труды VIII международного конгресса «Здоровье и образование в XXI веке; концепции болезней цивилизации» 14-17 ноября 2007 г., РУДН.-Москва.-2007.-С.639-640.

10. Тюренков И.Н. Фармакологическая коррекция эндотелиальной дисфункции, вызванной гормональной недостаточностью / И.Н.Тюренков, А.В.Воронков, А.И.Робертус //Психофармакология и биологическая наркология: материалы Ш съезда фармакологов России 23-27 сентября 2007г. Санкт-Петербург: Фармакология- практическому здравоохранению.-Санкт-Петербург.-2007.-Т.7.-Спец.вып., часть 2.-С.2-1983.

11. Тюренков И.Н. Морфологические изменения эндотелиоцитов мозга крыс с экспериментально

вызванной недостаточностью половых гормонов/ И.Н.Тюренков, А.В.Воронков, А.И.Робертус, А.А.Воробьев, С.В.Поройский, А.В.Поройская // Человек и лекарство: тезисы докладов 15-го Российского национального конгресса 14-18 апреля 2008г. -Москва, 2008. - С. 421.

12. Тюренков И.Н. Диагностика эндотелиальной функции в эксперименте/ /И.Н.Тюренков, А.В.Воронков, А.И.Робер1ус, И.К.Заитениди, С.А.Воскресенский //Ангиология и сосудистая хирургия,-2008.-T. 14.-№3 .-Приложение.-С. 155-156.

13. Тюренков И.Н.Основные методические приемы изучения эндотелиальной функции в эксперименте/ И.Н.Тюренков, А.В.Воронков, А.И.Робертус, А.А.Воробьев, С.В.Поройский //Бюллетень НЦССХ им.А.Н,Бакулева РАМН сердечно-сосудистых заболеваний. Приложение №1: тезисы докладов и сообщений XIV Всероссийского съезда сердечно-сосудистых хирургов 9-12 ноября 2008,-Москва,-2008.-Т.9.-№6.-С. 156.

14. Робертус А.И. Влияние структурного аналога ГАМК соединения РГПУ-189 на функцию эндотелия у животных с экспериментально вызванной недостаточностью половых гормонов/ А.И. Робертус //Материалы 67-й открытой научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием. Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины,-Волгоград.-2009.-С. 180-181.

15. Тюренков И.Н. Изучение влияния производного ГАМК РГПУ-189 на эндотелиальную функцию на фоне недостаточности половых гормонов/ И.Н.Тюренков. А.В.Воронков, А.И.Робертус // Гемореология И микроциркуляция (от функциональных механизмов в клинику)/ материалы международной научной конференции. - Ярославль: Изд-во ЯГПУ им. К.Д. Ушинского, 2009. - С.207,

16. Воронков A.B. Определение десквамированных эндотелиоцитов в крови крыс с недостаточностью половых гормонов/ А.В.Воронков, И.Н.Тюренков, А.И.Робертус, А.А.Слиецанс, Д.В.Куркин //Человек и лекарство: тезисы докладов 16-го Российского национал, конгресса 2009г. - Москва, 2009. - С.635.

17. Тюренков И.Н. Недостаточность половых гормонов, эндотелиальная дисфункция и коррекция ее ГАМК-ергическими средствами/ И.Н.Тюренков, А.В.Воронков, А.И.Робертус, Петрова Е.В. // Материалы VIII Съезда кардиологов ЮФО 27-29 мая 2009 г.- Ростов-на-Дону,- 2009.-С.201-202.

18. Робертус А.И. Оценка взаимосвязи между уровнем фибриногена и скоростью тромбообразования у животных с недостаточностью половых гормонов на фоне введения производного ГАМК РГПУ-189/ А.И. Робертус, А.В.Воронков// Сборник трудов межвузовской научной конференции, посвященной памяти профессора Владислава Васильевича Пичугина и 75-летию КГМУ. «Актуальные вопросы фармакологии и фармации» 400с ,-Курск.-2009.-С.308-309.

19. Тюренков И.Н. Эндотелиопротективное действие структурных аналогов ГАМК/ И.Н.Тюренков, А.В.Воронков, А.И.Робертус, А.А.Слиецанс, Е.ВЛетрова, Д.В.Куркин//Сборник научных трудов (под редакцией академика РАМН В.И.Петрова) 56-ой региональной научно-практической конференции профессорско-преподавательского коллектива ВолГМУ: Инновационные достижения фундаментальных и прикладных мед.исследований в развитии здравоохранения Волгоградской обл.. Издательство ВолГМУ.-Волгоград.-2009,- С.289-291.

20. Тюренков И.Н. Морфологическая оценка эндотелиальной дисфункции, в сосудах почек крыс обоего пола, с экспериментально вызванной недостаточностью половых гормонов/ И.Н.Тюренков, АБ.Воронков, Г.Л.Снигур, С.В.Поройский, А.В.Поройская, А.И.Робертус, А.А.Слиецанс, Е.ВЛетрова// Сборник трудов научно-практической конференции «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической морфологии» посвященной памяти член корр. РАМН, з.д.н. РФ, д.м.н., проф. ВЛШисарева.- Волгоград.-2010.-С.145-149.

21. Робертус А.И. Изучение антитромботической активности производного ГАМК РГПУ-189 в условиях эндотелиальной дисфункции при экспериментально вызванной недостаточностью половых гормонов / РобертусА.И., Воронков A.B.// Вестник РГМУ. Периодический медицинский журнал. - М.: ГОУ ВПОРГМУ Росздрава. - 2010, Специальный выпуск № 2. -С.542.

Список сокращений

NO-оксид азота СМК - скорость мозгового кровотока

АЦХ - ацетилхолин ЭД" эндотелиальная дисфункция

АФЭ - антитромботическая функция ЭЗВД" эндотелийзависимая вазодилатация

эндотелия ЭНЗВД - эндотелий независимая

ВНПГ - возрастная недостаточность вазодилатация

половых гормонов ЭНПГ-экспериментально вызванная

ГАМК - гамма-амино-масляная кислота недостаточность половых гормонов

НПГ - недостаточность половых гормонов ЭПД" эндотелиопротективное действие

ЭФТ - экспериментальная фармакотерапия

Подписано в печать -9,09 .2010 г. Заказ № 568 • Тираж 100 экз. Печ. л. 1,0 Формат 60 х 84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная.

Типография ИУНЛ Волгоградского государственного технического университета. 400131, г. Волгоград, просп. им. В.И. Ленина, 28, корп. №7