Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Экспрессия трансформирующего фактора роста бета и фактора некроза опухолей альфа в процессе ответа макрофага на активацию

\

На правах рукописи

РГБ ОД * 7 ЯНГ 2111

ЗУБОВА Светлана Геннадьевна

ЭКСПРЕССИЯ ТРАНСФОРМИРУЮЩЕГО ФАКТОРА РОСТА БЕТА И ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ АЛЬФА В ПРОЦЕССЕ ОТВЕТА МАКРОФАГА НА АКТИВАЦИЮ

Специальность -14.00.14 - Онкология 03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2000

Работа выполнена:

- в лаборатории онкоиммунологии (заведующий - д.м.н., профессор В. Б. Окулов) НИИ онкологии им. проф. H.H. Петрова МЗ РФ;

- в лаборатории Radiobiologie Applique'e (руководитель - профессор Ф.Дабурон) INRA, Франция.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор В.Б. Окулов

доктор биологических наук С.Д. Иванов

Официальные оппоненты:

- доктор биологических наук, профессор В.Н. Кокряков

- доктор медицинских наук М.А. Забежинский

Ведущая организация: Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. академика И. П. Павлова.

Защита состоится "_"_2000 г. в _часов на заседании

диссертационного совета (К.074.38.01) в НИИ онкологии им.проф. Н.Н.Петрова МЗ РФ (189646, Санкт-Петербург, Песочный-2, Ленинградская ул., д.68).

Автореферат разослан"_"_1999 г.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ онкологии им. проф. H.H. Петрова МЗ РФ

Ученый секретарь Специального совета,

доктор медицинских наук Е.В. Дёмин

PSi

О ч

2L-V / L/

Актуальность исследования. В последние годы макрофаг (МФ) вновь привлекает к себе внимание исследователей как клетка с чрезвычайно широким спектром биологической активности. Известно, что МФ является ключевой клеткой воспаления, антиген-презенгорующей клеткой, участвует в противовирусной, противомикробной, противоопухолевой защите, в регенерации, репарации тканей и координирует функции различных звеньев иммунной системы. Показано, что активированный МФ продуцирует свыше 100 биологически активных веществ, от простейших по составу молекул - свободных радикалов кислорода до высокомолекулярных белковых соединений, среди которых протеолитические ферменты и ростовые факторы с разнонаправленными эффектами (Nathan С., 1991). Поэтому активация МФ может приводить как к стимуляции, так и к подавлению роста опухоли, что стало особенно очевидным после всесторонних исследований трансформирующего фактора роста бета (ТФР-бета) и фактора некроза опухолей альфа (ФНО-альфа) - противоположных по эффектам цитокинов, синтезируемых активированными МФ. Именно этим соединениям отводят первостепенную роль в эффектах МФ как in vivo, так и in vitro (Grotendorst R.G. et а!., 1969). ФНО-альфа обладает сильным провоспалительным и катаболическим действием, антимикробной и противоопухолевой активностью (Nacy С.А. et al., 1991). Напротив, ТФР-бета ускоряет заживление ран, обладает противовоспалительным эффектом, предотвращает или ослабляет септический шок, способен усиливать опухолевый рост как путем непосредственного влияния на пролиферацию опухолевых клеток, так и посредством иммуносупрессивной активности (Wahl S.M. et al., 1988). Кроме того, важным событием, способствующим профессии опухоли, является усиление неоангиогенеза и пролиферации фибробластов, что в значительной степени зависит от ТФР-бета (Roberts AB. et al., 1986). Поэтому считается, что ТФР-бета является основным причинным фактором в фиброзировании тканей при локальном облучении, часто используемом для лечения новообразований. Поскольку имеющиеся в литературе сведения, касаются преимущественно поздних эффектов ионизирующей радиации на экспрессию ТФР-бета, данные о его экспрессии на ранних сроках после облучения представляются важными с точки зрения той роли, которую играет данный фактор в инициации процессов фиброзирования.

Изучение динамики ответа МФ на облучение представляет особый интерес, поскольку различные виды облучения применяются при лечении многих патогенетических процессов, что нередко приводит к неограниченному разрастанию соединительной ткани. Данные литературы, касающиеся изменения функциональной активности МФ под действием радиации, немногочисленны и противоречивы. Согласно данным одних авторов, изучавших влияние ионизирующей радиации на МФ в условиях in vitro, общее облучение мышей усиливает фагоцитарную и цитотоксическую активности МФ (Е.И. Хпоповская и соавт., 1993); по данным других авторов - ионизирующая радиация подавляет цитотоксическую активность МФ (Keller R., 1979; Kubota Y. et al., 1994). Уточнение ответа на этог вопрос представляется необходимым для выяснения того влияния, которое оказывают опухолеассоциированные МФ при проведении курса лучевой терапии на рост опухоли. С этой точки зрения вызывает интерес сравнение влияния ионизирующей радиации и действия

классических иммуномодуляторов на функциональный статус МФ, в том числе на экспрессию ТФР-бета и ФНО-альфа.

Продутая и синтез ТФР-бета и ФНО-альфа тесно взаимосвязаны и регулируются посредством положительной и отрицательной обратной связи, в том числе по аутокринному принципу. Поэтому любая попытка индуцировать противоопухолевую активность МФ путем усиления экспрессии и синтеза ФНО-альфа будет сопровождаться секрецией "проопухолевого" цигокина ТФР-бета. Ситуация осложняется тем, что активация МФ наступает вследствие практически любого экзогенного воздействия (цитостатиками, иммуномодуляторами, облучением), а также под воздействием эндогенных факторов - продуктов распада опухолевых клеток, вторичного инфицирования некротических участков и т.д.

Имеющиеся в литературе данные по экспрессии и синтезу ТФР-бета и ФНО-альфа активированными МФ относятся, главным образом, к реакциям, ограниченным 2-3 днями (Assoian RK. et al., 1987). С онкологической точки зрения значительно большую важность имеют отдаленные последствия активации МФ, а точнее - динамика продукции этих полифункциональных цитокинов в процессе ответа МФ на активацию, что более адекватно отражает патогенез опухолевого процесса. Изучение этой проблемы представляется актуальным для последующего исследования возможностей направленной модуляции активированных МФ с целью рационального вмешательства во многие патологические процессы, в том числе в опухолевый рост.

Целью работы1 является установление закономерности динамики экспрессии ТФР-бета и ФНО-альфа в процессе ответа МФ млекопитающих на активацию модуляторами биологического ответа и воздействие ионизирующей радиацией в связи с проблемой злокачественного роста.

В рамках этой цели были сформулированы следующие задачи:

1. Определить динамику экспрессии ТФР-бета и ФНО-альфа и функциональный фенотип МФ мышей после воздействия вакциной БЦЖ in vivo.

2. Определить динамику экспрессии ТФР-бета и ФНО-альфа и функциональный фенотип МФ после воздействия бактериального липополисахарида (ЛПС) in vitro.

3. Определить динамику экспрессии ТФР-бета и ФНО-альфа и функциональный фенотип МФ после общего однократного гамма-облучения ионизирующей радиацией.

4. Определить экспрессию ТФР-бета при местном воздействии ионизирующей радиации на кожу животных in vivo.

Научная новизна работы. Принципиально новым является комплексный анализ ранних и отсроченных по времени последствий активации МФ модификаторами биологического ответа и ионизирующей радиацией на функциональном, биохимическом и молекулярном уровнях.

Установлена одновременная экспрессия противоположных по основным биологическим эффектам на ткани цитокинов ТФР-бета и ФНО-альфа после воздействия на МФ различных активаторов.

Научно-практическое значение. Сведения о последствиях активации МФ на ранних и последующих этапах после воздействия представляют практический интерес, т.к. именно они имеют наиболее существенное значение для роста опухоли. Это особенно актуально в связи с продемонстрированной в работе активацией рост-стимулирующей активности МФ под воздействием ионизирующей радиации, как одного из основных компонентов комплексного лечения больных со злокачественными опухолями. Выявленная повышенная экспрессия ТФР-бета на ранних сроках после действия гамма-радиаций доказывает участие МФ в патогенезе пострадиационною фиброза.

Апробация работы. Результаты исследования обсуждались на научных лабораторных конференциях НИИ онкологии им. проф. Петрова, материалы диссертации были доложены на 4-й Международной конференции «Спид, рак и родственные проблемы» (Санкт-Петербург, 1996), на 1-ом съезде онкологов стран СНГ (Москва, 1996), 10-ом симпозиуме по молекулярной биологаи гемопоэза (Гамбург, 1997) и международной конференции по макрофагам (Париж, 1998).

На защиту выносятся следующие основные положения:

1. Стимуляция цитотоксических свойств макрофагов классическими активаторами ЛПС, БЦЖ сопровождается не только повышением экспрессии цитотоксического фактора ФНО-альфа, но и экспрессией ТФР-бета - цитокина, обладающего отчетливым росг-стимулирующим эффектом на злокачественные клетки и способным подавлять противоопухолевые цитотоксические эффекты макрофагов.

2. Ионизирующая радиация является активатором цитотоксической и росг-сгимулирующей активности макрофагов. При облучении опухолевых клеток и макрофагов in vitro макрофаги способны защищать злокачественные клетки от действия радиации.

3. Экспрессия ТФР-бета, являющегося основным медиатором посперадиационного фиброза, выявляется на ранних сроках после локального и общего облучения.

Структура диссертации. Диссертация изложена на 116 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов и списка литературы ( 206 источников, в том числе 18 отечественных). Работа проиллюстрирована 12 рисунками, содержит 7 таблиц.

По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования служили перитонеальные МФ мышей и моноциты периферической крови человека, выделенные из крови здоровых доноров. В работе использовались самцы мышей линии BALB/C в возрасте 1-1,5 месяца и массой 18-20 г (питомник «¿Рапполово», РАН). Лейковзвесь донорской крови была получена на отделении переливания крови в НИИ онкологии им. проф. H.H. Петрова МЗ РФ. Изучение экспрессии ТФР-бета после локального облучения проводилось в коже свиней (mini pig).

Для локального облучения кожи свиней использовался источник 1921г (мощность дозы 14 Гр/мин). Локальная доза облучения кожи для каждого животного составила 64 Гр.

Мыши BALB/C были подвергнуты общему однократному облучению в дозе 4 Гр на рентгеновской установке ИГУР-1 ( Cs, мощность дозы 1,34 Гр/мин). Облучение МФ в модели in vitro для изучения их функциональной активности производили на установке ИГУР-1 в дозе 8 Гр.

Для изучения влияния облучения на пролиферативную активность перитонеальных МФ клетки облучали после 18 часов культивирования в дозах О; 0,1; 0,2; 1,2; 4; 8; 12 Гр на той же установке.

В качестве клеток-мишеней служили клеточная линия KB (карцинома ротовой полости человека), а также линии трансформированных фибробластов мыши ЮТ 1/2 и L929.

Живую вакцину БЦЖ (Bacillus Calmett-Guerin) мышам вводили внутрибрюшинно в дозе 1 мг в 0,5 мл изотонического раствора натрия хлорида. Для исследования функциональной активности МФ использовали супернатанты активированных МФ, полученных по методу, описанному ранее (OiailoW. B.etal., 1992).

-На разных сроках после введения вакцины МФ высевали в 96-луночные культуральные платы в количестве 1*105 /мл в среду RPMI-1640 (Serva, Germany), содержащую 2% эмбриональной сыворотки, глутамин и антибиотики. После 18 часов культивирования в стерильных условиях культурапьную среду собирали и сохраняли при температуре минус 70" С. Контролем служили МФ мышей, которым вакцина не вводилась.

При проведении экспериментов in vitro перитонеальные МФ высаживали в 96-луночные планшеты и активировали ЛПС (Sigma, USA) в конечной концентрации 1 мкг/мл.

Определение цитотоксической и рост-стимулирующей активности МФ проводили стандартным радиометрическим методом согласно Lewis J.G., Adams D.O., (1987); OkuIOv V, В. et'al., (1992).

Для изучения непосредственного влияния МФ на клетки-мишени, высаженные в полную культурапьную среду RPMI-1640, перитонеальные МФ мышей в концентрации . 2М04 / мл культивировали в 96-луночном планшете в течение 72 часов. После этого культуральную среду полностью заменяли на новую и вносили клетки-мишени в концентрации 1*1 (^/мл. Одновременно в лунки вносили ЛПС в концентрации 1 мкг/мл или облучали в дозе 8 Гр на установке ИГУР-1. Пролиферацию клеток-мишеней определяли через 24 часа ко культивирования по включению 3Н-Тимидина.

В эксперименте по изучению влияния радиации на активность перитонеальных МФ часть клеток облучали предварительно в дозе 8 Гр до внесения клеток-мишеней. Контролем в этих экспериментах служили клетки-мишени, культивировавшиеся совместно с МФ и не подвергавшиеся радиационному воздействию, а также клетки-мишени, которые культивировали изолированно от МФ.

Лейковзвесь донорской крови, стабилизированная антикоагулянтом CFDA-1 (Baxter, USA), была получена на отделении переливания крови НИИ онкологии им. проф. Петрова МЗ РФ. Лейковзвесь разливали в стерильных условиях в центрифужные пробирки. Клетки выделяли согласно методу Hardin J.А. и Downs J.T., (1981) и высаживали в 96-луночный планшет в количестве 1«105/мл культуральной среды RPMI-1640, содержащей 2% телячьей эмбриональной сыворотки. Моноциты активировали внесением ППС в количестве 1 мкг/мл или облучали на гамма-установке ИГУР-1 в дозе 8 Гр. Функциональную активность моноцитов оценивали рутинным методом по включению 3Н-Тимидина клетками-мишенями.

Концентрацию ФНО-альфа и ингерлейкина-1 (Ил-1) в супернатантах активированных МФ определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа в "сендвич"- варианте (Кэтти Д., Райкундалиа Ч., 1991) с использованием набора реактивов, полученных на базе НИИ ОЧБ.

Определение содержания ТФР-бета1 в супернатантах активированных и облученных МФ проводили с использованием набора Quantikine (R&D systems, USA) по методу, описанному производителем.

Оценку экспрессии генов ТФР-бета и ФНО-альфа в перитонеальных МФ мыши проводили методом гибридизации in situ (Kanz et al., 1988), который позволяет выявлять специфические последовательности РНК в отдельных клетках При помощи данного метода оценивалось количество клеток, экспрессирующих исследуемые гены, а также интенсивность их экспрессии.

Для проведения реакции гибридизации in situ использовали фрагмент 4 экзона гена ФНО-альфа мыши, клонированный по сайтам Xho/Eco RI, предоставленный С.А. Недоспасовым (НИИ молекулярной биологии, РАН, Москва). Фрагмент гена ФНО-альфа имел протяженность 696 пар нуклеотидных оснований.

В работе была использована также нуклеотидная последовательность гена ТФР-бета 1 человека, клонированная по сайту Eco R1 в плазмиде pGEM-3Z. Фрагмент ДНК имел протяженность 1,1 тысяч пар оснований.

Меченые ДНК зонды получали, используя реакцию ник-трансляции, при которой комплементарная цепь ДНК строится с включением меченого Р -dCTP.

После проведения реакции гибридизации на стекла наносили радиочувствительную фотоэмульсию ЗМ, и проводили экспозицию в течение 1842 часов при +4°С в темноте. Экспрессию исследуемых генов определяли под микроскопом при 100-кратном увеличении.

Для определения экспрессии мРНК и синтеза ТФР-бета в коже свиней после локального облучения использовали соответственно «Nothem» и «Western» блот анализы (Маниатис Т. и соавт, 1984). Эта часть работы была проведена в лаборатории Radiobiologie Applique'e (INRA, France) под руководством Dr. M. Martin.

Через 6 часов после облучения образцы кожи свиней отделяли хирургическим путем и замораживали при температуре -80°С и использовали

для изучения экспрессии ТФР-бета. В качестве контроля были собраны необлученные участки кожи. Протеины ТФР-бета были экстрагированы из кожи по методу, описанному Roberts АВ. et al. (1980).

После проведения вертикального электрофореза и переноса белков на нигроцеллюлозную мембрану инкубацию с ТФР-бега1 антителами (R&D Systems, USA) проводили 3 ч при комнатной температуре. Конечная концентрация антител составила 0,5 нг/мл. Отмывку избытка антител осуществляли трижды в растворе PBS с добавлением Твин (0,1%), а затем наносили антикроличий иммуноглобулин, меченный пероксидазой хрена, предварительно разведенный до концентрации 1 нг/мл в растворе PBS-Твин (0.1 %) и BSA (3%). Инкубацию проводили 1 час при комнатной температуре.

Для определения количества белка ТФР-бета использовали набор для ECL detection (Amersham, Great Britain).

РНК выделяли используя кислотно-фенольно-хлороформный метод (Chomczynski et al., 1987). Выделение мРНК, включающее осаждение полиаденилированной мРНК на олиго dT целлюлозе и ее очистку от общей массы эукариотической РНК, проводили с использованием специальных колонок (mRNA Purification Kit, Pharmacia Biotech; Shweden).

Для переноса препаратов мРНК из геля агарозы на нитроцеллюлозный фильтр использовали процедуру, впервые описанную F.Southem (1978).

Мечение ДНК-зонда, специфичного к ТФР-бета1, осуществляли в реакции nick-трансляции путем встраивания меченых нукпеотидов, несущих в альфа-положении фосфатные группы или ЮР ("Amersham", Great Britain).

Реакцию nick-трансляции проводили в течение 2 часов при 15° С.

Для очистки меченой ДНК зонда ТФР-бета1 от ЮР дЦТФ, не вступившего в реакцию, проводилйсХроматографию на колонках с сефадексом G-50 (Pharmacia, Sweden).

Повторную гибридизацию проводили с рибосомной 18S РНК с целью установления эквивалентности внесения образцов мРНК. Для гибридизации использовалась коммерческая проба 18S РНК (Sigma, USA).

Статистическую обработку результатов проводили при помощи статистических программ Excel 7 с использованием t-критерия Стьюдента и непараметрического метода Вилкоксона-Манна-Уитни.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Экспрессия ТФР-бета и ФНО-альфа активированными макрофагами мыши.

Для изучения изменений активности перитонеальных МФ мышей под влиянием вакцины БЦЖ были проведены эксперименты в системе in vitro на различных сроках после введения вакцины. Было установлено, что МФ, активированные БЦЖ, продуцируют высокий уровень как рост-ингибирующих, так и рост-стимулирующих субстанций. При воздействии супернатантов культивируемых МФ на клеточную линию KB отмечалось проявление ингибирующих эффектов на 0, 1, 3 и 5 сутки, а действие рост-стимулирующих продуктов МФ начиналось спустя 3 недели с момента активации МФ и было

наиболее выражено на 23, 25, 35 и 40 сутки (рис. 1а). На линии фибробластсв мыши 10Т1/2 рост-ингибирующие эффекты супернатантов проявлялись на 3, 5, 7, 15 и 17 дни после активации МФ, а рост-стимулирующая активность была наиболее выражена, начиная с 19 дня после введения БЦЖ (рис. 16). На основании полученных данных можно заключить, что в процессе активации МФ проходят ряд фаз, сопровождающихся сменой их функциональной активности во времени. Полученная нами динамика ответа МФ на активацию вакциной БЦЖ согласуется с работами С. А. Громова и соавт. (1989), доказывающими, что за цитотоксической фазой ответа МФ на активацию следует более продолжительная фаза, в течение которой МФ секретируют преимущественно рост-стимулирующие субстанции. Такой характер ответа МФ на активацию обеспечивает разделение разнонаправленных эффектов во времени, что соответствует изначально двойственной роли МФ в процессах заживления ран. Вместе с тем, разделение фаз раневого процесса - результат системной работы множества звеньев клеточных элементов и гуморальных факторов. На основании этого можно предполагать, что время проявления той или иной активности МФ не детерминировано генетически, а определяется балансом активационных и регуляторных факторов.

На рис. 1а и 16 представлена также динамика синтеза ТФР-бета МФ, активированными БЦЖ в сопоставлении с их рост-ингибирующим и рост-стимулирующим потенциалом. Через 6 часов после активации МФ секреция ТФР-бета незначительно увеличивалась и на следующий день достигала максимума, превосходя контрольный уровень в 3 раза. Следует отметить, что увеличение секреции ТФР-бета носило периодический характер, так как и в дальнейшем, на 15 и 25 дни наблюдалось еще два максимума секреции этого фактора. На протяжении всех 40 дней наблюдения уровень ТФР-бета; в общем, был повышенным по сравнению с исходным значением.

На клеточной культуре 10Т1/2 прямая корреляция между макрофагальными эффектами и секрецией ТФР-бета также отсутствовала, но росг-сгимулирующие свойства МФ проявлялись более интенсивно, чем на клеточной линии КВ. Возможно, продолжительная секреция ТФР-бета изменяет активность МФ таким образом, что на поздних сроках после введения БЦЖ их рост-стимулирующие потенции становятся более выражены. Не подлежит сомнению тот факт, что в супернатантах МФ находится множество других регуляторных факторов, суммарная активность которых и определяет наблюдаемую реакцию клеток-мишеней.

Обращает на себя внимание то обстоятельство, что ответ МФ на активацию имеет колебательный характер. Не исключено, что такая флюктуация активности МФ играет роль регулятора межклеточных взаимодействий в процессе заживления ран.

т 700

3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 35 40 День после активации

7 9 11 13 15 17 19 2123 25 27 29 35 40 День после активации

б

Рисунок 1. Цитотоксическая и рост-стимулируюицая активность перитонеальных макрофагов мыши, активированных вакциной БЦЖ.

а. Клетки-мишени КВ, 6.Клетки-мишени фибробласты ЮТ 1/2. Ломаной линией показана концентрация ТФР-бета. * Различия достоверны относительно контроля, р<0,05

Таблица 1

Экспрессия генов ТФР-бета и ФНО-альфа пэритонеальными макрофагами мышей после активации ¡n vivo вакциной БЦЖ.

День послб Процент Интенсивность

активации меченых клеток метки

ТФР-бета Контроль 0,3 +++

1 0

2 0,2 ++

5 9 ++++

7 1 +++

23 1 ++

29 1,5 +++

ФНО-апьфа Контроль 0

1 7 ++++

3 3 ++++

5 0

7 О

9 1 +++

23 0

. 25 0

29 0

Методом in situ гибридизации было выявлено, что в МФ, активированных БЦЖ, возрастание мРНК ТФР-бета имело место на 5 день после активации (табл. 1). Определенный уровень экспрессии ТФР-бета отмечается также и в контроле, что свидетельствует о его конститутивной экспрессии. По данным Assoian и соавторов (1987) мРНК ТФР-бета экспрессируется в одинаковой степени в интактных и активированных МФ через 24 часа после воздействия ЛПС, однако, более поздние сроки после активации МФ в обсуждаемой работе не рассматриваются. Кроме того, этими же исследователями было установлено, что активация ЛПС индуцирует секрецию ТФР-бета уже через 24 часа. В нашем исследовании не наблюдалось увеличения экспрессии мРНК ТФР-бета в первые дни после активации. Полученная динамика экспрессии мРНК ТФР-бета в сравнении с концентрациями ТФР-бета в супернатантах активированных МФ позволяет предположить, что повышение синтеза этого фактора, наблюдаемое в 1 день после введения БЦЖ, осуществляется с использованием белка, депонированного в клетке. Экспрессия гена ФНО-альфа увеличивается в 1 и 3 дни после активации МФ вакциной БЦЖ и практически отсутствует в контроле (табл. 1). В дальнейшем незначительное увеличение присутствия мРНК этого фактора в клетке наблюдалось на 9 день после введения вакцины. Полученный результат согласуется с данными других авторов о индуцибельном характере экспрессии ФНО-альфа (Nacy et al., 1991; Koemeret al., 1987).

В проведенном нами исследовании подтвердилась способность МФ оказывать значительное рост-стимулирующее действие на опухолевые клетки. Периодический характер проявления МФ стимулирующей активности на опухолевый рост ставит под сомнение существование у МФ эволюционно закрепленного, специфического противоопухолевого ответа. Поскольку МФ осуществляют только первый этап распознавания антигенов, не идентифицируя их структуру и конформацию, то трансформированная клетка своего организма может восприниматься только как чужеродная. Это предположение позволяет объяснить, почему характер ответа МФ на присутствие опухолевых клеток соответствует раневому типу и сопровождается облигатной продукцией ростовых факторов.

- Динамика ответа перитонеапьных макрофагов мыши и моноцитов периферической крови (МПК) человека на активацию ЛПС.

Изменения концентрации ФНО-апьфа, ТФР-бета и ИЛ-1 в культуральной среде моноцитов периферической крови человека после активации ЛПС in vitro представлены в таблице 2. Можно видеть, что все эти цитокины присутствовали в супернатантах активированных МФ в значительно большей концентрации, чем до активации. В общем их" концентрация возрастала на 1-2 сутки после активации, снижалась на 2-5.-сутки и второй максимум секреции наблюдался на 8-10 сутки после действия ЛПС. Таким образом, секреция альтернативных по своему физиологическому действию цитокинов - ТФР-бета и ФНО-альфа возрастает практически одновременно после активации МФ и не имеет выраженной корреляции с фазами функциональной активности МФ.

Таблица 2

Продукция ТФР-бета, ФНО-альфа и ИЛ-1 (пг/мл) моноцитами периферической крови человека после активации липополисахаридом.

День после активации МФ Комтроль 1 2 3 5 7 8 10

ТФР-бета 350 792 295 420 419 632 533 753

"ФНО-альфа 25 380 320 300 235 320 350 320

ИЛИ 110 360 440 0 430 400 1100 1000

Поскольку ТФР-бета деактивирует МФ, можно ожидать, что по мере нарастания его продукции снижается синтез ФНО-альфа и одновременно уменьшается цитотоксическая (в том числе противоопухолевая) активность МФ. Изучая закономерности синтеза ТФР-бета и ФНО-альфа перитонеальными МФ и функциональную активность этих МФ, мы рассматриваем отдельные уровни синхронных событий, каждое из которых складывается из разнонаправленных механизмов. Профиль рост- стимулирующего и рост-ингибирующего действия супернатантов из МПК человека, в которых определялись указанные цитокины после активации ЛПС, приведен на рис,2. В этом эксперименте рост-ингибирующее' действие супернатантов МПК человека на клетки-мишени КВ отмечается только на 7 и 8 сутки после активации, тогда как в первые дни преобладают рост-стимулирующие эффекты. Представленная динамика

отражает, по-видимому, тот факт, что в отсутствие непосредственного контакта с клетками-мишенями МФ способны синтезировать преимущественно рост-стимулирующие субстанции, вне зависимости от времени, прошедшего с момента активации.

В связи с вышеизложенным можно предполагать, что любая прямая активация иммунной системы может стимулировать рост опухоли, поскольку рост-ингибирующая и рост-сгимулирующая активность экспрессируются МФ одновременно.

Рисунок 2. Рост-стимулирующая и цитотоксическая активность моноцитов периферической крови человека после активации ЛПС in vitro. Клетки-мишени KB *Различия достоаерны относительно контороля, р<0,05

Экспрессия генов ТФР-бета И ФНО-альфа после воздействия ионизирующей радиации.

1. Влияние ионизирующей радиации на моноциты и макрофаги.

Для моделирования ситуации, возникающей при облучении, мыши Balb/c были подвергнуты общему однократному гамма-воздействию в дозе 4Гр. На разных сроках после облучения перитонеальные МФ мышей выделяли и пассировали in vitro. Концентрацию ТФР-бета в культуральной среде МФ определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа. Было установлено, что в заданных условиях ионизирующая радиация индуцирует продукцию ТФР-бета перитонеальными МФ: концентрация ТФР-бета в супернатантах МФ облученных мышей была значительно выше контрольного уровня (МФ необлученных мышей) в течение первых 2 суток после облучения (рис.3). По всей вероятности, это пресинтезированный белек, который накапливается в резидентных МФ. Постепенно концентрация ТФР-бета в культуральной среде облученных макрофагов снижалась и на 4-10 дни после облучения была ниже контрольного значения. Таким образом, уже в течение

первых дней с момента облучения МФ секретируют повышенное количество этого фактора роста, что предположительно, может инициировать развитие фиброзных изменений.

Методом in situ гибридизации было установлено, что ионизирующая радиация индуцирует экспрессию и гена ТФР-бета, и гена ФНО-апьфа в МФ мышей, облученных in vivo в дозе 4 Гр. Результаты этих экспериментов представлены в таблице 3. Экспрессия генов ТФР-бета и ФНО-альфа индуцировалась радиацией: уже в 1 день после облучения она превосходила контрольный уровнь и оставалась повышенной в течение 10-дневного периода наблюдения.

К 1 2 3 4 56 788 10 День после облучения

Рисунок 3. Секреция ТФР-бета1 перитонеальными макрофагами мыши облученными in vivo в дозе 4 Гр. * Различия достоверны относительно контроля, р<0,05

На основании полученных данных можно заключить, что процессы секреции и экспрессии гена ТФР-бета протекают не одновременно, в начале секретируется п ре синтезированный белок, а затем, на 6 день после облучения содержание мРНК этого фактора в клетке достигает максимальной концентрации, в результате чего в более поздние сроки после облучения возможен новый пик продукции ТФР-бета. Необходимо отметить, что введение вакцины БЦЖ индуцировало гораздо менее выраженное увеличение экспрессии генов изучаемых факторов (табл. 1) по сравнению с их индукцией высокими дозами ионизирующей радиации (табл. 3). Возможно, что данное различие играет определенную роль в патологических процессах, имеющих место после облучения организма ионизирующей радиацией.

Таблица 3

Эспресеия генов ТФР-бета и ФНО-альфа перитонеальными макрофагами мышей после облучения in vivo в дозе 4 Гр.

День после облучения Процент меченых клеток Интенсивность метки

ТФР-бета Контроль 0,5 +++

1 3 ++++

2 4 ++++

4 8 ++++

6 9 ++++

10 4 ни

ФНО-альфа Контроль 0

1 3 ++++

2 1 +++

4 2 +4++

6 3 ++++

10 3 +++

На рис.4 представлены росг-ингибирующие и рост-стимулирующие эффекты МФ мышей, облученных in vivo в дозе 4, Гр. Здесь в качестве клеток-мишеней были использованы линия КВ и мышиные фибробласты ЮТ 1/2. Супернатанты облученных МФ обладали выраженной рост-стимулирующей активностью и значительно стимулировали пролиферацию обеих клеточных линий. Максимальный эффект воздействия проявлялся на 3 день после облучения, когда рост клеточных культур увеличивался по сравнению с контролем более, чем в 2 раза. Прямая корреляция между рост-стимулирующими эффектами МФ и синтезом ТФР-бета отсутствовала, но первый пик рост-стимуляции по времени совпадал с увеличением секреции ТФР-бета. Через 6 дней после облучения, несмотря на снижение концентрации ТФР-бета, рост-стимулирующие потенции МФ сохранялись до 8-9 дня наблюдения.

Изменение пролиферативного потенциала опухолевых клеток после гамма-облучения в дозе 8 Гр и динамику рост-ингибирующей активности МФ мы изучали при кокультивировании перитонеальных МФ мыши с клетками-мишенями. При облучении клеток линии КВ в культуре с перитонеальными МФ ионизирующая радиация фактически снимала рост-ингибирующее действие МФ, в то же время рост-стимулирующая способность МФ после облучения увеличивалась (табл. 4). Ингибирующий пролиферацию эффект радиации в дозе 8 Гр на клетки-мишени КВ в присутствии МФ был достоверно ниже по сравнению с действием радиации на эти же клетки-мишени, культивируемые изолированно.

500 -400

:3G0 -

*T X . о _

(О 5.

S 200-

5 ш

100-

5 6 7 8 9 10 День после облучения

К1 23 4567« 9 10

День после облучения

б

Рисунок 4. Рост-стимулирующая активность

перитонеапьных макрофагов мыши, облученных in vivo в дозе 4Гр.

а. Клетки-мишени КВ. б. Клетки-мишени фибробласты ЮТ 1/2. Ломаной линией показана концентрация ТФР-бета Контролем служили необлученные макрофаги * Различия достоверны относительно коктороля, р<0,05

Клеточная линия 1.929 оказалась более чувствительной к цитотоксическим эффектам МФ, чем линия КВ (табл. 5). При совместном культивировании клеточной линии фибробластов 1.929 с МФ мышей цитотоксические эффекты наблюдались в течение 4 дней. Воздействие облучения в дозе 8 Гр в модели кокультивирования МФ с фибробластами 1.929 достоверно снижало цитотоксическое действие МФ, а рост-стимулирующие эффекты МФ в этом случае не проявлялись.

Таблица 4

Кокультивированиэ перитонеальных макрофагов мыши и клеточной линии КВ после облучения ионизирующей радиацией в дозе 8 Гр.

День после облучения Включение 3Н-Тимидина, имп/мин Направленность эффектов макрофагов, %

КОНТРОЛЬ

МФ+КВ КВ

1 2880±158 3558+131 019*

2 2601+301 3979+465 О 35*

3 2417±123 3776+302 £36*

4 4169±201 3941±199 0 5

Среднее значение 3016+395 3813+95 «•21*

ОБЛУЧЕНИЕ

1 3477+354 2390±339 0 45*

2 29041231 2686±184 А 8

3 ■ 3241±284 2409±465 А-34*

4 3422±128 2681±412 А 28*

Среднее значение 32611129 2541±82 0-28*

Направленность эффектов облучен. % 0 7,5 С- 33,4*

Облученные МФ + КВ (без облучения) Контроль КВ

1 3656±469 3558+131 0 3

2 3411+204 3979+465 14

3 3654+404 3776+302 0 3

4 4709+336 3941±199 -0-19*

Среднее значение 3857±289 3813+95 01,2

'Различия достоверны по отношению к контролю, р<0,05; п=6 л Рост-ингибирующий эффект О Рост-стимулирующий эффект

Результаты этого раздела работы показали, что МФ способны к проявлению протекторных эффектов по отношению к опухолевым клеткам при действии на них ионизирующей радиации. Кроме того, возможность модуляции действия ионизирующей радиации в зависимости от состава облучаемой клеточной популяции (только клетки-мишени, или их смесь с МФ) свидетельствует о том, что эффекты такого воздействия обусловлены не только прямым действием на ДНК опухолевых клеток, но и межклеточными взаимодействиями.

Таблица 5

Кокультивирование перитонеальных макрофагов мыши и фибробластов 1.929 после облучения ионизирующей радиацией в дозе 8 Гр.

День после облучения Включение 'Н-Тимидина, имп/мин Направленность эффектов макрофагов, %

КОНТРОЛЬ

МФ+Ь929 Ш9

1 2542±138 3224±102 £ 21*

2 4028±212 9338±431 «57*

3 3726±145 6759±392 в-55*

4 3441±320 7169й226 «47'

Среднее значение 3434±320 662211266 С 48,1*

ОБЛУЧЕНИЕ

1 - 3553196 3443±131 й 3

2 4415+132 84в5+259 48*

3 50171206 4341±198 А 16

4 3925±148 5076±176 О 23*

Среднее значение 4228+295 5336±1101 £ 20,8*

Направленность эффектов облучен. % А 18,8* Ф 19,4*

Облученные МФ + Ь929 (без облучения) Контроль Ш9

1 38911207 3224±102 й 21*

2 6914+79 9338±431 0 26*

3 6123±134 6759£392 £9

4 4980±186 7169±22б 0 31*

Среднее значение 5477±661 6622+1266 Я- 17*

•Различия достоверны по отношению к контролю, р<0,05; п=6 О- Рост-интибирующий эффект ■О Роет-сшмулирующий эффект

2. Экспрессия ТФР-бета в коже свиней после воздействия ионизирующей радиации.

ТФР-бета является индуктором и промотором пострадиационного фиброза благодаря способности стимулировать продукцию белков межклеточного матрикса и пролиферацию фибробластов. В связи с этим основная цель настоящего раздела работы состояла в оценке экспрессии мРНК и синтеза ТФР-бета в коже свиней при локальном облучении. Кожа свиньи была выбрана в качестве объекта для исследования, поскольку данная модель может наиболее адекватно отражать ситуацию, наблюдаемую после острого лучевого поражения у человека. Известно, что после гамма-облучения в дозе 64 Гр уровень мРНК ТФР-бета в коже свиньи увеличивается в 19 раз спустя 3 недели после облучения в течение второй, эритематозной фазы реакции кожи на такое воздействие (Martine et al., 1993а). Повышенная экспрессия гена ТФР-бета отмечается также в коже и подлежащем мышечном слое фиброзной ткани в течение поздней фазы фиброза - спустя 12 месяцев после облучения (Martine et al., 1993а). Вопрос о том, происходит ли изменение экспрессии ТФР-бета непосредственно после облучения или его повышенная продукция является отдаленным следствием нарушения тканевого гомеостаза, остается практически неизученным. Для определения экспресии мРНКТФР-бета через 6 часов после облучения был использован «Nothem» блот анализ, определение концентрации белка ТФР-бета было проведено при помощи «Westhern» блот анализа.

мРНК была выделена из нормальной и облученной кожи свиней через 6 часов после локального облучения кожи в дозе 64 Гр. В результате проведения «Nothem» блот анализа было получено две последовательности мРНК ТФР-бета, соответствующих 3,5 т.п.о. и 2,5 т.п.о. У всех трех животных после облучения наблюдался повышенный уровень экспрессии ТФР-бета.

После экстрагирования этанолом в результате «Western» блот анализа были получены мономеры ТФР-бета молекулярной массой 14,6 кОа. В облученных образцах кожи также наблюдался повышенный уровень синтеза протеина ТФР-бета.

Анализ показал, что через 6 часов после воздействия радиации в дозе 64 Гр экспрессия гена ТФР-бета в коже свиньи возрастает в среднем в 2,27 раза, а продукция белка через этот же срок после облучения увеличивается в 1,82 раза по сравнению с контролем, полученным на необлученных животных (табл. 6, 7). У всех исследуемых животных существовал' некоторый исходный уровень экспрессии ТФР-бета, что согласуется с данными L.N. Thompson и соавт. (1989) о конститутивной экспрессии этого фактора в коже взрослых животных й с нашими вышеприведенными данными, полученными на МФ мышей. Необходимо отметить, что реакция всех 3 животных на воздействие радиации исключительно индивидуальна. Например, при оценке экспрессии гена ТФР-бета минимальное увеличение было 1,2- а максимальное 3,7-кратным. Относительное увеличение экспрессии мРНК и синтеза белка ТФР-бета находится не в прямой зависимости от исходного фона, что также указывает на индивидуальность реакции каждого из животных.

Несмотря на то, что основными продуцентами коллагена и ТФР-бета в коже являются фибробласгы, можно предположить, что сигнал, провоцирующий гиперпродукцию указанных факторов или пролиферацию самих фибробластов, исходит от более универсальных регуляторных клеток, участвующих в самых

начальных стадиях раневой реакции. Такими клетками, вероятнее всего, являются МФ или их тканевой аналог в коже - клетки Лангерганса.

Таблица 6.

Оценка экспрессии мРНК (опт. ед.) ТФР-бета в коже свиньи через 6 часов после воздействия гамма-радиации в дозе 64 Гр.

ТФР-бета 188 ТФР-бета 185 ТФР-бета 18Б

мРНК мРНК мРНК мРНК мРНК мРНК

Номер животного 1 1 2 2 3 3

Нормальная ткань 10,24 12,14 14,32 16,21 5,28 14,48

Облученная ткань 15,62 15,43 31,05 18,21 21,83 16,21

Абсолютное 1,52 1,27 2,17 1,12 4,13 1,12

увеличение

Относительное 1,20 1,94 3,69

увеличение

экспрессии

Таблица 7.

Оценка синтеза ТФР-бета (опт. ед.) в коже свиньи через 6 часов после воздействия гамма-радиации в дозе 64Гр.

Номер животного 1 2 3

Нормальная ткань 15,51 31,98 21,95

Облученная ткань 33,49 36,01 47,71

Относительное увеличение синтеза 2,16 1,13 2,17

Кариотипические исследования не выявляют специфических хромосомных аномалий фиброзной ткани, образующейся в ответ на облучение кожи свиньи в дозе 64 Гр (ваЬайег и. е1 а!., 1992). Этот факт позволяет выдвинуть гипотезу о том, что развитие пострадиационного фиброза определяет не трансформация клеток, а дисбаланс регуляторных факторов, служащий причиной избыточного накопления белков межклеточного матрикса. Радиационное поражение в дозе 64 Гр может быть получено человеком или животным только от техногенных источников радиации, поэтому можно предположить, что зволюционно закрепленная реакция репарации и заживления раны при такой дозе облучения оказывается неадекватной, в результате чего возможно развитие патологических фиброзных процессов и других осложнений. Концентрация ростовых факторов и цитокинов в первые моменты после облучения может явиться критической детерминантой для исхода последующего процесса восстановления.

Радиация сдвигает равновесие в соотношении цитокинов и, таким образом, нарушает эволюционно-детерминированные процессы ранозаживления, что приводит к персмстирующей продукции ростовых факторов и атипичному разрастанию соединительной ткани. После латентного периода различной продолжительности на месте облучения развивается фиброзный рубец.

Экспрессию ТФР-бета регулируют гены так называемого "раннего ответа" -c-jun, jun В и c-fos, которые являются компонентами фактора транскрипции АР-1. Максимальная индукция этих прото-онкогенов в коже свиньи также наблюдается через 6 часов после облучения в дозах от 8 до 48 Гр (Martine M. et al., 1993b). Таким образом, экспрессия генов c-jun, jun В, c-fos и ТФР-бета совпадают по времени, что позволяет считать ген ТФР-бета также геном "раннего ответа" на действие ионизирующей радиации.

Проведенное исследование показало, что активация МФ, независимо от их видовой принадлежности (человек или мышь), источника их получения (периферическая кровь или перитонеальная полость), способа активации (in vivo или in vitro) и активирующего агента (физический или химический фактор), стимулирует выброс ТФР-бета в межклеточную среду. Очевидно, сам синтез ТФР-бета и ФНО-альфа активированными МФ и их взаимозависимость следует рассматривать как реализующийся на уровне JVW> компонент единого, эволюционно закрепленного ответа организма на стресс.

МФ являются акцепторами любого внешнего воздействия: бактериальных инфекций, лучевого и химиотерапевтического воздействия, а также эндогенных раздражителей (поврежденные клетки, вторичные инфекции опухолей, фрагменты опухолевых клеток, сами опухолевые клетки) и реагируют на эти воздействия практически однотипно. Поэтому последствия активации МФ могут быть обратными ожидаемому деструктивному эффекту на опухолевый рост. С этой точки зрения рациональность активации МФ традиционными воздействиями может быть поставлена под сомнение. Белее клинически оправданной с этой точки зрения может быть элиминация опухолеассоциирозанных МФ, их деактивация или нейтрализация ТФР-бета.

Установленные в проведенном исследовании закономерности имеют общебиологический характер и отражают фундаментальные механизмы, лежащие в основе формирования защитных реакций организма по отношению к факторам кзк внешней среды, так и эндогенного происхождения.

ВЫВОДЫ

1. Активация перитонеальных макрофагов мыши in vivo при помощи вакцины БЦЖ приводит к экспрессии мРНК противоположных по основным физиологическим эффектам цитокинов ФНО-альфа и ТФР-бета. При этом продукция ТФР-бета продолжается свыше 1 месяца после введения вакцины.

2. Уровень экспрессии ТФР-бета и ФНО-альфа не коррелирует с фазами функциональной активности макрофагов, проявляющимися в чередовании цитотоксической и рост-стимулирующей активностей. На фоне повышенного синтеза ТФР-бета возможно проявление макрофагами, как цитотоксических свойств, так и рост-стимулирующих эффектов, которые, в свою очередь могут осуществляться на фоне повышенной экспрессии ФНО-апьфа.

3. Активация макрофагов периферической крови человека in vitro при помощи ЛПС сопровождается одновременным повышением секреции цитокиноз ТФР-бета и ФНО-апьфа уже через 18 часов после воздействия.

4. Ионизирующая радиация является активатором функциональной активности макрофагов. Общее однократное облучение мышей в дозе 4 Гр увеличивает рост-стимулирующие потенции макрофагов и индуцирует одновременное увеличение экспрессии мРНК ТФР-бета и ФНО-апьфа, сохраняющееся не менее 10 дней после гамма-воздействия.

5. Макрофаги оказывают защитный эффект на опухолевые клетки при их совместном облучении in vitro. Ингибирующий пролиферацию эффект радиации в дозе 8 Гр на клетки-мишени KB в присутствии макрофагов был достоверно ниже по сравнению с действием радиации на эти же клетки-мишени, культивируемые изолированно. Вместе с тем действие ионизирующей радиации достоверно снижала цитотоксический эффект макрофагов на клеточную линию L929. Это свидетельствует о том, что судьба опухолевых клеток в результате воздействия ионизирующей радиации может определяться их микроокружением.

6. Уровень экспрессии мРНК ТФР-бета в коже свиньи возрастает в ранние сроки после локального воздействия гамма-радиации. Через 6 часов после локального облучения кожи в дозе 64 Гр экспрессия мРНК ТФР-бета увеличивается в 2 раза. Одновременно почти в 2 раза происходит увеличение секреции белка ТФР-бета, что позволяет считать ген ТФР-бета геном раннего ответа на облучение ионизирующей радиацией.

7. Активация макрофагов независимо от видовой принадлежности модели (человек или мышь), источника их получения (периферическая кровь или леритонеальная полость), способа активации (in vivo или in vitro) и активирующего агента (физический или химический фактор) стимулирует выброс ТФР-бета в межклеточную среду.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. В случае аварийного облучения можно рекомендовать исследование возможности экстренной терапевтической помощи с использованием антител к ТФР-бета с целью предотвращения фиброзных изменений.

2. При лучевой терапии опухолей следует иметь в виду возможность стимуляции пролиферации выживших злокачественных клеток в результате активации МФ и выброса ими повышенных концентраций ТФР-бета, обладающего к тому же иммуносупрессивным эффектом.

3. При проведении курса лучевой терапии можно рекомендовать блокировать рекрутирование МФ в очаг опухолевого роста и/или нейтрализацию ТФР-бета.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Okulov V.B., KEIgjo, A.G.Ushmorov, A.O.Danilov, S.G.Zubova. Modulation of cell adhesion and DNA synthesis by epidermal growth inhibiting pentapeptide. // J. Cancer Res. Clin. Oncol. -1991. -Vol.117. -Suppl.ll. p.583.

2. Ushmorov A.A., A.O.Danilov, S.G.Zubova, K.EIgio, V.B.Okulov. Modulation of KB and A 431 cell adhesion by epidermal growth inhibitory pentapeptide. II Virchows Arhiv В Cell Pathology. -1992. -Vol.62, -p.353-356.

3. Зубова С.Г., А.О. Данилов, В.Б. Окулов, Д.Ф.Нягулов, И.Ю. Стюф, АЮ.Зарицкий. Синтез и экспрессия трансформирующего фактора роста бета активированными макрофагами. //Вопр. онкол. -1996. -Т.42. -N 5. с. 80-85.

4. Zubova S.G., Danilov А.О., Okulov V.B. Dynamics of macrophage response to activation and its role in pathogenesis of tumour growth. // 4th International Conference "AIDS, Cancer and Related Problems" St. Petersburg, Russia, -1996. -p. 92.

5. Zubova S.G., Danilov A.O., Okulov V.B. Dynamics of synthesis and expression of TGF-beta by activated macrophages. // 4th International Conference "AIDS, Cancer and Related Problems" St. Petersburg, Russia -1996. -p. 64.

6. Зубова С.Г., Данилов A.O., Стюф И.Ю., Окулов В.Б. Экспрессия и синтез ТФР-бета активированными макрофагами. // I съезд онкологов стран СНГ. Москва, -1996. -с. 197.

7.Чалисова Н.И., В.Б.Окулов, Г.Н. Акоев, А.О.Данилов, С.Г.Зубова, М.И.Людыно, В.А.Пеннияйнен. Влияние продуктов активированных макрофагов на рост нейритов в органотипической культуре чувствительных ганглиев куриных эмбрионов. // Цитология. -1997. -Т. 39. -N 8. -с.694-698.

8. Zubova S.G., Danilov А.О., Nyagulov D.F., Okulov V.B. Releasing of transforming growth factor beta (TGF-beta) by irradiated macrophages. // Acta Hematologica, -10th Symposium on Molecular Biology of Hematopoiesis July 2-6, -1997. Hamburg, Germany, -p.302.

9. Danilova A.B., Danilov AO., Zubova S.G., Okulov V.B.The effect of monocyte/macrophage activation on vessel cells. II The 1998 Macrophage Conference, Paris. -1998.

10. Зубова С.Г., Ф. Крешет, H. Го, АО. Данилов, М.К. Возенин, Ж-Л. Лефакс, Ф. Дабурон, М. Мартен, В.Б. Окулов. Влияние ионизирующей радиации на экспрессию трансформирующего фактора роста бета. // Бюлл. эксперим. биол. мед. -1998. -Т. 126. -N 11. -с. 529-533.

11. Данилова АБ., Окулов В.Б., Данилов АО. Зубова С.Г., Б.В. Афанасьев. Реакция эндотелия на воздействие химиотерапевтических препаратов и иммуномодуляторов. И Гематол. трансфузиол. -1998. -N 5. -с. 19-23.

Актуальность исследования. В последние годы макрофаг (МФ) вновь привлекает к себе внимание исследователей как клетка с чрезвычайно широким спектром биологической активности. Известно, что МФ является ключевой клеткой воспаления, антиген-презентирующей клеткой, участвует в противовирусной, противомикробной, противоопухолевой защите, в регенерации, репарации тканей и координирует функции различных звеньев иммунной системы. Показано, что активированный МФ продуцирует свыше 100 биологически активных веществ, от простейших по составу молекул -свободных радикалов кислорода до высокомолекулярных белковых соединений, среди которых протеолитические ферменты и ростовые факторы с разнонаправленными эффектами (Nathan С., 1991). Поэтому активация МФ может приводить как к стимуляции, так и к подавлению роста опухоли, что стало особенно очевидным после всесторонних исследований трансформирующего фактора роста бета (ТФР-бета) и фактора некроза опухолей альфа (ФНО-альфа) - противоположных по эффектам цитокинов, синтезируемых активированными МФ. Именно этим соединениям отводят первостепенную роль в эффектах МФ как in vivo, так и in vitro (Grotendorst R.G. et al., 1989). ФНО-альфа обладает сильным провоспалительным и катаболическим действием, антимикробной и противоопухолевой активностью (Nacy С.А. et al., 1991). Напротив, ТФР-бета ускоряет заживление ран, обладает противовоспалительным эффектом, предотвращает или ослабляет септический шок, способен усиливать опухолевый рост как путем непосредственного влияния на пролиферацию опухолевых клеток, так и посредством иммуносупрессивной активности (Wahl S.M. et al., 1988). Кроме того, важным событием, способствующим прогрессии опухоли, является усиление неоангиогенеза и пролиферации фибробластов, что в значительной степени зависит от ТФР-бета (Roberts A.B. et al., 1986). Поэтому считается, что ТФР-бета является основным причинным фактором в фиброзировании тканей при локальном облучении, часто используемом для лечения новообразований. Поскольку имеющиеся в литературе сведения, касаются преимущественно поздних эффектов ионизирующей радиации на экспрессию ТФР-бета, данные о его экспрессии на ранних сроках после облучения представляются важными с точки зрения той роли, которую играет данный фактор в инициации процессов фиброзирования.

Изучение динамики ответа МФ на облучение представляет особый интерес, поскольку различные виды облучения применяются при лечении многих патогенетических процессов, что нередко приводит к неограниченному разрастанию соединительной ткани. Данные литературы, касающиеся изменения функциональной активности МФ под действием радиации, немногочисленны и противоречивы. Согласно данным одних авторов, изучавших влияние ионизирующей радиации на МФ в условиях in vitro, общее облучение мышей усиливает фагоцитарную и цитотоксическую активности МФ (Е.И. Хлоповская и соавт., 1993); по данным других авторов -ионизирующая радиация подавляет цитотоксическую активность МФ (Keller R., 1979; Kubota Y. et al., 1994). Уточнение ответа на этот вопрос представляется необходимым для выяснения того влияния, которое оказывают опухолеассоциированные МФ при проведении курса лучевой терапии на рост опухоли. С этой точки зрения вызывает интерес сравнение влияния ионизирующей радиации и действия классических иммуномодуляторов на функциональный статус МФ, в том числе на экспрессию ТФР-бета и ФНОальфа.

Продукция и синтез ТФР-бета и ФНО-альфа тесно взаимосвязаны и регулируются посредством положительной и отрицательной обратной связи, в том числе по аутокринному принципу. Поэтому любая попытка индуцировать противоопухолевую активность МФ путем усиления экспрессии и синтеза ФНО-альфа будет сопровождаться секрецией "проопухолевого" цитокина ТФР-бета. Ситуация осложняется тем, что активация МФ наступает вследствие практически любого экзогенного воздействия (цитостатиками, иммуномодуляторами, облучением), а также под воздействием эндогенных факторов - продуктов распада опухолевых клеток, вторичного инфицирования некротических участков и т.д.

Имеющиеся в литературе данные по экспрессии и синтезу ТФР-бета и ФНО-альфа активированными МФ относятся, главным образом, к реакциям, ограниченным 2-3 днями (Assoian R.K. et al., 1987). С онкологической точки зрения значительно большую важность имеют отдаленные последствия активации МФ, а точнее - динамика продукции этих полифункциональных цитокинов в процессе ответа МФ на активацию, что более адекватно отражает патогенез опухолевого процесса. Изучение этой проблемы представляется актуальным для последующего исследования возможностей направленной модуляции активированных МФ с целью рационального вмешательства во многие патологические процессы, в том числе в опухолевый рост.

Целью работы является установление закономерности динамики экспрессии ТФР-бета и ФНО-альфа в процессе ответа МФ млекопитающих на активацию модуляторами биологического ответа и воздействие ионизирующей радиацией в связи с проблемой злокачественного роста.

В рамках этой цели были сформулированы следующие задачи:

1. Определить динамику экспрессии ТФР-бета и ФНО-альфа и функциональный фенотип МФ мышей после воздействия вакциной БЦЖ in vivo.

2. Определить динамику экспрессии ТФР-бета и ФНО-альфа и функциональный фенотип МФ после воздействия бактериального липополисахарида (ЛПС) in vitro.

3. Определить динамику экспрессии ТФР-бета и ФНО-альфа и функциональный фенотип МФ после общего однократного гамма-облучения ионизирующей радиацией.

4. Определить экспрессию ТФР-бета при местном воздействии ионизирующей радиации на кожу животных in vivo.

Научная новизна работы. Принципиально новым является комплексный анализ ранних и отсроченных по времени последствий активации МФ модификаторами биологического ответа и ионизирующей радиацией на функциональном, биохимическом и молекулярном уровнях.

Установлено, что ионизирующая радиация является активатором функциональной активности МФ и способна усиливать его рост-стимулирующее действие на опухолевые клетки.

Установлена одновременная экспрессия противоположных по основным биологическим эффектам на ткани цитокинов ТФР-бета и ФНО-альфа после воздействия на МФ различных активаторов.

Научно-практическое значение. Сведения о последствиях активации МФ на ранних и последующих этапах после воздействия представляют практический интерес, т.к. именно они имеют наиболее существенное значение для роста опухоли. Это особенно актуально в связи с продемонстрированной в работе активацией рост-стимулирующей активности МФ под воздействием ионизирующей радиации, как одного из основных компонентов комплексного лечения больных со злокачественными опухолями. Выявленная повышенная экспрессия ТФР-бета на ранних сроках после действия гамма-радиации доказывает участие МФ в патогенезе пострадиационного фиброза.

Апробация работы. Результаты исследования обсуждались на научных лабораторных конференциях НИИ онкологии им. проф. Петрова, материалы диссертации были доложены на 4-й Международной конференции «Спид, рак и родственные проблемы» (Санкт-Петербург, 1996), на 1-ом съезде онкологов стран СНГ (Москва, 1996), 10-ом симпозиуме по молекулярной биологии гемопоэза (Гамбург, 1997) и международной конференции по макрофагам (Париж, 1998).

На защиту выносятся следующие основные положения:

1. Стимуляция цитотоксических свойств макрофагов классическими активаторами Л ПС, БЦЖ сопровождается не только повышением экспрессии цитотоксического фактора ФНО-альфа, но и экспрессией ТФР-бета -цитокина, обладающего отчетливым рост-стимулирующим эффектом на злокачественные клетки и способным подавлять противоопухолевые цитотоксические эффекты макрофагов.

2. Ионизирующая радиация является активатором цитотоксической и рост-стимулирующей активности макрофагов. При облучении опухолевых клеток и макрофагов in vitro макрофаги способны защищать злокачественные клетки от действия радиации.

3. Экспрессия ТФР-бета, являющегося основным медиатором послерадиационного фиброза, выявляется на ранних сроках после локального и общего облучения.

Структура диссертации. Диссертация изложена на 116 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов и списка литературы ( 206 источников, в том числе 18 отечественных). Работа проиллюстрирована 12 рисунками, содержит 7 таблиц. По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ.

ВЫВОДЫ

1. Активация перитонеальных макрофагов мыши in vivo при помощи вакцины БЦЖ приводит к экспрессии мРНК противоположных по основным физиологическим эффектам цитокинов ФНО-альфа и ТФР-бета. При этом продукция ТФР-бета продолжается свыше 1 месяца после введения вакцины.

2. Уровень экспрессии ТФР-бета и ФНО-альфа не коррелирует с фазами функциональной активности макрофагов, проявляющимися в чередовании цитотоксической и рост-стимулирующей активностей. На фоне повышенного синтеза ТФР-бета возможно проявление макрофагами, как цитотоксических свойств, так и рост-стимулирующих эффектов, которые, в свою очередь могут осуществляться на фоне повышенной экспрессии ФНО-альфа.

3. Активация макрофагов периферической крови человека in vitro при помощи ЛПС сопровождается одновременным повышением секреции цитокинов ТФР-бета и ФНО-альфа уже через 18 часов после воздействия.

4. Ионизирующая радиация является активатором функциональной активности макрофагов. Общее однократное облучение мышей в дозе 4 Гр увеличивает рост-стимулирующие потенции макрофагов и индуцирует одновременное увеличение экспрессии мРНК ТФР-бета и ФНО-альфа, сохраняющееся не менее 10 дней после гамма-воздействия.

5. Макрофаги оказывают защитный эффект на опухолевые клетки при их совместном облучении in vitro. Ингибирующий пролиферацию эффект радиации в дозе 8 Гр на клетки-мишени KB в присутствии макрофагов был достоверно ниже по сравнению с действием радиации на эти же кпетки-мишени, культивируемые изолированно. Вместе с тем действие ионизирующей радиации достоверно снижало цитотоксический эффект макрофагов на клеточную линию L929. Это свидетельствует о том, что судьба опухолевых клеток в результате воздействия ионизирующей радиации может определяться их микроокружением.

6. Уровень экспрессии мРНК ТФР-бета в коже свиньи возрастает в ранние сроки после локального воздействия гамма-радиации. Через 6 часов после локального облучения кожи в дозе 64 Гр экспрессия мРНК ТФР-бета увеличивается в 2 раза. Одновременно почти в 2 раза происходит увеличение секреции белка ТФР-бета, что позволяет считать ген ТФР-бета геном раннего ответа на облучение ионизирующей радиацией.

7. Активация макрофагов независимо от видовой принадлежности модели (человек или мышь), источника их получения (периферическая кровь или перитонеальная полость), способа активации (in vivo или in vitro) и активирующего агента (физический или химический фактор) стимулирует выброс ТФР-бета в межклеточную среду.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. В случае аварийного облучения можно рекомендовать углубленное исследование возможности экстренной терапевтической помощи с использованием антител к ТФР-бета с целью предотвращения фиброзных изменений.

2. При лучевой терапии опухолей следует иметь в виду возможность стимуляции пролиферации выживших злокачественных клеток в результате активации МФ и выброса ими повышенных концентраций ТФР-бета, обладающего к тому же иммуносупрессивным эффектом.

3. При проведении курса лучевой терапии можно рекомендовать блокировать рекрутирование МФ в очаг опухолевого роста и/или нейтрализацию ТФР-бета.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Okulov V.B., K.EIgjo, A.G.Ushmorov, A.O.Danilov, S.G.Zubova. Modulation of cell adhesion and DNA synthesis by epidermal growth inhibiting pentapeptide. // J. Cancer Res. Clin. Oncol. -1991. -Vol.117. -Suppl.ll. p.583.

2. Ushmorov A.A., A.O.Danilov, S.G.Zubova, K.EIgio, V.B.Okulov. Modulation of KB and A 431 cell adhgesion by epidermal growth inhibitory pentapeptide. // Virchows Arhiv В Cell Pathology. -1992. -Vol.62, -p.353-356.

3. Зубова С.Г., А.О. Данилов, В.Б. Окулов, Д.Ф.Нягулов, И.Ю. Стюф, А.Ю.Зарицкий. Синтез и экспрессия трансформирующего фактора роста бета активированными макрофагами. //Вопросы онкологии. -1996. -Т.42. -N 5. с. 80-85.

4. Zubova S.G., Danilov А.О., Okulov V.B. Dynamics of macrophage response to activation and its role in pathogenesis of tumour growth. // 4th International Conference "AIDS, Cancer and Related Problems" St. Petersburg, Russia,-1996. -p. 92.

5. Zubova S.G., Danilov A.O., Okulov V.B. Dynamics of synthesis and expression of TGF-beta by activated macrophages. // 4th International Conference "AIDS, Cancer and Related Problems" St. Petersburg, Russia -1996. -p. 64.

6. Зубова С.Г., Данилов А.О., Стюф И.Ю., Окулов В.Б. Экспрессия и синтез ТФР-бета активированными макрофагами. // I съезд онкологов стран СНГ Москва, -1996. -с. 197.

7.Чалисова Н.И., В.Б.Окулов, Г.Н. Акоев, А.О.Данилов, С.Г.Зубова, М.И.Людыно, В.А.Пеннияйнен. Влияние продуктов активированных макрофагов на рост нейритов в органотипической культуре чувствительных ганглиев куриных эмбрионов. // Цитология. -1997. -Т.39. -N 8. -с.694-698.

8. Zubova S.G., Danilov А.О., Nyagulov D.F., Okulov V.B. Releasing of transforming growth factor beta (TGF-beta) by irradiated macrophages. // Acta Hematologica, -10th Symposium on Molecular Biology of Hematopoiesis July 2-6, -1997. Hamburg, Germany, -p.302.

9. Danilova A.B., Danilov A.O., Zubova S.G., Okulov V.B.The effect of monocyte/macrophage activation on vessel cells. // The 1998 Macrophage Conference, Paris. -1998.

10. Зубова С.Г., Ф. Крешет, Н. Го, А.О. Данилов, М.К. Возенин, Ж-Л. Лефакс, Ф. Дабурон, М. Мартен, В. Б. Окулов. Влияние ионизирующей радиации на экспрессию трансформирующего фактора роста бета. II Бюлл. эксперим. биол. и мед. -1998. -Т. 126. -N 11. -с. 529-533.

11. Данилова А.Б., Окулов В.Б., Данилов А.О. Зубова С.Г., Б.В. Афанасьев. Реакция эндотелия на воздействие химиотерапевтических препаратов и иммуномодуляторов. // Гематол. трансфузиол. -1998. -N 5. -с. 19-23.