Экспрессия теломеразы в иммунокомпетентных клетках человека в норме и при иммунопатологических состояниях

Королькова, Ольга Юрьевна

Диссертации по медицине → Клиническая иммунология, аллергология

Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Экспрессия теломеразы в иммунокомпетентных клетках человека в норме и при иммунопатологических состояниях

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Королькова, Ольга Юрьевна Новосибирск 2011 г.

Ученая степень: кандидата биологических наук

ВАК РФ: 14.03.09

Автореферат диссертации по медицине на тему Экспрессия теломеразы в иммунокомпетентных клетках человека в норме и при иммунопатологических состояниях

На правах рукописи

КОРОЛЬКОВА ОЛЬГА ЮРЬЕВНА

Экспрессия теломеразы в иммунокомпетентных клетках человека в норме и при иммунопатологических состояниях

14.03.09 - «Клиническая иммунология, аллергология»

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

1 О 7,

Новосибирск 2011

4840272

Работа выполнена в Учреждении РАМН Научно-исследовательском институте клинической иммунологии Сибирского отделения РАМН

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Кожевников Владимир Сергеевич Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Мордвинов Вячеслав Алексеевич

кандидат биологических наук Силков Александр Николаевич

Ведущая организация:

Государственный научный центр Институт иммунологии ФМБА России

Защита состоится «, и » гон г. в /Ч _ часов на заседании

диссертационного совета Д 001.001.01 в НИИ клинической иммунологии СО РАМН по адресу: 630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ клинической иммунологии СО РАМН

Автореферат разослан «7' » ущ гон

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук ^У^^^^ХлЛ^С^-. Дудаева Ольга Тимофеевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Теломераза представляет собой фермент, который осуществляет наращивание теломерных районов хромосомной ДНК. Известно, что укорочение теломерных районов ДНК до значений, являющихся критически малыми, может служить сигналом к репликативному старению соматических клеток и дестабилизации их хромосом [Chan S.R.W.L., 2004]. Активность теломеразы в совокупности с длиной теломер отражает пролиферативный потенциал клетки. Существуют данные, свидетельствующие о присутствии определяемой активности этого фермента не только в стволовых, половых и опухолевых клетках, но и в слизистых клетках кишечника и'в лимфоцитах периферической крови (ПК) и тимуса [Osterhage J.L., 2009], кроме того, каталитическая субъединица теломеразы (hTERT), являющаяся РНК-зависимой ДНК полимеразой, синтезирующей теломерные повторы, а также мРНК этой субъединицы, также экспрессируются в этих клетках на сравнительно низком, но детектируемом уровне.

В течение жизни в лимфоцитах периферической крови происходит постепенное укорочение теломер. Причиной этого являются клеточные деления, накапливающиеся с возрастом in vivo [Osterhage J.L., 2009]. Показано, что при многих, в том числе иммунопатологических, болезнях (ревматоидный артрит, атопический дерматит, бронхиальная астма и др.) лимфоциты периферической крови характеризуются укороченными теломерами и повышенной пролиферацией по сравнению с аналогичными показателями в лимфоцитах здоровых людей. Кроме заболеваний различного генеза, на скорость укорочения теломер в лимфоцитах могут влиять и многие другие факторы, как, например, наличие хронического .стресса [Georgin-Lavialle S., 2010].

Установлено, что экспрессия теломеразы в лимфоцитах строго контролируется в течение их развития, дифференцировки и активации [Georgin-Lavialle S., 2010]. Известно, что в результате стимуляции зрелые лимфоциты становятся способны экспрессировать теломеразу на довольно высоком уровне, причем после любой повторной стимуляции экспрессия теломеразы также может возрастать, но ее уровень уже не достигает уровня ответа на первичный стимул [Akbar A.N., 2007]. Такая динамика может отражать механизмы регуляции клональной экспансии лимфоцитов, являющейся частью иммунного ответа, на уровне контроля их пролиферации.

Помимо активации теломеразы существует механизм удлинения теломер, альтернативный теломеразному (ALT -alternative lengthening of telomeres). Тем не менее, наличие этого механизма в клетках млекопитающих в настоящее время обнаружено только в аномальных ситуациях, таких как злокачественные клетки, иммортализованные клеточные линии, и нокаутные по гену теломеразы мышиные клеточные линии, тогда как нормальные лимфоциты человека не обладают способностью использовать ALT для поддержания теломер [Muntoni А., 2009]. Таким образом, основным механизмом стабилизации длины теломер в лимфоцитах является активность теломеразы, и поскольку пролонгирование клональной экспансии крайне важно для функционирования лимфоцитов, они задействуют этот механизм для того, чтобы снизить (но не предотвратить целиком) сокращение теломер в течение пролиферации [Kashubowska L., 2008]. Так, в интактных лимфоцитах при ревматоидном артрите, системной красной волчанке, рассеянном

склерозе и атопическом дерматите" активность теломеразы увеличена [Klapper W., 2004]. Показано также, что активность теломеразы способна возрастать в результате острого психологического стресса [Epel E.S., 2010].

Многочисленные данные свидетельствуют, ..что при большинстве перечисленных ситуаций (иммунопатологические заболевания! стресс и многие другие) теломеры в лимфоцитах, несмотря на повышенную активность теломеразы, сокращаются с возрастом быстрее, чем у здоровых доноров, и немногие свидетельства сохранения длины теломер, в лимфоцитах при патологических состояниях являются, скорее, исключением. Таким исключением, например, является отсутствие ускоренного укорочения теломер при бронхиальной астме (БА) смешанного генеза, при том, что при атрпической и инфекционно-зависимой БА теломеры укорачиваются с возрастом значительно быстрее, чем у доноров [Борисов В.И., 2009]. ^

Учитывая, что регуляция. активности теломеразы контролируется как на уровне транскрипции гена hTF.RT, так и механизмами посттранскрипционной и посттрансляционной модификации [Ly Н., 2009], представляет интерес изучение не только экспрессии мРНК hTERT в лимфоцитах, но и наличия в них самого белка hTERT. Исследование изменений продукции теломеразы на уровне мРНК и белка ее каталитической субъединицы, таким образом, представляет значительный интерес, поскольку может помочь объяснить причину укорочения или сохранения длины теломер при иммунопатологических процессах.

Для количественной оценки мРНК hTERT обычно используют RT-PCR или Northern Blotting. Эти методы недостаточно., информативны, поскольку необходимость разрушения клеток для выделения мРНК не позволяет одновременно охарактеризовать исследуемый материал по другим параметрам (к примеру таким, как субпопуляционная принадлежность или экспрессия интересуемых белков) без дополнительного использования методов их сепарации. Этот Недостаток отсутствует в методе Flow-FISH, позволяющем оценивать содержание исследуемой ДНК или РНК на уровне единичной клетки с помощью внутриклеточной in situ гибридизации зонда, меченого флуорохромом, с последующим анализом на проточном цитофлуориметре. Представляется перспективным таким образом модифицировать метод Flow-FISH для выявления мРНК hTERT, чтобы это позволило с достаточной информативностью и высокой производительностью определять экспрессию теломеразы в исследуемом материале. ¡*

Цель исследования. Исследовать изменения активности теломеразы в лимфоцитах человека при иммунопатологических заболеваниях аутоиммунного и аллергического генеза на уровне продукции мРНК и белка hTERT и оценить влияние этих изменений на динамику длины теломер.

Задачи исследования: ' 1. Изучить информативность, эффективность и особенности применения метода Flow-FISH при определении относительного количества мРНК hTERT в иммунокомпетентных клетках.

2. Исследовать динамику экспрессии hTERT и мРНК hTERT в CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитах человека в условиях поликлональной стимуляции.

3. Изучить уровень спонтанной и индуцированной экспрессии hTERT и мРНК hTERT в лимфоцитах человека при ревматоидном артрите, атопическом дерматите, бронхиальной астме и апластической анемии.

Научная новизна. Показано, что уровень мРНК hTERT в лимфоцитах периферической крови человека достаточно высок для достоверной ее оценки путем in situ гибридизации с флуоресцентным зондом, специфичным к последовательности этой мРНК, с последующим анализом на проточном цитофлуориметре.

Обнаружено, что после трех суток поликлональной стимуляции лимфоцитов здоровых доноров в культуре in vitro экспрессия в них мРНК hTERT достоверно повышается. Такое повышение происходит за счет клеток, находящихся в S/M/G2 фазе клеточного цикла (пролиферирукицих клеток), тогда как в состоянии покоя (фаза G1/G0) как стимулированные, так и интактные клетки экспрессируют равные уровни мРНК hTERT. Содержание hTERT в лимфоцитах также достоверно возрастает в результате их стимуляции in vitro, более того, между содержанием hTERT в интактных и стимулированных лимфоцитах существует статистически значимая положительная корреляция.

Выявлено более высокое содержание мРНК hTERT в CD8 лимфоцитах пациентов с ревматоидным артритом по сравнению с группой доноров. Тем не менее, содержание hTERT в группе пациентов с РА не отличается от доноров ни в общей популяции лимфоцитов, ни в CD4 и в CD8 субпопуляциях.

Впервые исследовано содержание hTERT и ее мРНК в лимфоцитах пациентов с бронхиальной астмой. Полученные данные свидетельствуют, что в отличие от группы доноров, экспрессия мРНК hTERT в стимулированных лимфоцитах пациентов с БА повышена по сравнению с исходным (спонтанным) значением независимо от стадии клеточного цикла (G1/G0 и S/M/G2). Кроме того, для пациентов с БА смешанного генеза характерно повышение содержания каталитической субъединицы теломеразы в лимфоцитах после трех суток поликлональной стимуляции по сравнению с группой доноров.

Обнаружено, что в лимфоцитах пациентов с атопическим дерматитом, стимулированных поликлонально в течение трех суток, уровень мРНК hTERT, в отличие от доноров, не повышается. Также у пациентов с АД отсутствует корреляция между содержанием hTERT в интактных и стимулированных лимфоцитах.

Научно-практическая значимость работы. Модификация способа определения уровня мРНК каталитической субъединицы теломеразы (hTERT) обладает высокой производительностью и позволяет с достаточной информативностью определить мРНК hTERT в исследуемом материале (Flow-FISH). В данной методике окрашивание мРНК hTERT на уровне единичных клеток производится в суспензии фиксированных клеток с помощью гибридизации in situ, после чего следует анализ образца на проточном цитофлуориметре. Методика опубликована в виде патента «Способ определения уровня мРНК каталитической субъединицы теломеразы (hTERT) как показателя уровня активности фермента» и в статьях.

Данные об измененной экспрессии и/или способности к индукции hTERT и мРНК hTERT в лимфоцитах при таких патологиях, как ревматоидный артрит, атопический дерматит, бронхиальная астма и апластическая анемия, дают объяснение феномену ускоренного укорочения или, наоборот, сохранения длины теломер, наблюдаемое в различных субпопуляциях лимфоцитов при этих заболеваниях.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Модифицированный метод" Flów-FISH . позволяет определять содержание мРНК каталитической субъединицы теломеразы в иммунокомпетеНтных клетках с помощью гибридизации in situ с флуоресцентным PNA зондом и последующим анализом суспензии клеток на проточном цитофлуориметре.

2. Повьппение экспрессии мРНК hTERT, наблюдаемое при поликлональной стимуляции лимфоцитов, достигается за счет клеток, находящихся в фазе S/M/G2 клеточного цикла, в то время как клетки, находящиеся в фазе G1/G0, экспрессируют мРНК теломеразы на одинаковом уровне независимо от того, были ли они выделены из интактных или стимулированных в культуре лимфоцитов.

3. Повышенная активация hTERT в Т-лимфоцитах периферической крови обеспечивает сохранение длины теломер при иммунопатологических состояниях, как показано в случае бронхиальной астмы смешанного генеза, в то время как при нормальной или сниженной экспрессии теломеразы возникает ускоренное укорочение теломер (при ревматоидном артрите, атопическом дерматите и апластической анемии).

Апробация результатов. Материалы диссертации были доложены и обсуждены на 7-ой отчетной конференции ГУ НИИКИ СО РАМН «Иммунопатогенез и иммунотерапия основных заболеваний человека: от эксперимента к клинике» (г. Новосибирск, 2006), на научно-практических конференциях «Дни иммунологии в Сибири» (г. Омск, 2007, г. Красноярск, 2010), на Объединенном иммунологическом форуме ' (г. Санкт-Петербург, 2008), на школе 3rd ENÜ-MUGEN summer school in advanced immunology (Alghero, Italy, 2008). Апробация диссертации состоялась 25 мая 2010г. на семинаре НИИ клинической иммунологии СО РАМН.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, двух глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов и выводов. Материал изложен на 120 страницах машинописного текста, включающего 12 таблиц и 33 рисунка. Прилагаемая библиография содержит ссылки на 182 литературных источника, в том числе 171 зарубежных.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК для публикации результатов работ соискателей учёной степени кандидата наук, и 1 патент.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. В исследовании ■ i были использованы мононуклеарные клетки (МНК), выделенные из периферической крови 24 условно здоровых доноров, а также 19 пациентов с ревматоидным артритом, 12 пациентов с атопическим дерматитом, 21 пациента с бронхиальной астмой и 35 пациентов с апластической анемией, находившихся на лечении в клинике иммунопатологии СО РАМН, г. Новосибирск. Клетки опухолевой линии меланомы человека BRO и опухолевой линии хронической миелоидной лейкемии человека К562 были получены из Онкологического центра РАМН (г. Москва). В соответствии с данными литературы была выявлена высокая активность теломеразы в клетках

линии К562; также было показано, что клетки линии BRO являются позитивными по теломеразе.

Получение МНК периферической крови. К периферической крови с 200 единицами гепарина добавляли 10% желатин и инкубировали 45 минут в термостате при 37°. Полученную в результате лейковзвесь собирали, разбавляли забуференным физиологическим раствором с ЭДТА (ЗФР-ЭДТА) и центрифугировали в градиенте фиколл-верографин. Образовавшееся кольцо мононуклеарных клеток собирали и отмывали дважды ЗФР-ЭДТА. Клеточный осадок ресуспендировали в забуференном физиологическом растворе с ЭДТА и азидом Na (ЗФР-ЭА), подсчитывали количество клеток в камере Горяева и хранили в морозильной камере при -80° С в FBS с 10% DMSO.

Культивирование лимфоцитов периферической крови. Выделенные из периферической крови МНК помещали в лунки 24-луночного планшета в концентрации 2 млн на 1 мл питательной среды RPMI 1640 («Вектор», Россия) с 10% FBS (HyClone, США) и активаторами (1 мкл/мл антиСОЗ антител (МедБиоСпектр, Россия) и 50 ед/мл IL-2 (Биотех, Россия)). В зависимости от условий Эксперимента на определенные сутки культивирования клетки собирали и замораживали в FBS с 10% DMSO (Riedel-deHaën, Германия).

Определение содержания мРНК hTERT. Для гибридизации использовали 106 клеток на одну пробу.-, Исходя из этого, необходимое количество клеток осаждали центрифугированием и ресуспендировали осадок в гибридизационном растворе, содержащем 50% формамид, 20 мМ Tris и 1% BSA (все Sigma, США), и доведенный до конечного объема ЗФР-ЭА. Гибридизацию каждой пробы проводили в объеме 300 мкл. Контрольная проба содержала только клетки, ресуспендированные в гибридизационном растворе. К опытной пробе добавляли флуоресцентный зонд в конечной концентрации 0,9 мкг/мл. Используемый. в исследовании зонд является пептидонуклеиновой кислотой (peptide nucleic acid, PNA), с последовательностью FITC-OO-CCAGCCGCCAGCCCT (Bio-Synthesis, США) и комплементарен участку мРНК каталитической субъединицы теломеразы (нухлеотидь1,156-170). В работе Folini M. (2003) для успешного и специфичного ингибирования активности теломеразы использовалась идентичная последовательность PNA зонда, выбранная по результатам исследований вторцчной структуры мРНК hTERT с помощью программного обеспечения RNAfold. Было показано, что именно эта последовательность не вовлечена ни в какие структурные образования, и таким образом является доступной для антисмысловых нуклеиновых кислот; кроме того, на мРНК она располагается близко к точке начала трансляции [Folini M., 2003, Folini M., 2007]. Все пробы денатурировали в течение 10 минут при 80°С, периодически перемешивая. Гибридизация проводилась в темноте при комнатной температуре в течение 2 часов при постоянном перемешивании. После этого клетки переносили в цитометрические пробирки с 1 мл ЗФР-ЭА и осаждали центрифугированием. Осадок ресуспендировали в 1 мл ЗФР-ЭА, инкубировали 30 минут в термостате при 37° и снова осаждали. К осадку добавляли 500 мкл ЗФР-ЭА с 1 мкг 7-AAD (ICN Biomedicals Inc, США). Анализ проб проводили на проточном цитофлуориметре FACS Calibur с помощью программного обеспечения Cell Quest (Becton Dickinson, США). По параметрам прямого и бокового светорассеяния выделяли регион, в котором затем определяли сигнал флуорохрома FITC с использованием канала FL1. Наличие мРНК hTERT в клетках определяли

как средний уровень их флуоресценции (mean fluorescence intensity, MFI) по каналу FL1 после гибридизации в присутствии PNA зонда за вычетом фоновой (аутофлуоресценции) клеток, прошедших те же условия в отсутствии PNA зонда. Отношение полученного показателя в исследуемых клетках к аналогичному показателю в клетках опухолевой линии соответствует количеству в них мРНК hTERT. В целях выявления уровня мРНК hTERT в CD4 или CD8 субпопуляциях лимфоцитов без дополнительного использования методов их сепарации МНК перед гибридизацией метили соответствующими биотинилированными антителами (BD Biosciences, США), а затем стрептавидином, конъюгированным с флуорохромом Су-5 (Jackson IR, США). В дальнейшем при анализе проб на цитофлуориметре вводили дополнительный регион, исходя из флуоресценции клеток по каналу FL4, благодаря чему определяли наличие мРНК hTERT только в окрашенных антителами клетках.

Определение содержания hTERT в лимфоцитах. Ингакгные или культивированные лимфоциты периферической крови после разморозки и отмывки с ЗФР-ЭДТА окрашивали сначала моноклональными антителами к поверхностным маркерам CD4 и CD8 (Промикс, Россия) в количестве, рекомендуемом производителем. Затем клетки фиксировали 1% параформальдегидом, пермеабилизовали 0,2% Tween-20 (Sigma, США) и инкубировали с моноклональными антителами кролика к hTERT (Epitomics, США; титр антител составлял 1/200), отмывали и окрашивали вторичными анги-кроличьими антителами, меченными FITC (Abeam, США). После двух отмывок клетки ресуспендировали в 500 мкл ЗФР-ЭДТА. Анализ проб проводили на проточном цитофлуориметре.

Определение активности теломеразы. Активность теломеразы определяли с помощью метода амплификации теломерных повторов TRAP (Telomeric Repeat Amplification Protocol), с использованием набора TRAPeze® RT (Chemicon international, США). Постановку методики выполняли в соответствии с рекомендациями производителя.

Статистическая обработка. Статистический анализ полученных данных проводили с использованием пакета прикладных программ "Statistica 6.0" [Боровиков В.П., 1997]. Методы описательной статистики применялись на предварительном этапе сопоставления показателей различных групп. На основании варьирования показателя, численности выборок, а также закономерности распределения использовали непараметрические методы представления данных в виде медианы (М) и интерквартильного размаха (25%-75%). Сравнение вариационных рядов осуществлялось с помощью непараметрического U критерия Манна-Уитни и критерия Вилкоксона парных сравнений. Корреляционный анализ проводился методом ранговой корреляции Спирмена [Лакин Г.Ф., 1990].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Разработка условий гибридизации in situ. Метод Flow-FISH дает возможность детекции ДНК/РНК последовательностей на уровне единичной клетки с помощью внутриклеточной in situ гибридизации зонда, меченого флуорохромом, с последующим анализом на проточном цитофлуориметре. Именно этот метод является традиционным для измерения числа теломерных noBTopoB[Lansdorp P.M., 1996]. На рисунке 1 приведены шесть основных этапов Flow- FISH, каждый из которых в процессе выполнения данной работы был

модифицирован для наиболее специфичного определения экспрессии мРШС hTERT в иммунокомпетентных клетках.

Модификация способа определения уровня мРНК каталитической субъединицы теломеразы (hTERT) обладает высокой производительностью и позволяет с достаточной информативностью определить содержание мРНК hTERT в исследуемом материале. Эта методика позволяет выявлять мРНК hTERT на уровне единичной клетки с помощью гибридизации in situ, с последующим анализом на проточном цитофлуориметре (Flow-FISH). По уровню флуоресценции клеток, прошедших гибридизацию с флуоресцентным зондом, комплементарным мРНК hTERT, определяют относительное количество искомой мРНК в каждой клетке, причем уровень мРНК hTERT в клетках определяют как средний уровень их флуоресценции после гибридизации за вычетом аутофлуоресценции клеток, прошедших те же условия в отсутствии зонда. В качестве стандарта гибридизации параллельно определяют относительное количество мРНК hTERT в клетках человеческой опухолевой линии, в которых этот фермент постоянно активен, и мРНК hTERT стабильно присутствует в определенном количестве. В качестве такой теломераза-позитивной опухолевой линии для данного исследования была выбрана линия BRO (рис. 2). Относительное количество мРНК hTERT в лимфоцитах периферической крови или других исследуемых клетках выражают в процентах от аналогичного показателя в клетках опухолевой линии BRO.

Эффективность используемого зонда может быть изначально ограничена некоторыми факторами, в том числе доступностью последовательности РНК, выбранной в качестве мишени, так как стабильные вторичные структуры могут мешать гибридизации мРНК с зондом-ингибитором. Поэтому для специфической гибридизации с мРНК hTERT была выбрана доступная для антисмыслового зонда последовательность, не участвующая в структурных образованиях [Folini М., 2003, Folini М., 2007]. Для установления рабочей концентрации зонда была проведена параллельная гибридизация лимфоцитов и клеток опухолевой линии BRO с различным количеством PNA: 0,4 мкг/мл (86,8пМ), 0,8 мкг/мл (173,6 пМ),Т,2 мкг/мл (260,4 пМ) и 1,6 мкг/мл (347,2 пМ), а также без PNA (рис.З).В случае лимфоцитов светимость клеток по мере увеличения концентрации зонда постепенно вышла на плато, а в случае клеток BRO четкого плато получено не было, то есть уровень флуоресценции постоянно повышался. В результате в качестве рабочей концентрации была выбрана 0,8 мкг/мл (173,6 пМ) PNA.

1. Выделение и подготовка клеток

2. Денатурация нуклеиновых кислот

яааи&

3. Гибридизация с PNA зондом

4. Удаление из клеток не связавшегося зонда J

5. Окрашивание ДНК

СЕЗЕЕгЖ^^ШЕЕЯИЯНП^

6. Запись и анализ данных на проточном цитофлуориметре

Рис.1. Основные этапы метода Flow-FISH

400 350 300 250 E 200 I 150

5 100

50 0

0 0,4 0,8 1,2 1,6

PNA нкг/мл | -»-Лимфоциты -O-BRO l

Рис.2. Показатель активности Рис.3. Средний уровень флуоресценции

теломеразы в относительных единицах лимфоцитов и опухолевых клеток

в клетках опухолевых линий К562, линии BRO по каналу FITC при

BRO, а также в клетках, предлагаемых в гибридизации с разным количеством

качестве позитивного контроля (ПК) в PNA зонда. Примечание: представлены

наборе для определения активности относительные единицы флуоресценции

теломеразы TRAPeze® RT. Примечание: исследованных образцов по каналу FL1

Каждый образец был поставлен в дублях; (FITC). Результат одного из четырех

на диаграмме приводится среднее значение, экспериментов.

В стандартном протоколе гибридизации in situ клетки перед гибридизацией обычно фиксируют и пермеабилизуют. Протокол, разработанный в данной работе, базировался на методике, разработанной для измерения количества теломерных повторов с помощью Flow-FISH [Rufer N., 1998], в которой доступность мишени для зонда обеспечивается специфическими условиями денатурации. В специально подобранных условиях (30% формамид, 80°С) небольшой размер зонда в совокупности с повышенной текучестью мембраны обусловливает проникновение зонда внутрь клетки без пермеабилизации клеточной мембраны [Lauzon W., 2000]. При этом большинство белков также легко денатурирует, что, несомненно, повышает доступность РНК-мишени для зонда, но и осложняет выбор флуорохромов как для конъюгации с самим зондом, так и для поверхностного фенотипирования.

При анализе проб на проточном цитофлуориметре выделяли регион по параметрам прямого и бокового светорассеяния (например, лимфоцитарный гейт), из которого затем выделяли одинарные клетки по параметру FL3 Area, и затем в них определяли сигнал флуорохрома FITC с использованием канала FL1. Для того, чтобы отделить клетки с нормальным содержанием ДНК от агрегированных и апоптотических клеток при анализе данных на проточном цитофлуориметре, обычно используют различные ДНК-красители [Lauzon W., 2000]. Поэтому в данном исследовании при определении содержания мРНК hTERT методом Flow-FISH во все образцы добавляли ядерный краситель 7AAD, спектр эмиссии которого (от 635 до 675 нм) позволяет использовать его в комбинации с FITC при анализе напроточном цитофлуориметре.

Выделенные по параметру FL3 Area единичные клетки дополнительно разделяются на находящиеся в фазах клеточного цикла Gl /GO и S/M/G2, после чего в каждой из этих субпопуляций по каналу FL1 можно определить среднюю степень флуоресценции связавшегося PNA зонда. Таким образом была получена возможность определять относительное содержание мРНК hTERT не только в

общей массе одинарных МНК, но в клетках, находящихся в различных стадиях клеточного цикла.

Экспрессия мРНК hTERT в "интактных лимфоцитах. Для определения содержания мРНК hTERT из периферической крови были выделены МНК пациентов с ревматоидным артритом (РА, п=17), атопическим дерматитом (АД, п=12), бронхиальной астмой (БА, п=21), а также здоровых доноров (Д, п=18). Медиана содержания мРНК hTERT в лимфоцитах доноров составила 8,01% от теломераза-позитивной опухолевой линии BRO (рис.4). Медиана количества мРНК hTERT в лимфоцитах пациентов с РА, АД и БА находилась на уровне 7,34%, 7,72% и 7,15% от BRO соответственно, и не отличалась достоверно от донорского значения. Также было определено содержание мРНК hTERT в лимфоцитах пациентов с апластической анемией (АА, п=35). Было получено достоверно пониженное содержание мРНК hTERT в лимфоцитах пациентов с АА (медиана которого составила в среднем 5,1% от BRO) по сравнению с донорами (рис.4). По данным разных авторов [Ly Н., 2009, Young N.S., 2006, Yamaguchi Н„ 2005], уровень активности теломеразы в лимфоцитах пациентов с АА нередко значительно понижен, а следовательно, не может адекватно нейтрализовать укорочение теломер, происходящее в результате большого количества делений. Наиболее очевидным объяснением укорочения теломер при АА является пролиферативный стресс сохранившихся СКК, поскольку в условиях глубокого дефицита СКК и гемопоэтических предшественников необходимо значительно большее количество делений для созревания клеток крови.

Д РА АД ЕА АА

Д РА АД БА

Рис.4. Содержание мРНК 1ЛТШ.Т в Рис.5. Содержание ЫЕР.Т в интактных интактных МНК (%ВЕ.О) МНК (МБ)

Примечание: для каждой переменной отображены: медиана, квартальный размах (25%, 75% процентшга), размах (минимум, максимум). * - отличие от группы доноров р<0,05 (критерий Манна-Ушни) ,

Содержание субъединицы ЬТЕК'Г в интактных Лимфоцитах. Было определено содержание собственно каталитической субъединицы; теломеразы МТЖТ в интактных лимфоцитах доноров (п=24) и пациентов с РА (п=19), АД (п=12) и БА (п=20). На рисунке 5 приведены медианы содержания ílTERT в относительных единицах за вычетом значения контрольногообразадокрашенного только вторичными РГГС-коньюгированными антителами. При сравнении доноров и пациентов с РА значимых отличий между этими группами выявлено не было (медиана содержания 1ШЖТ составила 6,48 у доноров и 7,71 у пациентов с РА). В одном из исследований показано, что активность теломеразы в МНК

периферической крови пациентов с АД и псориазом повышена по сравнению с донорами [Wu К., 2000]. В соответствии с этими данными, мы обнаружили, что содержание субъединицы hTERT в интакгных МНК пациентов с АД повышено по сравнению с донорами (8,72), хотя экспрессия мРНК hTERT не изменена. Содержание hTERT в лимфоцитах периферической крови пациентов с БА было также достоверно выше, чем у доноров (9,46).

Корреляций между содержанием мРНК и белка hTERT в CD4+ и CD8+ лимфоцитах ПК не наблюдалось ни у доноров, ни у пациентов с исследованными заболеваниями.

Экспрессия мРНК hTERT в стимулированных лимфоцитах. Так как все клетки лимфоидного ряда становятся способны экспрессировать теломеразу после неспецифической активации в культуре, было рассмотрено влияние поликлональной стимуляции лимфоцитов в течение трех суток на экспрессию ими мРНК hTERT. По сравнению с интактными МНК, индуцированный уровень мРНК hTERT был достоверно повышен у доноров и пациентов с РА и БА. В отличие от этого, индуцированный уровень мРНК hTERT в лимфоцитах пациентов с АД достоверно не изменялся по сравнению с уровнем мРНК hTERT до стимуляции (рис.6). Поэтому исследуемые лимфоциты были распределены по фазам клеточного цикла, чтобы отделить покоящиеся лимфоциты (фазы клеточного цикла G1/G0) от лимфоцитов, находящихся в пролиферации (фазы S/M/G2) по сигналу

Рис.6. Содержание мРНК hTERT в интакгных (светлые столбики) и стимулированных (темные столбики) лимфоцитах доноров (п=18) и пациентов с РА (п=17), АД (п=12) и БА (п=20). Примечание: для каждой переменной отображены: медиана, квартальный размах (25%, 75% продвигали), размах (минимум, максимум). * -достоверность отличий стимулированных лимфоцитов от интакгных р<0,05 (критерий Вилкоксона).

ядерного красителя 7AAD. Оказалось, что повышение экспрессии мРНК hTERT при стимуляции лимфоцитов доноров и РА достигалось именно за счет лимфоцитов, находящихся в фазах S/M/G2 клеточного цикла (экспрессия мРНК hTERT в этой фазе была достоверно повышена по сравнению с интактными лимфоцитами как в норме, так и при всех исследованных заболеваниях). Лимфоциты доноров, РА и АД, находящиеся в фазе G1/G0, экспрессировали мРНК теломеразы на одинаковом уровне независимо от того, были ли они выделены из интактных МНК или культивировались на протяжении 3 суток (рис.6).

По литературным данным, у рациентов с ранним РА (длительность заболевания менее 1 года) максимальный уровень мРНК hTERT, достигаемый' в результате активации, был значительно ниже по сравнению со здоровыми донорами и пациентами с хроническим РА (с длительностью заболевания более года, что соответствует поздней и развернутой стадиям PA) [Thewissen М., 2005]. В данном исследовании не было выявлено отличий от доноров в экспрессии hTERT, но надо сказать, что в него были включены только пациенты с хроническим РА, которые, в отличие от пациентов с ранним РА, имеют профиль индуцированной активности теломеразы, близкий к здоровым донорам [Thewissen М., 2005]. Их Т-лимфоциты имеют большую репликативную историю и сниженную способность к пролиферации; это отражается и на длине их теломер, которая с возрастом сокращается быстрее, чем у доноров [Koetz К., 2000, Борисов В.И., 2007]. Показано, что лимфоциты пациентов с хроническим РА имеют повышенную чувствительность к акгивационному апоптозу [Tang X., 2004], и когда они погибают в ответ на стимуляцию, это ведет к увеличению относительной фракции Т-клеток, экспрессирующих «нормальный» уровень теломеразы. Поэтому результаты, полученные при изучении этой группы, могут не отражать действительный уровень теломеразы в Т-лимфоцитах.

Показано, что увеличение активности теломеразы при стимуляции лимфоцитов у пациентов с АД проявляется слабее, чем у доноров, хотя статистической достоверности эта разница не достигает [Wu К., 1999]. И действительно, в нашем исследовании АД явился единственным заболеванием, при котором в лимфоцитах при их поликлональной стимуляции уровень мРНК теломеразы возрастал недостоверно по сравнению с интактными лимфоцитами. У пациентов с БА уровень мРНК hTERT в активированных лимфоцитах был повышен не только в фазе S/M/G2, но также и в фазе G1/G0 по сравнению с интактными лимфоцитами, чего не наблюдается при других заболеваниях и у здоровых доноров.

Содержание hTERT в стимулированных лимфоцитах. Содержание субъединицы hTERT в лимфоцитах также анализировали на третьи сутки поликлональной активации в культуре. По сравнению с интактными лимфоцитами, после трехдневной поликлональной активации в культуре относительное содержание hTERT повышалось статистически достоверно в стимулированных лимфоцитах доноров и всех исследованных заболеваний (РА, АД, БА), что отражено в таблице 1. Особенностью пациентов с БА явилось то, что разброс значений hTERT в стимулированных лимфоцитах был намного больше, чем у доноров и у пациентов с другими заболеваниями. Тем не менее, разница содержания hTERT между интактными и стимулированными в течение 3 суток

Таблица 1

Содержание hTERT в интактных и стимулированных лимфоцитах

Группы сравнения Относительное содержание hTERT. МЕ (Р25-Р75)

в интактных лимфоцитах в стимулированных лимфоцитах

Доноры (п=24) 6,5 (4,7-8,2) 14,1 (10,7-19,8) #

РА (п=19) 7,7(5,8-11,8) 16,3 (15,0-28,7) #

АД (п=12) 8,7 (7,4-10,4) * 17,1(11,7-23,8) #

БА (п=20) 9,5(6,8-11,9)* 22,4 (14,4-38,9) # *

Примечание: МЕ (Р25-Р75) - медиана и квартили распределения признаков (25-75%). # -отличие стимулированных лимфоцитов от интактных р<0,05 (критерий Вилкоксона). * -отличие от группы доноров р<0,05 (критерий Манна-Уитни).

лимфоцитами пациентов с БА была статистически значимой, более того, БА явилась единственным заболеванием, при котором содержание ЬТЕЯТ в стимулированных лимфоцитах достоверно (р<0,05) превышало соответствующее значение у доноров (табл.1).

Доноры БА-А

Рис.7. Содержание ЬТЕкТ в интактных (светлые столбики) и стимулированных (темные столбики) лимфоцитах пациентов с БА различного генеза (МБ). Примечание: * - отлитие от группы доноров р<0,05 (критерий Манна-Уитни). # - отличие стимулированных лимфоцитов от интактных р<0,05 (критерий Вилкоксона).

После разделения пациентов БА на подгруппы с различным генезом заболевания было выявлено, что статистически достоверное ( повышение содержания субъединицы ИТЕЯТ в стимулированных лимфоцитах БА по сравнению с донорскими значениями происходит только в' подгруппе с БА смешанного генеза (БА-С на рис.7), что согласуется с фактом сохранения теломер на уровне возрастной нормы в лимфоцитах периферической крови при смешанной БА [Борисов В.И., 2009]. " ' "

Содержание hTERT и мРНК hTERT в CD4 и CD8 субпопуляциях лимфоцитов. Содержание мРНК hTERT было определено в CD4 и CD8 лимфоцитах 20 условно здоровых доноров, а также 19 пациентов с РА и 6 пациентов с АД. Относительное количество мРНК hTERT в CD8 лимфоцитах ПК пациентов РА статистически значимо

Таблица 2

Содержание мРНК hTERT в CD4 и CD8 субпопуляциях интактных лимфоцитов

Группы исследования : Относительное содержание мРНК hTERT. МЕ(Р25-Р75)

CD4 CD8

Доноры 7,7(6,5-13,7) 11,5(7,8-17,6)

РА 12,4 (6,5-23,4) 21,8 (10,0-28,1)#

АД 11,5(10,5-13,6) 17,4 (13,8-20,5)

Примечание: МЕ (Р25-Р75) - медиана и квартили распределения признаков (25-75%). # - отличие от группы доноров р<0,05 (критерий Манна-Уитни)

превышало соответствующий параметр группы доноров, что отображено в таблице 2. Разница содержания мРНК hTERT между CD4 и CD8 субпопуляциями лимфоцитов не достигала статистической значимости ни в одном случае. Тем не менее, содержание белка hTERT в CD8 превышало аналогичный показатель в CD4 лимфоцитах как в интактных, так и в стимулированных клетках (табл.3). Единственным исключением явилась группа пациентов с АД, в которой повышенное содержание hTERT в CD8 по сравнению с CD4 лимфоцитами было показано только для стимулированных лимфоцитов; при этом в интактных клетках уровень hTERT между CD4 и CD8 лимфоцитами не различался (табл.3) и был достоверно выше, чем уровень hTERT в CD4 и CD8 лимфоцитах группы доноров. Повышение hTERT по сравнению с группой доноров было также выявлено для интактных CD8 и стимулированных CD4 лимфоцитов пациентов с БА.

Таблица 3

Содержание hTERT в CD4 и CD8 субпопуляциях интактных и стимулированных _лимфоцитов _' ■■ ■ - .- - . ■ .- — - -

Группы исследования Лимфоциты Относительное содержание hTERT, ME (Р25-Р75)

CD4 CD8

Доноры (п=9) Интактные 5,6(3,1-7,1) 6,0 (4,9-8,0)*,

Стимулированные 13,7(13,2-14,8) 17,8 (16,8-20,7)*

РА (п=18) Интактные 6,8(5,9-9,7) 7,5 (5,7-12,1)*" ■

Стимулированные 19,0 (13,4-27,3) 21,4(16,1-30,9)*

ад (п=12) Интактные 7,3 (6,3-9,07)# г 7,9 (6,9-10,8)#

Стимулированные 19,1(10,5-25,2) 23,8 <14,1-29,7)*

БА (п=19) Интактные 8,5(5,6-11,4) 10,2 (6,5-13,0)#*

Стимулированные 21,6 (13,8-41,5)#- 26,2 (17,2-46,7)*

Примечание: ME (P2S-P75) - медиана и квартили распределения признаков, (25-75%). * -отличие CD4 от CD8 р<0,05 (критерий Вилкоксонз). # - отличие от группы дднрров р<0,05 (критерий Манна-Уитни) ,

При всех исследованных заболеваниях, кроме, БА смешанного- генеза; в лимфоцитах периферической крови индуцированная теломеразнай' активность находится на уровне донорского значения и, видимо, не может компенсировать ускоренное укорочение теломер, происходящее, в лимфоцитах ПК с йозрастом [Борисов В.И. 2006]. Несмотря на то, что индукция теломеразы сохраняет, по крайней мере на некоторое время, решшкативную способность Т-лимфоцитов, прошедших селекцию во время первичного ответа и становящихся клеткам памяти,; ее недостаточно, чтобы поддерживать длину теломер неограниченно; при повторных активациях Т-клеток памяти in vivo [Akbar A.N., 2007]. i

Исследование активности теломеразы в лимфоцитах при поликлональной стимуляции. Показано, что при культивировании лимфоцитов в присутствии РМА/иономицина либо анти-СОЗ антител происходит резкое повышение активности теломеразы. Судя по всему, это происходит для поддержания способности лимфоцитов к пролиферации в ходе нормального иммунного ответа, а также сохранения репликативной способности клеток памяти. В интактных лимфоцитах, а также в лимфоцитах, полученных с каждого дня культивирования в присутствии анти-СОЗ антител и 50 ед/мл IL-2, была определена активность теломеразы и содержание мРНК hTERT и hTERT. В

результате было получено, что динамика активности теломеразы при стимуляции лимфоцитов в культуре повторяет динамику как мРНК ЬТЕЯТ, так и ЬТЕЛТ, достигая максимального значения на 3 сутки и затем постепенно снижаясь (рис.8).

Рис.8. Содержание мРНК ЬТЕ&Г, ЬТЕЯТ и активности теломеразы в интактных лимфоцитах и после их стимуляции в присутствии антиСБЗ антител и 50 ед/мл 1Ь2. Примечание: содержание мРНК ЬТЕЯТ отображено в %ВЯО, содержание ЬТЕМ" и активность теломеразы - в относительных единицах.

При культивировании лимфоцитов доноров только лишь в присутствии IL-2 (без стимуляции анти-СОЗ антителами) содержание в них мРНК hTERT не менялось значительно по сравнению с исходным, оставаясь примерно на уровне начального значения (т.е. как в интактных лимфоцитах) в течение недели. Такие данные совпадают с данными различных авторов [Liu К.., 1999, Weng N.P., 1996],

Показано также, что на каждую повторную стимуляцию в культуре лимфоциты отвечают все уменьшающимися пиками индукции активности теломеразы [Akbar A.N., 2007]. В эксперименте, проделанном в ходе нашей работы, повторная стимуляция на 7 сутки культивирования также индуцировала второй пик активации мРНК hTERT, наблюдавшийся на 8 сутки (рис.9), то есть через сутки после реактивации, который тем не менее не достигал максимального значения (на 3 сутки). Таким образом, любая повторная стимуляция лимфоцитов также может индуцировать экспрессию в них теломеразы, но уровень этой экспрессии не достигает уровня ответа на первичный стимул. В результате активности теломеразы не хватает для того, чтобы неограниченно поддерживать длину теломер в лимфоцитах, что и приводит к постепенному сокращению теломер в клетках памяти in vivo [Buchkovich K.J., 1996].

♦ мРНК hTERT —В— hTERT —А—Активность теломеразы

Рис.9. Содержание ЬТЕКГ (сплошная линия; шкала справа) и мРНК hTERT (пунктирная линия; шкала слева) при

поликлональной активации лимфоцитов в течение 10 суток, с реактивацией на 7 сутки.

. » 1 ■* i I - и- 1 • i -

выводы

1. Разработанная методика Flow-FISH позволяет определять мРНК hTERT в интактных и пролиферирующих лимфоцитах периферической крови человека путем in sitw гибридизации с флуоресцентным пептидонуклеиновьш зондом, специфичным к последовательности этой мРНК, с последующим анализом на проточном цитофлуориметре.

2. При поликлональной стимуляции Т-лимфрцитов содержание в них как hTERT, так и ее мРНК возрастает уже на первые сутки культивирования, достигает пика на третьи сутки и затем постепенно снижается, что демонстрирует сходную динамику изменения hTERT и ее мРНК. Повышение экспрессии мРНК hTERT при поликлональной стимуляции в культуре происходит, только в лимфоцитах, находящихся в фазе S/M/G2 клеточного цикла, и не затрагивает лимфоциты, находящиеся в фазе G1/G0 клеточного цикла. Содержание hTERT в CD 8 лимфоцитах превышает аналогичный показатель в CD4 лимфоцитах как в интактных, так и в стимулированных лимфоцитах.

3. Экспрессия мРНК hTERT снижена в интактных лимфоцитах пациентов с апластической анемией и повышена в интактных CD8 лимфоцитах пациентов с ревматоидным артритом по сравнению с группой доноров.

4. Содержание белка hTERT в интактных CD4 и CD8 лимфоцитах пациентов с атопическим дерматитрм достоверно повышено по сравнению с группой донорон и возрастает статистически значимо после трех суток поликлональной стимуляции, однако при этом не наблюдается увеличения экспрессии мРНК hTERT, в отличие от группы доноров.

5. Содержание белка hTERT в интактных CD8 лимфоцитах пациентов с бронхиальной астмой достоверно повышено по сравнению с группой доноров. В отличие от доноров, экспрессия мРНК hTERT в стимулированных лимфоцитах пациентов с Б А повышена по сравнению с исходным (спонтанным) значением как в G1/G0, : так и в S/M/G2 стадиях клеточного цикла. Кроме того, содержание каталитической субъединицы те ломеразы в лимфоцитах пациентов с Б А смешанного генеза после трех суток стимуляции достоверно повышено по сравнению с группой доноров, что объясняет сохранение длины теломер в лимфоцитах при смешанной форме БА, в отличие от других исследованных

' заболеваний.

6. Изменения содержания hTERT в лимфоцитах периферической крови при иммунопатологических состояниях выявляются в разных субпопуляциях и на различных уровнях регуляции в зависимости от патологии (ревматоидный артрит, апластическая анемия, атопический дерматит, бронхиальная астма).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Кожевников B.C., Сенюков В.В., Борисов В.И., Королькова О.Ю. Метод оценки мРНК теломеразы в иммунокомпетентных клетках. // Иммунопатогенез и иммунотерапия основных заболеваний человека: от эксперимента к клинике. -Новосибирск- 2006.-С.176.

2. Королькова О.Ю., Борисов В.И., Кожевников B.C. Определение содержания мРНК hTERT теломеразы в интактных и стимулированных CD4+ и CD8+ лимфоцитах человека с помощью метода Flow-FISH. И Омский научный вестник. -2007. - №3. - Приложение 2. - С.34-36.

3. Королькова О.Ю., Борисов В.И., Кожевников B.C. Динамика экспрессии мРНК каталитической субъединицы теломеразы (hTERT) в лимфоцитах периферической крови (тезисы конференции Современные проблемы аллерголоши, иммунологии и иммунофармакологии) // Российский аллергологический журнал. - 2007. - №3. - Приложение 1. - с.25.

4. Королькова О.Ю., Сенюков В.В., Кожевников B.C. Экспрессия эрготоп-ассоциированных маркеров активированными Т-лимфоцитами (тезисы IV объединенного иммунологического форума) // Российский иммунологический журнал. - 2008. - Том 2 (11). - №2-3. - С. 127.

5. Korolkova О. J., Borisov V.l., Kozhevnikov V.S. Determination of hTERT mRNA content in intact and stimulated CD4+ and CD8+ human lymphocytes with the use of Flow FISH assay // Abstracts of participants of 3rd ENII-MUGEN summer school in advanced immunology. - 2008. - P.97.

6. Кожевников B.C., Королькова О.Ю, Борисов В.И. Патент РФ №2346279 «Способ определения уровня мРНК каталитической субъединицы теломеразы (hTERT) как показателя уровня активности фермента». Дата публикации 10 февраля 2009г. л

7. Королькова О.Ю, Сенюков В.В., Кожевников B.C. Экспрессия эрготоп-ассоциированкых. маркеров активированными Т-лимфоцитами. // Медицинская иммунология. -2009. - Т.П. - №2-3. - С.255-260.

8. Королькова О.Ю., Сенюков В.В., Кожевников B.C. Определение содержания мРНК каталитической субъединицы теломеразы в иммунокомпетентных клетках с помощью метода FLOW-FISH. // Молекулярная медицина. - 2010. - №1. - С.38-42.

9. Королькова О.Ю., Кожевников B.C. Экспрессия мРНК каталитической субъединицы теломеразы изменяется в течение клеточного цикла лимфоцитов. // Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Дни иммунологии в Сибири». - 2010. - С.126-128.

10. Борисов В.И., Королькова О.Ю. Влияние поликлональной активации лимфоцитов на изменение длины теломер и активности теломеразы in vitro. H Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Дни иммунологии в Сибири». - 2010. - С.100-102.

11. Королькова О.Ю., Абрамова Т.Я., Кулагин А.Д., Непомнящих В.М., Сизиков А.Э., Кожевников B.C., Козлов В.А. Экспрессия теломеразы в интактных и стимулированных лимфоцитах человека в норме и при иммунопатологических состояниях II Российский иммунологический журнал. - 2010. - Т.4(13). - №2. С. 145-154.

Подписано к печати 31.01.2011 формат - 60x84 1/16, Усл. печ. л. 1,5

Бумага: офсетная Печать: трафаретная Тираж: 100 экз. Номер заказа № 062 Типография ООО "ЮГУС-ПРИНТ", ИНН 5402467637, г. Новосибирск, ул. Залесского, 4

Оглавление диссертации Королькова, Ольга Юрьевна :: 2011 :: Новосибирск

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. Теломераза человека и ее регуляция.

1.1. Роль теломеразы в проблеме концевой недорепликации хромосом.

1.2. Состав теломеразного комплекса.

1.2.1. Каталитическая субъединица теломеразы.

1.2.2. РНК-субъединица теломеразы.

1.3. Регуляция активности теломеразы.

1.3.1. Транскрипционная регуляция hTERT.

1.3.2. Посттранскрипционная регуляция теломеразы.

Глава 2. Механизмы регуляции теломеразы в норме и при патологии.

2.1. Регуляция теломеразы в иммунокомпетентных клетках человека.

2.1.1. Лимфоидные клетки.

2.1.2. Миелоидные клетки.

2.2. Теломераза при различных иммунопатологических состояниях.

2.2.1. Активность теломеразы при ревматоидном артрите.

2.2.2. Активность теломеразы при системной красной волчанке.

2.2.3. Активность теломеразы при рассеянном склерозе.

2.2.4. Активность теломеразы при атопическом дерматите и псориазе.

2.2.5. Активность теломеразы при апластической анемии.

ЧАСТЬ II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ЧАСТЬ III. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Глава 1. Постановка метода оценки мРНК hTERT в имунокомпетентных клетках с помощью Flow-FISH.

1.1. Проверка специфичности используемого PNA зонда.

1.2. Разработка условий гибридизации in situ.

1.2.1. Выделение и подготовка клеточных образцов.

1.2.2. Денатурация нуклеиновых кислот.

1.2.3. Гибридизация.

1.2.4. Удаление не связавшегося зонда из клеток.

1.2.5. Окрашивание ДНК.

1.2.6. Запись и анализ данных.

1.2.7. Воспроизводимость метода Flow-FISH.

1.3. Демонстрация метода гибридизации in situ.

Глава 2. Экспрессия теломеразы в интактных и стимулированных лимфоцитах человека в норме и при иммунопатологических состояниях.

2.1. Экспрессия мРНК hTERT в интактных лимфоцитах.

2.2. Содержание субъединицы hTERT в интактных лимфоцитах.

2.3. Экспрессия мРНК hTERT в стимулированных лимфоцитах.

2.4. Содержание hTERT в стимулированных лимфоцитах.

2.5. Содержание hTERT и мРНК hTERT в CD4 и CD8 субпопуляциях лимфоцитов

2.6. Исследование активности теломеразы в лимфоцитах при поликлональной стимуляции.

ОБСУЖДЕНИЕ.

Введение диссертации по теме "Клиническая иммунология, аллергология", Королькова, Ольга Юрьевна, автореферат

Теломераза представляет собой фермент, который осуществляет наращивание теломерных районов хромосомной ДНК. Известно, что укорочение теломерных районов ДНК до значений, являющихся критически малыми, может служить сигналом к репликативному старению соматических клеток и дестабилизации их хромосом [Chan S.R.W.L., 2004]. Активность теломеразы в совокупности с длиной теломер отражает пролиферативный потенциал клетки. Существуют данные, свидетельствующие о присутствии определяемой активности этого фермента не только в стволовых, половых и опухолевых клетках, но и в слизистых клетках кишечника и в лимфоцитах периферической крови (ПК) и тимуса [Osterhage J.L., 2009], кроме того, каталитическая субъединица теломеразы (hTERT), являющаяся РНК-зависимой ДНК полимеразой, синтезирующей теломерные повторы, а также мРНК этой субъединицы, также экспрессируются в этих клетках на сравнительно низком, но детектируемом уровне.

Многочисленные данные свидетельствуют, что при большинстве перечисленных ситуаций (иммунопатологические заболевания, стресс и многие другие) теломеры в лимфоцитах, несмотря на повышенную активность теломеразы, сокращаются с возрастом быстрее, чем у здоровых доноров, и немногие свидетельства сохранения длины теломер в лимфоцитах при патологических состояниях являются, скорее, исключением. Таким исключением, например, является отсутствие ускоренного укорочения теломер при бронхиальной астме (БА) смешанного генеза, при том, что при атопической и инфекционно-зависимой БА теломеры укорачиваются с возрастом значительно быстрее, чем у доноров [Борисов В.И., 2009].

Учитывая, что регуляция активности теломеразы контролируется как на уровне транскрипции гена hTERT, так и механизмами посттранскрипционной и посттрансляционной модификации [Ly Н., 2009], представляет интерес изучение не только экспрессии мРНК hTERT в лимфоцитах, но и наличия в них самого белка hTERT. Исследование изменений продукции теломеразы на уровне мРНК и белка ее каталитической субъединицы, таким образом, представляет значительный интерес, поскольку может помочь объяснить причину укорочения или сохранения длины теломер при иммунопатологических процессах.

Для количественной оценки мРНК hTERT обычно используют RT-PCR или Northern Blotting. Эти методы недостаточно информативны, поскольку необходимость разрушения клеток для выделения мРНК не позволяет одновременно охарактеризовать исследуемый материал по другим параметрам (к примеру таким, как субпопуляционная принадлежность или экспрессия интересуемых белков) без дополнительного использования методов их сепарации. Этот недостаток отсутствует в методе Flow-FISH, позволяющем оценивать содержание исследуемой ДНК или РНК на уровне единичной клетки с помощью внутриклеточной in situ гибридизации зонда, меченого флуорохромом, с последующим анализом на проточном цитофлуориметре. Представляется перспективным таким образом модифицировать метод Flow-FISH для выявления мРНК hTERT, чтобы это позволило с достаточной информативностью и высокой производительностью определять экспрессию теломеразы в исследуемом материале.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Исследовать изменения активности теломеразы в лимфоцитах человека при иммунопатологических заболеваниях аутоиммунного и аллергического генеза на уровне продукции мРНК и белка hTERT и оценить влияние этих изменений на динамику длины теломер.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Изучить информативность, эффективность и особенности применения метода Flow-FISH при определении относительного количества мРНК hTERT в иммунокомпетентных клетках.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Показано, что уровень мРНК hTERT в лимфоцитах периферической крови человека достаточно высок для достоверной ее оценки путем in situ гибридизации с флуоресцентным зондом, специфичным к последовательности этой мРНК, с последующим анализом на проточном цитофлуориметре.

Обнаружено, что после трех суток поликлональной стимуляции лимфоцитов здоровых доноров в культуре in vitro эк спрессия в них мРНК hTERT достоверно повышается. Такое повышение происходит за счет клеток, находящихся в S/M/G2 фазе клеточного цикла (пролиферирующих клеток), тогда как в состоянии покоя (фаза G1/G0) как стимулированные, так и интактные клетки экспрессируют равные уровни мРНК hTERT. Содержание hTERT в лимфоцитах также достоверно возрастает в результате их стимуляции in vitro, более того, между содержанием hTERT в интактных и стимулированных лимфоцитах существует статистически значимая положительная корреляция.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ

Модификация способа определения уровня мРНК каталитической субъединицы теломеразы (hTERT) обладает высокой производительностью и позволяет с достаточной информативностью определить мРНК hTERT в исследуемом материале (Flow-FISH). В данной методике окрашивание мРНК hTERT на уровне единичных клеток производится в суспензии фиксированных клеток с помощью гибридизации in situ, после чего следует анализ образца на проточном цитофлуориметре. Методика опубликована в виде патента «Способ определения уровня мРНК каталитической субъединицы теломеразы (hTERT) как показателя уровня активности фермента» и в статьях.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Модифицированный метод Flow-FISH позволяет определять содержание мРНК каталитической субъединицы теломеразы в иммунокомпетентных клетках с помощью гибридизации in situ с флуоресцентным PNA зондом и последующим анализом суспензии клеток на проточном цитофлуориметре.

2. Повышение экспрессии мРНК hTERT, наблюдаемое при поликлональной стимуляции лимфоцитов, достигается за счет клеток, находящихся в фазе S/M/G2 клеточного цикла, в то время как клетки, находящиеся в фазе G1/G0, экспрессируют мРНК теломеразы на одинаковом уровне независимо от того, были ли они выделены из интактных или стимулированных в культуре лимфоцитов.

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертационного исследования на тему "Экспрессия теломеразы в иммунокомпетентных клетках человека в норме и при иммунопатологических состояниях"

выводы

1. Разработанная методика Flow-FISH позволяет определять мРНК hTERT в интактных и пролиферирующих лимфоцитах периферической крови человека путем in situ гибридизации с флуоресцентным пептидонуклеиновым зондом, специфичным к последовательности этой мРНК, с последующим анализом на проточном цитофлуориметре.

2. При поликлональной стимуляции Т-лимфоцитов содержание в них как hTERT, так и ее мРНК возрастает уже на первые сутки культивирования, достигает пика на третьи сутки и затем постепенно снижается, что демонстрирует сходную динамику изменения hTERT и ее мРНК. Повышение экспрессии мРНК hTERT при поликлональной стимуляции в культуре происходит только в лимфоцитах, находящихся в фазе S/M/G2 клеточного цикла, и не затрагивает лимфоциты, находящиеся в фазе G1/G0 клеточного цикла. Содержание hTERT в CD8 лимфоцитах превышает аналогичный показатель в CD4 лимфоцитах как в интактных, так и в стимулированных лимфоцитах.

4. Содержание белка hTERT в интактных CD4 и CD8 лимфоцитах пациентов с атопическим дерматитом достоверно повышено по сравнению с группой доноров и возрастает статистически значимо после трех суток поликлональной стимуляции, однако при этом не наблюдается увеличения экспрессии мРНК hTERT, в отличие от группы доноров.

5. Содержание белка hTERT в интактных CD8 лимфоцитах пациентов с бронхиальной астмой достоверно повышено по сравнению с группой доноров. В отличие от доноров, экспрессия мРНК hTERT в стимулированных лимфоцитах пациентов с БА повышена по сравнению с исходным (спонтанным) значением как в G1/G0, так и в S/M/G2 стадиях клеточного цикла. Кроме того, содержание каталитической субъединицы теломеразы в лимфоцитах пациентов с БА смешанного генеза после трех суток стимуляции достоверно повышено по сравнению с группой доноров, что объясняет сохранение длины теломер в лимфоцитах при смешанной форме БА, в отличие от других исследованных заболеваний.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Протокол, представляющий собой метод Flow-FISH, модифицирован для определения мРНК hTERT на уровне единичных клеток. Данный протокол включает выявление мРНК с помощью гибридизации in situ с флуоресцентным PNA зондом и последующим анализом суспензии клеток на проточном цитофлуориметре для полуколичественной оценки содержания мРНК каталитической субъединицы теломеразы в различных клетках. Таким образом с помощью метода Flow-FISH была получена возможность выявления мРНК hTERT с меньшей трудоемкостью и большей производительностью, чем при использовании таких традиционных методик, как RT-PCR.

С использованием протокола Flow-FISH продемонстрирована динамика индукции мРНК hTERT в лимфоцитах периферической крови при их стимуляции в культуре анти-СБЗ антителами в присутствии IL-2 в течение недели. Содержание мРНК hTERT возрастает уже после первых суток культивирования, достигает пика на третьи сутки и затем постепенно снижается. Динамика содержания субъединицы hTERT при этом полностью соответствует динамике ее мРНК. При повторной стимуляции уровень как hTERT, так и ее мРНК снова повышается, но при этом не достигает уровня первичной индукции. Таким образом, результаты, отражающие динамику содержания hTERT и ее мРНК, соответствуют данным, представленным в литературе, и могут отражать механизмы регуляции клональной экспансии лимфоцитов, играющей важную роль при иммунном ответе.

При проведении протокола Flow-FISH в интактных и стимулированных лимфоцитах периферической крови показана возможность определения содержания мРНК hTERT в клетках, находящихся в различных фазах клеточного цикла. Показано, что содержание мРНК hTERT в лимфоцитах условно здоровых доноров на третьи сутки стимуляции повышается статистически достоверно по сравнению с интактными лимфоцитами, но это повышение происходит лишь за счет лимфоцитов, находящихся в фазе S/M/G2 клеточного цикла. Содержание мРНК hTERT в лимфоцитах, находящихся в фазе G1/G0 клеточного цикла, не изменяется в результате их поликлональной стимуляции в культуре. Это говорит о том, что активация теломеразы происходит в результате запуска пролиферации клеток.

При исследовании содержания hTERT и ее мРНК в интактных и стимулированных лимфоцитах пациентов с заболеваниями аутоиммунного и аллергического генеза было выявлено, что мРНК hTERT в CD8 лимфоцитах ПК пациентов с РА было выше, чем в донорской группе, что не отражалось на содержании самого белка hTERT которое не превышало соответствующего донорского значения. Такие результаты частично расходятся с данными литературы, но объяснить их можно тем, что в данное исследование были включены пациенты с хроническим РА, не имеющие отличий от доноров по экспрессии hTERT и ее мРНК, в отличие от раннего РА.

Экспрессия мРНК hTERT в интактных лимфоцитах пациентов с АА достоверно снижена по сравнению с группой доноров.

Содержание hTERT в CD8 лимфоцитах превышает аналогичный показатель в CD4 лимфоцитах как в интактных, так и в стимулированных лимфоцитах для всех исследованных групп, кроме группы пациентов с АД, в которой повышенное содержание hTERT в CD8 по сравнению с CD4 лимфоцитами было показано только для стимулированных лимфоцитов; при этом в интактных клетках уровень hTERT между CD4 и CD8 лимфоцитами не различался и был достоверно выше, чем в группе доноров. В отличие от доноров, уровень мРНК hTERT в стимулированных лимфоцитах пациентов с АД повышается статистически недостоверно по сравнению с исходным уровнем. Также у этих пациентов отсутствует корреляция между содержанием hTERT в интактных и стимулированных лимфоцитах, присутствующая в норме в группе условно здоровых доноров.

Впервые показано, что у пациентов с БА содержание hTERT повышено по сравнению с группой доноров в интактных CD8 и стимулированных CD4 лимфоцитах. Кроме того, экспрессия мРНК hTERT индуцирована по сравнению с исходным значением как в Gl /GO, так и в S/M/G2 клетках

Активность теломеразы в лимфоцитах периферической крови, а также содержание hTERT и ее мРНК, во многом зависит не только от статуса активности этих лимфоцитов, но и от их репликативной истории, то есть количества делений, пройденных ими in vivo. Нарушения этого процесса, происходящие при различных патологических состояниях, неизбежно отражаются на активности теломеразы и экспрессии ее каталитической субъединицы.

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2011 года, Королькова, Ольга Юрьевна

1. Борисов В.И., Сенюков В.В., Кожевников B.C. Раннее старение иммунной системы при ревматоидном артрите // Российский иммунологический журнал. -2007. Т.1. - №2. - С. 144-149.

2. Борисов В.И., Демаков С.А., Непомнящих В.М., Леонова М.И., Демина Д.В., Баровская H.A., Кожевников B.C. Особенности изменения средней длины теломер в лимфоцитах у больных бронхиальной астмой // Медицинская Иммунология. 2009. - Т. 11. - №6. - С.523-530.

3. Боровиков В.П., Боровиков И.П. STATISTICA Статистический анализ и обработка данных в среде Windows.- М.: Информ.-изд. дом "Филинъ", 1997.- 608 с.

4. Вострякова С.А., Алифирова В.М., Иванова С.А., Орлова Ю.Ю. Апоптоз лимфоцитов у больных рассеянным склерозом // Бюллетень сибирской медицины. -2008. Приложение 1. - С.200-203.

5. Козлов В.А. Клеточный геном в патогенезе основных заболеваний человека (атеросклероз, аутоиммунные заболевания, рак) // Медицинская иммунология. 2010. - Т. 12. - №4-5. - С.285-296.

6. Лакин Г.Ф. Биометрия. Москва, «Высшая школа», 1990.- 352 с.

7. Резван В.В., Бокарев И.Н. Теломераза: новые возможности дифференциальной диагностики лимфаденопатии // Российские медицинские вести. -2001. №2. - С.4-9.

8. Ярцева И.М., Федорцева Р.Ф. Характеристика спонтанно трансформированной линии человека ECV304 I. Множественные хромосомные перестройки // Цитология. 2008. - Т.50. - №7. - С.568-576.

9. Akbar A.N., Vukmanovic-Stejic М. Telomerase in Т lymphocytes: use it and lose it? // The Journal of Immunology. 2007. - Vol.178. - P.6689-6694.

10. Ali A.S.M., Chopra R., Robertson J., Testa N.G. Detection of hTERT protein by flow cytometry // Leukemia. 2000. - Vol.14. -P.2176-2181.

11. Andrews N.P., Fujii H., Goronzy J.J., Weyand C.M. Telomeres and immunological diseases of aging // Gerontology. 2010. - Vol.56. - P.390-^403.

12. Armbruster B.N., Banik S.S., Guo C., Smith A.C., Counter C.M. N-terminal domains of the human telomerase catalytic subunit required for enzyme activity in vivo // Molecular and cellular biology. 2001. - Vol. 21. - №22. - P.7775-7786.

13. Artandi S.E., Alson S., Tietze M.K. et al. Constitutive telomerase expression promotes mammary carcinomas in aging mice // PNAS. 2002. - Vol.99. - №12. - P.8191-8196.

14. Autexier C., Lue N.F. The structure and function of telomerase reverse transcriptase // Annu Rev Biochem. 2006. - Vol.75. - P.493-517.

15. Bachand F., Autexier C. Functional regions of human telomerase reverse transcriptase and human telomerase RNA required for telomerase activity and RNA-protein interactions // Molecular and cellular biology // 2001. Vol. 21. - № 5. -P.1888-1897.

16. Baerlocher G.M., Mak J., Tien Т., Lansdorp P.M. Telomere length measurement by fluorescence in situ hybridization and flow cytometry: tips and pitfalls // Cytometry. 2002. - Vol.47. - P.89-99.

17. Bagheri S., Nosrati M., Li S. et al. Genes and pathways downstream of telomerase in melanoma metastasis // PNAS. 2006. - Vol.103. - №30. - P.l 1306-11311.

18. Beattie T.L., Zhou W., Robinson M.O., Harrington L. Reconstitution of human telomerase activity in vitro. Curr Biol // 1998. Vol.29. - №8(3). - P.177-80.

19. Belgiovine C., Chiodi I., Mondello C. Telomerase: cellular immortalization and neoplastic transformation. Multiple functions of a multifaceted complex // Cytogenet Genome Res. 2008. - Vol. 122(3-4). - P.255-62.

20. Berndt A., Kosmehl H., Celeda D., Katenkamp D. Reduced formamide content and hybridization temperature results in increased non-radioactive mRNA in situ hybridization signals // Acta Histochem. 1996. - Vol.98(2). - P. 156.

21. Biroccio A., Leonetti C. Telomerase as a new target for the treatment of hormone-refractory prostate cancer // Endocrine-Related Cancer. 2004. - Vol.11. - 407421.

22. Blasco A.M. Mice with bad ends: mouse models for the study of telomeres and telomerase in cancer and aging // The EMBO Journal. 2005. - Vol.24. - P. 10951103.

23. Bodnar A.G., Kim N.W., Effros R.B., Chiu C.P. Mechanism of telomerase induction during T cell activation // Exp Cell Res. 1996. - Vol.228. - P.58-64.

24. Bodnar A.G., Ouellette M., Frolkis M., Holt S.E., Chiu C.P., Morin G.B., Harley C.B., Shay J.W., Lichtsteiner S., Wright W.E. Extension of life-span by introduction of telomerase into normal human cells // Science. 1998. - Vol.279(5349). - P.349-352.

25. Bosoy D., Peng Y., Mian S., Lue N.F. Conserved N-terminal motifs of telomerase reverse transcriptase required for ribonucleoprotein assembly in vivo // The journal of biological chemistry. 2003. - Vol.278. - №6. -P.3882-3890.

26. Brewer P.B., Heisler M.G., Hejatko J., Friml J., Benkova E. In situ hybridization for mRNA detection in Arabidopsis tissue sections // Nature Protocols. 2006. -Vol.1.-P.1462- 1467.

27. Broccoli D., Young J. W., de Lange T. Telomerase activity in normal and malignant hematopoietic cells // Proc. Natl. Acad. Sci. 1995. - Vol.92. - P.9082-9086.

28. Briimmendorf T.H., Maciejewski J.P., Mak J., Young N.S., Lansdorp P. M. Telomere length in leukocyte subpopulations of patients with aplastic anemia // Blood. -2001. Vol.97(4). - P.895-900.

29. Bryan T.M., Goodrich K.J., Cech T.R. Telomerase RNA bound by protein motifs specific to telomerase reverse transcriptase // Mol Cell. 2000. - Vol.6(2). - P.493-9.

30. Bryce L.A., Morrison N., Hoare S.F., Muir S., Keith W.N. Mapping of the gene for the human telomerase reverse transcriptase, hTERT, to chromosome 5p 15.33 by fluorescence in situ hybridisation //Neoplasia. 2000. - Vol.2. - №.3. - p. 197-201.

31. Buchkovich K.J., Greider C.W. Telomerase regulation during entry into the cell cycle in normal human T cells // Molecular Biology of the Cell. 1996. - Vol.7. -P.1443-1454.

32. Calado R.T., Pintao M.C., Silva W.A. Jr, Falcao R.P., Zago M.A. // Aplastic anaemia and telomerase RNA mutations // Lancet. 2002. - Vol.360. - P. 1608.

33. Chakrabarti M.C., Schwarz F.P. Thermal stability of PNA/DNA and DNA/DNA duplexes by differential scanning calorimetry. // Nucleic Acids Research. -1999. Vol.27. -No.24. -P.4801-4806.

34. Chan S.R.W.L., Blackburn E.H. Telomeres and telomerase // Phil. Trans. R. Soc. Lond. 2004. - Vol.359. - P. 109-121.

35. Chang J.T., ChenY., Yang H., Chen C., Cheng A. Differential regulation of telomerase activity by six telomerase subunits // Eur. J. Biochem. 2002. - Vol.269, P.3442-3450.

36. Chang M., Arneric M., Lingner J. Telomerase repeat addition processivity is increased at critically short telomeres in a Tell-dependent manner in Saccharomyces cerevisiae // Genes Dev. 2007. - Vol.21. - P.2485-2494.

37. Chang S., DePinho R.A. Telomerase extracurricular activities // PNAS. -2002. Vol.99. - №20. - P. 12520-12522.

38. Cheadle C., Fan J., Cho-Chung Y.S., Werner T., Ray J., Do L., Gorospe M., Becker K.G. Control of gene expression during T cell activation: alternate regulation of mRNA transcription and mRNA stability // BMC Genomics. 2005. - Vol.6. - №75.

39. Chen J.L., Blasco M.A., Greider C.W. Secondary structure of vertebrate telomerase RNA // Cell. 2000. - Vol.3 - №100(5). - P.503-14.

40. Chen J.L., Greider C.W. Determinants in mammalian telomerase RNA that mediate enzyme processivity and cross-species incompatibility // The EMBO Journal. -2003. Vol.22. - №.2. -P.304-314.

41. Choi J., Southworth L.K., Sarin K.Y. et al. TERT promotes epithelial proliferation through transcriptional control of a Myc and Wnt-related developmental program//PLoS Genetics. 2008.-Vol.4. - Issue 1.-P.0124-0138.

42. Chuaire L. Telomere and Telomerase: brief review of a history initiated by Hermann Müller and Barbara McClintock // Colomb Med. 2006. - Vol.37. - P.336-339.

43. Colgin L. M., Wilkinson C., Englesou A., et al. The hTERTa splice variant is a dominant negative inhibitor of telomerase activity // Neoplasia. 2000. - Vol.2. - P.426-432.

44. Collins K., Mitchell J.R. Telomerase in the human organism // Oncogene. -2002. Vol.21. - P.564-579.

45. Collins K. The biogenesis and regulation of telomerase holoenzymes //Nat Rev Mol Cell Biol. 2006. - Vol.7. - P.484-494.

46. Collins K. Physiological assembly and activity of human telomerase complexes // Mech Ageing Dev. 2008. - Vol.l29(l-2). - P.91-98.

47. Cong Y., Wen J., Bacchetti S. The human telomerase catalytic subunit hTERT: organization of the gene and characterization of the promoter // Human molecular genetics. 1999. - Vol.8. -№.1. -P.137-142.

48. Cong Y., Wright W.E., Shay J.W. Human telomerase and its regulation // Microbiology and molecular biology reviews. 2002. - Vol.66. - №3. - P.407-425.

49. Cristofari G.I., Lingner J. Telomere length homeostasis requires that telomerase levels are limiting // The EMBO Journal. 2006. - Vol.25. - P.565-574.

50. De Semir D., Nosrati M., Li S., Kashani-Sabet M. Telomerase: going beyond the ends. // Cell Cycle. 2007. - Vol.6(5). - P.546-549.

51. Desbarats L., Gaubatz S., Eilers M. Discrimination between different E-box-binding proteins at an endogenous target gene otc-myc // Genes and development. 1996. -Vol.10. -P.447-460.

52. Dolci S., Levati L., Pellegrini M., Faraoni I., Graziani G., Di Carlo A., Geremia R. Stem cell factor activates telomerase in mouse mitotic spermatogonia and in primordial germ cells // Journal of Cell Science. -2002. Vol.115. - P.1643-1649.

53. Drosopoulos W.C., DiRenzo R., Prasad V.R. Fluman telomerase RNA template sequence Is a determinant of telomere repeat extension rate // The journal of biological chemistry. 2005. - Vol.280. - №38. - P.32801-32810.

54. Ducray C., Pommier J., Martins L. et al. Telomere dynamics, end-to-end fusions and telomerase activation during the human fibroblast immortalization process // Oncogene. 1999. - Vol.18. - P.4211-4223.

55. Eberhardy S.R., D'Cunha C.A., Farnham P.J. Direct examination of histone acetylation on Myc target genes using chromatin immunoprecipitation. // The journal of biological chemistry. 2000. - Vol.275. - №43. - P.33798-33805.

56. Effros R.B. Telomerase induction in T cells: a cure for aging and disease? // Exp Gerontol. 2007. - Vol.42(5). - P.416-420.

57. Egholm M., Buchardt O., Christensen L. et al. PNA hybridizes to complementary oligonucleotides obeying the Watson-Crick hydrogen bonding rules. // Nature (London). 1993. - Vol.365. -P.566-568.

58. Eiso H., Keiko H., Naokuni T. et al. Telomerase activity in human intestine // International Journal of Oncology.-1996.-Vol.9, №3.-P.453-458.

59. Elkon R., Zlotorynski E., Zeller K.I., Agami R. Major role for mRNA stability in shaping the kinetics of gene induction // BMC Genomics. 2010. - Vol.11. - P.259.

60. Engelhardt M., Kumar R., Albanell J., Pettengell R., Han W., Moore M.A.S. Telomerase regulation, cell cycle, and telomere stability in primitive hematopoietic cells // Blood. 1997. - Vol.90. -№1.-P.182-193.

61. Epel E.S., Lin J., Dhabhar F.S., Wolkowitz O.M., Puterman E., Karan L., Blackburn E.H. Dynamics of telomerase activity in response to acute psychological stress // Brain, Behavior, and Immunity. 2010. - Vol.24. - P.531-539.

62. Erdmann N., Liu Y., Harrington L. Distinct dosage requirements for the maintenance of long and short telomeres in mTert heterozygous mice // Proc. Natl. Acad. Sci. 2004. - Vol.101. -P.6080-6085.

63. Etheridge K.T., Banik S.S.R., Armbruster B.N., Zhu Y., Terns R.M., Terns M.P., Counter C.M. The nucleolar localization domain of the catalytic subunit of human telomerase // The journal of biological chemistry. 2002. - Vol.277. - №27. - P.24764-24770.

64. Feng J., Funk W.D., Wang S.S. et al. The RNA component of human telomerase// Science. 1995. - Vol.269(5228).-P.1236-1241.

65. Field J.J., Mason P.J., An P. et al. Low frequency of telomerase RNA mutations among children with aplastic anemia or myelodysplasia syndrome // J Pediatr Hematol Oncol. 2006. - Vol.28(7). - P.450-453.

66. Flemington E.K., Rodriguez A. Use of gene overexpression to assess function in cell cycle control // Cell Cycle Checkpoint Control Protocols. Methods in Molecular Biology. -2004. - Vol.241, II. - P. 195-206.

67. Flores I., Blasco M.A. The role of telomeres and telomerase in stem cell aging // FEBS Lett. 2010. - Vol.584(17). - P.3826-30.

68. Fogarty P.F., Yamaguchi H., Wiestner A.et al. Late presentation of dyskeratosis congenital as apparently acquired aplastic anaemia due to mutations in telomerase RNA // Lancet. 2003. - Vol.362. - P.1628-1630.

69. Folini M., Berg K., Millo E. et al. Photochemical internalization of a peptide nucleic acid targeting the catalytic subunit of human telomerase // Cancer Research. 2003. -Vol.63. - P.3490-3494.

70. Forsyth N.R., Wright W.E., Shay J.W. Telomerase and differentiation in multicellular organisms: turn it off, turn it on, and turn it off again. // Differentiation. -2002. Vol.69(4-5). - P. 188-197.

71. Fu D., Collins K. Purification of human telomerase complexes identifies factors involved in telomerase biogenesis and telomere length regulation // Mol Cell. -2007. Vol.28(5). - P.773-785.

72. Fujii H., Shao L., Colmegna I., Goronzy J.J., Weyand C.M. Telomerase insufficiency in rheumatoid arthritis // Proc Natl Acad Sci. 2009. - Vol.17. - №106(11). -P.4360-4365.

73. Gall J.G. Cajal bodies: the first 100 years // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. -2000. Vol. 16. - P.273-300.

74. Georgin-Lavialle S., Aouba A., Mouthon L., Londono-Vallejo J.A., Lepelletier Y., Gabet A., Hermine O. The telomere/telomerase system in autoimmune and systemic immune-mediated diseases // Autoimmunity Reviews. 2010. - Vol.9. - P.646-651.

75. Granger M.P., Wright W.E., Shay J.W. Telomerase in cancer and aging // Critical Reviews in Oncology/Hematology. 2002. - Vol.41. - P.29-40.

76. Greider C.W. Telomerase is processive // Molecular and cellular biology. -1991. Vol. 11. - № 9. - P.4572-4580.

77. Hahn W.C. Role of telomeres and telomerase in the pathogenesis of human cancer // Journal of Clinical Oncology. 2003. - Vol 21. - №10. - p.2034-2043.

78. Hardy C.D., Schultz C.S., Collins K. Requirements for the dGTP-dependent repeat addition processivity of recombinant tetrahymena telomerase // The journal of biological chemistty. 2001. - Vol.276. - №7. - P.4863-4871.

79. Harrington L., Zhou W., McPhail T., Oulton R., Yeung D.S., Mar V., Bass M.B., Robinson M.O. Human telomerase contains evolutionarily conserved catalytic and structural subunits // Genes Dev. 1997. - Vol.11. -P.3109-3115.

80. Haruta Y., Hiyama K., Ishioka S., Hozawa S., Maeda H., Yamakido M. Activation of telomerase is induced by a natural antigen in allergen-specific memory T lymphocytes in bronchial asthma // Biochem Biophys Res Commun. 1999. - Vol.259(3). -P.617-623.

81. Henson J.D., Reddel R.R. Assaying and investigating Alternative Lengthening of Telomeres activity in human cells and cancers // FEBS Lett. 2010. - Vol.584(17). -P.3800-11.

82. Hiyama E. et al. Telomerase activity in rheumatoid synovium correlates with the mononuclear infiltration level and disease aggressiveness of rheumatoid arthritis // J Rheumatol. 1998. - Vol.25. - P.214-20.

83. Holt S.E., Wright W.E.,Shay J.W. Regulation of telomerase activity in immortal cell lines // Molecular and cellular biology. 1996. - Vol.16. - №6. - P.2932-2939.

84. Holt S.E., Aisner D.L., Shay J.W., Wright W.E. Lack of cell cycle regulation of telomerase activity in human cells // PNAS. 1997. - Vol.94. - P. 10687-10692.

85. Hug A., Korporal M., Schroder I., Haas J., Glatz K., Storch-Hagenlocher B., Wildemann B. Thymic export function and T cell homeostasis in patients with relapsing remitting multiple sclerosis // The Journal of Immunology. 2003. - Vol.170. - P.432-437.

86. Jady B.E., Bertrand E., Kiss T. Human telomerase RNA and box H/ACA scaRNAs share a common Cajal body-specific localization signal // J Cell Biol. 2004. -Vol.164.-P.647-652.

87. Jady B.E., Richard P., Bertrand E., Kiss T. Cell cycle-dependent recruitment of telomerase RNA and Cajal bodies to human telomeres // Molecular Biology of the Cell. -2006.-Vol.17.-P.944-954.

88. Jang PL, Oh C., Jo J., Kim Y., Kwon K. Detection of telomerase activity in psoriasis lesional skin and correlation with Ki-67 expression and suppression by retinoic acid // J Korean Med Sci. 2001. - Vol.16. - P.623-9.

89. Jaskelioff M., Song W., Xia J. et al. Telomerase deficiency and telomere dysfunction inhibit mammary tumors induced by polyomavirus middle T oncogene // Oncogene. 2009. - Epub ahead of print.

90. Kammori M., Kanauchi H., Nakamura K. et al. Demonstration of human telomerase reverse transcriptase in human colorectal carcinomas by in situ hybridization // International Journal of Oncology.-2002.-Vol.20.-P. 15-21.

91. Kashubowska L. Telomere shortening and ageing of immune system // Journal of physiology and pharmacology. 2008. - Vol.59. - Suppl.9. -P.169-186.

92. Katayama Y., Kohriyama K. Telomerase activity in peripheral blood mononuclear cells of systemic connective tissue diseases // J Rheumatol. 2001. -Vol.28(2). - P.288-91.

93. Kedde M., le Sage C., Duursma A., Zlotorynski E., van Leeuwen B., Nijkamp W., Beijersbergen R., Agami R. Telomerase-independent regulation of ATR by human telomerase RNA // J Biol Chem. 2006. - Vol.281. - P.40503-40514.

94. Keith W.N., Hoare S.F. Detection of telomerase hTERT gene expression and its splice variants by RT-PCR. // Methods Mol Med. 2004. - Vol.97. - P.297-309.

95. Kim N.W., Wu F. Advances in quantification and characterization of telomerase activity by the telomeric repeat amplification protocol (TRAP) // Nucleic Acids Research. 1997. - Vol.25. - №13. -P.2595-2597.

96. Klapper W., Moosig F., Sotnikova A., Qian W., Schroeder J.O., Parwaresch R. Telomerase activity in B and T lymphocytes of patients with systemic lupus erythematosus // Ann Rheum Dis. 2004. - Vol.63. - P.1681-1683.

97. Koetz K., Bryl E., Spickschen K., O'Fallon W.M., Goronzy J.J., Weyand C.M. T cell homeostasis in patients with rheumatoid arthritis. // Proc Natl Acad Sci. 2000. - Vol.97.-P.9203-9208.

98. Kurosaka D., Yasuda J., Yoshida K. et al. Telomerase activity and telomere length of peripheral blood mononuclear cells in SLE patients // Lupus. 2003. - Vol.12. -№8. - P.591-599.

99. Lansdorp P.M., Verwoerd N.P., van de Rijke F.M. et al. Heterogeneity in telomere length of human chromosomes // Human Molecular Genetics. 1996. - Vol.5. -No.5 -P.685-691.

100. Larsen R.D., Schonau A., Thisted M et al. Detection of ganxma-globin mRNA in fetal nucleased red blood cells by PNA fluorescence in situ hybridization // Prenatal diagnosis. 2003. - Vol.23. - P.52-59.

101. Lauzon W., Dardon J.S., Cameron D.W., Badley A.D. Flow cytometric measurement of telomere length // Cytometry (Communications in Clinical Cytometry). -2000.- Vol.42. -P.159-164.

102. Lee J., Sung Y.H., Cheong C. et al. TERT promotes cellular and organismal survival independently of telomerase activity // Oncogene. 2008. - Vol.27(26). - P.3754-60.

103. Liang J., Yagasaki H., Kamachi Y. Mutations in telomerase catalytic protein in Japanese children with aplastic anemia // Haematologica. 2006. - Vol.91. - P.656-658.

104. Lindvall C.3 Hou M., Komurasaki T. Molecular characterization of human telomerase reverse transcriptase-immortalized human fibroblasts by gene expression profiling: activation of the Epiregulin gene 11 Cancer research. 2003. - Vol.63. - P. 17431747.

105. Lingner J., Hughes T.R., Shevchenko A., Mann M., Lundblad V., Cech T.R. Reverse transcriptase motifs in the catalytic subunit of telomerase // Science. 1997. -Vol.276.-P.561-567.

106. Liu C., Fang X., Ge Z., Jalink M., Kyo S., BjoErkholm M., Gruber A., SjoEberg J., Xu D. The telomerase reverse transcriptase (hTERT) gene is a direct target of the histone methyltransferase SMYD3 // Cancer Research. -2 007. Vol.67. -№6. -P.2626-2631.

107. Liu J. Studies of the molecular mechanisms in the regulation of telomerase activity // FASEB J. 1999. - Vol.13. - P.2091-2104.

108. Liu J.P., Chen S.M., Cong Y.S., Nicholls C., Zhou S.F., Tao Z.Z,. Li H. Regulation of telomerase activity by apparently opposing elements // Ageing Res Rev. -2010. Vol.9(3). - P.245-256.

109. Liu K., Schoonmaker M.M., Levine B.L., June C.H., Hodes R.J., Weng N. Constitutive and regulated expression of telomerase reverse transcriptase (hTERT) in human lymphocytes // PNAS. 1999. - Vol.96. - P.5147-5152.

110. Ly H. Genetic and environmental factors influencing human diseases with telomere dysfunction // Int J Clin Exp Med. 2009. - Vol.2. - P.l 14-130.

111. Marrone A., Stevens D., Vulliamy T., Dokal I., Mason P.J. Heterozygous telomerase RNA mutations found in dyskeratosis congenita and aplastic anemia reduce telomerase activity via haploinsufficiency // Blood. 2004. - Vol.104. - P.3936-3942.

112. Moriai M., Tsuji N., Kobayashi D., Kuribayashi K., Watanabe N. Down-regulation of hTERT expression plays an important role in 15-deoxy-Deltal2,14-prostaglandin J2-induced apoptosis in cancer cells // Int. J. Oncol. 2009. - Vol.34. -P.1363-1372.

113. Mozdy A.D., Cech T.R. Low abundance of telomerase in yeast: implications for telomerase haploinsufficiency // RNA. 2006. - Vol.12. - P. 1721-1737.

114. Nakamura T.M., Morin G. B., Chapman K. B., Weinrich S. L., Andrews W.H., Lingner J., Harley C.B., Cech T.R. Telomerase catalytic subunit homologs from fission yeast and human // Science. 1997. - Vol.277. - P.955-959.

115. Nakatake M.3 Kakiuchi Y., Sasaki N., Murakami-Murofushi K., Yamada O. STAT3 and PKC differentially regulate telomerase activity during megakaryocyte differentiation ofK562 cells // Cell Cycle. -2007. Vol.6(12). -P.1496-501.

116. Norrback K., Enblad G., Erlanson M., Sundstrom C., Roos G. Telomerase activity in Hodgkin's disease // Blood. 1998. - Vol.92. - №2. - 1998. -P.567-573.

117. O'Sullivan R.J., Karlseder J. Telomeres: protecting chromosomes against genome instability // Nat Rev Mol Cell Biol. 2010. - Vol.11(3). - P. 171-181.

118. Ogoshi M., Le T., Shay J.W., Taylor R.S. In situ hybridization analysis of the expression of human telomerase RNA in normal and pathologic conditions of the skin. // J Invest Dermatol. 1998. - Vol.110. - P.818-23.

119. Osterhage J.L., Friedman K.L. Chromosome end maintenance by telomerase // The journal of biological chemistry. 2009. - Vol.284. - №24. - P.16061-16065.

120. Park J.I., Venteicher A.S., Hong J.Y. et al. Telomerase modulates Wnt signalling by association with target gene chromatin // Nature. 2009. - Vol.460(7251). -P.66-72.

121. Park Y.P., Choi S.C., Kim J.H. et al. Up-regulation of Mac-2 binding protein by hTERT in gastric cancer // Int J Cancer. 2007. - Vol.l20(4). - P.813-820.

122. Pauleya K.M., Chaa S., Chanb E.K.L. MicroRNA in autoimmunity and autoimmune diseases // J Autoimmun. 2009. - Vol.32(3-4). - P.189-194.

123. Ray A., Norden B. Peptide nucleic acid (PNA): its medical and biotechnical applications and promise for the future//FASEB J. -2000. Vol.14. -P.1041-1060.

124. Roth A., Yssel H., Pene J., Chavez E.A., Schertzer M., Lansdorp P.M., Spits H., Luiten R.M. Telomerase levels control the lifespan of human T lymphocytes // Blood. -2003. Vol.102. - P.849-857.

125. Roth A., Baerlocher G.M., Schertzer M., Chavez E., Duhrsen U., Lansdorp P.M. Telomere loss, senescence, and genetic instability in CD4+ T lymphocytes overexpressing hTERT // Blood. 2005. - Vol.106. - P.43-50.

126. Rouda S., Skordalakes E. Structure of the RNA-binding domain of telomerase: implications for RNA recognition and binding // Structure. 2007. - Vol.l5(l 1). - P.1403-1412.

127. Rufer N., Dragowska W., Thornbury G., Roosnek E., Lansdorp P.M. Telomere length dynamics in human lymphocyte subpopulations measured by flow cytometry // Nat Biotechnol. 1998. -Vol.16. - P.743-747.

128. Sekaran V.G., Soares J., Jarstfer M.B. Structures of telomerase subunits provide functional insights // Biochim Biophys Acta. 2010. - Vol. 1804(5). - P.190-201.

129. Shay J.W., Wright W.E. Senescence and immortalization: role of telomeres and telomerase // Carcinogenesis. 2005. - Vol.26. - P.867-874.

130. Smith L.L., Coller H.A., Roberts J.M. Telomerase modulates expression of growth-controlling genes and enhances cell proliferation // Nat Cell Biol. 2003. -Vol.5(5). - P.474-479.

131. Son N.H., Murray S., Yanovski J., Hodes R.J., Weng N. Lineage-specific telomere shortening and unaltered capacity for telomerase expression in human T and B lymphocytes with age // J. Immunol. 2000. - Vol. 165. - P. 1191-1196.

132. Son N.H., Joyce B., Hieatt A., Chrest F.J., Yanovski J., Weng N. Stable telomere length and telomerase expression from naive to memory B-lymphocyte differentiation // Mech Ageing Dev. 2003. - Vol.124. - P.427-432.

133. Sung Y.H., Choi Y.S., Cheong C., Lee H.W. The pleiotropy of telomerase against cell death // Mol Cells. 2005. - Vol.19. - P.303-309.

134. Tang X., Yocum D.E., Dejonghe D., Nordensson K., Lake D.F., Richard J. Increased activation-induced cell death in peripheral lymphocytes of rheumatoid arthritis patients: the mechanism of action.// Immunology. 2004. - Vol.112. - P.496-505.

135. Taylor R.S., Ramirez R.D., Ogoshi M., Chaffins M., Piatyszek M.A., Shay J.W. Detection of telomerase activity in malignant and nonmalignant skin conditions. // J Invest Dermatol. 1996. - Vol.106. - P.759-65.

136. Teixeira M.T., Arneric M., Sperisen P., Lingner J. Telomere length homeostasis is achieved via a switch between telomerase-extendible and -nonextendible states // Cell. 2004. - Vol. 117. - P.323-335.

137. Terasaki T., Kyo S., Takakura M. et al. Analysis of telomerase activity and telomere length in bone and soft tissue tumors // Oncology Reports.-2004.-Vol. 11.-P. 13071311

138. Tesmer V.M., Ford L.P., Holt S.E. et al. Two Inactive Fragments of the Integral RNA Cooperate To Assemble Active Telomerase with the Human Protein Catalytic Subunit (hTERT) In Vitro // Molecular and Cellular Biology.-1999.-Vol. 19,№9.-P.6207-6216.

139. Thewissen M., Linsen L., Geusens P., Raus J., Stinissen P. Impaired activation-induced telomerase activity in PBMC of early but not chronic rheumatoid arthritis patients. // Immunol Lett. 2005. - Vol.100. - P.205-210.

140. Tomlinson R.L., Ziegler T.D., Supakorndej T., Terns R.M., Terns M.P. Cell cycle-regulated trafficking of human telomerase to telomeres // Molecular Biology of the Cell. 2006. - Vol.17. - P.955-965.

141. Valenzuela H.F., Effros R.B. Divergent telomerase and CD28 expression patterns in human CD4 and CD8 T cells following repeated encounters with the same antigenic stimulus II Clinical Immunology. 2002. - Vol.105. - №2. - P.l 17-125.

142. Weng N., Levine B.L., June C.H., Hodes R.J. Human naive and memory T lymphocytes differ in telomeric length and replicative potential // Proc Natl Acad Sci. -1995. -Vol.92.-P.11091-11094.

143. Weng N., Levine B.L., June C.H., Hodes R.J. Regulated expression of telomerase activity in human T lymphocyte development and activation // The Journal of Experimental Medicine. 1996. - Vol.183. - P.2471-2479.

144. Weng N., Granger L.,Hodes R.J. Telomere lengthening and telomerase activation during human B cell differentiation // Proc. Natl. Acad. Sci. 1997. - Vol.94. -P. 10827-10832.

145. Weng N. Interplay between telomere length and telomerase in human leucocyte differentiation and aging // Journal of Leucocyte biology. 2001. - Vol.70. -P.861-867.

146. Weng N. Regulation of telomerase expression in human lymphocytes // Springer Semin Immunopathol. 2002. - Vol.24. - P.23-33.

147. Weng N. Telomere and adaptive immunity // Mech Ageing Dev. 2008. -Vol.129.-P.60-66.

148. Wong J.M.Y., Collins K. Telomerase RNA level limits telomere maintenance in X-linked dyskeratosis congenital // Genes Dev. 2006. - Vol.20. - P.2848-2858.

149. Wu K., Volke A., Lund M., Bang K., Thestrup-Pedersen K. Telomerase activity is spontaneously increased in lymphocytes from patients with atopic dermatitis and correlates with cellular proliferation // J Dermatol Sci. 1999. - Vol.22(l). - P.24-30.

150. Yajima T., Yagihashi A., Kameshima H. et al. Quantitaive reverse transcription-PCR assay of RNA components of human telomerase using the TaqMan fluoogenic detection system // Clinical Chemistry.-1998.-Vol.44, №12.-P.2441-2445.

151. Yamaguchi H., Baerlocher G.M., Lansdorp P.L. et al. Mutations of the human telomerase RNA gene (TERC) in aplastic anemia and myelodysplastic syndrome // Blood. -2003. Vol. 102(3). - P.916-918.

152. Yamaguchi H., Calado R.T., Hinh Ly H., Kajigaya S., Baerlocher G.M., Chanock S.J., Lansdorp P.M., Young N.S., Mutations in TERT, the gene for telomerase reverse transcriptase, in aplastic anemia //N Engl J Med. 2005. - Vol.352. - P.1413-24.

153. Young N.S. Pathophysiologic mechanisms in acquired aplastic anemia // Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2006. -p.72-77.

154. Yudon K., Matsuno H., Nezuka T. Different mechanisms of synovial hyperplasia in rheumatoid arthritis and pigmented villonodular synovitis // Arthritis and rheumatism. 1999. - Vol. 42. - N.4. - P.669-677.

155. Zhou L., Zheng D., Wang M., Cong Y. Telomerase reverse transcriptase activates the expression of vascular endothelial growth factor independent of telomerase activity // Biochemical and Biophysical Research Communications. 2009. - Vol.386. -P.739-743.

156. Zhu Y., Tomlinson R.L., Lukowiak A.A., Terns R.M., Terns M.P. Telomerase RNA accumulates in cajal bodies in human cancer cells. // Molecular biology of the cell. -2004.- Vol.15. -P.81-90.