Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Укорочение длины теломерных районов ДНК при иммунодефицитных, аллергических и аутоиммунных состояниях

На правах рукописи

БОРИСОВ ВЯЧЕСЛАВ ИГОРЕВИЧ

Укорочение длины «уюмерных районов ДНК при иммунодефицитных, аллер! ических и аутоиммунных состояниях

14 00 36 - Аллергология и иммунология

Авторефера! диссер1ациина соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск, 2007

ООЗОВОУ5Э

003060759

Работа выполнена в Государственном учреждении научно-исследовательском институте Клинической иммунологии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Научный руководитель:

Доктор медицинских наук Кожевников Владимир Сергеевич

Официальные оппоненты'

Доктор медицинских наук, профессор Сенников Сергей Витальевич Доктор биологических наук Идока I алина Вениаминовна

Ведущая организация: Санкт-11етербургский государственный медицинский университет им акад ИП Павлова

Защита состоится « 28 »_Июня_2007 г в 14 00

часов на заседании диссертационного совета Д 001 001 01 ГУ НИИ Клинической иммунологии СО РАМН, но адресу 630099, г Новосибирск, ул Ядринцевская, 14

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке ГУ НИ института Клинической иммунологии СО РАМН

Автореферат разослан « ^ ^^ 2007 г

Ученый секретарь

№ д?,гп>р от к»—

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность

После установления связи ограниченного количества делений клеток в культуре, так называемого предела Хейфлика, из-за критического сокращения теломерных районов ДНК (теломер) в результате проблемы концевой недорепликации ДНК, теломеры стали рассматриваться как "митотические часы" клетки и это привело к взрывообразному изучению данного феномена Была установлена прямая зависимость между длиной теломерных районов ДНК и максимальным количеством делений клетки Бьщо показано, что при длине теломер, менее чем 2 тысячи пар нуклеощцов (тыс п н) клетка выходит из клеточного цикла и больше уже не способна делиться, с последующей, как правило, скорой гибелью в результате апопгоза (Allsop R С, 1992) Во множестве работ была показана обратная связь мевду длиной теломер и возрастом (Harley С, 1990, Frenck R W, 1998, Rufer N, 1999) Укорочение теломер происходит во всех соматических клетках организма (Chenf Н, 2003), включая и лейкоциты крови, в то время как в стволовых клетках, а так же в клетках некоторых опухолевых линий, длина теломер не изменяется, что происходит за счет активности в недавнем времени открытого фермента теломеразы (Blackburn Е Н, 1992, Counter С.М, 1992) В настоящий момент длина теломерных районов ДНК в соматических клетках рассматривается как показатель их пролиферативного потенциалами как показатель "состаренности" клетки (AUsopp RC, 1992, Weng N-P, 1995, Effros RB, 1996) Соответственно, при исследовании любых процессов, связанных с клеточной активностью, пролиферацией и апопгозом, длина теломер становится одним из важных функциональных показателей

Для такой системы как иммунная характерна высокая пролиферативная активность, как за счет постоянного клеточного обновления, так и за счет массивной пролиферации в ответ на различные антигены Соответственно, сокращенная длина теломер может стать ограничением к адекватному уровню пролиферации в ответ на антиген или для нормального клеточного обновления

Согласно сказанному выше представляется актуальным измерение такого показателя, как длина теломер при исследовании иммунной системы, как в норме, что позволит узнать качественные изменения в

системе с возрастом, так и при патологии, что даст понимание патогенеза заболевания, направление его развития, а так же изменений, происходящих с самой иммунной системой Следует заметить, что из-за разнородности по качественному и функциональному составу, измерение теломер необходимо проводить как на популяционном, так и на субпопуляционном уровне

Получено огромное количество информации по динамике длины теломер в лейкоцитах крови, как в норме, так и при различных заболеваниях инфекционной и онкологической природы (Counter СМ, 1995, Effros RB, 1996, Maruyama Y, 1997, Palmer L,D, 1997), но существует мало данных при заболеваниях, связанных с патологией самой, иммунной системы Из-за высокой частоты встречаемости заболеваний атопического и аутоиммунного генеза, а так же синдрома приобретенного иммунодефицита представляется актуальным и несущим большой научный интерес получение новых и полноценных данных по динамике длины теломер в лейкоцитах периферической крови при данных заболеваниях, связанных с патологией иммунной системы

Существует несколько методов измерения длины теломер, но все они достаточно длительны и громоздки, имеют свои преимущества и недостатки, разделить которые можно на две основные категории либо необходимо разрушение клеток для выделения ДНК, либо метод не позволяет оценивать большую выборку одной популяции клеток При исследовании иммунной системы необходим принципиально новый метод, который бы обладал следующими особенностями во-первых, не было необходимости разрушения клеток для выделения ДНК, поскольку необходимо

измерение длины теломер in situ, во-вторых, дифференцировка по поверхностным антигенам, и в-третьих, большое количество исследуемых клеток за минимальное время Таким условиям удовлетворяет метод Flow-FISH - гибридизация т situ в клетках с последующим анализом на проточном цитофлуориметре При исследовании клеток периферической крови с помощью проточной цитометрии по двух параметрам размеру клетки и ее плотности, можно разделить все ядерные клетки на три популяции лимфоциты, моноциты и гранулоциты без использования флуоресцентных меток В настоящий момент при использовании метода Flow-FISH такое разделение популяций было невозможным» получали только популяцию лимфоцитов и популяцию моноцитов и гранулоцитов вместе Возможно, благодаря этому недостатку flow-FISH, а так же невозможности оценки большого количества клеток с помощью других методов, исследование длины теломер в моноцитах не было проведено ни в группе здоровых доноров, ни при какой либо патологии Исходя из этого, представляется актуальным модернизация метода для получения возможности исследования длины теломер в моноцитах

Таким образом, исследование динамики длины теломер лейкоцитов периферической крови, как в норме, так и при заболеваниях, связанных с патологией иммунной системы с помощью модернизированного метода Flow-FISH может помочь более полно понять процессы, происходящие в самой иммунной системе, и объяснить некоторые звенья патогенеза заболеваний

Цепь исследования - исследовать взаимосвязь изменения длины теломерных районов ДНК в иммунокомпетентных клетках с этиологией и патогенезом заболеваний, связанных с аутоиммунными, аллергическими и иммунодефицигными состояниями

Задачи исследования:

1 Модернизировать и стандартизовать метод Flow-FISH для измерения длины теломерных районов ДНК в лейкоцитах периферической крови человека, включая моноциты и субпопуляции лимфоцитов

2 Изучить изменения длины теломерных районов ДНК в CD4+ и CD8+-лимфоцитов, моноцитов и гранулоцитов здоровых людей в зависимости от возраста

3 Исследовать длины теломерных районов ДНК в лейкоцитах периферической крови при ревматоидном артрите, бронхиальной астме, атопическом дерматите и ВИЧ инфекции

4 Оценить связь изменений длины теломерных районов ДНК в иммунокомпетентных клетках с патогенезом заболеваний на примерах больных ревматоидным артритом (с анемией и без анемии) и бронхиальной астмой (атопической, инфекционно-зависимой и смешанной формой)

Положения, выносимые на защиту

1 Метод Flow-FISH с использованием контрольных клеток и известной длиной теломер является оптимальным методом для измерения длины теломерных районов ДНК при исследовании иммунокомпетентных клеток Этот метод является воспроизводимым, высокоинформативным и обладает высокой производительностью

2 При ревматоидном артрите происходит раннее истощение репликативного потенциала всех основных популяций лейкоцитов периферической крови, которое усугубляется для лимфоцитов ранней инволюцией тимуса у больных старше 30 лет

3 Ускоренное сокращение теломерных районов ДНК может происходить вследствие генетически-обусловленной патологии гемапоэтических предшественников и тимуса (ревматоидный артрит), за счет гомеостатической пролиферации, вызванной лимфопенией (при ревматоидном артрите и ВИЧ инфекции), а так же за счет хронической антигенной стимуляции (при атопическом дерматите и бронхиальной астме) в зависимости от патогенеза заболевания может происходить с разной интенсивностью, во всех, или в отдельных популяциях иммунокомпетентных клеток

Научная новизна результатов работы

1 Впервые показано укорочение длины теломер в моноцитах у здоровых доноров и выявлена средняя скорость сокращения с возрастом

2 Впервые выявлено ускоренное укорочение теломер в моноцитах периферической крови при ревматоидном артрите Показано так же, что при ревматоидном артрите у больных с анемией хронических заболеваний происходит более значительное сокращение теломер в лимфоцитах, чем у больных без анемии

3 Прд ВИЧ инфекции впервые вьивлено ускоренное укорочение теломер в моноцитах, а так же показана корреляция длины теломер в CD4+ лимфоцитах с показателем ИРИ

4 При бронхиальной астме впервые показано укорочение теломер в CD4+ и ÇD8+ димфоцитах в зависимости от генеза астмы При топической астме происходит укорочение в CD4+ лимфоцитах, тогда как при инфекционнозависимой астме в CD4+ и в CD8+ лимфоцитах

Практическая значимость работы

1 Модифицирован метод Flow-FISH для одновременного измерения длины теломерных районов ДНК как в популяции лимфоцитов, моноцитов и гранулоцигов, так и в субпопуляциях лимфоцитов, дифференцированных по поверхностным антигенам В общем плане, данный метод позволяет определять длину теломер в суспензии, любы^, клеток, а так же в субпопуляциях клеток, дифференцированных по поверхностным ри нге нам

2 Длина теломер может быть дополнительным показателем тяжести заболевания при ревматоиднорм артрите и ВИЧ инфекции

Данная работа была выполнена в лаборатории клинической иммунопатологии ГУ НИИ Клинической иммунологии СО РАМН Заведующий лабораториейдмн, Кожевников Владимир Сергеевич Работа по стандартизации метода- выполнялась совместно с лабораторией молекулярной цитогенетики, ИЦиГ СО РАН

Автор выражает глубокую благодарность заведующему лабораторией клинической иммунопатологии, дмн Кожевникову Владимиру Сергеевичу, всем сотрудникам лаборатории, а так же к б н Демакову Сергею Анатольевичу за помощь и поддержку, оказанную в выполнении работы

Апробация работы Материалы диссертации доложены и обсуждены на следующих конференциях 1 Ежегодная конференция-конкурс молодых ученых и студентов «Авиценна-2005» -Новосибирск 2005 2 Всероссийская конференция, посвященная 15-летнему юбилею Красноярского Краевого Центра по профилактике и борьбы со СПИДом и другими инфекционными заболеваниями «Дни иммунологии в Сибири», Красноярск, 2005 3 I съезд терапевтов Сибири и Дальнего Востока «Терапия и фундаментальные науки - перспективы содружества в новом тысячелетии», Новосибирск, 2005 4 7-я отчетная конференция ГУ НИИ КИ СО РАМН «Иммунопатогенез и иммунотерапия основных заболеваний человека от эксперимента к клинике», Новосибирск, 2006

Публикации По теме диссертации опубликовано 7 работ, из них 2 статьи в центральной печати

Объем и структура работы Диссертация написана в традиционном стиле и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов и выводов Материал изложен на 124 страницах машинописного текста, включает 24 рисунка и 22 таблицы Прилагаемая библиография содержит ссылки на 165 литературных источников, из них 155 иностранных и 9 отечественных

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Характеристика обследованных больных

Все больные с ревматоидным артритом (диагноз верифицирован в соответствии с критериями ACR, 1987г ), бронхиальной астмой (диагноз верифицирован на основании международных критериев GIN А, 2003г) и атопическим дерматитом (диагноз поставлен в соответствии с Международной классификацией болезней 10-го пересмотра) были госпитализированы в Клинику иммунопатологии Института клинической иммунологии СО РАМН в связи с обострением основного заболевания Количество больных в исследуемых группах и средний возраст в группе представлены в таблицах и на рисунках Группы условно здоровых доноров были подобраны строго по возрасту и полу

ВИЧ инфекция Группа с ВИЧ инфекцией была сформирована из больных, направленных на обследование в лабораторию клинической иммунологии института клинической иммунологии СОР АМН из Центра профилактики и борьбы со СПИДом, г Новосибирск Средний показатель процентного отношения CD4+ к CD8+ Т-лимфоцитам (ИРИ) составил 0,72 ±0,491 Метод Flow-FISH для оценки длины теломер в клетках

Получения лейкоцитов периферической крови. 5 мл периферической крови добавляли в пробирку со 100 ед гепарина Затем добавляли 10% раствор желатина для осаждения эритромассы Лейковзвесь отмывали забуференным физиологическим раствором с ОД % БСА (ЗФР-БСА)

Получение мышиных спленоцитов После измельчения селезенки клетки отмывали ЗФР, содержащим 0,01% ЭДТА, 0,1% азида натрия и 0,1% бычьего сывороточного альбумина (БСА), центрифугируя при 1000 об/мин 5 мин, суспендировали в сыворотке эмбрионов коров, содержащей 10% ДМСО, и хранили при температуре -80°С

Мечение антителами CD4+ и CD8+ лимфоцитов

Лейкоциты метились биотинилированными анти-СТМ или анти-СТ>8 антитела Инкубировали 20 мин, отмывали ЗФР-БСА и добавляли стрептавидин, меченый флуорохромом Су5 и инкубировали 20 минут После отмывки ресуспендировали в 4 мМ растворе BS3 (Bis(sulfosuccmimidyl)suberat) и инкубировали 30 минут при 37°С, после чего отмывали ЗФР-БСА

Оценка относительной длины теломер (ОДТ) 1x106 лейкоцитов смешивали с 5х105 спленоцитов мыши и осаждали Осадок ресуспендировали в 300 мкл гибридизационного раствора,содержащего 70% формамида Флуоресцин-(СССТАА)з Peptide Nucleic Acid (PNA) зонд, добавляли в концентрации 0,3 мкг/мл Инкубировали при 80°С в течение 10 минут, гибридизация длилась 3 часа По окончанию гибридизации клетки переносили в пробирки для цитометрии, дважды отмывали 70% формамидом и однократно ЗФР-БСА, содержащим 0,1% Tween 20 Осадок ресуспендировали в 0,5 мл ЗФР-БСА, содержащем 25мкл/мл РНКазы и 7-Аминоакгиномицина D Анализ проб проводили на проточном цитофлуориметре FACS Calibur, используя FL1 канал для определения сигнала флуоресцеина и FL3 канал для 7-AAD, с помощью программного обеспечения Cell Quest™0 Сигнал флуоресценции теломер определяли как средний уровень флуоресценции (mean fluorescence intensity, MFI) клеток, находящихся в Go/Gi фазе клеточного цикла, вычитанием фоновой аутофлуоресценции (те MFI контрольных образцов, прошедших FISH в отсутствии PNA зонда) Относительные значения длины теломер определяли как отношение MFI исследуемого образца к MFI спленоцитов мыши Дополнительно вводится коэффициент для уравновешивания сигнала на количество хромосом в клетках, тку человека 46 хромосом, а у мыши 42, т е и количество теломер будет разное Оценка абсолютной длины теломер в субпопуляции лимфоцитов Оценка абсолютной длины теломер проводились пересчетом через относительную длину по формуле Y = 2014 + 286*Х, где «Y» - это получаемая

абсолютная длина в парах нуклеотвдов, а «X» - это длина теломер относительно клеток внутреннего контроля (ОДТ) Формула получена в результате пересчета по 5 донорам относительной длины через абсолютную, измеренную методом Southern Blotting Все данные по длине теломер представлены в формате среднее значение ± стандартная ошибка (Mean ±SE)

Метод для измерения длины теломер Soulhera Blotting Заливка клеток в блочки и их обработка

Клетки в количестве 1x106 заливались легкоплавкой агарозой и переносились в форму для блочков Блочки переносились в пробирки с протеиназой К на ночь Затем отмывались ТЕ буфером 4 раза

Гидролиз ДНК в блочках и пульс-форез Блочки инкубировали 30 мин в 1хбуфере для рестрикгазы Kzo9I, содержащем 20 мкг/мл РНКазы А и 5 мкМ спермидина Буфер заменяли на содержащий по 50 ед Kzo9I и инкубировали ночь при 37°С Рестриктную смесь заменяли на 0,5хТВЕ и инкубировали 30 мин Затем блочки монтировали в 1% агарозный гель на 0,5хТВЕ и проводили пульс-форез

Саузерн-блот гибридизация Гель обрабатывали 0,25 N HCl в воде 15 мин 1 После 2-х раз промывания, помещали в раствор состава 0,5 N NaOH, 1 М NaCl и переносили' ДНК на мембрану Hybond-N+ капиллярным способом в течение 20 ч Фильтр подсушивали, кратковременно облучали УФ, споласкивали в 2xSSC 10 мин и полностью1 высуойшали'1 'ДНК для зонда содержала многократно повторенный теломерный повтор (TTAGGG)n ДНК метили альфа-32Р дАТФ Фильтр с образцами смачивали в 2xSSC и проводили предгибридизацию в растворе 5xSSC, 1,5% сухое обезжиренное молоко; 0,2% SDS при 55°С в течение 30 мин, после чего раствор заменяли на свежий и добавляли денатурированный кипячением зонд Гибридизацию проводили при 55°С в течение 12 ч Фильтр отмывали 2xSSC, 0,1% SDS -1 раз при KT 10-мин, lxSSC, 0,1% SDS -2 раза по 20 мин при 55°С, 0,lxSSC, 0,1% SDS -2 раза по 20 мин при 55°С Отмытый фильтр экспонировали с рентгеновской пленкой CP-BU, AGFA

1 Статистическая обработка данных Статистические расчеты проводились с использованием методов описательной, параметрической и непараметрической статистики с использованием пакета программ STATISTICA 6 0, StatSoft, Inc USA

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Метод Flow-FISH для измерения относительной длины теломер (ОДТ)

Основное достоинством метода Flow-FISH - это возможность определения длины теломер в суспензии клеток от situ, дифференцируя различные популяции по параметрам прямого и бокового светорассеивания (по размеру и плотности клетки), а так же с возможностью выделения популяций по поверхностным антигенам, меченным соответствующими моноклональными антителами

Первой задачей стало воспроизводство метода Flow-FISH Исгюлъчуя готовый коммерческий набор фирмы DACO, Denmark для определения относительной длины теломер была возможность разделения лейкоцитов на лимфоциты и гранулоцигы с моноцитами (Рисунок 1, А)

Эффект исчезновения моноцитов при стандартной процедуре гибридизации в методе Flow-FISH был уже описан ранее (Gabriela М, 2002) Возник вопрос о стандартизации метода, поскольку при ежедневном повторении с одними и теми же клетками он приводит к различным результатам Так же встает вопрос, как быть уверенным в том, что гибридизация действительно прошла успешно

Эти вопросы разрешились с введением в опыт внутреннего контроля гибридизации, который показывает положительный исход гибридизации, и в то же время, этот контроль служит как стандарт длины, относительно которого ведется измерение длины теломер исследуемых клеток

А. Ш&Н Ь. пзс-н

Рисунок I. Расхождение популяций лейкоцййэв периферической крови по параметрам прямого и бокового «веггорасеенвапия. А. Стандартное распределение популяций клеток ири Ноиг-Р15Н. Ш лимфоциты И2 моноциты и грацу.юшны Б. После модернизации. Лейкоциты периферической крови (К] - лимфоциту Н2 -моноциты, КЗ - !рал>лоця1Ы). ['КС-II - размер клетки 1 плотность

(гранулярность) клетки.

Подобное было уже предложецо фирмой DAKO, где брались si етавдярт кяет/ опухолевой линии (Neuber К., 2003). В данной рабств тцким контролем ci; ы к о::;н селезенки мышей линии С 5 7151 ас к Эгя клетки были взяты из соображений, что длина теломер силеноцнтои мыши на порядок больше челонечееких. Eia тпом п основан приннигт к нутре! иге го контроля гибридизации, когда шггенеишюстъ сигнала после гибридизации возрастает на два поряди, что указывает на успешное ее завершение СРисунок 2).

Поскольку клетки контроля пришли псе этапы, что и нсозмиуемые клетки, соответственно псе колебания прибора, а гак же человеческий фактор были одинакоЕи,1 для обеих популяций и при измерении ОДТ эти изменения будут нивелированы.

Определение относительной длины теломер (ОДТ) сводится к следующей формуле: X=(FLI одЫТ^ндг-РЦии,!!, .3„Я<11)/(ТЬ1 стандар T(-j,,uaj-FLl с танда рт(_№Щ0), где ГЫо111)(Т( МЩ1) ото уровень светимости по FLf каналу в опышых клетках в пробе с зоццом. ссотастстыешш Г1.1о1тыт(_,1Ж,, аналогично, по п пробе бет зоцца, т.е. аутофлуорсецсзщня клеток, FL1 стандарт^ 1И,ц) - иг« интенсивность светимости по FL1 Каналу клеток внутренне! xî кешрвйк с зондом, a FLIciан,тнрт(,,„ц) без зонда или аутофлуорееценция (Рисунок 2).

* ' mi § S / \ ш -

к I f Г

з; гЦ

. 0 „, о

А. ГР-Н Б, FL1-H

Рисунок 2, А, Гистограмма по уровню светимости M H К человека Е.

Гистограмма по уровню светимости юкток-стшшрга (мышиные енленоцнты линии

C57Black). М) овстимость клетбх без зонда (аутофлуоресцсицня), М2 светимость

клеток с добавлением зонда- FL1 («сь X) ншенеивность светимости по каналу

светимости FITC. Counts (ось Y ) - количество клеток.

Поскольку при Использовании клеток внутреннего контроля в одной пробирке с наследуемыми (Метками происходит незначительное наложение популяций (Рисунок 3), для Гюдьшей точности метода было предложено проводить гибрядшадию для КЛетоК-Контро.тя и отдельной пробирке параллельно с исследуемыми клетками.

Рисунок Дифференциация

популяций при прямом и боковом с вето рассеивании. Лейкоциты ПК и мышиные сплсноциты С57В1аек йодной Пробе. R] спленоциты мыто

С57В1аск_ R2 - лимфоциты. КЗ -моноциты, R4 - гранулоцитьг. FSC-H — размер КЛС1КИ SSC-lt - плотность (гранулярности клетки.

Проведя 5 опытов на клгГКйК одного донора получили, что ошибка метода при раздельной гибридизации меньше, чем при совместной, а результат по среднему значению отличается на 2.9%. что статиста' |ески допустимо (Таблица 1).

По.мер опыта Раздельная гибридизация Совместная гибридизация

Длина тсломер, н.н.

1 4276 4239

2 4033 4144

3866 4620

4 4244 4257

5 4255 4049

Среднее значение 4135 4262 '

Стандартная ошибка 80,31 97,08

Ошибка метода 1,94 2,28

Таблица 1. Сравнение ошибки метода при проведении раздельной и совмест ной гибридизации клеток-контроля и исследуемых клеток.

Следующей задачей стал подбор условий, для выявления популяции моноцитов, которая была решена путем изменений состава и концентрации реактивов к гибридизационном и отмывочпых растворах, времени и температуры гибридизации, а так же настроек прибора, Дополнительно, исно.тьзование клеток-контроля в отдельной пробе, без смешивания с исследуем'-1 и клетками позволило разделить популяции MOHoisiiroB 8 гракупошпов. (Рясунак I Ну

После успешного выянления всех rjx:x орИвньк популяций лейкоцитов Йериферической крови перешли к стандартизации метода для измерения Длины тедомер в парах пуклеотилов.

Модифицирование метода ДЛЯ измерения длины тело «ер в парах нуклготидов (н.н.). Первым шагом стало измерение абсолютной длины тсломер МНК периферич.еской крови у 5 доноров и нескольких популяций клеток-стан д кати с пнмошью метода Soiilhcrti Blotting. После этого е помощью воспроизведенного нами метода FIow-FISH измерили ОДТ в MIIK доноров относительно клеток-стапдарга и построили прямую зависимости относительной длины тедомер ОТ абсолютной (Рисунок

у= гон«««"*

Отно«итепьная ддача, %

Рисунок 4 Линейная зависимость абсолютной длины теломер доноров от относительной длины теломер (за клетки контроля брались мышиные спленоциты С57В1аск)

Получили формулу для пересчета абсолютной длины через относительную Y — 2014 + 286*Х, где Х- длина, относительно клеток внутреннего контроля Уровень достоверности составил Р=0,028

Дальнейшая работа заключалась в наборе материала, те в измерении длины теломер у больных ревматоидным артритом, ВИЧ инфекцией, атопическим дерматитом и бронхиальной астмой

Ревматоидный артрит.

Измерение длины теломер у больных РА выявило достоверную обратную корреляцию длины теломер с возрастом в обеих исследуемых группах, что подтверждает теорию об укорочении теломер с возрастом (Рисунок 5) При сравнении длины теломер по популяциям клеток периферической крови между группами доноров и больных РА получили, что при РА длина теломер достоверно короче во всех трех популяциях лейкоцитов (р<0.05) У доноров длина теломер составляет 7,08 тыс п н для лимфоцитов, 7,4 тыс п н для моноцитов и 7,13 тыс п н для гранулоцитов У больных РА 6,4 тыс п н, 8,85 тыс п н и 6,2 тыс п н соответственно

больных РА (Б)

Так как теломеры укорачиваются только при делении клетки, было исследовано количество клеток в фазе S/M в обеих группах Выявили достоверное повышение

количества пролиферирующих клеток при РА только для лимфоцитов (Р<0,05), те сокращение длины теломер в моноцитах и гранулоцитах не объясняется повышенной пролиферациеи

Поскольку при РА существует i енетическая иаюлошя гамуса, приводящая к его инволюции к 30 мдам, то речко снижается продукция новых 1-лимфоцитов, что запускает гомсостатичсскую пролиферацию периферических Т-лимфоцитов Для изучения влияния данной патологии на длину теломер разбили группы на подгруппы до 30 лет и старше и сравнили показатели можд> собой Для лимфоцитов и моноцитов сохраняется аналогичные соотношения между донорами и больными РА в обеих подгруппах, как и для всей выборки в целом Для гранулоцитов достоверное укорочение только в группе с РА после 30 лет, с тенденцией к укорочению после 30 При сравнении по количеству клеток в фазе S/M выявили, что для моноцитов и гранулоцитов в обеих подгруппах идентично количество мезеду группами Для лимфоцитов интересно то, что в подгруппе до 30 тег количество клеток в S/M фазе одинаково Тогда как после 30 лет повышено при РА. Это объясняется инволюцией тимуса к этому возрасту, что приводит к снижению притока новых Т-лимфоцитов на периферию, и в результате запускается гомеостатическая пролиферация лимфоцитов на периферии Проведя корреляционный анализ длины теломер с возрастом начала, продолжительностью и уровнем активности заболевания, выявили только обратную корреляцию длины теломер в лимфоцитах с возрастом Для моноцитов и гранулоцитов никаких взаимосвязей выявлено не было

Средняя скорость укорочения геломер с возрастом составляет в iруппе доноров для лимфоцитов 63 п н /год, моноцитов 26 п нУгод и для грацулодиггов 24 п н /год (Рисунок 5, Л) Эти данные схожи с результатами ранее проведенных, огромных по масштабу, исследовании Натали Руфер (Rufer, N, 1999), ще скорос 1 ь укорочения для лимфоцитов и гранулоцитов составила 59 п н /год и 39 « нУгод сошвегслвенно, данным по моноцитам отсутствуют У больных РА для лимфоцитов, моноцитов и гранулоцитов скорость укорочения соответсгвегаю составляет 51 пп/год, 33 пи /год и 34 пн/год (Рисунок 5, Б)

При ревматоидном api рте у некоторых больных развивается анемия хронического воспаления, которая присутствует при различных, хронически текущих воспалительных иболеваниях Ранее было покачано, что анемия ассоциируется с большей тяжестью течения заболевания и изменением лабораторных показателей состояния иммунной системы (Сизиьов А Э, 2006) Мы решили сравнить подгруппы больных с анемией и без анемии но длине те юмер (Рисунок 6)

Доноры Вез анемии СанеыиеЙ

~<'Т девяяяря

От. ormi<5?.a

-Ci девиация

о Лимфоциты « Маняциш » гравушзциты

Рисунок 6 Д.шна геломер в группах РА с анемией и бе 4 анемии и в группе доноров * - уровень статистически значимого разтичия при р<.0,05 между донорами и обеими подгруппами с РА ¥ - уровень достовеоного различия при р<0,05 между подгруппой с анемией и без анемии

Ввдно, что у больные РА с анемией длина теломер во всех трех популяциях короче, чем без анемии, с достоверным различием для лимфоцитов (без анемии 6,5 тыс п н ±0,41 и больные РА с анемией 5,85 тыс п н ±0,39, р<0,05)

Поскольку популяция лимфоцитов состоит из двух основных субпопуляций, функционально различных, решили исследовать длину теломер в CD4+ и CD8+ лимфоцитах Результаты представлены в Таблице 2 Обнаружили, что у доноров длина теломер в CD8+ лимфоцитах, как в общей группе, так и в обеих возрастных подгруппах значительно короче, чем в CD4+ лимфоцитах, в то время как у больных с ревматоидным артритом длина теломер между этими субпопуляциями практически идентична как общей группе, так и в обеих подгруппах

При сравнении исследуемых групп друг с другом по длине теломер ввдно^ что при РА теломеры значительно короче в обеих возрастных подгруппах, что справедливо для обеих субпопуляций лимфоцитов Подгруппы с анемией хронического генеза и без анемии по длине теломер в субпопуляциях лимфоцитов не сравнивались

Эти данные подтверждаются несколькими исследованиями, в которых показано, что при РА укорочение происходит не только в лимфоцитах, но так же и в гранулоцитах (Stefan 0, 2003) N Ruffer показала, что у здоровых людей в наивных лимфоцитах и гранулоцитах идет одинаковая скорость укорочения теломер с возрастом, и это скорее всего из-за того, что у них один общий предшестйенник -стволовая кроветворная клетка

< Доноры (Mean ±SE) PA (Mean ±SE)

Общая группа ■ (12) До 30 лет (22) Старше 30 лет (1Г Общая Группа (24) До 30 лет (6) Старше 30 лет (13)

CD4+ лимфоциты, тыс пн 7,1±0,37 8,9±0,27 7,0±0,35 *б,2±0,24 **7,4 ±0,25 *6,3±0,36

CD8+ лимфоциты, тыс п н 6,7±0,32 8,5±0,24 6,4±0,27 *б,0±0,28 *7,3 ±0,36 6,Э±0,41

Средний возраст, лет 45 ±6,2 23 ±4,9 47 ±8,5 45±10,1 23 ±3,6 * 47 ±15,1

Таблица 2 Данные по исследованию и сравнению группы с РА и доноров * - уровень достоверного различия между донорами и больными РА по длине

теломер в соответствующих возрастных подгруппах Р<0,05 ** - уровень достоверного различия Р<0,01

Объяснялось это тем, что наивные лимфоциты только что вышли из тимуса и еще не прошли антигенную презентацию, т е имеют практически неизменные теломеры после выхода из костного мозга, а гранулоцигы имеют небольшой срок жизни и длина их теломер напрямую отражает длину теломер стволовой клетки (1£ийёг N, 1999, \VengN-P, 2001)

На рисунке 5 ввдно, что у доноров скорость укорочения с возрастом в моноцитах я гранулоцитах идентична, что так же можно объяснить общим предшественником, поскольку это уже зрелые клетки, не подвергающиеся делению При ревматоидном артрите так же получено подобное соотношение Суммируя полученные данные по длине теломер, получаем, что при ревматоидном артрите укорочение теломер происходит в обоих ростках кроветворения одновременно -миелоидном, представлен моноцитами и гранулоцитами, и лимфоидном, лимфоцитами различных субпопуляций Все это поводит к предположению, что укорочение теломер при РА возможно уже на уровне стволовых кроветворных предшественников миелоидного и лимфоидного ряда Дополнительный факт в пользу этой теории, что было показано сокращение теломер уже в наивных лимфоцитах СШ1С045И0пи" при РА (Кое1г К, 2000) В подтверждение этому служит то, что проведенные нами

12

исследования по поиску корреляций между продолжительностью, активностью и возрастом начала заболевания с длиной теломер, а так же результаты некоторых зарубежных авторов (Goronzy JJ, 2001) показывают отсутствие взаимосвязи между таковыми, т е уже в молодом возрасте, при постановке диагноза, теломеры были уже значительно короче, чем у доноров соответствующего возраста

Проведено уже множество исследований при трансплантации костного мозга, когда исследовалась длина теломер до странсплангации и после, через различные промежутки времени Было показано во всех работах, что после трансплантации происходит резкое сокращение теломер в стволовых клетках, лимфоцитах и гранулоцитах реципиента, по сравнению с донорскими показателями Вызванный таким образом репликативный стресс стволовых клеток приводит к сокращению теломер в самих транплантированных клетках, что, в свою очередь, приводит к продукции зрелых клеток миелоидного и лимфоидного ростков с уже короткими теломерами (Lee J J, 1999, Notaro R, 1997, Thomley 1, 2002)

Известно, что теломераза способствует поддержанию длины теломер при их укорочении в результате деления В таких клетках, как стволовых присутствует высокая активность теломеразы, в результате чего в этих клетках за всю жизнь человека практически не изменяется длина теломер (Engelhardt М ,1997) Однако было показано, что в примитивных гематопоэтических клетках (CD34+CD171oCD45RAlo) теломеразная активность уже ниже (Chiu С Р,1996) Было показано, что снижение теломеразной активности в клетках доминантно-негативных по мутации в гене hTEKT приводило к снижению потенциала колонеобразований Тогда как при введении искусственного вектора hTERT, приводящего к увеличению теломеразной активности, напротив резко увеличивало количество эритроидных колоний CFU клетками (Zimmermann S, 2004) При исследовании регуляции теломеразной активности было показано, что такой провоспалительвыи цитокин как интерферон напрямую блокирует активность теломеразы при добавлении в культуру клеток (Reed J R, 2004) Есть несколько работ, в которых показано, обратная зависимость длины теломер в лейкоцитах от количества трансплантированных стволовых клеток, те чем меньше клеток введено для восстановления, тем сильнее происходит сокращение теломер за одно и от же время, т е по аналогии можно предположить, что чем меньше образуется колоний CFU клетками, тем сильнее произойдет укорочение теломер (Notaro R 1997)

Объединяя все выше сказанное можно предположить, что идет блокирование интерфероном теломеразы, причем как в лимфоцитах, так и на уровне колонеобразующих единиц, что сказывается на ускоренном сокращении теломер во всех клетках крови И наши данные по ускоренному укорочению теломер в лимфоцитах, моноцитах и гранулоцитах, а так же литературные данные по сокращению теломер в «наивных» лимфоцитах при ревматоидном артрите подтверждают это предположение об укорочении теломер на уровне стволовых кроветворных клеток Дополнительно запуск гомеостатической пролиферации приводит к еще более глубокому истощению пролиферативного потенциала клетками

У больных ревматоидным артритом с синдромом анемией происходит еще большее укорочение теломер во всех популяциях лейкоцитов, чем без анемии Как было показано в работе Сизикова А Э (Сизиков А Э, 2006) анемия при РА ассоциирована с большей тяжестью заболевания и худшим прогнозом, что вполне объясняется более сильным укорочением теломер в этой подгруппе Там же показано, что у больных с анемией хронических заболеваний при ревматоидном артрите значительно повышен сывороточный уровень ИФ-у, в сравнении с больными без анемии Возвращаясь к вопросу, описанному выше, что ИФ-у блокирует активность теломеразы и это приводит к снижению образований колоний CFU-E, что, предположительно, и будег приводить к снижению продукции ретикулоцитов Одним из основных участников ревматоидного воспаления является провоспалительный цитокин ФИО, и было продемонстрировано, что при добавлении в культуру клеток опухолевой линии HepG2 он вызывает дозозависимое блокирование продукции hTERT

- каталитической субъединицы теломеразы (Weifen X, 2001), те можно предположить, что это будет способствовать снижению количества CFU и будет приводить к анемии и сокращению теломер в кроветворных предшественниках

ВИЧ инфекция

Следующей патологией был исследован иммунодефицит при ВИЧ инфекции Получили, что в группе с ВИЧ, в лимфоцитах и моноцитах происходит достоверное сокращение теломер, в то время как в гранулоцитах длина полностью идентична в сравнении с донорами (Таблица 3)

При исследовании клеточного цикла определили, что как уровень апоптоза, так и процент клеток в S/M фазе в группе больных ВИЧ инфекцией выще в обеих популяциях лимфоцитов, Р<0,01 (Данные не представлены)

Усиленная пролиферация может быть, как за счет антигенной активации, что подтверждается повышенной теломеразной активностью (Wolthers К С, 1999), чем повышенный уровень апоптоза можно объяснить как активационный апощоз дополнительно к апоптозу при поражении клеток вирусом, так и за счет гомеостатеческих процессов, приводящих к усиленной пролиферации каждой из основных субпопуляций лимфоцитов, поскольку происходит развитие выраженной лимфопении

Доноры (32) (Mean ±SE) ВИЧ (31) (Mean ±SE)

Лимфоциты, тыс п н 7,4 ±0,28 **6,4±0,18

Моноциты, тыс п н 7,1 ±0,21 *6,6 ±0,23

Гранулоциты, тыс п н 6,9 ±0,27 6,9 ±0,39

Возраст, лет 28 ±6,8 28 ±6,6

Таблица 3 Показатели длины теломер при ВИЧ в популяциях лейкоцитов ПК * -уровень достоверного различия Р<0 01 ** - уровень достоверного различия Р<0 01

При исследовании теломер в субпопуляциях CD4+ и CD8+ лимфоцитов выявлено достоверное сокращение длины теломер в обеих субпопуляциях при ВИЧ в сравнении с донорами Интересно, что ВИЧ инфицированных соотношение по длине теломер между CD4+ и CD8+ лимфоцитов практически идентично (соответственно 6,9 тыс пни 6,7 тыспн, Р<0,01) Для исследования взаимосвязи длины теломер с прогрессированием заболевания построили корреляционную прямую между иммунорегуляторным индексом ИРИ (соотношение количества CD4+/CD8+) и длиной теломер в этих субпопуляциях лимфоцитов и выявили интересную зависимость чем ниже показатель ИРИ, тем короче теломеры у этих больных в обоих субпопуляциях лимфоцитов, т е чем меньше процент CD4+ лимфоцитов, тем короче теломеры в этой субпопуляции (Р<0,05) Для субпопуляции CD8+ лимфоцитов такой достоверной закономерности не было выявлено, можно только говорить о тенденции к укорочению В субпопуляции CD4+ лимфоцитов повышена как пролиферативная активность, так и уровень апоптоза Для CD8+ лимфоцитов есть незначительная тенденция к увеличению уровня апоптоза, в то время как количество клеток в фазе S/M недостоверно меньше при ВИЧ (Р<0,01)

Согласно одной из гипотез, иммунная система устроена таким образом, что пытается восстановить общее число лимфоцитов независимо от того, какая из двух субпопуляций лимфоцитов (лимфоциты CD4+ или CD8+) уменьшается Хотя при: ВИЧ-инфекции избирательно поражаются лимфоциты CD4+, стимулируется пролиферация как лимфоцитов CD4+, так и лимфоцитов CD8+ Поэтому на ранних стадиях ВИЧ-инфекции общее число Т-лимфоцитов остается нормальным, но отношение числа лимфоцитов CD4+ к числу лимфоцитов CD8+ снижается Нами показана обратная зависимость количества CD4+ с CD8+ у больных ВИЧ (Рисунок 7, А)

Длина тел онер влййфоцитах, п.н

Рисунок 7 А Соотношение количества CD4+ и CD8+ лимфоцитов Б Зависимость длины теломер лимфоцитов от количественного субпопуляционного состава при ВИЧ инфекции

Получается, что повышение пролиферативной активности CD&+ лимфоцитов может быть обусловлено как пролиферацией специфичных к ВИЧ клонов лимфоцитов CD8+, так и компенсаторным усилением пролиферации всех клонов лимфоцитов CD8+ в ответ на снижение общего числа Т-лимфоцитов, обусловленное потерей лимфоцитов CD4+ Выявили зависимость между количеством клеток и длиной теломер для CD8+ лимфоцитов, чем выше процент клеток, тем длина теломер меньше, тогда как для CD4+ лимфоцитов с точностью наоборот, что логично объясняется усиленной пролиферацией (Рисунок 7, Б)

Идет количественное замещение гибнущей популяции CD4+ лимфоцитов популяцией CD8+ лимфоцитов Все это указывает на то, что при ВИЧ инфекции развивается гомеостатическая пролиферация, причем CD4+ пролиферируют для поддержания собственной популяции, a CD8+ для поддержания общего количества лимфоцитов

Атопический дерматит

Следующей патологией стало исследование атонического синдрома При атопическом дерматите основной интерес заключался в исследовании длины теломер в лимфоцитах, поскольку это основные клетки, принимающие участие в патогенезе заболевания При измерении длины теломер у больных с АД обнаружили, что в обеих субпопуляциях Т-лимфоцитов теломеры значительно короче при сравнении с донорами, что соответственно говорит и о достоверном различие длины теломер в общей популяции лимфоцитов (доноры CD4+ 8,8 тыс п н, CD8+ 8,2 тыс п н, больные АД 7,6 тыс п н и 7,5 тыс п н соответственно) (Таблица 4)

CD4, тыс п н CD8, тыс п н Возраст, лет

Доноры (18) (Mean ±SE) 8,8±0,49 8,2 ±0,46 24 ±3,4

АД (19) (Mean±SE) *7,6±0,40 *7,5±0,40 24 ±10,0

Таблица 4 Длина теломер в субпопуляциях лимфоцитов в группе с АД

Интересно, что как и при ревматоидном артрите, различие между субпопуляцией СЕ)4+ и СБ8+ Т-лимфоцитов при АД минимально, в то время как у доноров такое различие значительно Анализ клеючного цикла показал, что процент пролиферирующих клеток, как и уровень алоптоза, достоверно выше при АД в обеих субпопуляциях, (Р<0 01)

При атопическом дерматите отсутствует в клинике заболевания наличие лимфопении, и, соответственно, нет причин для запуска гомеостатической пролиферации периферических лимфоцитов, т е сокращение теломер в лимфоцитах не объясняется этим процессом Эти данные указывают на то, что идет хроническая антигенная стимуляция лимфоцитов, чем и можно объяснить повышенный уровень

апоптоза, как активационный При атопическом дерматите получили данные о сокращении теломер в лимфоцитах за счет обеих субпопуляций CD4+ и CD8+, что полностью аналогично данным в зарубежной литературе, где так же предполагают хроническую стимуляцию m vivo, что и приводит к репликативному старению популяции лимфоцитов (Wu К, 2000) Так же, а отличие от гомеостатической активации, в пользу этого свидетельствует повышенный уровень активности теломеразы, что возможно только пра антигенной или митогенной стимуляции (Wang NP, 1996)

Кртгеиальная астма

Данные по длине теломер в лимфоцитах при БА представляют особый интерес, поскольку впервые показывают динамику теломер в лимфоцитах при этом заболевании Основные клетки, которые участвую в патогенезе заболевания - это Т-лимфоциты Поэтому, длину теломер и пролиферативную активность решили исследовать только в субдапуляциях лимфоцитов CD4+ и CD8+(Таблица 5)

CD4, тыс п H CD8, тыс п H Возраст, лет

Доноры (25) (Mean ±SE) 7,9 ±0,30 7,3 ±0,24 38±10,5

БА(23) (Mean ±SE) *7,0 ±0,23 6,9 ±0,27 38 ±9,6

Таблица 5 Длина теломер в субпопуляциях лимфоцитов группе с БА *- уровень достоверного различия РО 05

При сравнении исследуемых групп друг с другом по длине теломер получилось, что в группе с БА длина теломер в субпопуляции CD4+ Т-лимфоцитов значительно короче, чем у доноров, в то время как в субпопуляции CD8+ Т-лимфоодтов достоверного различия нет, есть тенденция к укорочению телоломер при БА (Доноры! CD4+ 7,9тыс п н, CD8+ 7,3 тыс п н, при БА CD4+ 7,0 тыс п н, CD8+ 6,9 тыс п н, Р<0,05) Между субпопуляциями в группе с БА длину теломер можно считать идентичной Это указывает на повышенную активацию CD4+ лимфоцитов m vivo, что подтверждается патогенезом .БА, когда происходит активация Т-хелперного звена иммунитета (Kay А В, 2001) Обнаружен повышенный процент апоптотичных клеток в обеих субпопуляциях при БА, с достоверным различием для CD8+ Т-лимфоцитов, (Р<0,05), для которых так же повышена пролиферативная активность

Поскольку диагноз «бронхиальная астма» включает инфекционно-зависимый, атопический и смешанный типы течения, то группа с ЕА была разбита на три подгруппы по соответствующему типу

Обнаружили заметное сокращение теломер в CD4+ и в CD8+ лимфоцитах в подгруппе с инфекционнозависимой астмой, с небольшим смещением в сторону CD4+ лимфоцитов для обеих субпопуляций (р<0,05) По уровню апоптоза в субпоцуляциях между группами нет особых различий, когда как активность пролиферации выше в группе с астмой для субпопуляции CD8+ лимфоцитов Это указывает на активацию как Т-хелперного, так и Т-цитотоксического звеньев иммунитета

В группе с атоническим генезом астмы присутствует укорочение теломер только в субпопуляции CD4+ лимфоцитов (Р<0,05), тогда как в CD8+ лимфоцитах длина теломер идентична между донорами и больными БА По активности пролиферации видно, что в CD8+ лимфоцитах при астме выше, а для CD4+ лимфоцитов показатели Идентичны Уровень апоптоза выше, чем у доноров в CD8+ лимфоцитах, и так же в два раза, но только ниже для CD4+ лимфоцитов Поскольку в патогенезе атопии лежит активация Th2 звена иммунитета, то идет в основном активация CD4+ лимфоцитов, признаки которой и были обнаружены у больных астмой атопического генеза теломеры в этой субпопуляции у больных значительно короче, и соответствуют длине

16

теломер в СБВ+ лимфоцитах При астме смешанного генеза длины теломер в обеих субпопуляциях СШ+ и СЭ8+ оказались практически идентичными донорским показателям, на основании чего можно предположить, что этот тип астмы не является просто одновременным проявлением обеих типов астмы инфекционно-зависимой и атопической При бронхиальной астме, как и при атопическом дерматите, не происходит развития лимфопении в течение длительного срока заболевания, т е причиной укорочение теломер в лимфоцитах не может быть развитие гомеостатической пролиферации Эти данные говорят в пользу значительных различий патогенеза разных форм бронхиальной астмы

ВЫВОДЫ

1 Разработанная модификация метода Но№'-Р18Н дает возможность одновременно исследовать длину теломерных районов ДНК всех основных популяций лейкоцитов периферической крови лимфоцитов, моноцитов и гранулоцитов, а так же субпопуляций лимфоцитов, дифференцированных по поверхностным антигенам

2 С возрастом у здоровых доноров происходит постепенное сокращение длины теломер во всех популяциях иммудакомпетентных клеток, включая СЕ>4+- и СШ+-лимфоцигы Соотношение длины теломер моноцитов и гранулоцитов остается постоянным в любом возрасте, тогда как длина теломер лимфоцитов в молодом возрасте больше чем в моноцитах и гранулоцитах, а в пожилом возрасте - короче

3 У больных ревматоидным артритом укорочение длины теломерных районов ДНК происходит во всех исследованных популяциях лейкоцитов периферической крови гранулоцитах, моноцитах и лимфоцитах, включая СШ+- и С08+-кдетки Развитие анемии хронических заболеваний при ревматоидном артрите ассоциируется с более сильным сокращением теломер в СМ+- и С08+-субпопуляциях лимфоцитов

4 У больных ВИЧ инфекцией сокращение теломер происходит в С134+- и СБ8+-лимфоцитах При бронхиальной астме сокращение теломер в разных субпопуляциях лимфоцитов зависит от типа астмы при атопической форме сокращение теломер обнаруживается в СЕ)4+-клетках, при инфекционно-зависимой - в С1)4+- и С08+-клетках, при смешанной форме длина теломер этих клеток остается в пределах возрастной нормы При атопическом дерматите укорочение теломер происходит в обеих субпопуляциях лимфоцитов, в большей степени в С04+-клетках

5 Укорочение теломерных районов ДНК в иммунокомпетентных клетках характерно для основных заболеваний, развивающихся на основе аутоиммунных, иммунодефицитных и аллергических состояний, происходит по разным причинам, включая генетические дефекты гемо- и тимопоэза, ВИЧ-инфекцию, антигенную стимуляцию, и отражает патогенетические варианты этих заболеваний, проявляясь во всех или отдельных субпопуляциях иммунокомпетентных клеток

Список опубликованных работ по теме диссертации

Борисов В И, Кожевников В С, Сенюков В В, Сизиков А А, Коненкова Л П, Герцог О А, Козлов В А Укорочение длины теломер моноцитов при ревматоидном артрите // Медицинская иммунология - 2006 -Т,1 -Стр 87-90

Борисов В И, Демаков С А, Сенюков В В , Кожевников В С, Сизиков А Э , Коненкова Л П, Герцог О А, Леонова М И, Демина Д В, Козлов В А Сокращение длины теломер в Т-лимфоцитах у пациентов с ревматоидным артритом и атопическим дерматитом // Вестник уральской медицинской академической науки -2006 -Т 3-1(14) -Стр 22-24

Борисов В И, Кожевников В С, Сенюков В В , Сизиков А Э , Козлов В А Радаее старение иммунной системы при ревматоидном артрите // Russian Journal of Immunology -2007 -№2 - Стр 17-20

Борисов В И, Коненкова Л П, Кожевников В С Укорочение теломер при ревматоидном артрите Результаты ежегодной конференции-кощсурс молодых ученых и студентов «Авиценна-2005» -Новосибирск СибМедИздат -НГМА -2005 -Стр 482

Борисов В И, Сенюков В В, Кожевников В С Определение длины теломерных районов ДНК (теломер) как показателя пролиферативного потенциала клеток // Дни иммунологии в Сибири материалы Всероссийской научно-практической конференции -Красноярск Издательство КраеГМА -2005 -Стр 19-21

Борисов В И, Сенюков В В Раннее старение иммунной системы при ревматоидном артрите // II Сибирский конкурс молодых ученых «терапия фундаментальные науки - перспективы содружества в новом тысячелетии», Новосибирск -2005-Стр 859-864

Борисов В И, Сенюков В В , Сизиков А Э, Коненкова Л П, Герцог О А, Кожевников В С, Козлов В А Укорочение длины теломер моноцитов при ревматоидном артрите // Иммунопатогенез и иммунотерапия основных заболеваний человека от эксперимента к клинике -Новосибирск -2006 -Стр 145147

Подписано к печати 22 05 2007 формат - 60x84 - 1 печатный лист

Бумага офсетная Печать Duplo DP-43S Тираж 100 экз Номер заказа № 550 Типография ООО "ЮГУС ПРИНТ" г Новосибирск, ул Залесского, 4

1.1 Актуальность

После установления связи ограниченного количества делений клеток в культуре, так называемого предела Хейфлика, из-за критического сокращения теломерных районов ДНК (теломер) в результате проблемы концевой недорепликации ДНК, теломеры стали рассматриваться как "митотические часы" клетки и это привело к взрывообразному изучению данного феномена. Была установлена прямая зависимость между длиной теломерных районов ДНК и максимальным количеством делений клетки. Было показано, что при длине теломер, менее чем 2 тысячи пар нуклеотидов (тыс.п.н.) клетка выходит из клеточного цикла и больше уже не способна делиться, с последующей, как правило, скорой гибелью в результате апоптоза (Allsop R.C., 1992). Во множестве работ была показана обратная связь между длиной теломер и возрастом (Harley С., 1990, Frenck R.W., 1998, Rufer N., 1999). Укорочение теломер происходит во всех соматических клетках организма (Cherif Н., 2003), включая и лейкоциты крови, в то время как в стволовых клетках, а также в клетках некоторых опухолевых линий, длина теломер не изменяется, что происходит за счет активности в недавнем времени открытого фермента теломеразы (Blackburn Е.Н., 1992, Counter С.М., 1992). В настоящий момент длина теломерных районов ДНК в соматических клетках рассматривается как показатель их пролиферативного потенциала или как показатель "состаренности" клетки (Allsopp R.C., 1992, Weng N.-P., 1995, Effros R.B., 1996). Соответственно, при исследовании любых процессов, связанных с клеточной активностью, пролиферацией и апоптозом, длина теломер становится одним из важных функциональных показателей.

Для такой системы как иммунная характерна высокая пролиферативная активность, как за счет постоянного клеточного обновления, так и за счет массивной пролиферации в ответ на различные антигены. Соответственно, сокращенная длина теломер может стать ограничением к адекватному уровню пролиферации в ответ на антиген или для нормального клеточного обновления.

Согласно сказанному выше представляется актуальным измерение такого показателя, как длина теломер при исследовании иммунной системы, как в норме, что позволит узнать качественные изменения в системе с возрастом, так и при патологии, что даст понимание патогенеза заболевания, направление его развития, а также изменений, происходящих с самой иммунной системой. Следует заметить, что из-за разнородности по качественному и функциональному составу, измерение теломер необходимо проводить как на популяционном, так и на субпопуляционном уровне.

Получено огромное количество информации по динамике длины теломер в лейкоцитах крови, как в норме, так и при различных заболеваниях инфекционной и онкологической природы (Counter С.М., 1995, Effros R.B., 1996, Maruyama Y., 1997, Palmer L.D., 1997), но существует мало данных при заболеваниях, связанных с патологией самой иммунной системы. Из-за высокой частоты встречаемости заболеваний атопического и аутоиммунного генеза, а также синдрома приобретенного иммунодефицита представляется актуальным и несущим большой научный интерес получение новых и полноценных данных по динамике длины теломер в лейкоцитах периферической крови при данных заболеваниях, связанных с патологией иммунной системы.

Существует несколько методов измерения длины теломер, но все они достаточно длительны и громоздки, имеют свои преимущества и недостатки, разделить которые можно на две основные категории: либо необходимо разрушение клеток для выделения ДНК, либо метод не позволяет оценивать большую выборку одной популяции клеток. При исследовании иммунной системы необходим принципиально новый метод, который бы обладал следующими особенностями: во-первых, не было необходимости разрушения клеток для выделения ДНК, так как необходимо измерение длины теломер in situ, во-вторых, дифференцировка по поверхностным антигенам, и в-третьих, большое количество исследуемых клеток за минимальное время. Таким условиям удовлетворяет метод Flow-FISH - гибридизация in situ в клетках с последующим анализом на проточном цитофлуориметре. При исследовании клеток периферической крови с помощью проточной цитометрии, по двух параметрам: размеру клетки и ее плотности, можно разделить все ядерные клетки на три популяции: лимфоциты, моноциты и гранулоциты без использования флуоресцентных меток. В настоящий момент при использовании метода Flow-FISH такое разделение популяций было невозможным, получали только популяцию лимфоцитов и популяцию моноцитов и гранулоцитов совместно. Возможно, благодаря этому недостатку flow-FISH, а также невозможности оценки большого количества клеток с помощью других методов, исследование длины теломер в моноцитах не было проведено ни в группе здоровых доноров, ни при какой либо патологии. Исходя из этого, представляется актуальным модернизация метода для получения возможности исследования длины теломер в моноцитах.

Таким образом, исследование динамики длины теломер лейкоцитов периферической крови, как в норме, так и при заболеваниях, связанных с патологией иммунной системы с помощью модернизированного метода Flow-FISH может помочь более полно понять процессы, происходящие в самой иммунной системе, и объяснить некоторые звенья патогенеза заболеваний.

1.2 Цель исследования - исследовать взаимосвязь изменения длины теломерных районов ДНК в иммунокомпетентных клетках с этиологией и патогенезом заболеваний, связанных с аутоиммунными, аллергическими и иммунодефицитными состояниями.

7. ВЫВОДЫ

1. Разработанная модификация метода Flow-FISH дает возможность одновременно исследовать суммарное число теломерных повторов ДНК всех популяций лейкоцитов периферической крови: лимфоцитов, моноцитов и гранулоцитов, а также субпопуляций лимфоцитов, дифференцированных по поверхностным антигенам.

2. С возрастом у здоровых доноров происходит постепенное сокращение теломер во всех популяциях иммунокомпетентных клеток, включая CD4+- и С08+-лимфоциты. Соотношение длины теломер между моноцитами и гранулоцитами остается постоянным в любом возрасте, тогда как длина теломер в лимфоцитах в молодом возрасте больше, чем в моноцитах и гранулоцитах, а в пожилом возрасте - меньше.

3. У больных ревматоидным артритом укорочение теломер происходит во всех исследованных популяциях лейкоцитов периферической крови: гранулоцитах, моноцитах и лимфоцитах, включая CD4+- и СБ8+-клетки. Развитие анемии хронических заболеваний при ревматоидном артрите ассоциируется с более сильным сокращением теломер в CD4+- и С08+-субпопуляциях лимфоцитов.

4. У больных ВИЧ инфекцией сокращение теломер происходит в CD4+- и СБ8+-лимфоцитах. При бронхиальной астме укорочение теломер в разных субпопуляциях лимфоцитов зависит от типа астмы: при атопической форме сокращение обнаруживается в С04+-клетках, при инфекционно-зависимой - в CD4+- и СБ8+-клетках, при смешанной форме длина теломер в этих клетках остается в пределах возрастной нормы. При атопическом дерматите укорочение теломер происходит в обеих субпопуляциях лимфоцитов, в большей степени в CD4+-KneTKax.

5. Сокращение теломер в иммунокомпетентных клетках характерно для заболеваний, развивающихся на основе аутоиммунных, иммунодефицитных и аллергических состояний, происходит по разным причинам и отражает патогенетические варианты этих заболеваний, проявляясь во всех или отдельных субпопуляциях иммунокомпетентных клеток.

6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследования длины теломерных участков ДНК иммунокомпетентных клеток человека методом Flow-FISH ограничивались субпопуляциями лимфоцитов и гранулоцитов, на наш взгляд, в основном в связи с трудностями идентификации моноцитов. Суть нашей модификации метода заключается в удалении из гибридизационной смеси клеток внутреннего контроля Эти клетки применялись в базовом методе с целью проведения гибридизации PNA-зонда с теломерными повторами ДНК исследуемых и контрольных клеток в идентичных условиях (в одной пробирке) с целью повышения точности исследования (Борисов В.И., 2006). Присутствие клеток внутреннего контроля, по нашему мнению, затрудняло идентификацию не только моноцитов, но и других клеток в исследуемой лейковзвеси, в связи с чем и сама точность исследования могла снижаться. Удаление клеток внутреннего контроля из проб позволило уверенно идентифицировать моноциты по параметрам светорассеивания после процедуры гибридизации. Более того, исследование одних и тех же образцов базовым и модифицированным методом выявило, что точность исследования (таблица 9) при использовании модифицированного метода также выше.

В качестве основного итога работы можно рассматривать положение, во-первых, о распространенности феномена укорочения теломер в иммунокомпетентных клетках при иммунопатологических процессах, в основе которых лежит аутоиммунитет, иммунодефицит и аллергия, и, во-вторых, о разных причинах и механизмах такого укорочения, заложенных в патогенезе заболеваний иммунопатологической природы. Так, в условиях лимфопении, развивающейся при ревматоидном артрите и ВИЧ-инфекции, укорочение теломер в иммунокомпетентных клетках связано, главным образом, с гомеостатической пролиферацией, восполняющей истощение пула Т-клеток. При атопической дерматите количество лимфоцитов не снижается, а укорочение теломер Т-клеток, скоре всего, связано с их массивной антигенной стимуляцией и пролиферацией, в пользу чего свидетельствует и активация теломеразы в Т-клетках при атопическом дерматите. Обнаружение укорочения теломер не только в Т-клетках, но и в моноцитах при ревматоидном артрите свидетельствует о репликативном стрессе уже на уровне плюрипотентных стволовых клеток. Это расширяет наше понимание причин развития лимфопении при ревматоидном артрите, не ограничивая его только генетическим дефектом тимопоэза. Более того, более выраженное укорочение теломер в иммунокомпетентных клетках у больных ревматоидым артритом с анемией, по сравнению с больными без анемии, прямо указывает на то, что более тяжелое течение ревматоидного артрита связано с более выраженными признаками старения Т-клеток. Данные об укорочении теломер в разных субклассах Т-клеток при разных формах бронхиальной астмы, и, в особенности, об отсутствии укорочения при смешанной форме, могут рассматриваться в качестве весомого аргумента в пользу значительных различий патогенеза разных форм бронхиальной астмы. Таким образом, другим важным итогом работы является демонстрация того, что патогенез иммунопатологических процессов находит отражение в состоянии иммунокомпетентных клеток на молекулярно-генетическом уровне.