Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Экспрессия продуктов генов ENV и GAG HTLV-1 в Е. соli, их анализ и использование для экспериментальныхи диагностических целей

> >

- АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

- ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

I___ им. цкпдемика Н.Н.Блохина______

0 На прамх рукописи

1

УДК 577.21.218:578. 74:579.25.5.

Сырцев Александр Валентинович

Экспрессия продуктов генов ENV и GAG HTLV-I в Е. coli, их анализ и использование для экспериментальных и диагностических целей

14.00.14 • Отология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - .1995

РаОота выполнена в Онкологическом научном центре имени Н.'Н.Бдохша Академии «едицннских наук Российской Федерации.

Научный руководитель: руководитель лаборатории вирусного канцерогенеза НИИ Канцерогенеза ОНЦ АМН РФ, доктор медицинских наук, В.э.Гурцевич.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук А.Г.Татосян доктор биологических наук А.Ф.Вобков

Ведущая организация: НИИ Эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф.Гамалеи.

Защита диссертации состоится ••■•/6» й^ол^ 1дд5 г, в чесов на ааседании специализированного совета К. 001.17.01 Онкологического научного центра АМН ГО (115478. Москва, Каширское шоссе 24)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ОНЦ АМН ГО.

Автореферат раэоолан »2.0« си^елЯ 1ЭЭ5 г.

Ученый секретарь специализированного совета д.м.н., профессор В.С.Турусов

Общая характеристика работы:

1.Актуальность проблемы. является первым экзогенным

ретровирусом человека, этиологически ассоциированным с Т-клеточным лейкозом взрослых (А1Ъ). Имеются убедительные аргументы и в пользу причинной связи этой инфекции с хроническими нервными заболеваниями человека, такими как тропический спастический парапарез (Т5Р) или атрофическая мивлопатия (НАМ). Н'ГЬУ-1 также ассоциировал с такими патологическими состояниями человека как, увеиты, мелкоклеточный рак легкого, различные Форш полиэндокринопатий (Базедова болезнь, инсулинзаЕисимый диабет) и т.д. Выявлены эндемичные регионы, где повышенная заболеваемость указанными болезнями сочетается с высокой инфицированностью НТЦ/-I. Лица, инфицированные НТЬУ-1 встречаются и спорадически.

Исследованиями нашей лаборатории (лаб. вирусного канцерогенеза, ОНЦ АМН РФ) показано, что вирусоноситедьство Н'ГЬУ-! встречается в г.Москве, в Дальневосточном регионе России, в государствах Казахстан, Грузия и в большинстве Среднеазиатских государств. Эти исследования также позволили выявить две инфицированные НТЬУ-1 семьи, у одного из членов которой был диагностирован НТЬУ-1-ассоциированный случай АП, - первый зарегистрированный случай этого заболевания на территории бывшего СССР. Принимая во внимание пути распространения НТЪУ-1 (половой, с молоком матери, при гемотрансфузи-ях), можно предположить, что наличие таких своеобразных резервуаров вируса угрожает медленным, но неуклонным ростом числа инфицированных людей в регионах, где инфекция НТЬУ-I является еще спорадичес-крй.

Накопленные в настоящее время данные об НТЬУ-I инфекции с несомненностью указывают на необходимость широкого скринирования на антитела к НТЬУ-I доноров крови и представителей так называемых "групп риска". Такое скринирование позволяет осуществлять контроль за. инфицированными лицами и остановить дальнейшее распространение инфекции. Существующие, однако, за рубежом коммерческие скринирую-щие и верифицирующие тесты, приготовленные на основе культуральных вирусных частиц, по данным зарубежных авторов и результатам наших собственных исследований, не обладают достаточной специфичностью и чувствительностью. Поэтому представляются логичным направления исследований с целью экспрессировать диагностически значимые белки Н1ЪУ-1 в бактериальных и других системах для последующей разработки

скрияирующих тестов на Сазе рекомбинантных белков.

2. Цели и задачи исследования. Поскольку по существующим рекомендациям ВОЗ, определяющим для диагностики HTLV-I инфекцииявляет-ся одновременное 'Янаружение антител к продуктам генов gag (р53, р24 или р19) и env (gp62, gp46 и gpZl). Целью данной работы являлось получение рекомбинантных белков, указаньых выше генов HTLV-I, изучение ил свойств (стабильность, иымуногенность и т.д.), а также их анализ в плане потенциального использования для диагностических целей.

В связи с этим в задачи исследования входило:

1. Молекулярное клонирование отдельных фрагментов генов env и gag HTLV-I в различных типах векторных систем и отбор оптимальной векторной системы.

2. Экспрессия, выделение и анализ различных свойств рекомбинантных белков. ^

3. Оценка серологической реактивности полученных рекомбинантных белков с помощью различных обраацов позитивных, неопределенных и др. сывороток.

3. Научная новизна. Получена коллекция ллазмидных клонов, способных экспрессировать в E.coll гибридные, белки гена env и gag HTLV-I. .Проанализированы несколько вариантов векторов с различными типами промоторов и способов индукции белков (дискретный или слитный), которые не использовались ранее для экспрессии белков HTLV-I. Выявлена наиболее чувствительная к лротеолизу часть карбокситерми-нальной области gp46env HTLV-I, локализующаяся между сайтами Taq-Taql и содержатся только 25 аминокислотных оснований. Установлено, что бактериальная La-лротеаза не является ответственной за процесс лротеолиза HTLV-I гибридных белков AC-gp46env ' и AC-p24pl5eair в E.coli.

4. Научно-практическая значимость работа. Экспрессированные белки некоторых из полученных клонов после иммуиоафинной очистки, могут быть использованы в качестве специфических антигенов при создании тест-систем по выявлении HTLV-I инфекции, а в Настоящее время широко используются для скринирования сывороток крови поступающих в лабораторию для выявление специфических антител на HTLV-I.

Использование рекомбинантных белков позволяет проводить оценку серопозитивности, следуя принятым международным критериям и существенно повышает достоверность выявления HTLV-I специфических анти-

тел. Использование некоторых рекомбинантных белков позволяет проводить дифференциальную диагностику между I1TLV-I и HTLV-II инфекцией.

Полученная коллекция клонов, способных экспрессировать регсом-бинанткне белки генов gag и env HTLV-I, может быть использована ив только в диагностических целях, но и для получения в будущем полик-лональных и мсноклональных антител, a Tarate в кажестве мслекуляр-но-биологических зондов. Плазмвдные клокы, содержащие различные фрагменты генов env и gag HTLV-I, могут служить также основой для переклонирования в другие векторные системы и их модификаций.

6.Апробация работы. Апробация диссертационной работы была проведена 27 марта 1995 г., на совместной научной конференции лабораторий вирусного канцерогенеза, иммунологии онксгенных вирусов, молекулярной биологии вирусов, регуляции клеточных и вирусных онкогенов НИИ Канцерогенеза ОНЦ АМН РФ.

Основные положения диссертации докладывались на советссо-фран-цуэском симпозиуме по вирусологии опухолей (Латвия, Рига, 1990 г.), на П-ой международной конференции "AIDS, Cancer and Human Retroviruses" (Россия, Санкт-Петербург, 1093 г.), на 1Х-ой международной конференции по СПИДу (Германия, Берлин, 1993 г.), ка Х-ой международной конференции по СПИДу (Япония, Йокохама, 1994 г.), на ГП-ей международной конференции "AIDS, Cancer and Human Retroviruses" (Россия, Санкт-Петербург, 1995 г.)

6. Публикации. По материалам выполненных исследований опубликовано 23 работы.

7.Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (включающего 4 главы), описания' использованных материалов и методов, результатов исследования, обсуждения полученных данных, выводов и списка литературы. Работа содержит 38 рисунков, 3 таблицы, занимает страниц машинописного текста. Библиография включает 2.° источников отечественной и 9S иностранной литературы.

СОДЕРШШИЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1.1!зТоряшга и метода, в качестве источника плазмидной ДНК использовали субклон рАТКОб (любезно предоставлен проф. Х.Иошида, Япония), содержащий ВатНЬфрагмент АТК-1. Позиция данного фрагмента соответствует 5115-6120 н.п. полной нуклеотидной последовательности данного изолята HTLV-I и включает почти полную рамку считывания gp46 за исключением последних четырех аминокислот. Для клонирования

использовалась тагосе плазмида рМТ-2 (любезно предоставлена докт. В.А.Морозовым), содержащая р24р15 последовательности гена gag HTLY-I. В качестве экспрессирующих векторов использовали рАТН(-1,10,11), i также термоиндуцибельный вектор рЕХ-2 и ИПТГ . (изопропил-D-гиогаяактспиранозид)-индуцибельиый вектор

РКК233-2. Для репликации и выделения плаамидных ДНК использовали штаммы Е.col i: DH-1(F-, recAl, endAl, gyrA96, thi-1, supE44); HB101(F-,recA13, ara-14, proA2, lacYi, galK2, supE44); R832 (dám, recA+); 490A(recA-); V6(cI857+). Бактерии штаммов C600 (supE44, thi-1, thr-1, leuB6, lacYl, tonA21) и 1оп-"минус" SG21063 (MC4100, gal, lon-146::TnlO), трансформированные pATH и рекомбинантными плазмидами, использовали для химической индукции белка, согласно методу Шлиндлер и соавт.(1984). Аналогичным образом бактерии штамма pop2136(MM294, clts857+), трансформированные рЕХ или его рекомбинантными плазмидами, использовали для термоиндукции белковых про--дуктов повышенной температурой, а штамма JM103(endAl, hsdR, supE, sbcB, thi-1, strA, laclq), трансформированные рШЗЗ-2, - для индукции с помощь» ИПТГ. Штаммы SG21053, R832, 4Q0A любезно предоставлены докт. Р.Борнкаммом (ФРГ, Мюнхен), W6 - докт, Г.Шакиелем (ФРГ, Хайдельберг), pop 2136 - коммерческий штамм фирмы "Geno-fit"(Франция). Для выделения и очистки плаамидных ДНК использовали хроматографические колонки "Qiagen" ("Diagen", ФРГ), как рекомендовано производителем.

Компетентные для трансформации стоки бактерий готовили рубидиевым методом. Выделение "мини-количеств" плазмидной ДНК, гидролиз ДНК рестриктазами. ферментативные реакции с фрагментом Кленова, Т4-полимеразой, щелочной фосфатазой теленка, электрофорез ДНК в атарозном геле выполняли согласно Дэвису и соавт. (1986). Для дйги-рования использовали модификацию этой реакции, предложенную фирмой "BoehrInger" для молекул ДНК с тупыми концами в присутствии 1Б2 по-лиэтиденгликоля (ПЭГ). При этом, лигазная смесь помимо ПЗГ-6000, лигазы и ДНК, также содержала 20 Ш Трис-HCI. pH 7,6; 10 Ш MgCla ; 10 дитиотреитола и 0,6 мМ АТР. Для дотирования молекул с выступающими б'-концами данный буфер использовали без полиэтиленгликоля.

Рестрицированные фрагменты ДНК выделяли в агаровном геле с помощью NA-45 DEAE-бумаги, как рекомендовано "Schleicher & Schu-¿11*41686)

Приготовление белковых лизатов и электрофорез белков в ДСН-ПА-

АГ выполняли, как описано Лэммли (1970). Элекгроперенос белков проводили по стандартной методике, используя в качестве мембран иммо-байлон Р ("Milliроге") и нитроцеллюлозу . Для препаративного выделения рекомбинантннх гибридных белков после ДСН-ПААГ использовали метол Байта и Вилкокса (1984).

Клетки насекомых SÍ158 (любезно предоставлены проф. Н.Мюллер-Ланч, Германия, Хомбург); трансакцию Sf1Б8 проводили используя модификацию с CaClg; для проведения дот-блот анализа инфицированных клеток Sf 158 был использован нерадиактивчьй кит фирмы "Boehringer".

При тестировании клонов методом полимеразной цепной реакции (PCR), использовался стандартный протокол.

В качестве контролей использовали: H7LV-1-позитивную сыворотку больного A7L (ATL-сывсрогка), любезно предоставленную проф. Г.Де-Тэ (Франция JIaprat), моиоклональиые антитела MET-30nv, lCllenv, H15(Gl)e'e<r, а также панель HTLV-¡-позитивных сывороток, собранных в различных республиках бывшего СССР. В работе были использованы HTLV-1 лродуцируювде Т-лимфобластоидные линии МТ-2, МТ-4, C91/PL, и HTLY-I негативные Т-клеточные линии Molt-4, Jurkat. Среды для культивирования клеток готовились в соответствии с рекомендациями фир-ш-изготовителя.

2.Результаты и обсуждение.

2.1. Конструирование рАТИ-лроизиодныд плазммднш: клонов.

В процессе работы нами была создана коллекция экспрессирующих векторов, содержащих фрагменты вирусной ДНК, кодирующих различные области gp46 гена env и р24р15 гена gag HTLV-I (рис.1,а). Для этой цели использовали стандартные схемы клонирования в соответствии с указанными ресгротшшми сайтами полилинкера (рис. 1,6), коррегируя в каждом случае рамку считывания антранилатсинтазы . и gp46env, p24pl5trasr HTLV-I. Наилучшие результаты при клонировании были подучены со штаммами E.coli DH-1 и 490А.

2.2. Анализ экспрессии гибридных белков АС-ер46гг" НШГ-1 в Е.сохь

Полученные плазмидные векторы теоретически были способны экспрес-сироьать гибридные белки, имеющие, следующую структуру, начиная о ами-

1 LTR F

\ LTR 1

Neol

1256

6120

2252

pCU-l, 044 и. n.

ESSSS&SSSS&SCBi

pC 134,696 И.П.

~m

»СШ-М, 991

Едц-—-a

ШВ&ВНВ

pC<a-g, 48« и. я.

Нп^гтпг^шшгггйттУ

tCll-4, 4M M. n.

yC4Q-X. 313 и. n. pCU8-t, эта м. 1

pC41-8f lot м. п. и. в.

»Ш4->, ЮЗ и. а.

pATH vector

ЕеоЯХ tt(! S«al 1мШ ХЪаЛ Utl fftl ВМШ СШ

-1 -I I I 4. -I 1 -L 4.

I

<л I

Рис.1, а - фрагменты ДНК генома HTLV-I, использованные для клонирования в рАТН-векторах; размеры фрагментов в нуклеотвдных парах (п.н.) указаны сверху, б - схема расположения рестриктных сайтов полиликкера рАТН-10.

А О 1 4 б 8 21 О 1 4 6 В 21

12 34 5 67 8910 11 12

Рис.2. Кинетика индукции гибридных белков в штамме С600 E.coli (акриламидный гель): сверху указано время в часах от начала индукции; а - клон рС41-2; б - клон рС40-1; в - клон рС42-5. 1-6 - контроль PATH; 7-12 - опытные клоны. Положение маркеров молекулярной массы указано слева; стрелками справа показана экспрессия гибридных белков.

нетерминальной области: бактериальная антранилатсинтага с молекулярной массой окого 37 кДа - небольшой полипептид, кодируемый областью лоли-линкера - область gp46 env полипротеина H7LV-I. Молекулярная масса . экспрессировамных белков была блквка к расчетным и варьировала от 66-68 кДа клона реге 1 до 41-42 кДа клона рС41-2, имеющего наименьшую I "вставку" в 103 п.и. Исключение представлял только продукт клона РС124-2, поведение которого было явно аномальным в процессе ДСН-ПЛАТ (см.ниже).

Каждый полученный клон был проанализирован на способность экс-прессировать гибридный бедок в процессе индукции. Кинетика индукции показала, что для большинства клонов был характерен нестабильный тип экспрессии, когда видимый гибридный белок отсутствовал в ДСН-ПААГ (рис.2,в), но мог быть выявлен иммуноблотингом. Максимальное количество гибридных белков AC-gp46 обычно наблюдали на 6-21 ч после добавления специфического индуктора trp-промотора - индолипакриловой кислоты.

Стабильный тип экспрессии был характерен только для клона рС41-2, продукт которого с молекулярной массой 41-42 кДа(рис. 2,а) аккумулировался с высокой эффективностью в E.coll и мог быть легко выделен в препаративных количествах. Гибридный белок AC-gp46 клона рС40-1 также легко мог быть обнаружен в пшиакршамидном геле (рис. 2, б), но тем не менее этот егриант экспрессии следует охарактеризовать как промежуточный с частичной деградацией, так как на иммуноблоте можно было обнаружить продукты частичного протеолиза с молекулярной массой 40 и 44 кДа

Особо следует Еыделить необычные свойства продукта клона рС124-Г:. Ориентация Taql-Taql фрагмента в 105 п.н. первично была определена косвенным путем на основании данных иммуноблотинга лизатов нескольких позитивных клонов на 21 ч индукции с ATL-сывороткой. Однако при анализе полной кинетики индукции мы не обнаружили ни экспрессии белка с большей молекулярной массой, чем антранилатсинтаза, ни соответствующей иммунологической специфичности. В последующих опытах нам удалось показать, что продукт этого клона не аналогичен бактериальной антранилат-синтазе, так как на поздних часах индукции имела место его протеолкти-ческая деградация. Более того, только в процессе протеолиза продукт этого клона приобретал способность реагировать с ATL-сывороткой и мо-ноклональными антителами . Но еще более парадоксальным является то, что з процессе протеолиза присходило изменение электрофорегической подвижности гибридного белка и его миграция в зону белков с молекулярной

массой 43-44 кДа, что значительно выше молекулярной массы антранилат синтазы (рис.3.).

рис.3. Кинетика индукции продукта клона рС124-2. а - ДСН-ПА-АГ; б - иммуноблот-анализ с ATL-сывороткой. 1-6 •■ рАТН; 7-12 - рС124-2; стрелками справа показано положение гибридного белка в ПААГ и иммуноблоте; светлой стрелкой - предполагаемый продукт протеолиза с "большей" мол.массой.

Для возможного объяснения аномальных свойств гибридного белка клона рС124-2 следует принимать во внимание следущие факты: 1) плазмидная.'ДНК этого клона содержит множественную "вставку" 1а-ql-Taql фрагментов; 2) неправильная ориентация второго Taql-TaqI фрагмента приводит к появлению в экспрессируемом белке дополнительной тетрапептидной последовательности Q1u-Asp-Val-Val, за которой следует стоп-кодон; 3) полипептид, кодируемый TaqI-TaqI-фрагментом. сильно обогащен пролином, высокое содержание которого обычно приводит к искусственному завышению молекулярной массы; 4) промежуточный

продукт протеолиза с кажущейся молекулярной массой 43-44 кДа реагирует с мокогаональными антителами МЕТ-3 и ICH, свидетельствуя, что области аминокислот 190-199 gp46 по крайней мере частично сохранены. Исходя из иьлохенного, мы предполагаем, что второй Taql-Taql фрагмент множественной "вставки" клона рС124-2 ориентирован неправильно; протеолиз приводит к отцеплению небольшого полипептвда кар-бокситерминальной области, что в свою очередь вызывает процентное, увеличение доли пролина, ведущее к парадоксальному "увеличению" молекулярной массы продукта клона рС124-2 в процессе деградации. Большое внимание, которое было уделено клону рС124-2, неслучайно, так как зарубежными исследователями было показано, что это наиболее серологически реактивная часть gp46 HTLY-I, которая может использоваться для дифференциации hTLV-I и HTLV-II инфекции.

2.3. Серологическая реактивность гибдоршж йалиав AC-gp46env HTLV-I.

Антигенные свойства каждого из полученных клонов были охарактеризованы в иммуноблотинге с ATL-сывороткой и моноклональными антителами. На рис.4, представлены данные иммуноблотинга некоторых-из

1 23456123 4 5

67 ► 45*

30* 20 ►

ЙДаШ дщ,

гз щ

ш»

- 58

А Б

рис.4. Сравнительный иммуноблот-аналиа экстрактов »слонов с: а -- моноклональными антителами lCllenv; б - ATL-сывороткой. 1 -РС28-1; 2 - РС42-5; 3 - рС121-8; 4 - рС121-8/Т1; 5 - рС124~2; 6 - рАТН.

полученных клонов а 1С11-антителами и A7L-сывороткой. Профиль реактивности указанных кленов был практически идентичным, за исключением белка AC-gp4S клона рС28-1, имеющего дополнительные полосы реак-трдносги с ATL-сывороткой из-за наличия аминстерминальных зпитопов. В целом продукт к.лона рС121-3, в сравнении с продуктами других кленов, обладал наилучшей серологической реактивностью при тестировании на апти-5?р45-антитела группы позитивных и неопределенных сывороток. Но следует отметить еще белее высокую реактивность продукта iиена рШ1-8/Т1. Плазмилная ДНК клока рС121-8 была дополнительно модифицирована клонированием Taql-Taql фрагмента в «нтактный Oiat-сайт. 3 результате нам удалось получить хотя и нестабильный, :;о значительно более антигенный бе/пк, перспективы применения ксто-рого для огроднагноети^ изучаются ъ настоящее время.

Прег;ас'ативнс очищенный AC-gp46 белок клона рС121-8 был кепель-зован для иммуноблот-анализа сывороток от гдороаых и боль ни;: людей (рис.3.). 'Этот рекомбиначтаый белек был использован также для подтверждении случая сенейногс. инфицнролания HTL.V-1 инфекцией (рис.6.).

рис.5. Иммуноблот-анализ панели НТЬУ- I-позитивных сывороток крови от здоровых и больных людей. Слева двумя стрелками показаны мод. массы, препаративно выделенного гибридного белка клона рС121-8 (мол.масса 45 кДа) и бактериальной АС (мол.масса 37 кДа), дорожки 1 и 36 окрашены голубым Кумасси; дорожка 2 -позитивный контроль; дорожки с 3 по 35 - иммунореактивность серологически позитивных сывороток.

67 kD—. 45kD-H-

30

рис.6.Обнаружение епу-специфических антител у больного НТ1Л-1-ассоциированным Т-клеточным лейкозом из Грузии и членов его семьи с помощью-рекомбинангного белка клона р0121-8; дорожка 1, 5 - реактивность с моноклональныыи антителами (МЕТ-3); дорожка 2 - ШК (АТЬ-больной); з - Ш-И (жена больного); 4 - НВК-Б (сын больного).

2.4. Экспрессия гибридншс белков AC-p24pl5ea* HILV-I в E.coli.

Для клонирования был выбран фрагмент Ncol-TaqI, кодирующий большую часть p24eewr и plB«®* HTLV-I. AC-p24pl5ïatr гибридный белок, экспрессируемый клоном рС133, не обнаруживался визуально в ДСН-ПААГ и только в иммуноблот-анализе были выявлены продукты его деградации. В данном случае, мы однозначно связываем низкий уровень экспрессии gag-рекомбинантного белка с его протеолизом. Более того, нротеолиз имел место и в случае АС-р246гаа' гибридного белка клона рС134 , который должен содержать только 125 аминокислотных оснований р?4 в результате делеции StuI-SmaI-фрагмента клона рС133. Продукт клона рС134 с мол. массой 62,5 кДА, неожиданно, значительно Интенсивнее реагировал в иымуноблогинге с антителами Н15, чем гибридный белок рС133 (рис.7.).

1 2 3 4 5

i

щ Ctyí >• :

\ ■щ m 1Ф» ..чЧ',- fe 1

GAG 1 2

рис.7.Реактивность рекомбинантных белков клонов рС133 и рС134 о H-15(G-l)-p24 монокяональными антителами: 1) клон рС133 2) клон PC134.

Таков несоответствие нммуяореактивностей этих рекомбинантных белков может быть связано с тем, что в точке дотирования рамки "считывания" гена gag между "тупыми" концами ДИК, образованными между сайтами StuI и Sroal, происходит добавление дополнительных 1В аминокислотных оснований (при отсутствии стоп-кодонов), не имеющих иммуно' логической специфичности gaff- предшественника HTLV-1. При наличии интактного эпитопа Н15 это могло бы привести к значительному снижению иммунорёактивности в реакции с поливалентной ATL-сывороткой, но не с моноклинальными антителами. Следует такз*е отметить, что после внутренней делеции гибридный белок клона рС134 должен содержать в своем составе протеазный домен HTLV-1. Теоретически невозможно предсказать, . как при этом будет происходить процесс "фолдинга" +3т кой сложной гибридной молекулы, но нельзя также и полностью иоклю-

- и -

чить возможность аутокаталитического протеолиза AC-gag-гибридного белка, как это было недавно показано на примере HERV-K- эндогенного прэвируса человека. Поэтому, чтобы устранить эти возможные негативные моменты, мы получили клон рС135 со встроенным HindIII-линкером. Это позволило нам восстановить рамку считывания АС-р24 с частью последовательности р15 через дополнительные 3 аминокислотных оснований линкера. К сожалению, с помощью указанной манипуляции нам не удалось существенно снизить уровень протеолиза иди обнаружить какое-либо усиление серологической реактивности гибридного белка рС135.

Дальнейшая работа с gag-содержащими плазмидами представляется достаточно перспективной, несмотря на проблему протеолиза. Следует отметить, что в плазмидных ДНК рС134 и рС135 отсутствует короткий фрагмент gag-области HTLV-1 между сайтами Hinf 1 и Sinai (координату 1921-1952 п.н.), с которым связывают негативное влияние кг yposcia экспрессии рекомбинаитных gag-белков HïLV-l. Кромэ того, наличие HindllI-сайта в клоне рС135 позволяет переклонкиовзть дананй фрагмент в другие векторные системы.

2.б. Подхода, исплльвованниэ ддя сюсяеюм протеолиза гнбркдаик Садков AC-BP4Benv и АС-р24р15<гае HILV-I E.coîi.

1.Экспрессия в различных типах векторных систем. 2.Экспресса гибридных белков в lon(-) - штамме E.coli.

3.Конструирование сложных гибридных белков.

4. Уменьшение размера экспрессируемых белков.

2.6. Попика экспрессия гонов env и еац KTLV-I s клетках насекомых.

Анализируя особенности экспрессии рекомСкнантних бкглоъ г pus env к gag в прокасиотичес:сой системе (на основе E.cclJ), чх мммуь-о-реактизность с позитивными сыворотками, общей проблемой оставался протеолиз, который частично мы снизили, получиз ряд перспективны* клонов. Поскольку, в норме, в прокаодатичеашх системах еиятегируо-мые бедки не подвергаются процессу гликоаилйровашш, а по мненш) некоторых исследователей именно это является одной по основных причин протеолиза. то в заключительной части работы нами была сделана попытка экспрессировать env и gag НТЬУ-1 в эукаркохкческой бзкуло-вирусной системе.

Используя коллекцию клонов, полученных на основе вектора рАТН,

и бакуловирусные векторы семейства AcMNPV (autographa callfornica nuclear polyidrosis virus), нами были получены два оона, содержащие полный gp62 гена env и две конструкции, содержадие р24р15 гена gag HT1.V-I. После опытов по трансакции, в стоках мы обнаружили ре-комбиначтный .чирус, содержащий env и gag HTLV-I, что подтверждалось обнаружением позитивных сигналов в опытах по дот-гибридизации (рис.8.), а также характерным цитопатическим действием вируса на

V 2 3 4 6 в 7 8 9 Ю 11 12

А в

С •

о •

Е F

G

Н

рис.8. Дот-гибридизация: позитивный сигнал в лунках 2С, 7D.

клетки, насекомых БИбв при их кокультиваши. Однако, в иммунобло-тннге и имиунофлуоресценции, используя референс-сыворотку, специфических антител нь было оонг-ружено, что свидетельствует об отсутствии трансляции белков. Дачное направление будет продолжено после сиквейирог»ания ДНК полученных клонов.

ЗАКП1ЧЕНИЕ

Таким образом, несмотря на протеолитическую деградацию, экс-прессированные гибридные белки АС-др46еПУ и АС-р24р15ва(г НТЦУ-1 (данные обобщены в табл.1.) представляют определенную диагностическую ценность. Последующая разработка иммуноаффйнных методов очистки на основе моноклокальных антител к бактериальной антранилатсинтазе может существенно усилить диагностические перспективы использования гибридных белков, зкспрессироваиных рАТН-производными плазмидаыи. Многие из полученных белков могут быть потенциально использованы как для иммунодиагностических, так и различных экспериментальных целей.

Таблица.1.

Название клона Вектор Ген Тип рекомбин. белка;расчетн. иол. масса. Размер** смысловой части йрагм. Уровень* 8'сспрес. белка Реактш в иммунс анализе

РС28-1 рАТН-10 СПУ епу 67,9 кДа 844 п.н.' йр46 < 0,1 X +4 +

рСЗЗ-4 рАТН-10 епу епу 52,2 кДа 418 П.Н. И-ер4б < 0,1 X +t

рС2Й-5 рЕХ-П епу епу 148 кДа 844 П.Н. Вр4б г г

РС40-1 рА'ГН-Ю епу епу 40,4 КДа 315 П.Н. Н-гр46 10 % ++

рС41-2 рАТН-10 епу епу 40,8 кДа 103 П.Н. м-ер4б 15 X ++

РС124-2 рАТН-11 епу епу 41 кДа 105 П.Н. с-ет>4б 20 г ++

рС42-6 рАТН-11 епу ' еп*/ 63,2 кДа 426 п.н. С-8Р4б • < 0,1 X ++1

РС42-5Х рАТН-11 епу гех епу-гех 72 КЦа Б56 п.Н. С-{Гр4бгех < 0,1 2

РС122-14- рАТН-10 епу СПУ 45,4 КЦа . 231 п.н. С-6Р46 . < 0,1 X +-М

РС121-8 рАГН-11 епу епу 43,2 КДа 154 П.Н. С- вр4б < 0,1 X 4+< +

РС12С-6 рАТН-10 епу епу 46,в кДа 272 П.Н. с-гр4б < 0,1 X + + +

РС121-8КК РКК233-2 епу 6,2 »<Да дискретный 154 и.н. . С-гр46

РС120-6КК рККЯЗЗ-2 епу 0,9 кДа дискретный 272 П.Н. с-гр4б

РС1СО рАТН-11 '¿ац гадг 73,5 КЦа 906 п.Н. р24р15 < 0,1 X ' +++

рС134 рАТН-11 ваг ева 62,5 кДа 696 п.н. р24 < 0,1 * ++

рС1о5 ратн-11 ваг «зе 68 кДа 706 П.Н. р24р15 < 0,1 2 + +

Количество Э1сслрессируемых рекомбинантных белков оценивалось (в соотношении с общим бактериальным) при прямой визуализации в акригамидном гэле. после окраски голубым Кумасси. **- м-цр46 - аминотерминальная область гена еру НТЬУ-1. С-др4б - карбоксигерминальная область гена епу НТЬУ-1.

ВЫВОДЫ:

1.Генно-инженерными методами получена коллекция плазидных ДНК, экс-прессирующих рекомбинантные гибридные белки pp46snv и p24pl5,rew' вируса Т-клеточного лейкоза человека. Проведено детальное изучение их свойств.

2.Установлено, что рекомбинантные белки N-концевой области gp46env HTLV-1 обладают высокой степенью стабильности при экспрессии в E.colí, но низкой иммунореактивностыо. Напротив, рекомбинантные белки С-концевой области gp46env имеют высокий уровень иммуноре-активности, но крайне нестабильны в процессе индукции.

3.Выявлена наиболее чувствительная к протеолизу часть карбокситер-минальной области gp46env HTLV-I, локализующаяся между .сайтами TaqI-Taql и содержащая 35 аминокислотных основания,

4.Установлено, что бактериальная La-лротеаза не является ответственной за процесс протеолиза HTLV-I гибридных белков AC-ffp46env и АС-p24pl5eatr vb E.coll.

5.Проведена предварительная оценка диагностического потенциала ре-комбинантного белка клона рС121-8, кодируемого Salî-Hpal фрагментом гена env HTLV-I., Выявлено, что более чем в 90 X случаев HTLV-I позитивные сыворотки содержат антитела к продукту этого клона.

Список научных работ, опубликовании* по теме диссертации:

1. Гурцевич В.Э., СеюотаН.Б., ПивникА.В., Павлиш О.А., Степина В.Н., СырцевА.В., Яхнина Е.И., Кременецкая A.M., Первый диаг-носцированный в СССР случай Т-клеточного лейкоза взрослых (ATL) с выраженным иммунным ответом к HTLV-1, Вопросы онкологии, 37, 5, 563-567, 1991,

2. СенютаН.Б., Яковлева Л.С., Степина В.Н., Павлиш 0.А., Сцрцев А. В.Гурцевич В.Э., Антитела к HTLV-1 в сыворотках доноров icpo-ви. проживающих в республиках Средней Азии и Казахстана, Вопросы вирусологии, 4, 328-331, 1991;

3. Gurtsevitch V. , Senjuta N., Pavlish 0.. ShihJ., Steplna V., Syrtsev A., Potekhln 0. and Lenoir J. HTLV-I positive caso of ATL In Georgia (formely USSR). Int.J.Cancer, 51. 835-836, 1992.

4. 0.А.Павлиш, А.В.Снрцез, Л.Н.Щербак., В.Э.Гурцевич., Дифференциальная экспрессия рекомбинантных гибридных Оелков, содержали« амино- и карбокситерминальную области наружного большого гликоп-ротеида Свр46) вируса Т-клеточяого лейкоэа человека (HTLV I) в клетках Esherlchia coll. Молекулярная биология, том 27, вып.!., стр.120-131, 1993 г.

5. А.М.Расули, Н Н.Клепиков. С.М.Андреев, М.В.Сидорова, М.Г.Вафина, Н.Б.Сенюта, О.А.Павлии, А.В.Сырцез, В.Э.Гурцевич., Иммунореак-тивиость синтетических пептидов, соответствующих В-клеточ1Шы эпитопам структурных белков Т-лимфотропного вируса человека 1-го типа. Молекулярная биология, том27, вып.4., стр.880-887, 1993 г.

е. Gurtsevitch V., Senjuta N.. LennartE L., Steplna V., Pavllsh 0., Yakovleva L., Syrtsev A. Cancer Research Center RAMS, Russia; Abbot QnbH Diagnostic, Wiesbaden, Germany. HTLV-I infection among different ethnic groups In Sakhalin. Il-nd International Conference "А1Ш, Cancer and Human Retroviruses" St.-Petersburg, Russia, Nov.29- Dec.3,(Abstracts), 1S93.

7. Pavlish 0., Syrtsev A., Susova 0., Scherbak L., Gurtsevitch V. Cancer Re.^eirch Center of RAMS, Moscow, Russia. ENV-.GAG-,and TAX HTLV-1 recombinant proteins: significance for diagnosis. Il-nd International Conference "AIDS, Cancer and Human Retroviruses", St.-Petersburg, Russia, Nov.29-Dec.3, (Abstracts), 1993.

8. Rasulee A., LeRiverend E., ShihJ., Senjuta N., Pavllsh 0',,

Syrtsev A.. Klepikov N. . Lee H., Gurtsevitch V. CUBA- "WHITE SPOT" In Caribbean HTLV-I endemic region. Cancer Research Center, RAM3, Russia; Center Nacional de Blopreparados, MiNSAP, Cuba; Abbot Laboratories, North Chicago, IL, USA. Il-nd International Conference "AIDS, Cancer and Human Retroviruses'* St.-Petersburg, Russia, Nov.29-Dec.3, (Abstracts), 1993.

8. Senjuta N., Pavlish 0., Schat2ll H., Syrtsev A. , Steplna V., Ya-kovleva L., Gurtsevitch V. Prevalence of HTLV-I in the Far Eastern part of Russia. lX-th International Conference on AIDS in affiliation with the IV-th SID World Congress, Berlin, June 6-11, 1993, P0-C08-2757.

10.Gurtsevitch V,, Senjuta N., Shih J., Stepina V., Syrtsev Д., Rar sulee A.. Klepikov N.. Pavlish 0. HTLV-I family infection Jn Turkmenistan. IX-th International Conference on AIDS in affllia-. tlon with the ¡V-th STD World Congress, Berlin, June 6-11, 1693, PO-A34-0804.

11.Gurtsevitch V., Senjuta N.. Pasulee A., Pavllsb.,0., Syrtsev A., Klepikov N. Seroepldemiology of HTLV-I Infection in CUBA:"WHITE SPOT" in Caribbean endemic region 7 IX-th International Conference on AIDS in affiliation with the IV-th STD World Congress,; Berlin, June 6-11, 1993, P0-C06-2695.

12.Gurtsevitch v., Senjuta N.. Pavlish 0., Shih J., Pivnlk A., Yak-hriir.a E., Steplna V., Kremenetskaya A., Kaplanskaya I., Syrtsev A., Chukanov S. and Lee H. Clinical, morphological and virologi-cal features of HTLV- I-posltive сазе of ATL in white jnan fran the Caucasus. Leukemia Res., 17, 621-627, 1993.

13.Rasulee A., L-atflverend Б., Shih J., Senjuta N.. Pavlish 0., Syrtsev A., Klepikov N.. Lee H. and Gurtsevitch V. HTLV-I serop-' revalence in blood donors irt Cuba. Int.J.Cancer, 54, 885-886, 1993.

M.Rasulee A., Senjuta N.. Klepikov N.. Rasulee S., Pavllsh.O., Syrtsev A., Gurtsevitch V. HTLV-I seroprevalence study of healthy population from three geographical areas with a ne& synthetic peptide-based EL ISA SYSTEM. Co-operative BIOLAM and Viral Carcinogenesis Laboratory, Cancer Research Center, Moscow, Russia. (ABSTRACTS), May 14-19, USA, 1994.

16.В.Э.Гурцевич, Л.М.Расули, Е.Ле Риверенд, Н.Б.Сенюта, О.А.Павлин, Н.Н.Клепиков, А.В.Сырцев, Д.¡Пия. Куба - "Белое пятно" в Карибе-

кои HTLV-1 эндемичном регионе ? Иммунология, №1, стр 31-33, 1094 г.

16.Qurtsevitch V., SenyutaN., Steplna V., Yakovleva L., Pavlish 0., ' Syrtsev A., SusovaO., Scherbak L., ShlhJ.. Hayaml M, HTLV-1 Infection among Nlvkhl people in Sakhalin. Int.J.Cancer: 59, 1-2. 1994.

17.Qurtsevitch V., SenyutaN., Stepina v., Yakovleva L., Syrtsev A., Susova 0., Pavlish 0. HTLV-I among native people of Far Eastern regions of Russia. Cancer Research Center, Moscow, Russia. Tenth International Conference on AIDS, Yokohama, Japan, 7-12 August, 1994. PA0156 (ABSTRACTS).

18.Yamashita M., Syrtsev A., Ahlron A., Shogat B., Qurtsevitch V., Ishlda'T., Yamaraoto N., TakechlsaJ., Igarashi T., Ibuki K., Ido Б., Miura T., and Hayaml M. Genetic analyses of HTLV-I from India and newly identified endemic loci, Iranian Mashhad and Russia. Inst. Virus Res. Kyoto Univ., Kyoto Japan; Cancer Res. Center RAMS, Moscow, Russia, Beillnson Med. Center, Petah-Tlguva, Israel; Toklo Univ., Tokio Japan; Tckio Med. and Dental Univ., Toklo Japan. Tenth International Conference on AIDS, Yokohama, Japan, 7-12 August. 1094. PA0162 (ABSTRACTS).

19.Qurtsevitch V., SenJutaN., Stepina V., Yakovleva L., Pavlish 0., Syrtsev A., Susova 0., Scherbak I., Shlh J., Hayaml M. Familial infection In different geographlo regions pf the Former Soviet Union (FSU). AIDS Research and Human Retroviruses, 1Q, 4, p.487, 1994.

20.Расули A.M., Сенюта Н.Б., Клепиков H.H., Андреев С.М., Павлин О.А., Сирцев А.В.. Сидорова М.В., ВафинаМ.Г., Авьмуко А.А., Степина В.Н., Хаитов P.M., Гурцевич В.Э. Формирование и характеристика панели сывороток, содержащих антитела к HTLV-I. Использование для скрининга синтетических пептидов. Иммунология, №2;

, дтр.42-47, 1964 г.

21.A.M.Расули, Ш.М.Расулн, Н.Н.Клепиков, С.М.Аидреев, Д.В.Мещерякова, С.О.Тарасова, Н.Б.Сенюта, А.В.Сырцов. В.Э.Гурцевич. Перекрестная реактивность и гомология аминокислотной структуры имму-нодоминантных пептидных, фрагментов структурных белков ретровиру-сов человека HTLV-I, HTLV-II. HIV-I и HIV-II. Молекулярная биология, том 29, вып.1., 1995 г.

22.Ямашита М., Сенюта Н.В., Павлиш О.А., Миура Т., Смрцев А.В.. Гу-

роваЕ.Л., Степана В. Н., ИОуки К., Сусова О.J0., Щербак JJ.H., Шатцел Г., Ших Д., Яковлева Л.С., Вебер Д., Мало X., Жессан А., Де-Те Г., Хайами М, и Гурцевич В.Э. Распространение и филогенетический анализ изолятов HTLV-I, персистирущих на Дальнем Востоке России. Молекулярная биология (1695, N6, принята в печать).

23.N.Senuyta. Z.Kologrivova. R.Ruzibaklev, A.Syrtsov. T.Afanasleva, J.Shih, V.Gurtsevltch, and M.Hayanl. HTLV-I/11 Infection among Kamchatka's natives and ethnic Jewish people In Bukhara. III-nd International conference "AIDS, Cancer and Human Retroviruses", St.-Petersburg, Russia, (199Б, принята в печать).

Автор выражает сердечную благодарность канд.мед.наук 0..4.Пав-лишу за большую помощь в разработке протоколов клонирования, анализа полученных результатов и ценные советы в процессе исследования.

Приношу глубокую благодарность к.б.н.И. А. Гуигоряк и к.м.н. С. А. Гапецкому за критические замечания при обсуждении шг/ериалов диссертационной работы.