Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Изучение последовательностей ДНК человека, гомологичных гену env MMTV, и их экспрессии при раке молочных желез

На правах рукописи

РГБ ОД

10 ОЕЗ 2СЛ2

Махов Петр Борисович

ИЗУЧЕНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ДНК ЧЕЛОВЕКА, ГОМОЛОГИЧНЫХ ГЕНУ ет> ММТУ, И ИХ ЭКСПРЕССИИ ПРИ РАКЕ МОЛОЧНЫХ ЖЕЛЕЗ.

14.00.1-1. - онкология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 2001

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте Канцерогенеза Российского Онкологического Научного Центра им. Н.Н. Блохина Российской Академии Медицинских Паук

1 (аучный руководитель: Доктор биологических наук Крюкова Н.Н.

Официальные оппоненты: док юр медицинских наук 1 кшлиш О.Л. доктор биологических наук Миллер Г.Г.

Ведущая организация: Институт Вирусологии им. Д.И. Ивановского.

Защита состоится "

ог- в . 10

час.

На заседании специализированного Диссертационного Совета (К.001.17.01) Российского Онкологического Научного Центра им. Н.Н.Блохина РАМП (Москва 115478, Каширское шоссе д. 24 ).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российскою Онколем ического Научного Центра Российской Академии Медицинских Паук.

Автореферат раюслан "-> I "__' _2001 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета,

Доктор медицинских наук Ю.А. Барсуков

Р^бз /зз. //^-//ГР

Общая характеристика работы.

1. Актуальность проблемы. Рак молочной железы является одним из наиболее распространенных онкологических заболеваний, и у женщин его частота составляет около 30% среди диагностируемых опухолей. Данная проблема является весьма актуальной в двух аспектах. Во-первых. сложившаяся в последнее время ситуация, связанная с высокой частотой заболеваемости и "омоложением" РМЖ, требует создания более точных и простых методов своевременного выявления среди населения групп риска этого заболевания, ранней диагностики, а |акже и целях мониторинга больных и дальнейшего успешного лечения. Во-вгорых, возможное участие регровирусов в канцерогенезе молочной железы человека требует более глубоких фундаментальных исследований.

В современной литературе имеется большое количество публикаций, посвященных эндогенным ретровирусам человека родственным MMTV, и связанных с развитием некоторых патолог ических процессов у человека и, в частности, с некоторыми онкологическими заболеваниями. В работах, как правило, указывается на активность gag иpol - генов как в тканях, так и в лимфоцитах периферической крови человека. При этом, работ, посвященных гену env, а также указывающих на ассоциацию РМЖ с экспрессией последовательностей, родственных гену env MMTV в современной литературе (по отношению к вышеуказанным) имеется значительно меньше. Такие транскрибирующиеся последовательности обнаруживались авторами в ткани рака молочной железы, однако, о наличии их в лимфоцитах периферической крови ранее не сообщалось. Вместе с тем, накоплено много данных по обнаружению как в ткани РМЖ. сыворотках крови, так и в лимфоцитах периферической крови ант hi снов, нммупо.тогически родст венных продуктам и gag, и env генов MMTV. Таким образом, последовательности генома человека.

гомологичные гену ет ММТУ изучены неполно. Поскольку ранее в лаборатории иммунологии онкогенных вирусов было показано, что антиген, иммунологически родственный продукту гена ет ММТУ - gp52, специфически экспрессируется в Т-лимфоцитах больных РМЖ, исследование таких последовательностей и их экспрессии в лимфоцитах периферической крови человека в настоящее время является актуальным как для фундаментальной науки, так и в целях прикладного характера.

2. Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы было исследование последовательностей ДНК человека, гомологичных гену ет ММТУ и их экспрессии в лимфоцитах периферической крови человека, как в норме, так и в ассоциации с развитием РМЖ у человека.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Исследование образцов ДНК лимфоцитов периферической крови человека на наличие последовательностей, гомологичных гену ет ММТУ методом гибридизации по Саузерну.

2. Сравнение частоты выявления последовательностей, гомологичных гену ет ММТУ, при использовании разных зондов.

3. Исследование образцов тотальной РНК лимфоцитов периферической крови человека на наличие транскриптов, гомологичных гену ет ММТУ.

4. Определение особенностей экспрессии последовательностей, гомологичных гену ет ММТУ, в группах больных РМЖ, и в ряде контрольных групп.

Исследовались: группа больных РМЖ, группа больных гинекологическими опухолями (данная группа использовалась в качестве

контрольной группы гормонозависимых опухолей) и группа здоровых доноров.

Научная новизна. Новизна научною подхода состоит в поиске поеледоваи-льностей. близкородственных гену env MMTV и их траискриптов в лимфоцитах периферической крови исследуемых лиц. В лимфоцишх периферической крови исследуемых групп были обнаружены гранскрипциопно-активные последовательности ДНК, высокоюмологичные гену env MM TV, при лом эти последовательности не являемся родственными последовательностям гена env I1HRV-K10. Впервые была показана корреляц!1я экспрессии таких последовательностей в лимфоцитах периферической крови с обнаружением в этих лимфоцитах антигена, иммунологпчески родственною продукту гена env MMTV - gp52. Методом нозерн-гибридизапии показаны различия в уровнях экспрессии последовательностей, высокогомологичных гену env MMTV среди исследуемых групп.

3. Научно-практическая значимость работы. У 75% больных РМЖ, по сравнению с 27,4% больных опухолями гинекологической сферы и 25% здоровых доноров в лимфоцитах периферической крови выявлены транскрипционио-активные последовательности, имеющие высокую степень гомологии с областью i сна с7/г MMTV. кодирующей gp52. которые также выявляются методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).

В настоящее время метод ПЦР широко используется в клинической практике для диагностики различных заболеваний. Таким образом, настоящие исследования несут теоретическую основу для разработки диагностических тестов на РМЖ, а также для дальнейшей отработки

з

метола ПЦР, позволяющего проводить более широкий скрининг различных групп населения.

4. Апробация работы. Апробация диссертационной работы была проведена 23 ноября 2000г. на совместной научной конференции лабораюрий иммунологии онкогенных вирусов, молекулярной биологии вирусов, вирусного канцерогенеза и регуляции вирусных и клеточных онкогенов 11ИИ канцерогенеза РОНЦ РАМ! I.

Основные материалы диссертационной работы были представлены на международных конференциях "СПИД, рак и родственные проблемы" (Россия. Санкг-Петербург, 1997, 1998 и 2000гг.),

5. Публикации. 11о материалам работы опубликовано 9 работ.

6. Структура и объем диссертации. Материал диссертации изложен на 110 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения и выводов. Работа проиллюстрирована 16 рисунками, 3 диаграммами и 3 таблицами. Библиографический материал включает в себя ссылки на 103 источников зарубежной и отечественной литературы.

Содержание работы.

Материалы и методы.

Клинический материал. Образцы крови больных РМЖ, больных с опухолями гинекологической сферы были получены из хирургического отделения опухолей женской репродуктивной системы (заведующий отделением д.м.п. Лактионов К.П.), а также из хирургического отделения опухолей молочных желез ПИИ клинической онкологии РОНЦ РАМП (в.н.е.. д.м.п. Полевая Р,.Б.). Образцы лимфомассы здоровых допоров

были получены из отделения переливания крови РОНЦ РЛМН (заведующий отделением к.м.п. Огородникова Е.В.).

Плашиды. Плазмида plilucscripl SKI со вставкой гена env MMTV была любезно предоставлена Головкиной Т.В. (Университет Пенсильвании. Филадельфия, США). Плазмида pUKKENVl,9(+) со вс [авкой по.тпоразмерного гена env HERV-K10 была любезно предоставлена и.с. Клейман Д.И. (лаб. Вирусного канцерогенеза НИИ

Канцерогенеза РОНЦ РАМН).

Клеточные линии: Клсточпая линия карциномы молочной железы

mi,иней 1'4. несущая в своем геноме полноразмернын MMTV штамма GR, была получена в лаборатории нммуиолопт онкогепных вирусов НИИ Канцерогенеза РОНЦ РАМИ. Линия клеток карциномы молочной железы мышей ММ5, несущая в своем геноме полноразмерный MMTV штамма C3I1. была получена из коллекции НИИ канцерог енеза РОНЦ РЛМН.

Ггюридизационные зонды: Первый зонд, длиной 1,5т.п.о., был поучен из плазмпды pBlueskript SK+ после обработки рестриктазой Pstl и представлял собой геи env MMTV. Второй зонд, длиной 927 п.о., был получен при помощи ПЦР и праймерами к области гена env MMTV, кодирующий gp52, которые по данным поиска (использующего 4 базы данных) не имели гомологии с человеческим геномом. Специфичность лого зонда была подтверждена ею секвенпрованнем.

Выделение ДНК из лимфоцитов периферической крови и клеток стабильных клеточных линий. Фракционирование компонентов крови осуществляли путем градиентного центрифугирования в фикол-содержащем растворе I listopaque-1077 (Sigma, США). Выделение ДНК из лимфоцшов крови и клсточиых культур осуществляли с использованием прокчшазы К с дальнейшей экстракцией фенол-хлороформом.

ПЦР проводилась с использованием Taq-полпмеразы (Силекс-М, Россия) в ирису iеi вин 2.5mM MgCb. ImM dNTP, 0,3|т1 каждого праймера (З.6о.е./Н)0ц1) в следующем режиме: денатурация ДНК 94"С - 4мип.,

далее следовало 40 циклов: 94"С - 40сек; 57°С - 45сек; 72°С - 50сек. Последующая элонгация цепей проводилась при 72"С - 5 мин. В реакции использовали 200нг геномной ДНК. Продуты реакции анализировали в 2% агарозном геле.

Праймеры для получения ew-MMTV специфических продуктов амплификации имели следующий состав:

прямой - 5TAG AGT ТСТ GAC CAA ТСА ААС CAT G-3'; обратный - 5'-АТА ТСТ АСА GGT AGC AGC ACG TAT G-3' Специфичность продуктов ПЦР проверяли методом гибридизации но Саузерну с зондом, представляющим собой фрагмент гена env MM I V, кодирующий gp52.

Качество выделения геномной ДНК проверяли при помощи ПЦР с праймерами к гену GAPDH и последующего электрофоретического анализа в 1% агарозном геле.

Меченъе зонда проводили с использованием гексануклеотидных рендом-праймеров и большого фрагмента Кленова ДНК-полимеразы! в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя (СИЛЕКС-М; Россия), с последующей очисткой зонда от не включившейся метки методом хроматографии на сефадексе G50 с помощью центрифугирования.

Обнаружение последовательностей ДНК человека, гомологичных гену env MMTV, среди рестрицированных фрагментов геномной ДНК проводили методом гибридизации по Саузерну. Образцы лимфоцитарной геномной ДНК в течение 12-16 часов обрабатывали ресгрицирующими эндонуклеазами, затем разделяли методом электрофореза в 1% агарозном геле. Перенос по Саузерну на фильтры Hybond-N (Amersham) проводился в 20xSSC, с предшествующей денатурацией геля в нескольких объемах раствора, содержащего 0,5М NaOH, 1,5М NaCI и восстановлением геля в нескольких объемах раствора, содержащего 1,0 М Tris-HCl рН-8,0, 1,5М NaCI фрагментов ДНК в агарозном геле. Фиксацию перенесенных на фильтр фрагментов ДНК проводили в течение 2-х часов при t=80"C в

вакууме. Затем фильтры инкубировали в растворе содержащем 5xSSC, 0.5% blocking reagent (Hoehringer Mannheim), 0,02%SDS, 0,l%Sarkosil в течении 3 часов. Далее проводили птбридпзацию с зондами, мечеными |и'~-1Ч с1ЛТ1\ при температуре 68"С в отсутствие формамида в течение 1216 часов в буфере, содержащем 5xSSC, 0.5% blocking reagent (ßoehringer Mannheim), 0.02%SDS. 0, l%Sarkosil., с последующей отмывкой фильтров от нсспепифнчески связавшегося зонда в двух сменах раствора, содержащею 2xSSC и 0,1%SDS, при комнатной температуре (по 15 минут) и. затем, в двух сменах раствора, содержащего 0,IxSSC и

0.1%SI)S. при температуре 68°С (по 30 минут). После огмывки, высиненные фнлмры 'женонпроналп с реппеновекой пленкой в течение 1-14-и суток.

Обнаружение транскрнптов, гомологичных гену env MMTV, в лиифоцитах периферической крови человека, проводили методом нозерн-гибридизации. Для этого образцы суммарной клеточной РНК разделяли методом электрофореза в денатурирующем формальдегидном геле. Перенос разделенных образцов РНК на фильтры Hybond -N (Amersham) проводили в растворе 20xSSC. Фиксацию перенесенных на фильтр образцов РНК проводили при 80"С в вакууме. Дальнейшую гибридизацию в жестких условиях с зондами, мечеными [n'12-P] dATP, проводили также, как описано выше.

Ссквенировапие ПЦР-продуктов. Проводили с помощью коммерческого набора "Sequenase kit, version 2.0" (1JSB) в соответствии с прилагаемой инсфукцией.

Результаты и обсуждение.

1. Последовательности гомологичные гену env MMTV в геноме человека.

1.1 Получение гибрндизацнонных зондов.

Для получения первого зонда, клетки Ii.coli штамма XLBlu были трансформированы илазмидой pBluescript SK+ со вставкой гена env

ММТУ. Нлазмида была наработана в большом количестве, после чего из нее был выделен зонд (вставка), который использовался при дальнейшей работе.

Использование второю зонда, соответствующего области гена ет ММТУ. кодирующей gp52, было обусловлено тем, что ранее в лабораюрии иммунологии онкогенных вирусов была показана специфичность экспрессии антигена, иммуиологически родственного gp52 ММТУ, для РМЖ.

1.2. Обнаружение последовательностей ДНК человека, гомологичных гену епу ММТУ.

Поскольку антиген человека иммуиологически сходен с продуктом гена ет ММТУ - gp52, и специфически выявляется в Т-лимфоцитах периферической крови больных РМЖ, было принято решение начншиь поиск последовательностей, гомологичных гену ет ММТУ в геномной ДНК лимфоцитов периферической крови человека.

Методом гибридизации по Саузерну в жестких условиях, среди электрофоретически разделенных продуктов рестрикции выявлялись фрагменты длиной от 0,6 до 1,5кЬ , дающие четкую положительную реакцию с мечеными зондами.

На диаграмме 1 представлено распределение частот выявления последовательностей, гомологичных гену еп\> ММТУ в геномной ДНК лимфоцитов периферической крови исследуемых групп.

Диаграмма 1:

100 80 60 40 20 0

1 2 3

□ ет ММТУ Пдр52ММТУ

1 - больные РМЖ

2 - больные с гинекологическими опухолями

3 - здоровые доноры

* - значения столбцов соответствуют процентам

положительных случаев Частот выявления анализируемых последовательностей ДНК в группе больных РМЖ, при использовании как одного, гак и другою

I ибридизационных зондов, статистически достоверно отличалась от двух исследованных групп (р = 0,00213 для группы больных с опухолями гинекологической сферы и р = 0,00609 для группы здоровых доноров). На рисунке 1 представлен пример гибридизации по Саузерну с зондом, представляющим собой gp52- кодирующую область гена ет< ММТУ.

12 3 4 5

• Я-Ч • -У*:»

" -Лг -'ячу з'-"-* ^^^

Рис. 1. 1 - Образен ДНК лимфоцитов периферической крови родственника больной РМЖ; 2 - Образец ДНК лимфоцитов периферической крови больной раком тела матки; 3,4 - Образцы ДНК лимфоцитов периферической крови больных РМЖ; 5 - Образец ДНК культуры РМЖ мыши Г4. (Образцы геномной ДНК были обработаны ресгриктазой ЕеоЮ)

11аблюдаемое снижение частоты выявления последовательностей ДНК. гомологичных гену ет ММТУ, при использовании в качестве гибриди ¡анионного зонда gp52-кoдиpyIOщeй области гена ет ММТУ объясняется тем, что первый зонд, представлявший собой ген ет ММТУ, по-видимому, выявлял последовательности эндогенных провирусов НПЯУ-К. Для проверки этого предположения была проведена гибридизация но Саузерну в жестких условиях некоторых образцов геномной ДНК исследуемых групп, а также фрагмента гена ет ММТУ, кодирующего gp52, с зондом, представляющим собой ген ет НЕЯУ-КЮ. Оказалось, что при такой гибридизации, положительная реакция фрагмента гена ет ММ ГУ. кодирующего §р52. с геном ет НЕЯУ-КЮ

отсутствовала, в то время как образцы геномной ДНК гибридизовались с геном ¿тггНЕЯУ-КЮ.

2. Экспрессия последовательностей человека, гомологичных гену епр ММТУ.

Изучение экспрессии последовательностей человека проводилось методом нозерн-гибридизации в жестких условиях с использованием тех же зондов, что и в предыдущей. Для этого использовались образцы тотальной РНК, выделенные из лимфоцитов периферической крови исследуемых групп.

В лимфоцитах периферической крови исследуемых групп как одним, так и другим гибридизационными зондами выявлялась транскрипция последовательностей, гомологичных гену ет ММТУ. Длина таких транскриптов составляла около 4кЬ. На рисунке 2 изображен пример гибридизации с зондом, представляющим собой £р52-кодирующую область гена ет ММТУ.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 И 12 13

Рис. 2. 1 - маркер длин РНК; 2 - препарат тотальной РНК, полученный из клеток Р4; 3-7 - препараты тотальной РНК лимфоцитов периферической крови здоровых доноров; 8-11 - препараты тотальной РНК лимфоцитов периферической крови больных РМЖ;_12 - препарат тотальной РНК лимфоцитов периферической крови больной раком яичника; 13 - препарат тотальной РНК лимфоцитов периферической крови больной РМЖ.

На диаграмме 2 представлено сравнительное распределение частот выявления транскриптов, гомологичных гену env MMTV в образцах тотальной РНК лимфоцитов периферической крови исследуемых групп.

Диаграмма 2:

1 - больные РМЖ

2 - больные с гинекологическими опухолями

3 - здоровые доноры

* - значения столбцов соответствуют процентам положительных случаев

При статистическом анализе частот обнаружения транскриптов, гомологичных гену env MMTV в образцах тотальной РНК лимфоцитов периферической крови исследуемых групп, оказалось, что группа больных РМЖ статистически достоверно (р<0,01) отличалась от группы больных с опухолями гинекологической сферы и группы здоровых доноров.

Было проведено сравнение данных по экспрессии последовательностей, гомологичных гену env MMTV, с данными (любезно предоставленными H.H. Крюковой) по выявлению антигена, иммупологически родственного главному белку оболочки MMTV - gp52, методом непрямой иммунофлюорисценции на фиксированных ацетоном на предметных стеклах препаратах тех же лимфоцитов периферической крови исследуемых групп. Оказалось, что экспрессия последовательностей, гомологичных гену env MMTV, коррелировала с обнаружением этого антигена. В таблице 1 демонстрируется сравнение описанных выше результатов:

□ envMWTV Dgp52IVMTV

Таблица 1

Диагноз Гибридизация по Саузерну Нозерн-Гибридизация ФИФ

Больные РМЖ 4/4 4/4 3/4

Больные с 2/9 2/9 2/9

Гинекологическим»

опухолями

Здоровые доноры 6/10 3/10 4/10

Поскольку обнаружение транскриптов, гомологичных гену ет ММТУ, в лимфоцитах периферической крови совпадало с обнаружением антигена, иммунологически родственного £р52 ММТУ, в тех же образцах лимфоцитов, можно сделать предположение, что исследуемые нами последовательности могут служить матрицами для синтеза этого антигена. Косвенно это может быть подтверждено тем, что различий в частоте обнаружения последовательностей, гомологичных гену ет ММТУ и их транскриптов и обнаружения антигена, иммунологически родственного gp52 ММТУ, практически не было во всех исследованных нами группах.

Наблюдались случаи, когда образцы РНК лимфоцитов периферической крови, положительных по ДНК, были отрицательны в нозерн-гибридизации. Такие случаи касались только образцов РНК лимфоцитов, полученных от больных с опухолями гинекологической сферы или от здоровых доноров. Это объясняется тем, что по-видимому, часть выявляемых нами последовательностей ДНК, близкородственных гену ет ММТУ, находится в транскрипционно не активных участках хроматина, что косвенно подтверждается разностью профилей гибридизации по Саузерну среди образцов исследуемых групп.

J. Обнаружение последовательностей ДНК человека, высокогомологичных гену env MMTV методом ПЦР и возможность использования его в качестве скришшгового метода для выявления групп риска РМЖ.

Помимо обнаружения последовательностей ДНК в лимфоцитах периферической крови исследуемых групп, гомологичных гену env MMTV. методом гибридизации по Саузериу в жестких условиях с зондами, для облегчения скрининга образцов ДНК исследуемых групп на наличие данных последовательностей, был отработан метод ПЦР для обнаружения таких последовательностей. Используемые праймеры были подобраны с тем учетом, что они не имели гомологии как с человеческим геномом, так п с последовательностями HHRV-K - провирусов.

15 образцах ДНК лимфоцитов периферической крови исследуемых групп выявлялись 2 типа ПЦР-продуктов: длиной 650 и 200 и.о. По-видимому. последовательность, размером 200 и.о. может являться делегированным вариантом ПЦР-нродукта размером 650 п.о. Частота обнаружения ПЦР-продуктов длиной 200 и.о. во всех группах была ниже, чем час roía обнаружения ПЦР-продуктов длиной 650 п.о. На рисунках 3 и 4 представлен пример проведения ПЦР и последующей гибридизации но Саузериу в жестких условиях с зондом, представляющим собой gp52-кодирующую область гена env MMTV.

Статистически достоверных отличий (в зависимости от длины обнаруживаемого ПЦР-продукта) среди исследуемых групп обнаружено не было, однако, при сопоставлении частот обнаружения специфичных ПЦР-продукгов. показано статистически достоверное отличие (р<0.01) группы больных РМЖ от групп больных с опухолями гинекологической сферы и здоровых доноров.

Интересно, чю в группе протестированных 36-и здоровых доноров, состоящей из 17-и мужчин и 19 женщин, из 10-и положительных образцов Д1IK, 9 образцов оказались полученными от женщин.

I 2 3 4 5 6 7 X 9 К) 11 12 13 14 15 16 17 18

12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

927

'650

200

Рис. 4. Проведение последующей гибридизации по Саузерну с зондом, представляющим gp52-кодирующую область гена ет ММТУ. I - Маркер длин ДНК; 2-12, 18 - Образцы ДНК лимфоцитов периферической крови больных РМЖ; 13,14 - Образцы ДНК лимфоцитов периферической крови здоровых доноров; 15 - Положительный контроль ПЦР; 16 - Отрицательный контроль ПЦР; 17 - Плазмида рВ1ие5спр1 вК+Л (не была амплифицнровапа и использовалась в качестве отрицательного контроля для гибридизации).

В настоящее время в качестве молекулярно-генетической диагностики РМЖ используется определение мутаций в генах - опухолевых супрессорах ВЯСА1 и ВКСА2. Мутации генов ВКСА! и ВКСА2 приводят к возникновению РМЖ, а также рака яичников. Однако, такие молекулярно-генетические маркеры РМЖ, как мутантные гены ВКСА1 и ВКСА2. в основном служат для определения наследственных форм РМЖ и рака яичников.

Известно, что для успешного лечения РМЖ, крайне важен ранний срок его диагностики. При этом, большое значение играет своевременное выявление групп повышенного риска в отношении развития РМЖ, среди населения. Таким образом, метод ПЦР, отработанный нами, мог бы

служим, методом первичною скрининга, поскольку является простым и чувспмиельпым меюдом выявления молскулярно-гснетических маркеров.

4. Сопоставление результатов, полученных используемыми в работе методами.

При сопоставлении результатов, полученных методами гибридизации по Саузерну, нозсрн-гпбрпдизации и прямой иммунофлюорисценции с методом ПЦР, для образцов ДНК исследуемых групп оказалось, что факт обнаружения таких последовательностей меюдом ПЦР. совпадает с фактами обнаружения последних другими используемыми методами.

Ниже представлена таблица 2. демонстрирующая совпадение результатов, полученных тремя использованными методами.

Таблица 2

Образцы. Гибридизация но Нозерн- 11ЦР

Труппы Саузерну Гибридизация

1 РМЖ + + +

2 РМЖ + + +

3 РМЖ + + +

4 * + + +

5 * + + +

6 РМЖ + + +

7 РМЖ + - -

8 РМЖ - - -

9 РМЖ + + +

10 РМЖ + + -

11 зд.донор - - -

12 зд.донор + + +

13 зд.донор + + +

14 зд.донор + - +

15 РЯ + + +

16 РМЖ + + +

17 зд.донор + + +

* - 4 п 5 образцы лимфоцитов, полученные ог сестер близнецов - дочерей нацистки, больной РМЖ.

Следует отметить, что в таблицу 2 вошли только те образцы, которые были тестированы одновременно всеми использованными методами.

Несовпадение результатов тестирования наблюдалось только в трех из 17 случаев.

Суммарные данные, полученные в работе, отображены в заключительной таблице 3. При статистической обработке данных, было показано, что группа больных РМЖ статистически достоверно (р<0,05) отличалась от группы здоровых доноров и группы больных с опухолями гинекологической сферы, во всех использованных в работе тестах .

Таблица 3.

Диагноз Гибрид по Са\ Зонд Ет 1,5кЬ изация перну Зонд ёр52 927Ьр Поз Гибри; Зонд епу 1,5кЬ ерн-изация Зонд ЕПУ 1,5кЬ ФИФ . ПЦР

Больные РМЖ 21/23 17/20 21/23 3/4 4/4 17/21

Больные гинекологическими опухолями 3/9 2/9 2/9 2/11 2/11 2/9

Здоровые доноры 6/11 4/12 3/11 2/10 2/9 10/36

ВЫВОДЫ.

1. В геноме лимфоцитов человека обнаружены последовательности ДНК, гомологичные гену ет ММТУ, и их транскрипты, способные экспрессироваться до трансляционного уровня.

2. Транскрипция последовательностей, гомологичных гену ет ММТУ, в лимфоцитах периферической крови коррелирует с обнаружением в них антигена, иммунолошчески родственною gp52 ММ I V.

3. Последовательности, гомологичные гену ет ММ IV, и их фаискрипты, были обнаружены в лимфопшах периферической крови больных РМЖ в 85% случаев (в среднем но используемым методам), что статистически достоверно отличает гту группу от

iруины больных с опухолями гинекологической сферы (23%) и здоровых допоров (31%). 4. Офабоганы методы молекулярной гибридизации и ПЦР для выявления последовательностей, гомологичных гену env MMTV. в образцах ДИК и РНК лимфоцитов периферической крови человека, которые могут быть использованы в клинической пракшке для обнаружения генетических маркеров РМЖ.

Список публикаций по материалам диссертации.

1. Луншикова А.А.. Малнванова Т.Ф.. Махов II.К. Крюкова И.Н., JlaKiiionoi! К.II.. Нолевая И.Б. 2001 "Экспрессия env MMTV-юмологичпых последовательностей". Молекулярная генетика, микробиология, nupycojioi ия. Принято к печати.

2. Лмпннкопа А.А.. Крюкова II.II.. Махов II.П.. Полевая Н.Б. 1998 "Корреляция между экспрессией антигена, иммунологически родеI пенною gp52 и транскрипцией гомологичных env MMTV последовательностей ДНК в лимфоцитах периферической крови больных РМЖ". Мол. Генетика. Микрообиология. вирусология. №3. с. 33-36.

3. Крюкова И.П.. Махов II.Б.. Малнванова Т.Ф., Юрчснко В.А. 1999. "О диагностических возможностях тссга на экспрессию env ММ IV -гомологичных последовательностей в лимфоцитах при раке молочной железы человека". Вестник РОНЦ, №4, с. 34-38.

4. I.ushnikova Л.A., Kryukova I.N., Makhov Р.В.. Polevaya li.B., Laktionov К.P. "Ilinnan niammary carcinoma is associated wilh monse mammary tumor virus (MMTV) - related sequence expressionin Iniman periplieral blood lymphocytes". Proc. of 2001 SABCS Annual Meeting, Texas. USA, abstr. 432.

5. Махов II. В.. Лупгннкова A. A.. Денисова A.Л.. Кармош II. Г.. Лакпюион К.И.. Полевая 1л. Б., Ставцев М. Г. 2000. Обнаружение последовательностей ДНК человека, высокогомологичнмх гену env

MMTV в лимфоцитах периферической крови методом ПЦР. Русский Журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы. Т4, №1, с. 98.

6. Lushnikova, P. Makhov, I. Kryukova, T. Malivanova, E. Polevaya. 1997. Supposed expression of MMTV-related human DNA sequences in peripheral blood lymphocytes of mammary cancer patients. Virus research. Abstracts of the XXlInd Meeting of the European tumor virus group. V. 47, №2, p. 106.

7. I.ushnikova. 1. Kryukova, P. Makhov, T. Malivanova, E. Polevaya. 1997. Transcription of DNA sequences related to env MMTV in peripheral blood lymphocytes from mammary cancer patients. Abstracts/ First international meeting on advances in the knowledge of cancer management. Vienna. № 206.

8. Лушникова А. А., Махов II. Б., Маливанова Т.Ф., Крюкова И.Н., Полевая Е. Б. 1997. Корреляция между экспрессией антигена, иммунологически родственного gp52 MMTV и трапскринцией последовательностей ДНК, гомологичных env MMTV в лимфоидных клетках больных раком молочной железы. Русский Журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы. Т. 1, №1, с. 266.

9. 1. Kryukova, T. Malivanova, A. Lushnikova, P. Makhov. 1998. "Human mammary carcinoma and specific retroviral - related marker expression". 17th Int. Cancer Congr. Rio-De Janeiro

10. Крюкова И.Н., Лушникова А. А., Махов Г1. Б. 2001. Влияние 5-аза-цитидина па экспрессию env MMTV-гомологичных последовательностей в лимфоцитах здоровых доноров. Русский Журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы. Т. 5, №1, с. 126.