Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Экспрессия молекулярно-биологических маркеров при немелкоклеточном раке легкого

¡-из од

1 в ОЕВ 2002

На правах рукописи

СТЕПАНОВА Евгения Владиславовна

Экспрессия молекулярно-бнологнчсскмх маркеров при немелкоклеточном раке легкого

14.00.14 - онкологии

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва -2001

Работа выполнена в Российском онкологическом научном центре им. Н.Н.Блохина РАМН.

I

доктор медицинских наук, профессор,

А.Ю.Барышников

доктор медицинских наук, профессор,

член-корреспондент РАМН

М.И.Давыдов

доктор медицинских наук, профессор, М.Б.Бычков

доктор медицинских наук, профессор, Е.А.Коган

Ведущее научное учреждение -

Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена МЗ РФ

Защита диссертации состоится «О--» Арсо^-Я 2002г. в _

часов на заседании диссертационного Совета (К.00117.01) Российского онкологического научного центра им. Н.Н.Блохина РАМН (115478, Москва, Каширское шоссе, 24).

Научные руководители -

Официальные оппоненты -

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского онкологического научного центра им. Н.Н.Блохина РАМН.

/

Автореферат разослан 2001_г. *"'

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук, Ю.А.Барсуков

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ

Для злокачественных опухолей легкого характерна стремительная профессия, агрессивное течение заболевания и низкая выживаемость больных. Совокупная статистика данных многочисленных авторов показывает, что, несмотря на совершенствование хирургического метода, 5-летний срок в целом переживают 20-30% радикально оперированных больных, и заметной тенденции к улучшению данных результатов не наблюдается [Давыдов М.И., 1994]. Используя традиционные факторы прогноза, часто невозможно предсказать вероятность и сроки появления метастазов в каждом конкретном случае.

За последние несколько десятилетий достигнут значительный прогресс в понимании молекулярной биологии клетки. Стали известны многие механизмы контроля клеточного деления и смерти, поддержания генетической стабильности, пути передачи сигнала от рецепторов в ядро и т.д. Оказалось, что изменения некоторых белков, участвующих в этих процессах, могут приводить к трансформации клеток. Такие структурные и функциональные особенности, определяемые в опухолевой ткани, получили название молекулярно-биологических (молекулярных) маркеров опухолевого роста [Коган Е.А., 1997].

Одним из современных путей совершенствования прогнозирования течения рака легкого и оптимизации лечебной тактики является изучение присутствия молекулярно-биологических маркеров в ткани опухоли. Наличие/отсутствие в опухолевых клетках определенных маркеров (например, р53, Вс1-2, Вах, НЕ11-2/пеи, УЕОР и т.д.) может приводить к тому, что опухоли, сравнимые по распространенности (по классификации ТКМ), различаются по агрессивности течения заболевания.

Идентификация маркеров для более точного прогноза течения заболевания и определения адекватной терапии для больных раком легкого является актуальной и перспективной задачей. Исследование прогностических маркеров в комплексе со всеми подходами, которые обычно доступны в клинической практике, в будущем поможет выбрать наиболее эффективные методы лекарственной терапии индивидуально для каждого больного.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью настоящей работы явилось изучение экспрессии некоторых молекулярно-биологических маркеров (р53, Вс1-2, Вах, Кл-67, НЕК2/пеи, С095Ь и УЕОР) при немелкоклеточном раке легкого (НМРЛ) и оценка возможности их индивидуального или комплексного использования для прогнозирования течения болезни.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Исследовать экспрессию молекулярно-биологических маркеров (р53, Вс1-2, Вах, Кл-67, НЕ112/пеи, СБ95Ь и УЕвР) в клетках НМРЛ различных гистологических типов с помощью иммуноги-стохимического метода.

2. Сопоставить результаты тестирования с традиционными клиническими и морфологическими характеристиками опухоли с целью оценки возможного влияния молекулярно-биологических маркеров на биологическое поведение опухоли.

3. Оценить прогностическую значимость экспрессии молекулярно-биологических маркеров при НМРЛ.

НАУЧНАЯ понизил

Была исследована панель молекулярно-биологнческих маркеров, связанных с пролиферацией, апоптозом и ангиогенезом (р53, Вс1-2, Вах, Кл-67, НЕ112/пеи, СБ95Ь и УЕвЕ), при НМРЛ. Изучены особенности экспрессии и взаимного влияния маркеров на прогрессию плоскоклеточного и адсиогенного рака легкого. Проведен анализ наиболее информативных критериев прогноза течения заболевания и риска появления метастазов при НМРЛ различных типов. Впервые установлено, что совместная экспрессия р53 и УЕвР в опухолевой ткани имеет высокую прогностическую значимость для 5-летней безрецидивной выживаемости больных НМРЛ.

НЛУЧИО-Ш'ЛКТИЧЕСКЛЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Использование в патологоанатомической практике определения молекулярно-бпологических маркеров позволит прогнозировать течение немелкоклеточного рака легкого при хирургическом лечении и химиотерапии. Оценка совместной экспрессии р53 и УЕвР при НМРЛ 1-Н стадии имеет важное прогностическое значение для выделения группы повышенного риска метастазирования.

Разработаны и внедрены в медицинскую практику новые прогностические факторы НМРЛ, что содействует рациональному лечению больных.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Диссертационная работа изложена на 130 страницах машинописного текста. Диссертация состоит из ведения, обзора литературы, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения,

выводов, списка литературы, включающего 190 источников. Работа иллюстрирована 25 таблицами, 23 рисунком.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Апробация работы состоялась 27 апреля 2001г. на совместной научной конференции с участием лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей, отделений торако-абдоминальной хирургии, химиотерапии и комбинированных методов лечения РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН.

Основные положения диссертации представлены на Четвертой научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2000» (Санкт-Петербург, 2000); II съезде онкологов стран СНГ (Киев, 2000).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Общая характеристика больных. В исследование включен 101 больной HMPJI: 78 - мужчин и 23 женщин. Все больные были радикально оперированы в отделении торако-абдоминальной хирургии НИИ КО РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН (руководитель - д.м.н., профессор, член-корр. РАМН Давыдов М.И.) в 1986-1990 годах. Все больные имели радикальное хирургическое вмешательство, опухолевая ткань по линии резекции отсутствовала. Все больные были прослежены в течение 5 лет или до появления метастазов.

Гистологическое строение опухоли определялось согласно классификации опухолей легких (ВОЗ, 1981 г.). Оценка распространенности болезни проводилась в соответствии с системой TNM (1997 г.) на основании данных обследования, операционных и морфологических находок. В исследование вошло 49 (48,6%) больных плоско-

клеточным раком легкого (ПРЛ) 1Б стадии и 52 (51,4%) - больных аденокарциномой (АК), из которых 7 больных имели 1А стадию, 8 больных - 1Б, б больных - ПА, 11 больных - НБ и 20 - ША стадию.

Иммуногистохимический анализ проводили на срезах с парафиновых блоков опухолей, предназначенных для стандартного морфологического исследования. Использованные в работе первичные антитела представлены в таблице 1.

Таблица 1.

Панель использованных в исследовании антител

Клон Фирма Разведение Специфичность

Ki-S5 DAKO 1:50 Антиген Ki-67, пролифе-ративная активность

DO-7 DAKO 1:200 Нормальный и мутантный тип р53

124 DAKO Вс1-2

Анти-Вах (поликлон.) DAKO 1:500 Вах

С-1 Santa Cruz Biotech 1:500 VEGFa

Aimi-HER-2/iieu (поликлон.) DAKO 1:500 HER-2/neu

Ahtii-CD95L (полпклон.) Santa Cruz Biotech 1:500 CD95 (Fas/APO-1) лиганд

Парафиновые срезы депарафинировали и регидратировали по стандартной методике. Для "демаскировки" антигенов проводили прогревание срезов на водяной бане в предварительно нагретом до 95-99°С цитратном буфере в течение 30 минут. Инкубацию с первичными антителами проводили при 4°С в течение 16 часов. После первичных антител стекла промывали 2 раза по 5 минут в фосфатном буфере. В качестве вторичных антител использовали тест-систему ЬБАВ+кИ [ОАКО] согласно инструкции. Для визуализации

иммуногистохимической реакции использовали DAB+ систему [DAKO]. Срезы докрашивали гематоксилином Майера и заключали в канадский бальзам.

Оценку результатов окрашивания проводили с применением светового микроскопа «Leica» (Германия) под увеличением х10, х20, х40. Для всех маркеров оценивали локализацию окрашивания в клетке (ядро, цитоплазма, мембрана). Количество положительных клеток оценивали в зонах, содержащих их максимальное количество.

В исследовании применяли следующие критерии результатов:

(1). опухоль считали отрицательной по р53, если в ткани опухоли отсутствовала ядерная реактивность с антителами или количество окрашенных клеток было менее 25%; положительной по р53, если было окрашено более 25% ядер опухолевых клеток;

(2). опухоль считали отрицательной по Вс1-2 или Вах, если в ткани опухоли отсутствовала цитоплазматическая реактивность с антителами или количество окрашенных клеток было менее 25%; положительной по Вс1-2 или Вах, если было окрашено более 25% опухолевых клеток;

(3). опухоль расценивали как положительную по CD95L, если более 10% опухолевых клеток были окрашены антителами с любой интенсивностью;

(4). для оценки интенсивности окрашивания антителами к HER-2/neu использовали критерии: 0 - отсутствие окрашивания; 1+ -слабое окрашивание мембраны опухолевых клеток; 2+ - средняя интенсивность окрашивания более 10% опухолевых клеток; 3+ - сильная степень окрашивания более 10% опухолевых клеток; опухоль, оцениваемую как 0 или 1+, считали отрицательной, 2+ или 3+ - положительной по HER-2/neu;

(5). количество сосудов, окрашиваемых антителами к VEGF, оценивали полуколичественно: 1 - отсутствие окрашивания; 2- окрашивание небольшого числа сосудов; 3 - окрашивания среднего числа сосудов в опухоли, 4 - в опухоли наблюдается окрашивание большого числа сосудов;

(6). для оценки пролиферативнон активности (ПА) опухоли подсчитывали количество Ki-67-положптельных опухолевых клеток, приходящиеся на 200-300 опухолевых клеток; индекс Ki-67 определяли по формуле: ПА = число Ki-67 положительных клеток х 100/ общее количество клеток.

Статистический анализ проводили на персональном компьютере с использованием программы "SPSS" (v9.0. for Windows). Для проверки достоверности различий значений признаков в группах использовали тесты «хи-квадрат» (х2) и точный критерий Фишера. Различия считались статистически достоверными при р<0,05 (95% точности). Расчет выживаемости проводили методом Каплана-Мейера. Сравнение двух кривых выживаемости проводили с помощью логранкового критерия [Гланц С., 1999]. Для оценки независимости признаков использовалась модель пропорционального регрессионного анализа Кокса.

ГЕЗУЛЬТЛТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Молскулярио-бпологнчсскис особенности НМРЛ

Нами была изучена пролиферативная активность и экспрессия белков, участвующих в канцерогенезе и прогрессии опухолей (р53, Вс1-2, Вах, НЕЯ-г/пеи, С095Ц УЕОР), при НМРЛ.

Обнаружено окрашивание опухолевых ядер антителами к р53 в 57,4% случаев НМРЛ, тогда как нормальные клетки стромы и инфильтрирующие опухоль лимфоциты не окрашивались антителами к р53. В таблице 2 представлены данные о накоплении р53 у больных НМРЛ. Обнаружено, что гиперэкспрессия р53 наблюдается часто при плоскоклеточном раке легкого (63,3 %) и аденокарциноме (51,9%).

Таблица 2.

Накопление р53 при НМРЛ.

НМРЛ - нсмслкоклсточный рак легкого, ПРЛ - плоскоклеточиьш рак легкого, АК - аденкарцмиома легкого

Группа Количество случаев, п Экспрессия р53, п (%)

Общая группа НМРЛ 101 58 (57,4)

ПРЛ 1В стадии 49 31 (63,3)

АК 52 27 (51,9)

АК I стадии 15 6 (40,0)

АК II стадии 17 12 (70,6)

АК ША стадии 20 9(45)

При этом отмечено, что при ранней стадии болезни гиперэкспрессия р53 обнаруживается чаще при плоскоклеточном раке, чем при аденокарциноме. Экспрессия р53 была статистически не достоверно ниже при ША стадии АК, что может косвенно говорить о накоплении «нулевых» мутаций р53. Локализация опухоли (центральный

или периферический рак) и степень ее дифференцировки не коррелируют с экспрессией р53.

Белки семейства Bcl-2 (Вс1-2 и Вах) являются одними из основных эффекторов апоптоза в клетке. Мы исследовали экспрессию двух основных белков этого семейства в ткани HMPJI: Вс1-2, ингибитора апоптоза, и Вах, индуктора апоптоза. Обнаружено, что накопление Вс1-2 и Вах происходит в цитоплазме опухолевых клеток. Инфильтрирующие опухоль лимфоциты всегда были сильно окрашены антителами к Вс1-2 и расценивались как внутренний положительный контроль.

Экспрессия Вс1-2 была обнаружена в 19 % случаев при НМРЛ. При плоскоклеточном раке - 31 %, чем при аденокарциноме - 8 % случаев (р=0,007). Экспрессия Вах определялась в 41 % случаев НМРЛ, значительно чаще в аденокарциномах, чем в плоскоклеточном раке (58% н 22 %, соответственно; р= 0,0002). Таким образом, в нашем исследовании обнаружено, что экспрессия белков Вс1-2 и Вах, контролирующих апоптоз, значительно различается при плос-коклеточпом раке и аденокарциноме (Рис. 1).

Плоскоклсточмый Лдеиоклрцинома рак

Рисунок 1. Экспрессия Вс1-2 и Вах в зависимости от гистологического типа рака легкого.

а 13с1-2 □ 0 ах

Такой дисбаланс про- и антиапоптотических факторов в адено-карциноме и плоскоклеточном раке легкого может свидетельствовать о различной роли Вс1-2 и Вах в патогенезе этих опухолей.

Экспрессия VEGF - одного из основных стимуляторов ангиогене-за, была найдена в цитоплазме опухолевых клеток в 47 % случаев HMPJI. Экспрессия VEGF наблюдалась также на эндотелиальных клетках сосудов опухолевой ткани в 63 % аденокарциномы и обратно коррелировала с присутствием VEGF в опухолевых клетках (р=0,04).

Частота экспрессии VEGF на опухолевых клетках не зависела от гистологического строения опухоли (42 % - в группе АК и 51 % -при ПРЛ), размера опухоли, дифференцнровки, пола больных. Экспрессия VEGF при аденокарциноме была статистически значимо выше в группе с поражением перибронхиальных лимфоузлов, чем в двух других группах. Экспрессия VEGF у больных с метастазами в регионарные перибронхиальные лимфоузлы (N| по TNM классификации) составила 71 %, без поражения лимфоузлов (N0 по TNM классификации) - 25 %, (р=0,015) (Рис. 2).

VEGF играет важную роль в опухолевом неоангиогенезе и в образовании гематогенных метастазов для многих типов опухолей [Ellis L., 1996]. В нашем исследовании частота экспрессии VEGFa в опухолевых клетках была выше у больных, имеющих метастазы в регионарные перибронхиальные лимфоузлы.

50% 40% 30%

80% 70% 60%

20% 10% 0%

N1

N0

Рисунок 2. Экспрессия УЕСГ в первичной опухоли у больных аденокарциномой легкого с и без метастазов в регионарные лимфоузлы.

Повышенная экспрессия НЕК2/пеи па мембране опухолевых клеток выявлена в 21 % случаев аденокарщшомы и ассоциировалась с присутствием р53 (к=0,31; р=0,025), с количеством р53 положительных клеток (к=0,31; р=0,023) и интенсивностью окраски антителами к р53 (к=0,31; р=0,024). В нашем исследовании не было найдено никаких корреляций между экспрессией НЕЯ2/пеи и клинико-патологическими параметрами опухоли.

Синтез СР95Ь может использоваться опухолью для ускользания от иммунного ответа и способствовать метастазированшо. Экспрессия С095Ь нами было обнаружена в 56 % (29 из 52) случаев аденокарщшомы легкого. Экспрессия СЭ95Ь имела тенденцию быть выше у больных с метастазами в регионарные псрибронхиальиые лимфоузлы: частота встречаемости в группе Ыо составляет - 43,8 % (7 из 16), в группе N1 - 70,6 % (12 из. 17) (Табл. 3). Интенсивность окрашивания антителами к С095Ь увеличивалась по мере увеличения степени поражения лимфоузлов (достоверность различий между группой N0 и N2 составляет р=0,06).

Таблица 3.

Экспрессия С095Ь у больных адснокарциномон легкого.

Группы больных с адено-карцпномой легкого, (п) Частота экспрессии СБ95Ь, % Средний уровень экспрессии, (М + т)

Общее число наблюдений (52) 56 1,6±0,72

N0(16) 43,8 1,14+0,37

N,(17) 70,6 1.67+0,77

N2(19) 52,6 1,8±0,72

Экспрессия СЭ95Ь опухолевыми клетками может являться одним из механизмов, способствующим нечувствительности опухолевых клеток к иммунологическому ответу на раннем этапе лимфогенного метастазирования.

Способность к неограниченному размножению - является одной из главных особенностей опухолевых клеток. Количество делящихся клеток является интегральным показателем следующих особенностей опухолевых клеток: независимости от ростовых сигналов; нечувствительности к сигналам, блокирующим деление; неограниченной возможности деления; усиленного ангиогенеза.

В нашем исследовании пролиферативная активность (индекс Кл-67) плоскоклеточпого рака была значительно выше, чем аденокар-дшюмы (37,0+27,3 % и 4,2+9,9 %, соответственно; р<0,000001). Статистический анализ выявил, что пролиферативная активность адено-карциномы и плоскоклеточного рака зависит от разных молекулярных маркеров. Так, при плоскоклеточном раке выявлена прямая корреляция с экспрессией Вс1-2 (к=0,35; р=0,01), а при

аденокарциноме - с присутствием р53 (к=0,3; р=0,033) и CD95L (к=0,26; р=0,069).

Таким образом, по данным нашего исследования определение экспрессии р53 и VEGF может давать информацию о биологическом поведении опухоли только на ранних стадиях прогрессии (I-II стадии). При III стадии происходит резкое снижение экспрессии р53 и VEGF, что возможно связано с накоплением «нулевых» мутаций в гене р53 и увеличением синтеза других стимуляторов ангиогенеза. Частота экспрессии белков семейства Bcl-2 - Вс1-2 и Вах, сильно отличается в плоскоклеточном раке и аденокарциноме, что может говорить об их различной роли в патогенезе этих опухолей. VEGF и CD95L являются факторами, экспрессия которых увеличивается у больных, имеющих метастазы в регионарные перибронхиальные лимфоузлы.

Клиническое значение экспрессии молекулнрно-биологичсскнх маркеров при IIMPJI

Основным критерием эффективности хирургического лечения больных раком легкого является оценка продолжительности жизни и 5-летняя безрецидивная выживаемость. Общепризнанно, что основными факторами, влияющими на безрецидивную выживаемость и продолжительность жизни, являются распространенность опухоли и ее гистологическая структура. Одной из задач проведенного памп исследования было оценить прогностическое значение экспрессии молекулярно-биологпческих маркеров для больных PJL

В таблице 4 представлены данные о статистически значимых факторах прогноза 5-БВ больных HMPJI. Экспрессия р53, Вс!-2 и VEGF, наряду со степенью поражения лимфоузлов, коррелировала как с частотой появления метастазов в течение 5 лет после удаления пер-

винной опухоли,.так и с продолжительностью безрецидивного периода.

Таблица 4.

Зависимость 5-лстисй безрецидивной выживаемости (5-БВ) больных НМРЛ от различных клшшко-патологнческнх пара-

метров п экспрессии молскулярно-биологическнх маркеров.

Показатель, (п) 5-БВ, % Медиана, мсс Достоверность, р

Дифференцировка

0,(11=17) 38,5 21 0,041

02(п=42) 50,0 Не достигнута

03(п=17) 29,4 21

Метастазы в регио-

нарные лимфоузлы

N„(11=65) 52,3 Не достигнута 0,0016

N,(11=17) 29,4 21

N2 (п= 19) 21,1 15

р53

отриц. (п=43) 60,5 Не достигнута 0,002

полож. (п=58) 29,3 20

Вс1-2

отриц. (п=82) 39,0 23 0,048

полож. (п=19) 57,9 Не достигнута

УЕОР

отриц. (п=54) 56,4 Не достигнута 0,0014

полож. (п=47) 25,5 18

Многофакторный анализ показал, что только степень поражения лимфоузлов (р=0,0003, коэффициент регрессии 0,49, стандартная ошибка 0,13), экспрессия р53 (р=0,0079, коэффициент регрессии 0,54, стандартная ошибка 0,202) и УЕвИ (0,0076, коэффициент регрессии 0,53, стандартная ошибка 0,20) являются независимыми факторами прогноза НМРЛ.

Был проведен анализ влияния совместной экспрессии молекуляр-но-биологических маркеров на прогноз заболевания. Сочетание экспрессии р53 и УЕОР может иметь большое прогностическое значе-

ние для больных НМРЛ I стадии (Рис. 3). Группа больных УБвР" р53~ имеет наиболее благоприятный прогноз течения заболевания (5-летняя безрецидивная выживаемость составила 87,5 %, медиана не достигнута), тогда как группа УЕОР+р53+ является группой повышенного риска метастазнрования (5-летняя безрецидивная выживаемость составила 11 %, медиана - 16 мес.). .Группы, где положительным является только один маркер, занимают промежуточное значение.

Рисунок 3. Сравнительная 5-летняя безрецидивная выживаемость больных НМРЛ I стадии в зависимости от совместной экспрессии УЕйР и р53 в опухоли.

Отдельно изучена прогностическая значимость молекулярно-биологических маркеров при плоскоклеточиом раке и аденокарци-номе легкого.

При плоскоклеточном раке легкого накопление р53, отсутствие Вс1-2 или экспрессия УЕвР, являются неблагоприятными прогностическими признаками при 1Б стадии (Табл. 6).

На рисунке 4 представлены кривые безрецидивной выживаемости больных плоскоклеточпым раком легкого в зависимости от статуса

оК

УЕЩ-) УЕСГ(+) УЕОГ(+)

р53(-) р53(+) р53 (-) р53(+)

-■г

Н НМРЛ I стадии И ПРЛ I стадии □ АКI стадии

р53 и УЕвР. По данным многофакторного анализа показано, что экспрессия УЕОР в опухолевой ткани является независимым прогностическим маркером 5-БВ у больных ПРЛ 1В стадии (р=0,009, коэффициент регрессии 0,76, стандартная ошибка 0,292) (Рис. 4Б). Экспрессия р53 также является важным прогностическим показателем (Рис. 4А).

Таблица 6.

Зависимость 5-лстнен бсзрсцндншюй выживаемости больных ПРЛ 1В стадии от экспрессии молскулпрно-биологнческнх факторов.

Показатели, (п) 5-БВ, % Медиана, мес Достоверность, р

р53

отриц. (п=18) 72,2 Не достигнута 0,015

полож. (п=31) 35,5 20

Вс1-2

отриц. (п= 34) 41,2 20 0,07

полож. (п=15) 66,7 Не достигнута

УЕОР

отриц. (п=24) 75,5 Не достигнута 0,0005

полож. (п=25) 24 16,5

Анализ влияния совместной экспрессии нескольких маркеров на 5-летней безрецидивной выживаемости показал, что определение совместной экспрессии р53 и УЕвР имеет важное значение в группе плоскоклеточного рака легкого (Рис. 3). Определение экспрессии Вс1-2 у больных ПРЛ 1В стадии увеличивает прогностическую значимость критерия. Группа больных с фенотипом р53"УЕОР"Вс1-2+ имеет наиболее благоприятный прогноз (5-летняя безрецидивная выживаемость составила 100 % (4 из 4), медиана не достигнута), а наихудший прогноз - группа р53+УЕОР+Вс1-2" (5-летняя безреци-днвная выживаемость составила 0 % (0 из 13), медиана - 12 мес.); р=0,003.

0,75.

0,5

0,25

р53" р53*

р=0,032

д | 17,5 35,0 52,5 70,0 Время до появления метастазов, мсс

к ч к я

0,75-

0,5

0,25

н

уе с г

УЕвК*

р<0,001

17,5 35,0 52,5 70,0 Время до появления метастазов, мсс

Рисунок 4. Зависимость 5-летней безрецидивпой выживаемости больных плоскоклеточным раком легкого 1Б стадии от экспрессии р53 (А) и УЕСГ (В) в опухолевой ткани.

При аденокаршшоме легкого анализ безрецидивной выживаемости радикально оперированных больных стадий 1-П показал, что только поражение лимфоузлов и накопление р53 являются достоверными маркерами появления метастазов после удаления первичной опухоли (р=0,012 и 0,031, соответственно).

В 72,2 % (13 из 18) случаев у больных с накоплением р53 в опухоли отмечено появление метастазов в течение 5 лет после операции, и лишь в 28,5 % (4 из 14) случаев в группе р53". Медиана безрецидивной выживаемости в группе р53+ составляет 23 месяца, а в группе р53" не достигнута.

Отсутствие совместной экспрессии р53 и УЕвЕ в опухолевой ткани сопровождалось в 33,3 % (3 из 9) случаев появлением метастазов (медиана безрецидивной выживаемости не достигнута), тогда как в группе р53+УЕОЕ+ метастазы развились в 80 % (8 из 10) случаев (медиана безрецидивной выживаемости составила 20 месяцев); р=0,042.

Как известно, при более значительном распространении опухоли прогноз безрецидивной и общей выживаемости ухудшается. Между тем, при анализе группы больных аденокарцином ША стадии обнаружено, что больные с экспрессией Вах имеют лучший прогноз, чем при его отсутствии (Рис. 5).

В группе Вах" у 100 % (9 из 9) больных появились метастазы в течение 4-15 месяцев после удаления первичной опухоли, тогда как в группе Вах+ метастазы появились у 63, 6 % (7 из 11) больных в течение 3-55 месяцев. Особенно важно, что медиана безрецидивной выживаемости в группе Вах+ составила 36 месяцев, а в группе Вах" - 6 месяцев (р<0,005).

л н

— Вах" ...... Вах+

р<0,005

17,5 35,0 52,5 70,0 Время до появления метастазов, мсс

Рисунок 5. Зависимость 5-летней безрецидивной выживаемости больных аденокарциномой легкого Ша стадии от экспрессии Вах в опухолевой ткани.

Таким образом, достоверно показана высокая значимость определения совместной экспрессии р53 и VEGF в опухолевой ткани для прогнозирования 5-летней безрецидивной выживаемости больных немелкоклеточным раком легкого I-II стадии. Группу повышенного риска метастазировання составляют p53+VEGF+ и низкого риска ме-тастазирования - р53 VEGF" больные. Определение экспрессии Вах может иметь значение для прогнозирования сроков появления метастазов у больных аденокарциномой ША стадии.

выводы

1. Ядерное окрашивание антителами к р53 выявлено в 57% случаев НМРЛ и коррелировало с ухудшением 5-летней безрецидивной выживаемость больных. Локализация опухоли и степень ее диф-ференцировки не коррелируют с экспрессией р53.

2. Экспрессия Вс1-2 была обнаружена чаще при плоскоклеточном раке - 31 %, чем при аденокарциноме - 8 % случаев. Экспрессия Вах определена в 58% случаев аденокарциномы и в 22 % случаев плоскоклеточного рака легкого. Дисбаланс про- и антиапоптоти-ческих факторов в аденокарциноме и плоскоклеточном раком лекгого может свидетельствовать о различной роли Вс1-2 и Вах в патогенезе этих опухолей.

3. Пролиферативная активность плоскоклеточного рака была значительно выше, чем аденокарциномы (р<0,000001). Выявлен различный уровень регуляции пролиферативной активности при плоскоклеточном раке и аденокарциноме легкого. При плоскоклеточном раке индекс Кл-67 прямо коррелировал с экспрессией Вс1-2, а при аденокарциноме - с присутствием р53 и СБ95Ь.

4. Больные, имеющие метастазы в перибронхиальные лимфоузлы, имеют высокую частоту экспрессии УЕОР и СБ95Ь в первичной опухоли по сравнению с больными, не имеющими метастазы в регионарные лимфоузлы.

5. Определение экспрессии р53 и УЕОР может давать прогностическую при ранних стадиях (1-И) немелкоклеточного рака легкого. Совместная экспрессия р53 и УЕОР в опухолевой ткани является прогностическим критерием для 5-летней безрецидивной выживаемости больных НМРЛ 1-И стадии. Группу повышенного риска метастазирования составляют р53+УЕОР+ и низкого риска мета-стазирования - р53'УЕСР' больные.

6. При плоскоклеточном раке легкого 1Б стадии больные с фенотипом p53"VEGF"Bcl-2+ имеют наиболее благоприятный прогноз (5-летняя безрецидивная выживаемость составила 100 %), группа p53+VEGF+Bcl-2" имеет плохой прогноз (5-летпяя безрецидивная выживаемость - 0 %).

7. Экспрессия Вах при Ша стадии адепокарцпномы легкого предсказывала более благоприятный прогноз, чем при отсутствии экспрессии этого белка (медиана безрецидивной выживаемости составила б месяцев у Вах" и 36 месяцев у Вах+ больных; р<0,005).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Степанова Е.В., Лактионов К.К., Полоцкий Б.Е., Барышников АЛО. Прогностическое значение иммуногистохимического определения экспрессии молекулярных биомаркеров (р53, Вс1-2, Вах, УБвР) при плоскоклеточном раке легкого. // Материалы IV научной конференции «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2000». Клиническая иммунология. 2000. Т.2. № 2. С. 198.

2. Барышников А.Ю., Степанова Е.В., Давыдов М.И. Молекулярные биомаркеры рака легкого. // Вестник ОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН. 2000. Т.1. С.51-59.

3. Степанова Е.В., Барышников А.Ю., Лактионов К.К., Полоцкий Б.Е., Перевощиков А.Г., Давыдов М.И. Прогностическое значение иммуногистохимического определения экспрессии молекулярных биомаркеров (р53, Вс1-2, УЕОБ) при плоскоклеточном раке легкого. // Материалы II съезда онкологов стран СНГ. Экспериментальная Онкология. 2000. Т.22 Эирр!. Абстр 206.

4. Степанова Е.В., Лактионов К.К., Полоцкий Б.Е., Давыдов М.И., Барышников Л.Ю. Прогностические маркеры плоскоклеточного рака легкого. // Российский онкологический журнал. 2001. №5. С.22-25.

5. Барышников А.Ю., Степанова Е.В., Бебезов Б.Х., Огородникова М.В., Смирнова Е.А. Экспрессия молекулярно-биологических маркеров при аденокарциноме легкого. // Новости клинической цитологии. 2001. № 11. С. 11-16.

6. Барышников А.Ю., Степанова Е.В., Бебезов Б.Х., Давыдов М.И., Райхлин Н.Т. Нарушение процессов апоптоза при раке легкого: механизмы, клиническое значение. // Центрально-азиатский медицинский журнал. 2001. №12. С. 3 -15.

Актулльмость темы

Для злокачественных опухолей легкого характерна стремительная прогрессия, агрессивное течение заболевания и низкая выживаемость больных. Совокупная статистика данных многочисленных авторов показывает, что, несмотря на совершенствование хирургического метода, 5-летний срок в целом переживают 20-30% радикально оперированных больных, и заметной тенденции к улучшению данных результатов не наблюдается. Общепризнанно, что основными факторами, влияющими на продолжительность жизни онкологических больных, являются распространенность опухоли и ее гистологическая структура. Однако, используя традиционные факторы прогноза, часто невозможно предсказать вероятность и сроки появления метастазов в каждом конкретном случае.

За последние несколько десятилетий достигнут значительный прогресс в понимании молекулярной биологии клетки. Стали известны многие механизмы контроля клеточного деления и смерти, поддержания генетической стабильности, пути передачи сигнала от рецепторов в ядро и т.д. Оказалось, что изменения некоторых белков, участвующих в этих процессах, может приводить к трансформации клеток. Такие структурные и функциональные особенности, определяемые в опухолевой ткани, получили название молекулярно-биологических (молекулярных) маркеров опухолевого роста [Коган Е.А., 1992, 1997].

Одним из современных путей совершенствования прогнозирования течения рака легкого и оптимизации лечебной тактики является изучение присутствия молекулярно-биологических маркеров в ткани опухоли. Наличие/отсутствие в опухолевых клетках определенных маркеров может приводить к тому, что опухоли, сравнимые по распространенности (по классификации TNM), различаются по агрессивности течения заболевания.

Наиболее ранними событиями в процессах канцерогенеза и прогрессировании опухолей, являются нарушение механизмов пролиферации и апоптоза (программированной клеточной гибели) в опухолевых клетках.

Одним из методов определения пролиферативной активности (ПА) опухоли служит индекс Ki-67-положительных клеток. Ki-67 является негистонным белком, который обнаруживается в ядрах во время поздней Gi, S, G2, и М, но не в G0 фазе клеточного цикла [GerdesJ., 1984].

Ключевыми белками, участвующими в управлении апоптозом, являются белки семейства Вс1-2 и супрессор опухолевого роста Р53.

Супрессор опухолевого роста, р53, известен как один из главных белков, регулирующий прохождение клеткой клеточного цикла. Активность р53 требуется для активации некоторых форм апоптоза, и его мутации могут быть ассоциированы с агрессивностью течения заболевания и устойчивостью опухолевых клеток к хнмио- или лучевой терапии. Мутации гена р53 - одни из самых распространенных нарушений, которые находят во всех типах опухолей человека [Greenblatt M.S., 1994].

Имеются данные, что трансмембранный белок HER2/neu с молекулярной массой 185 кД, являющийся аналогом рецептора фактора роста эпидермиса и обладающий тирозинкиназной активностью определяет прогноз, по крайней мере, в опухолях молочной железы и яичников.

Многие противоопухолевые агенты, включая цитотоксические препараты (ингибиторы топоизомераз 1 и 11 типа, ДНК-активные препараты, такие, как цисплатин), действуют, индуцируя апоптоз в клетках-мишенях [Dive С., 1991]. Было показано, что индукция апоптоза химиопрепаратами происходит через CD9S (Fas/APO-1) рецептор-лигандную систему [Friesen С., 1997]. Нарушение экспрессии CD9S рецептора в опухолевых клетках может приводить к их ускользанию от иммунологического ответа и блокированию запуска апоптоза, индуцированного химиотерапией.

Неоангиогенез или формирование новых микрососудов на основе уже существующей в ткани сети сосудов, является необходимым для роста опухоли и развития метастазов [Folkman J , 1997]. Фактор роста эндотелия сосудов (VEGF, vascular endothelial growth factor), является главным фактором, индуцирующим образование новых сосудов в опухоли путем стимулирования деления и миграции эндотелиальных клеток близлежащих сосудов [Ferrara N., 1997]. Экспрессия VEGF в злокачественных опухолях ассоциирована с увеличением метастазирования, и укорочением безрецидивной выживаемости.

Однако до сих пор идентификация маркеров для более точного прогноза течения заболевания и определения адекватной терапии является еще открытой проблемой для больных раком легкого. Исследование прогностических маркеров в комплексе со всеми подходами, которые обычно доступны в клинической практике, в будущем поможет выбрать наиболее эффективные методы лекарственной терапии индивидуально для каждого больного.

Цель работы

Целью настоящей работы явилось изучение экспрессии некоторых молекулярно-биологических маркеров (р53, Вс1-2, Вах, Кл-67, НЕ112/пеи, СШ5Ь и УЕОИ) при немелкоклеточном раке легкого (НМРЛ) и оценка возможности их индивидуального или комплексного использования для прогнозирования течения злокачественного процесса.

Задачи исследования

1. Исследовать экспрессию молекулярно-биологических маркеров (р53, Вс1-2, Вах, Кл-67, НЕЯ2/пеи, С095Ь и УЕОР) в клетках НМРЛ различных гистологических типов с помощью иммуногистохимического метода.

2. Сопоставить результаты тестирования с традиционными клиническими и морфологическими характеристиками опухоли с целью оценки возможного влияния молекулярно-биологических маркеров на биологическое поведение опухоли.

3. Оценить возможную прогностическую значимость экспрессии молекулярно-биологических маркеров при НМРЛ.

Научная новизна

Была исследована панель молекулярно-биологических маркеров, связанных с пролиферацией, апоптозом и ангиогенезом (р53, Вс1-2, Вах, Кл-67, НЕЯ2/пеи, СЭ95Ь и УЕвЕ), при НМРЛ. Изучены особенности экспрессии и взаимного влияния маркеров на прогрессию плоскоклеточного и аденогенного рака легкого. Проведен анализ наиболее информативных критериев прогноза течения заболевания и риска появления метастазов при НМРЛ различных типов. Впервые установлено, что совместная экспрессия р53 и УЕвР в опухолевой ткани имеет высокую прогностическую значимость для 5-летней безрецидивной выживаемости больных НМРЛ.

Научно-практическая значимость

Использование в патологоанатомической практике определения молекулярно-биологических маркеров позволит прогнозировать течение немелкоклеточного рака легкого при хирургическом лечении и химиотерапии. Оценка совместной экспрессии р53 и УЕвР при НМРЛ 1-И стадии имеет важное прогностическое значение для выделения группы повышенного риска метастазирования.

Разработаны и внедрены в медицинскую практику новые прогностические факторы НМРЛ, что содействует рациональному лечению больных.

выводы

1. Ядерное окрашивание антителами к р53 выявлено в 57% случаев НМРЛ и коррелировало с ухудшением 5-летней безрецидивной выживаемость больных. Локализация опухоли и степень ее дифференцировки не коррелируют с экспрессией р53.

2. Экспрессия Вс1-2 была обнаружена чаще при плоскоклеточном раке - 31 %, чем при аденокарциноме - 8 % случаев. Экспрессия Вах определена в 58% случаев аденокарциномы и в 22 % случаев плоскоклеточного рака легкого. Дисбаланс про- и антиапоптотических факторов в аденокарциноме и плоскоклеточном раком лекгого может свидетельствовать о различной роли Вс1-2 и Вах в патогенезе этих опухолей.

3. Пролиферативная активность плоскоклеточного рака была значительно выше, чем аденокарциномы (р<0,000001). Выявлен различный уровень регуляции пролиферативной активности при плоскоклеточном раке и аденокарциноме легкого. При плоскоклеточном раке индекс Кь67 прямо коррелировал с экспрессией Вс1-2, а при аденокарциноме - с присутствием р53 и С095Ь.

4. Больные, имеющие метастазы в перибронхиальные лимфоузлы, имеют высокую частоту экспрессии УН С) К и СР95Ь в первичной опухоли по сравнению с больными, не имеющими метастазы в регионарные лимфоузлы.

5. Определение экспрессии р53 и VEGF может давать прогностическую при ранних стадиях (MI) немелкоклеточного рака легкого. Совместная экспрессия р53 и VEGF в опухолевой ткани является прогностическим критерием для 5-летней безрецидивной выживаемости больных HMPJI Г—II стадии. Группу повышенного риска метастазирования составляют p53+VEGF+ и низкого риска метастазирования - p53"VEGF" больные.

6. При плоскоклеточном раке легкого 1Б стадии больные с фенотипом p53*VEGF"Bcl-2+ имеют наиболее благоприятный прогноз (5-летняя безрецидивная выживаемость составила 100 %), группа p53VEGF+Bcl-2" имеет плохой прогноз (5-летняя безрецидивная выживаемость - 0 %).

7. Экспрессия Вах при Illa стадии аденокарциномы легкого предсказывала более благоприятный прогноз, чем при отсутствии экспрессии этого белка (медиана безрецидивной выживаемости составила 6 месяцев у Вах' и 36 месяцев у Вах+ больных; р<0,005).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Для исследования возможной роли молекулярно-биологических маркеров в патогенезе НМРЛ и прогнозировании течения злокачественного процесса методами иммуногистохимии была изучена экспрессия р53, Bcl-2, Вах, CD95L, HER2/neu, VEGFa и пролиферативной активности (Ki-67 индекс). Исследование проводилось на парафиновых блоках плоскоклеточного РЛ T2N0M0 и аденокарциномы различной степени злокачественности (I-Illa стадии). Все больные были прослежены в течение 5 лет или до появления метастазов.

При исследовании выявлено окрашивание опухолевых ядер антителами к р53 в 57,4% случаев, тогда как нормальные клетки стромы и инфильтрирующие опухоль лимфоциты не окрашивались антителами к р53. Экспрессия р53 не ассоциировалась с какими-либо клинико-патологическими характеристиками опухоли (стадией, поражением лимфоузлов дифференцировкой, гистологическим типов опухоли, полом). Экспрессия р53 была не достоверно ниже при Ша стадии аденокарциномы, что может косвенно говорить о накоплении «нулевых» мутаций р53. Таким образом, оценка статуса р53 с помощью ИГХ может давать информацию о биологическом поведении опухоли только на ранних стадиях туморогенеза (стадии 1-Й).

Экспрессия Вс1-2 нами была обнаружена в 19% НМРЛ, значительно чаще при плоскоклеточном раке, чем при аденокарциноме (р=0,007). Экспрессия проапоптотического белка этого семейства - Вах определялась в 41% случаев НМРЛ, и была значительно выше в аденокарциномах, чем при эпидермоидном раке (р= 0,0002). Такой дисбаланс про- и антиапоптотических факторов в аденокарциноме и плоскоклеточном РЛ может свидетельствовать о различной роли Вс1-2 и Вах в патогенезе этих опухолей.

Экспрессия УЕОК - одного из основных стимуляторов ангиогенеза, была найдена в цитоплазме опухолевых клеток в 47% случаев НМРЛ. Экспрессия У!:ОР наблюдалась также на эндотелиальных клетках сосудов опухолевой ткани в 63% аденокарциномы и обратно коррелировала с присутствием УЕСП; на опухолевых клетках (р=0,04).

Повышенная экспрессия НЕК2/пеи на мембране опухолевых клеток выявлена в 21% случаев аденокарциномы и ассоциировалась с присутствием р53, с количеством р53 положительных клеток и интенсивностью окраски антителами к р53.

Синтез С0951, может использоваться опухолью для ускользания от иммунного ответа и способствовать метастазированию и лимфоузлы. Однако экспрессия СР95Ь опухолевыми клетками не является единственным и достаточным механизмом для ингибирования опухолью инфильтрирующих лимфоцитов.

Исследование показало, что пролиферативная активность плоскоклеточного рака была значительно выше, чем аденокарциномы (37% и 4,2%, соответственно). Статистический анализ выявил, что пролиферативная активность аденокарциномы и плоскоклеточного рака зависит от разных молекулярных маркеров. Так, ПА плоскоклеточного рака коррелировала с экспрессией Вс1-2 в опухолевой ткани, а в аденокарциноме - с присутствием р53 и CD95L (р=0,069).

Таким образом, подводя итог первой части исследования, нами была обнаружены различные нарушения экспрессии молекулярно-биологических маркеров при HMPJ1, и показано возможное участие Вс1-2 в прогрессировании плоскоклеточного рака легкого, а р53 и Вах - при аденокарциноме легкого.

Исследование прогностического значения маркеров при HMPJ1 показал, что экспрессии VEGF и р53 в опухолевой ткани может быть независимыми признаками укорочения безрецидивной выживаемости наряду с поражением регионарных лимфоузлов.

Многофакторный пропорциональный анализ Кокса показал, что VEGF и р53 являются независимыми маркерами БВ в группе больных I стадии. Другие показатели: пол, дифференцировка, кл инико-анатом ическая форма, распространенность опухоли, гистологическое строение, экспрессия Вс1-2, Вах и пролиферативная активность не оказывали значимого влияния на развитие отдаленных метастазов в нашем исследовании.

Экспрессия VEGF наблюдалась в 24% в группе без метастазов и в 68% в группе с метастазами. Медиана БВ в группе VEGF+ составила 18 месяцев, а в группе VEGF' больных медиана достигнута не была.

Экспрессию р53 также находят чаще в группе больных с появлением метастазов (р=0,007). Медиана БВ в группе без накопления р53 также не была достигнута, а в группе с накоплением р53 составила 21 месяц (р=0,01).

При плоскоклеточном раке легкого экспрессия Вс1-2 имеет сильную тенденцию к ассоциации с лучшим прогнозом (медиана не была достигнута в группе Вс1-2+, и составила 20,5 месяцев в группе Вс1-2; р=0,12), чего нельзя сказать об общей группе HMPJ1 и аденокарциноме.

При анализе группы больных аденокарциномой ШД стадии обнаружено, что больные с экспрессией Вах имеют лучший прогноз, чем без нее (р<0,001). Так, медиана БВ в группе Вах+ составила 36 месяцев, а в группе Вах - 6 месяцев.

Таким образом, опредление молекулярно-биологических маркеров при немелкоклеточном раке легкого может быть использовано для выделения группы больных с повышенным риском метастазирования (р53+УЕОР+ больные), которым показано назначение адъювантной химиотерапии даже при I стадии.