Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Экспрессия и функции толл-лайк-рецепторов в эпителии кишечника человека

На правах рукописи

БОГУНОВИЧ МИЛЕНА ДРАГОЛЮБОВНА

ЭКСПРЕССИЯ И ФУНКЦИИ ТОЛЛ-ЛАЙК РЕЦЕПТОРОВ В ЭПИТЕЛИИ КИШЕЧНИКА ЧЕЛОВЕКА

14.00.36 - аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

Москва 2005

Работа выполнена в Государственном учреждении научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи РАМН и медицинском центре Mount Sinai, Нью Йорк, США.

Научный руководитель:

доктор биологических наук А.Н. Наровлянский

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор Л.В. Урываев

доктор биологических наук, профессор А.В. Санин

Ведущая организация:

ГУ НИИ вирусных препаратов им. ОТ. Анджапаридзе РАМН

Диссертационного Совета Д 001.007.01 в ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН (123098, Москва, ул. Гамалеи, 18)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН

Защита состоится

Ученый секретарь Диссертационного совета;

доктор медицинских наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Все многоклеточные организмы колонизированы множеством микробов, формирующих так называемую микрофлору. Более 1013 бактериальных микроорганизмов населяют кишечник, играя жизненно важную роль в физиологической деятельности желудочно-кишечного тракта и обеспечивая организм множеством незаменимых факторов. Установление взаимовыгодных отношений между организмом-хозяином и паразитирующим микробом ведет к формированию симбиотического равновесия (Hooper and Gordon 2001). Метаболизм питательных веществ и органических молекул, поддержание роста кишечного эпителия, индукция процесса васкуляризации, развитие лимфоидной ткани, а также препятствие колонизации патогенных бактерий являются только некоторыми примерами полезного эффекта, оказываемого кишечной микрофлорой (Berg 1995).

Иммунная система в норме обладает свойством относительной толерантности к кишечной микрофлоре. После заселения тканей кишечника новорожденных нормальной бактериальной микрофлорой местная иммунная реакция ограничивается так называемым "физиологическим воспалением", проявляющимся в необратимой инфильтрации слизистой кишечника лейкоцитами, формировании лимфоидных фолликулов и создании эпителильного барьера в результате усиления межэпителиальных взаимодействий (Maaser and Kagnoff 2002). Вследствие установления биологического равновесия между бактерильной флорой и организмом хозяина жизнедеятельность кишечной микрофлоры ограничивается кишечным просветом.

В отличие от нормальной микрофлоры, большинство бактериальных патогенов, поражающих кишечный тракт, обладают способностью проникать в клетки кишечного эпителия, пересекать эпителиальный барьер и заселять подлежащие ткани, вызывая немедленную реакцию со стороны иммунной системы и развитие острого воспаления слизистой кишечника (Sansonetti 2002).

При наличии определенной генетической предрасположенности присутствие бактериальной микрофлоры играет критическую роль в инициации и развитии неспецифических воспалительных заболеваний кишечника, включающих болезнь Крона и неспецифический язвенный колит (Podolsky 2002). Данная группа заболеваний характеризуется формированием хронического воспаления кишечника, главной причиной которого считается неадекватный ответ иммунной системы к кишечной микрофлоре (Farrell and LaMont 2002).

Понимание механизмов взаимодействия кишечной микрофлоры с иммунной системой хозяина представляет как высочайший научный, так и клинический интерес. Ключевые факторы, сдерживающие постоянный натиск бактериальной микрофлоры, но быстро реагирующие на инвазию бактериальных патогенов, остаются практически не изученными. Учитывая недавнее открытие семейства Толл-лайк Рецепторов (Toll-like Receptors - TLR), специализирующихся на распознавании бактериальных компонентов, целью исследования явилось изучение экспрессии и функций TLR на кишечном эпителии - клеточной популяции, первой вступающей в контакт с кишечными бактериями.

Для реализации данной цели были поставлены следующие задачи:

1. охарактеризовать экспрессию TLR1 - TLR5 в эпителии кишечника человека;

2. базируясь на результатах экспрессии TLR в первичном эпителии, создать модель in vitro на основе клеточной линии эпителия кишечника, экспрессирующую функциональные TLR;

3. на базе созданной клеточной модели охарактеризовать специфичность эпителиальных TLR как к изолированным бактериальным компонентам, так и к интактным бактериальным энтеропатогенам.

4. на базе созданной клеточной модели оценить чувствительность эпителиальных TLR к кишечной микрофлоре;

5. определить потенциальные гены-мишени для эпителиальных TLR.

Научная новизна и практическая значимость

Дана характеристика экспрессии TLR1, TLR2 и TLR4 в кишечном эпителии. Впервые выявлена дифференцированная субпопуляция клеточного эпителия, коэкспрессирующая TLR1, TLR2 и TLR4 и принадлежащая к энтероэндокринной линии.

Впервые показано, что функциональная синергия между TLR1 и TLR2 базируется на физическом взаимодействии двух молекул.

Впервые при помощи экспериментальной модели in vitro, созданой на базе клеточной линии эпителия кишечника человека, определена специфичность TLR1/TLR2, TLR2/TLR6 и TLR4/MD2 к грам-положительным и грам-отрицательным кишечным патогенам.

Впервые с использованием той же экспериментальной модели проведена оценка чувствительности TLR1/TLR2, TLR2/TLR6 и TLR4/MD2 к кишечной микрофлоре.

Впервые охарактеризованы гены-мишени для экспрессированных в клеточной линии эпителия человека TLR1/TLR2, TLR2/TLR6 и TLR4/MD2.

На основе полученных результатов была предложена новая концепция о роли эпителиальных TLR в иммунном ответе слизистых кишечника.

Апробация работы. Результаты работы доложены на международных конференциях Digestive Disease Week, Сан Диего, США, май 2000; CCFA Signal Transduction Workshop, Амилия айлэнд, Флорида, США; декабрь 2000, FASEB, Орландо, США, апрель 2001; Cytokines and Interferons, Турин, Италия, October 2002; Digestive Disease Week, Новый Орлеан, США, май 2004. Материалы диссертации обсуждены на научной конференции отдела интерферонов ГУ НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи РАМН 2 ноября 2004 года.

Публикации. По результатам диссертации опубликовано 4 работы. Структура и объем диссертации: диссертация состоит из введения, трёх глав обзора литературы, описания материалов и методов, трех глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы (124 зарубежных и 2 отечественных источников). Работа изложена на 115 страницах, иллюстрирована 15 рисунками и двумя схемами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Культуры клеточных линий и реагенты для их культивирования. В

данной работе использовались эмбриональная клеточная линия человека 29 3Т и клеточная линия со свойствами эпителия толстого кишечника САСО-2. Клеточные линии были приобретены в American Tissue Culture Collection (ATCC), США.

Для клеточной активации применялись липополисахариды (ЛПС; Sigma, США), выделенные в промышленных условиях из Salmonella typhimurium (содержание протеина <3%) или S. enteritidis (содержание протеинов <1%; RNA <1%). Стандартный ЛПС (стЛПС) приобретенный в Sigma, был дополнительно очищен в лабораторных условиях методом модифицированной фенольной экстракции в соответствии с ранее опубликованным протоколом (Hirschfeld, Ma et al. 2000).

Векторы экспрессии и последовательности кДНК. Плазмиды рМВ1, содержащие дикий тип генов TLR1 и TLR4 человека, содержащие HA-tag, были предоставленны Феликсом Рандоу (Felix Randow, Harvard Medical School, США). Дикий тип гена MD2 человека, включающего FlagHis6-tag и клонированного в плазмиду pEF-BOS, был предоставлен Кенсуке Мияке (Kensuke Miyake, Saga Medical School, Япония). Дикий тип гена TLR2 человека, несущий gD-tag, а также доминантно-негативная форма гена TLR2 человека (dnTLR2), клонированные в плазмиду RKN, были предоставлены Полом Годовским (Paul Godowsky, Genentech, США). Дикий тип гена TLR6 человека, содержащий myc-tag и клонированный в плазмиду pEF-BOS, был предоставлен Шизуо Акира (Shizuo Akira, Osaka University, Япония)

Гены-репортеры. Плазмидный вектор, несущий мультимеризованный элемент NF-кВ IgK, клонированный в непосредственной близости с геном люциферазы, был предоставлен Адрианом Тингом (Adrian Ting, Mount Sinai School of Medicine, США). Плазмида pCMVß, содержащая г Р-гаяастоЗДДОЫ, л а приобретена в Clontech, США. "Пустой" вектор pCDNA3 был приобретен в Promega, США.

Транзиторная экспрессия генов в клеточных культурах, стимуляция клеток и анализ клеточной активации. Клеточные линии 293Т и САСО-2 культивировались в 24-х луночных планшетах. В момент достижения неполного монослоя культивируемые клетки были подвержены транзиторной трансфекции при помощи коммерческого набора Lipofectamine PLUS (Invitrogen, США) в соответствии с протоколом изготовителя. Для трансфекции клеточной линии 293Т были использованы следующие плазмиды: TLR1 - 0.085-0.00085 Hgfrnl (оптимальная концентрация 0.085 Jlg/ml), TLR2 - 0.005 Hg/ml, TLR4 - 0.0850.00085 (ig/ml; гены-репортеры pCMV-ß-галактозидаза (0.01 ^ig/ml) и NF-KB-люцифераза (0.01 pg/ml). Чтобы стандартизировать реакцию трансфекции, конечная концентрация плазмидной ДНК доводилась до 1 (lg/ml путем добавления "пустого'1 вектора pCDNA3. Клеточная линия САСО-2 была подвержена трансфекции плазмидами в следующих концентрациях: TLR1 - 0.15-0.0015 ng/ml (оптимальная концентрация 0.015 |ig/ml), TLR6 - 0.15-0.0015 |xg/ml (оптимальная концентрация 0.015 (ig/ml), TLR2 - 0.01-0.001 nl/mg, dnTLR2 - 0.4 ng/ml, TLR4 -0.01 ng/ml и MD2 - 0.05 (ig/ml; гены-репортеры pCMV-ß-галактозидаза (0.35 Hg/ml), NF-icB-luciferase (0.1 ng/ml), IL-8-люцифераза (0.1 (ig/ml); а также "пустой"

вектор pCDNA3 (конечная концентрация плазмидной ДНК1 Hg/ml). Через 16 часов после окончания трансфекции в клеточные культуры были добавлены отдельные компоненты бактериальных клеточных стенок (ЛПС или ПГН) или бактериальные суспензии Salmonella paratyphi, Shigella flexnerii, Listeria monocytogenes, дикого (H44/76) и мутантого (pLAK33) штаммов Niesseria meningitides или кишечной микрофлоры. Через 8 часов после начала стимуляции/инфекции клетки были лизированы в 100 ц1 лизирующего буфера (Reporter Lysis Buffer, Promega, США), и люциферазная активность была измерена при помощи люминометра (Turner Designs Luminometer TD20/20, Promega, США) с применением соответствующего набора (Luciferase Assay System, Promega, США). Люциферазная активность была нормализована относительно отражающей эффективность трансфекции активности ß-галактозидазы в том же клеточном лизате (Zhu, Gagnidze et al. 2001). Отношение двух параметров - люциферазной и р-галактозидазной активностей - было использовано для статистического анализа. Одновременно проводилось 4-6 экспериментов (см. описания к рисункам). Каждый элсперимент повторялся четыре раза. На рисунках представлены результаты статистической обработки одного из четырех повторов.

Бактериальные штаммы и их культивирование. В данной работе использовались следующие бактериальные кишечные патогены: Salmonella paratyphi серотип 5а (Клинический изолят, Stephen Jenkins, Mount Sinai School of Medicine, США), Shigella flexnerii серотип 2a (ATCC #25875), Listeria monocytogenes (Hao Shen, University of Pennsylvania, США), Neisseria meningitides (дикий штамм и мутантный штамм с отсутствующим ЛПС (van der Ley, Steeghs et al. 2001)). Бактериальная масса, ресуспендированная в фосфатном буфере, хранилась при -80°С. При использовании инактивированных патогенов, бактериальная суспензия была разморожена и инактивирована путем нагревания. Инактивация патогенов была подтверждена путем повторного посева бактериальных суспензий.

Бактериальная инфекция клеточных культур. САСО-2, культивированные в 24-х луночных плашках, были стимулированы инактивированными бактериальными суспензиями, содержащими 1x105 CFU/ml S. parctvphi, lx105 CFU/ml S. flexnerii, lxlO6 CFU/ml L. monocytogenes или lx102 -1x10 CFU/ml N. menigitidis. В случае инфекции САСО-2, культивируемые в среде без антибиотиков, инфицировались 1x10 CFU/ml S. flexnerii (свежевыращенные), 1x10s СЮ/ml S. paratyphi (свежевыращенные) или 1x10 CFU/мл L. monocytogenes (из замороженной суспензии). Оптимальные концентрации бактерий были предварительно определены для каждого типа инфекции, и дальнейшее увеличение количества патогена вело к гибели эпителиальных клеток (данные не показаны). С целью предотвращения излишнего бактериального роста в клеточную среду был добавлен гентамицин через час после инфекции (10 (ig/ml, Boehringer-Mannheim, Германия).

Метод коиммунопреципитации и Western blot. Клеточная линия 293Т, выращиваемая в 20 миллилитровых плашках до уровня неполного монослоя, была трансфецирована плазмидами, экспрессирующими TLR1 или TLR2, или их комбинацией (TLR1+TLR2). Пустой вектор pcDNA3 был добавлен до общего содержания плазмидной ДНК 5 Hg. Через 48 часов после трансфекции клетки были

лизированы для получения полного клеточного экстракта. Ядерная фракция была удалена путем центрифугирования. Для преципитации TLR2, полученные супернатанты инкубировались с 2 pg антител против TLR2. Для преципитации TLR1 плазмидного происхождения было использовано 2 (xg антител против HA-tag - маркера для TLR1. Для преципитации эндогенного TLR1 было использовано 2 [ig антител против TLR1, реагирующих с N-концом молекулы TLR1. В качестве контроля использовалось 10 |ig очищенного IgG того же изотипа, что и специфические антитела. Иммунные комплексы преципитировались при помощи гранул сефарозы, покрытых протеином G. После нескольких повторных промываний преципитированные комплексы были диссоциированы от гранул сефарозы и анализированы методом Western blot Протеины, входящие в состав иммунных комплексов, были разделены путем электрофореза (SDS-PAGE) и перенесены на нитроцеллюлозную мембрану. Для детекции TLR1 мембрана подверглась блотингу антителами против TLR1 или НА. Лизаты клеточной линии 293Т, трансфецированные плазмидами TLR1 или TLR2, были использованы в качестве положительного контроля. Затем мембраны были проявлены.

Метод иммуногистохимии и иммунофлюоресции. Морфологически сохранные ткани тонкого и толстого кишечника, полученные в результате хирургического вмешательства с целью удаления опухолевых образований кишечника, были зафиксированы в 10% формалине и заключены в парафин. Гистологические срезы ларафинизированных тканей были депарафинизированны в ксилене, регидрированы в этаноле с уменьшающейся концентрацией и обработаны в микроволновой печи раствором цитрата натрия (Antigen Unmasking Solution, Vector Laboratories, США) в течение 15 минут, после чего слайды подверглись либо одинарному, либо двойному окрашиванию антителами против TLR1-5 человека (Santa Cruz Biotechnologies, США), маркера кишечного эпителия мультикератина человека (цитокератины 4/5/6/8/10/13/18, Novocastra, Великобритания), маркера энтероэндокринных клеток серотонина (NCL-SEROTp, Novocastra, Великобритания). Одинарное окрашивание проводилось с антителами против TLR1-5. Двойное окрашивание проводилось с комбинацией антител против TLR1 + TLR2, TLR1 + TLR4, TLR2 + мультикератина, TLR1 + серотонина, TLR2 + серотонина. В случае окрашивания клеточной линии 293Т, клетки, выращиваемые на слайдах с лунками, были подвержены транзиторной трансфекции для экпрессии TLR1, TLR2, TLR4 или "пустого" BeKTopapcDNA3 (общее количество плазмидной ДНК - 1 ng/ml). Через шестнадцать часов после трансфекции слайды были зафиксированы в 10% формалине и окрашены антителами против TLR1, TLR2 или TLR4 в соответствии с протоколом для одинарного окрашивания. С целью подтверждения специфичности иммуногистохимической реакции, перед началом окрашивания первичные антитела были предварительно нейтрализованы пептидом, блокирующим активный центр данного антитела. Антитела против TLR1 и TLR2 инкубировались с соответствующим блокирующим пептидом (Santa Cruz Biotechnologies, США). После инкубации с первичными антителами использовались соответствующие вторичные антитела, меченные биотином, щелочной фосфатазой или флюорофором (Texas Red, FITC). После инкубации с антителами, меченными биотином, последовательно использовались стрептавидин с пероксидазой хрена и раствор DAB (immunoCruz Staining System, США). Перед

началом окрашивания слайды погружались в 0.3% Н2О2 в метанол (10 мин.) с целью подавления активности эндогенной пероксидазы. Если вторичные антитела были мечены щелочной фосфатазой, слайды блокировались раствором левамизола и затем окрашивались при помощи соответствующего набора (Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit I, Vector Laboratories, США). Если первичные антитела было непосредственно мечены биотином (TLR1), в качестве вторичного маркера применялся стрептавидин, связанный с флюорохромом. Для отрицательного контроля было проведено параллельное окрашивание очищенными изотипическими IgG (простыми или меченными биотином) с соответствующими вторичными антителами, Слайды были визуализированы при помощи флюоресцентного микроскопа (Olympus BX60), подсоединенного к цифровому фотоаппарату (Optronix) или при помощи конфокального микроскопа.

Метод обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (RT-PCR). Для характеристики экспрессии TLR в клеточных линиях 293Т и САСО-2, была изолирована общая РНК. 2.S Jig РНК было использовано для реакции обратной транскрипции. PCR с полученной кДНК была проведена с использованием Taq-полимеразы и праймеров для TLR1, TLR2, TLR4, TLR6 и MD2. Праймеры для TLR1, TLR2 и TLR6 реагировали с геномной ДНК. Поэтому для исключения контаминации выделенной РНК геномной ДНК одновременно была проведена реакция обратной транскрипции с отсутствием обратной транскриптазы. Результаты соотносились с уровнем экспрессии гена Для

определения уровня экспрессии генов цитокинов и хемокинов в ответ на стимуляцию TLR, клетки САСО-2 выращивались в шести-луночных планшетах и трансфецировались плазмидами, экпрессирующими TLR1 (0.015 ^g/ml), TLR6 (0.015 Hg/ml), TLR4 (0.01 Jlg/ml) и MD2 ( 0 ц£/пй)в комбинации с pCDNA3 (до общего содержания плазмидной ДНК 1 ng/ml). Через шестнадцать часов после трансфекции в клеточную среду был добавлен 1 Hg/m] стЛПС или 1 Hg/ml ПГН. Клетки были лизированы через 4 часа после трансфекции. Моноциты были выделены из мононуклеарной клеточной массы периферической крови методом адгезии к пластику в соответствии с описанным ранее протоколом (Sherris, Stohl et al. 1989). Выделенные моноциты переносились в шести-луночные планшеты (1x106 клеток/ml) и стимулировались 1 Hg/ml стЛПС. Через 4 часа после начала стимуляции клетки были лизированы для выделения общей РНК. 2.5 |lg РНК использовалось для реакции обратной транскрипции. Полученная кДНК подвергалась амплификации методом PCR с использованием праймеров, специфичных к IL-8, МСР-1, IP-10, IL-1B, IL-12 р40 и р-актину. Олигонуклеотиды, используемые в качестве праймеров, были моделированы в соответствии с последовательностями кДНК, опубликованными базой данных генного банка Genebank. Последовательности для праймеров TLR6 и MD2 были предоставлены Дэниэлом Подольски (Daniel К. Podolsky, Harvard Medical School, Boston, США). Праймеры для 1L-8 были ранее опубликованы (Eckmann, Jung et al. 1993), праймеры для МСР-1 были произведены в Biosource (Camarillo, США).

Определение уровня продукции цитокинов методом ELISA. САСО-2, культивированные в 24-х луночных планшетах, были трансфецированы плазмидами, экспрессирующими TLR1 (0.015 ^ig/ml), TLR6 (0.015 TLR4

(0.01 (Ig/ml) и MD2 ( 0 Hg/0ll5, а также pCDNA3 до конечной концентрации

плазмидной ДНК 1 Jig/ml. Через шестнадцать часов после трансфекции в клеточную среду были добавлены 1 (Xg/ml стЛПС или 1 (Jg/ml ПГН. Через пятнадцать часов после стимуляции клеточные супернатанты были собраны, и количество IL-8 и IL-1P в супернатантах было измерено методом ELISA при помощи стандартных наборов (BD Biosciences Pharmingen, США) с использованием 96-луночных планшетов для ELISA (BD Biosciences Pharmingen, США) в соответствии с протоколом производителя. Концентрации были определены при помощи автоматического измерителя оптической плотности на аппарате nQUANT и программы К4 (ВЮ-ТЕК Instruments, США). Статистическая обработка данных. Во время исследования использовались варианты количественного анализа. При расчетах, произошедших в одной группе до и после добавления использовался параметрический (парный критерий

Стьюдента). Расчет статистических параметров (среднее значение и стандартное распределение) осуществлялся в программе Exel (Microsoft).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Характеристика экспрессии TLR в эпителии кишечника человека.

Легшее в основу данной работы определение экспрессии TLR в кишечном эпителии человека методом иммуногистохимии выявило высоко-дифференцированную эпителиальную субпопуляцию, коэкспрессирующую TLR1, TLR2 и TLR4. Она продуцирует серотонин и принадлежит к энтероэндокринной линии. Данная популяция характеризуется внутриклеточным распределением TLR у базального полюса и редуцированной апикальной частью.

Для иммуногистологического анализа использовались антитела против TLR1-5. В случае использования антител против TLR3 и TLR5 окрашивание полностью отсутствовало как в эпителиальном монослое, так и в собственной пластинке, что может быть объяснено отсутствием экспрессии TLR3 и TLR5 в слизистой кишечника или низкой реактивностью данных антител к соответствующему антигену. Положительная реакция была выявлена при окрашивании антителами против TLR1, TLR2 и TLR4. Специфичность антител против TLR1, TLR2 и TLR4 была подтверждена рядом экспериментов. Окрашивание отсутствовало, если специфические первичные антитела против TLR1, TLR2 и TLR4 были заменены контрольными изотопическими иммуноглобулинами. Более того, иммунореактивность антител против TLR1 и TLR2 элиминировалась после инкубации данных антител с соответствующими блокирующими пептидами. В качестве дополнительного контроля, подтверждающего специфичность антител против TLR1, TLR2 и TLR4 была использована клеточная линия 29 3Т, трансфецированная векторами экспрессии TLR1, TLR2, TLR4 или пустым вектором. Коэкспрессия TLR1 с TLR2, а также TLR1 с TLR4 в одной и той же клеточной популяции была демонстрирована методом двойной иммунофлюоресценции. Колокализация окрашивания TLR2 и маркера кишечного эпителия мультицитокератина (цитокератины 4/5/6/8/10/13/18) подтвердила факт принадлежности TLR1-, TLR2- и ТLR4-положительной субпопуляции к кишечному эпителию. Колокализация TLR1 или TLR2 и маркера энтероэндокринных клеток серотонина была определена методом двойной иммунофлюоресценции. В результате данного эксперимента было выявлено, что

экспрессирующие серотонин клетки присутствуют в эпителии как тонкого (ileum), так и толстого (colon) кишечника, что соответствует распределению серотонин-продуцирующих энтероэндокринных клеток (Turvffl, Mourad et al. 1998; Farthing 2000); при этом, наличие серотонина колокализовалось с экспрессией как ^R1 так и TLR2.

Однослойный эпителий кишечника изолирует лимфоидную ткань слизистой от бактериальной флоры кишечного просвета. В то время как функции TLR на антиген-презентирующих клетках достаточно хорошо изучены, вовлеченность TLR в бактериально-эпителильные взаимодействия остается спорной. Чтобы предотвратить хроническое воспаление слизистой кишечника в результате взаимодействия эпителильных TLR с бактериальной микрофлорой, эпителий должен игнорировать присутствие бактерий-симбиотов при сохранной чувствительности к кишечными патогенами. Феномен эпителиальной толерантности может быть объяснен несколькими гипотезами:

1) изначальный контакт эпителия с микрофлорой во время колонизации кишечника может вызывать состояние толерантности вследствие снижения экспрессии TLR и продукции молекул, блокирующих сигнальный каскад TLR (Cario, Gcrken et al. 2002);

2) базальная экспрессия TLR в эпителиальном монослое может вести к избеганию контакта с бактериями кишечного просвета, и взаимодействию только с патогенами, пересекающими эпителиальный барьер (Hershberg 2002);

3) эпителиальные клетки обладают неизвестным механизмом дифференцировки между нормальной микрофлорой и бактериальными патогенами (Backhed and Hornef 2003).

Данное исследование подтверждает вторую гипотезу: дифференцированная субпопуляция кишечного эпителия характеризуется внутриклеточным распределением TLR у базального полюса и редуцированной апикальной частью, снижающей контакт с кишечным просветом.

Попытки охарактеризовать экспрессию TLR в кишечном эпителии были предприняты ранее. Так, в одной работе TLR2 и TLR4 "практически не определялись" на эпителиальных клетках толстого кишечника человека, в то время как апикально-цитоплазматическая экспрессия TLR3 и TLRS присутствовала на эпителиоцитах. При наличии хронического воспаления, свойственного неспецифическим воспалительным заболеваниям кишечника (болезнь Крона и неспецифический язвенный колит), наблюдалось повышение экспрессии TLR4 и снижение экспрессии TLR3, в то время как уровень экспрессии TLR2 и TLR5 оставался неизменным (Cario and Podolsky 2000). В другом исследовании экспрессия TLR2 и TLR4 отсутствовала в эпителии как нормального, так и воспаленного кишечника, и наличие TLR определялось исключительно в макрофагах lamina propria (Hausmann, Kiessling et al. 2002). Определение TLR4 в изолированных криптах тонкого кишечника мыши показало внутриклеточную экспрессию TLR4 в эпителиоцитах (Homef, Frisan et al. 2002). В другом исследовании было показано, что в эпителии кишечника мыши экспрессия TLR4 варьирует с наибольшим уровнем экспрессии в дистальном отделе толстого кишечника. TLR4 определялся на апикальной поверхности эпителия, расположенного в основании кишечных крипт (Ortega-Cava, Ishihara et al. 2003).

Толерантность изолированных эпителиоцитов к бактериальной стимуляции (Panja, Blumberg et al. 1993; Naik, Kelly et al. 2001) затрудняет объяснение физиологической значимости такой экспрессии TLR, но соответствует результатам данной работы: только небольшая высоко специализированная субпопуляция эпителия толстого и тонкого кишечника способна реагировать на активацию РАМР, в то время как эпителиоциты выполняют барьерную и транспортную фукции, проявляя устойчивость к бактериальным стимулам кишечного просвета. Более того, результаты данной работы коррелируют с исследованием экспрессии TLR4 в слизистой желудка. В соответствии с данной работой, TLR4 определялся в нормальной слизистой желудка как в избирательных клетках эпителия, так и мононуклеарных лейкоцитах lamina propria (Ishihara, Rumi et al. 2004).

Морфологические особенности TLR-экспрессирующей эпителиальной субпопуляции демонстрируют её потенциальную вовлеченность в реакции естественного иммунитета. Помимо экспрессии TLR1, TLR2 и TLR4, не исключено наличие и других членов семейства TLR в данном типе клеток.

Биологическая роль совместной экспрессии TLR1, TLR2 и TLR4. Функциональные исследования с использованием клеточной модели, а также ряд параллельных экспериментов по совместной иммунопреципитации TLR1, TLR2 и TLR4 показали, что совместная экспрессия TLR1 и TLR2 ведет к функциональной синергии, базирующейся на физическом взаимодействии двух молекул, что демонстрирует существование рецепторной пары TLR1/TLR2 (Рисунок 1). TLR функционируют в качестве гомо- и гетеродимеров (Ozinsky, Smith et al. 2000; Wyllie, Kiss-Toth et al. 2000; Takeuchi, Kawai et al. 2001; Alexopoulou, Thomas et al. 2002; Takeda, Takeuchi et al. 2002; Zhang, Tay et al. 2002). Гетеродимерные взаимодействия между TLR1 и TLR2 были продемонстрированы и в данной работе. В частности, было показано, что функциональная синергия между TLR1 и TLR2 базируется на физическом взаимодействии двух молекул. Кристаллографический анализ подтверждает формирование рецепторного комплекса TLR1/TLR2 (Xu, Тао etal.2000).

РИСУНОК I. TLR1 ассоциируется с TLR2. А. Совместная экспрессия TLRI и TLR2 в клеточной линии 293Т ведет к физическому взаимодействию двух молекул. Клеточная лини* 293Т была трансфецирована пустым вспором или векторами экспрессии TLR1 и TLR2 (в комбинации TLR1+TLR2 млн ло-отделыюсти). Через 48 чао» после трансфекции клетки были лизированы, и (легочные лизаны были инкубированы с антителами против TLR2 с целью преципитации трансгенного TLR2, или антителами против НА дм преципитации трансгенного TLR1, содержащего HA-tag. Преципитированные иммунные комплексы были диссоциированы и разделены при помощи SDS-PAOE с последующим иммуноблотом антителами против TLR2 (для определения TLR2) и НА (дм определения TLR1). Клеточные люаты, инкубированные с изотопическими иммуноглобулинами, были использованы в качестве отрицательного контроля (IgG козы, IgG мыши). Непреципитированные лизаш клеток 293Т (20 fir общего белка), трансфецированные векторами экспрессии TLR1 и TLR2, служили положительным контролем. Б. Экспрессия TLRI, TLR2, TLR4 и TIM ниточными линиями 293Т и СЛСО-2. Экспрессия генов TLRI, TLR2, TLR4, TLR6 и р-ажтина была определена путем обратной транскрипции обшей РНК, изолированной из 293Т и САСО-2, с последующим проведением PCR с использованием TLRI-, TLR2-, TLR4- и Т1Л6-специфичных праймеров. Праймеры для TLRI, TLR2 и TLR6 не захватывают итрон и связываются как с кДНК так и геномной ДНК. Поэтому, чтобы подтвердить отсутствие контаминации изолированной общей РНК геномной ДНК, паралельно обычной реакции обратной транскрипции (RT+) была проведена реакция обратной транскрипции в отсутствии обратной траискрштгазы (RT-). РНК, изолированная из моноцитврной клеточной линии ТНР-1, была использована в качестве положительного контроля. В. В клеточной линии 293Т

Создание модели in vitro на основе клеточной линии эпителия кишечника, экспрессирующей функциональные TLR Др)гой член семейства TLR родственный TLR1, - TLR6 - также способен образовывать рецепторную пару с TLR2 (Ozinsky, Smith et al 2000, Ozinsky, Underbill et al 2000, Wyliie Kiss Toth et al 2000, Sandor Latz et al 2003) Присутствие мРНК для TLR6 было зарегистрировано в изолированном первичном эпителии кишечника человека (Melmed Thomas et al 2003) Учитывая биологию TLR2 и TLR4 было сдеаано предположение, что TLR1/TLR2, TLR2/TLR6 и TLR4/MD2 являются функцинольными комбинациями TLR в кишечном эпителии и, вероятно вовлечены в распознавание кишечных патогенов

Как показали резутьтаты RT-PCR клетки САСО-2 экспрессируют TLR2 при отсутствии других членов семейства TLR TLR1, TLR6 TLR4 и MD 2 Более того клеточная линия кишечного эпителия САСО-2 не чувствительна к СТИМУЛЯЦИИ бактериальными компонентами ЛПС (грам-отрицательные бактерии) и ПГН (грам положительные бактерии) Чтобы получить рецепторную пару TIR1/TLR2 (РИСУНОК 2А) САСО-2 были транзиторно трансфецированы вектором экспрессии TLRI Для экспресии TLR2/TLR6 (Рисунок 2Б), САСО 2 были трансфецированы вектором экспрессии TLR6 С целью получения комбинации TLR4/MD2 (Рисунок 2В) бьпа произведена совместная трансфекция плазмидных векторов

экспрессирующих TLR4 и MD2. Одиночная трансфекция плазмидных векторов, экспрессирующих TLR2, TLR4 и MD-2 была использована в качестве контроля. Клеточный ответ оценивался в результате измерения люциферазной активности клеточных лизатов вследствие активации гена-репортера NF-кВ-зависимой

люциферазы. Для стимуляции клеток были использованы компоненты как грам-отрицательных (стЛПС, Salmonella typhimurium), так и грам-положительных (ПГН, Staphylococcus aureus) бактерий. СтЛПС служил источником лигандов как для TLR1/TLR2, так и TLR4/MD2. ПГН, распознаваемый TLR2/TLR6 (Ozinsky, Underbill et al. 2000), был использован в качестве альтернативного лиганда. Чтобы доказать, что эндогенный TLR2 вовлечен в функциональные взаимодействия с трансгенными TLR1 или TLR6, доминантно-негативная форма TLR2 (dnTLR2), блокирующая трансдукцию сигнала, исходящего от TLR2 (Yang. Mark et al. 1999), была экспрессирована совместно с TLR1 или TLR6. Экспрессия dnTLR2 значительно уменьшила TLR1- и ТLR6-зависимую активацию САСО-2 (Рисунок 2Д,Е,Ж).

РИСУНОК 2. Трмсгенные TLR1 или TLR2, экспрессированные в клеточной линии САСО-2, формируют рецепторвые пары TUU/TUU ■ TLR2/TLR6 с эндогенным TLR2.

А, Б, В. Трансгенная экспрессия TLR1, TLR2. TLR6, TLR4 и MD2 в щеточной линии САСО-2 САСО-2 были транзкторно трансфецированы вектором экспрессии гена-репортера NF-кВ-зависимой люциферазы независимо или совместно с TLR1, TLR2, TLR6, TLR4, MD2 или комбинацией TLR4 и MD2. Через 1$ часов после трансфекции клетки были стимулированы 1 цг /ил стЛПС (А, В) или 1 цг/мл ПГН (Б). Данные представлены в виде степени индукции (количество раз) люциферазной активности лизатов стимулированных клеток по отношению к нестомулированному контролю через 8 часов после начала стимуляции. Уровень люциферазной активности нормализован к уровню ß-галаггозцдазной активности в одном и том же клеточном лизаге Каждая точка представляет среднее значение + стандартное распределение четырех экспериментов

Г. Схематическое изображение гипотезы трансгенные TLR1 и TLR6 формируют рецепторные пары с эндогенным TLR2.

Д, Е, Ж. Трансгеиная экспрессия доминантно-негативного TLK2 предотвращает TLR1- и ТиМ-зависимую активацию NF-кВ Клеточная линия САСО-2 была транзиторно трансфецирована вектором, несущим ген NF-кВ-зависимой люциферазы, в комбинации с векторами экспрессии TT.R1 (Д), TLR6 (Е) или TLR4 и MD2 (Ж) с добавлением гшазмиды, экспрессирующей доминантно-негативный TLR2 (dnTLR2) Через 16 часов после трянсфекции клетки были активированы 1 рг/мл стЛПС (Д, Ж) или 1 рг/мл ПГН (Е) и люироваяы через 8 часов после начала стимуляции Данные представлены в виде процента ЛПОПГН-индуцнрованной активности NF-kB (*), (**) р<0001 Каждая точка представляет среднее значение+стандартное распределение шести экспериментов

Специфичность эпителиальных TLR к изолированным бактериальным компонентам и к интактным бактериальным кишечным патогенам. Лиганды как естественного, так и бактериального происхождения были определены для большинства TLR (Medzhitov 2001), при этом специфичность TLR к интактным бактериальным патогенам остается практически не охарактеризована. Ранние исследования по изучению функций TLR выявили, что TLR2 обладает реактивностью к целому ряду бактериальных продуктов. Позднее было показано, что TLR2 активируется грам-положительным стафилококком (Yoshimura, Lien et al. 1999; Takeuchi, Hoshino et al. 2000). Отрытие гетеродимерных взаимодействий между TLR2 и TLR1 или TLR6 потребовало более детального изучения специфичности различных комбинаций TLR. Результаты данного исследования, сфокусированного на функциях TLR1/TLR2, TLR2/TLR6 и TLR4/MD2, демонстрируют, что различные комбинации TLR способны дискриминировать между грам-отрицательными и грам-положительными бактериями. TLR4/MD2 взаимодействует с грам-отрицательными Salmonella и Shigella (Рисунок ЗВ), в то время как специфичность TLR2 зависит от того, с каким партнером он димеризуется. Аналогично TLR4/MD2, TLR1/TLR2 распознает грам-отрицательные бактерии (Рисунок ЗА). TLR2/TLR6 специфичен к грам-положительной Listeria (Рисунок ЗБ).

РИСУНОК 3. Реиепторные пары TLR1/TLR2 (CACO-2/TLR1) я TLR4/MD2 (САСО-2/TLR4+MD2) ркпошнот грам-фтршителшые Salmonella paratyphi и Shigella JlexKertl,

TLR2/TLR6 (CACO-2/TLR6) распознают грам-положительную Listeria monocytogenes. Клеточная линия САСО-2 была трансфецирована векторами экспрессии 1LR1 (CACO-2/TLR1, А), TLR6 (CACO-2/TLR6, Б) или TLR4 и MD2 (CACO-2/TLR4+MD2, В) совместно с вектором, несушим ген NF-кВ-зависимой Люциферам. Через ¡6 часов после трансфекции клепт были инфицированы (Жив.) Salmonella paratyphi (1x10' CFU/мл), Shigella flexnerii (1x10s CFU/мл), listeria monocytogenes (lxlO7 CFU/мл) или стимулированы таким же количеством инактивированиых (Инакт.) патогенов. В качестве положительного контроля клетки были активированы 1 цг/мл стЛПС (А, В) или 1 цг/мл ПГН (Б). Данные представлены в виде степени индукции (количество раз) люциферазиой активности лизатов стимулированных клеток по отношению к нестимулированному контролю через 8 часов после начала стимуляции. Уровень люциферазиой активности нормализован к уровню р-галактозидазной активности в одном и том же клеточном лизате. Каждая точка представляет среднее значение + стандартное распределение четырех экспериментов.

Сравнение специфичности тестируемых комбинаций TLR к изолированным компонентам клеточных стенок грам-положительных и грам-отрицдтельных микроорганизмов показало, TLR1/TLR2 и TLR4/MD2 отвечают на стимуляцию стЛПС в аналогичном интервале концентраций (10 ng/ml - 10 g/ml; Рисунок 4А,В). TLR2/TLR6 активируется ПГН (Рисунок 4Б).

РИСУНОК 4 Рецелторные пары TLR1/TLR2 (CACO-2/TLR1) н TLR4/MD2 (САСО-2/TLR4+MD2) распознают стЛПС, TUR2/TLR6 (CACO-2/TLRi) специфичен к ПГН. САСО-2 были трансфецированы векторами экспрессии TLR1 (CACO-2/TLR1, A), TLR6 (CACO-2/ILR6, Б) или TLR4 в комбинации с МВД (CACO-2/TLR4+MD2, В) совместно с вектором, несущим ген NF-кВ-зависимой люциферазы. Через 16 часов после трансфекции клетки были активированы стЛПС в интервале концентраций 0.001-100 цг/мл ПГН в интервале концентраций 001-25 цг/мл. Данные представлены в виде степени индукции (количество раз) люциферазиой активности лизатов стимулированных клеток по отношению к нестимулированному контролю через S часов после начала стимуляции. Уровень люциферазиой активности нормализован к уровню р-галактозидазной

А

Б

В

'1

m слсо-гтлитог

.7 » .

Интересно, что ПГН является общим компонентом как для грам-положительных (множественные слои, формирующие внешний покров), так и для грам-отрицательных (одиночный слой, покрытый клеточной мембраной) микроорганизмов. Тем не менее, TLR2/TLR6 обладает низкой чувствительностью к грам-отрицательным патогенам. Это может быть объяснено позицией лиганда в бактериальной клеточной стенке и его доступностью для рецептора. Хотя структурные различия между ПГН грам-положительных и грам-отрицательных бактерий также могут иметь значение. TLR4/MD2 и TLR1/TLR2 распознают грам-отрицательные бактерии, но обладают специфичностью к различным компонентам грам-отрицательных бактерий. Стимуляция высоко очищенным ЛПС и мутантным штаммом N. meningitides, не способным продуцировать ЛПС, подтвердили, что ЛПС необходим для активации TLR4/MD2. Лиганд для TLR1/TLR2 отличен от ЛПС, и определение его химической природы не входило в цели данной работы. Ранее было показано, что коммерческий ЛПС, приготовленный в промышленных условиях, может быть контаминирован другими компонентами бактериальных клеточных стенок (Hirschfeld, Ma et al. 2000). Среди контаминантов были обнаружены муропептиды (Chamaillard, Hashimoto et al. 2003; Girardin, Boneca et al. 2003), липопротеины и липопептиды. Липопептидная фракция, выделенная из ассоциированных с эндотоксином Shigellaflexneri протеинов, сигнализирует через

TLR2 (Aliprantis, Weiss et al. 2001) и является наиболее вероятным кандидатом на роль лиганда для TLR1/TLR2.

Обращает на себя внимание тот факт, что TLR1ATLR2 и TLR2/TLR6 обладают перекрестной реактивностью к максимальным концентрациям соответствующих лигандов, а в частности, TLR1/TLR2 может активироваться высокими концентрациями ПГН, и наоборот, TLRI/TLR2 активируется максимальными концентрациями ЛПС. Это может быть обьяснено либо структурным сходством между TLR1 и TLR6 (Hajjar, O'Mahony et al. 2001), или присутствием контаминатов, содержание которых при высоких концентрациях основного компонента достигает критического порога. Феномен

кроссреактивности отсутствует, когда TLR1/TLR2 и TLR2/TLR6 активируются живыми патогенами, что может отражать специфичность TLR1/TLR2 и TLR2/TLR6 в физиологических условиях.

РИСУНОК 5. Схематическое обобщение: TLR1/TLR2 н TLR4/MD2 распознают гран-отрицательные бактерии, обладав специфичностью к различным компонентам их клеточных стенок. В противоположность этому, TLR2/TLR6 распознает грам-попожигельные бактерии и составляющую их клеточных стенок ПГН.

TUM UR1 TLR2 TLR2 TU»

Оценка чувствительности эпителиальных TLR к кишечной микрофлоре. Аналогично кишечным патогенам, кишечная микрофлора также способна активировать эпителиальные TLR (Рисунок 6).

рисунок 6. тыи/тии (сасо-г/тгш), тиилъкб (слсо-г/тим) в тим/мш <сасо-

2/ТЬИ4+М02) активируются бактериальной кишечной микрофлорой. Клеточная линия САСО-2 была трансфецирована векторами экспрессии Т1А1 (САСО-2ЛТ_Ю, А), ТЬЯб (САСО-г/ТЬЯб, Б) или Т1Л14 и МБ2 (САСО-2Яии+МЭ2, В) совместно с вектором, несущим ген ЭТ-кВ-зависимой люциферазы. Через 16 часов после трансфекции клетки были стимулированы суспензией кишечных бактерий, изолированных из кишечника мыши и инактивированиых нагреванием (как описано в "Материалах и методах"), в объемном отношении 0.1-10 рл бактериальной суспензии на 1 мл клеточной среды (рл/мл). В качестве положительного контроля клетки были активированы 1 цг/мл

стЛПС (А, В) или 1 цг/мл ПГН (Б). Данные представлены в вине степени индукции (количество раз) люцифсрал ной активности лизатов стимулированных клеток по отношению к нестимулированному контролю через 8 часов после начала стимуляции. Уровень люциферазной активности нормализован к уровню Р-галакгозидазной активности в одном и том же клеточном лизаге. Каждая точка представляет среднее значение + стандартное распределение четырех экспериментов.

А Б

0.1 1 10 eiflnc ИМ

Реактивность эпителиальных TLR к кишечной микрофлоре коррелирует с базальной экспрессией TLR1, TLR2 и TLR4 в первичном эпителии.

Определение потенциальных генов-мишеней для эпителиальных TLR.

С целью определения генов-мишеней эпителиальных TLR, экспрессия индуцицируемых бактериальной инфекцией хемокинов IL-8, МСР-1, IP-10 (Chensue 2001) и цитокинов IL-lp (Burns, Martinon et al. 2003) and IL-12 p40 (Trinchieri 2003) была определена на основе использования экспериментальной модели САСО-2 (Рисунок 7).

РИСУНОК 7. TLR1/TLR2-, T1,R2/TLR6- ■ TLR4/MD2-3aancHMU яктнвацнв клеточной линии САСО-2 «едет к индукции пмокииов IL-S, МСР-1 и IP-16, но не цитокинов IL-lf} aid IL-12 р40. А. Определение зкспрессия мРНК для ILS, МСР-1, IP-10, IL-lf! u IL-12 р40 Клеточная линия САСО-2 была траисфецирована векторами экспрессии TLRI, TLR6, TLR4 в комбинации с MD2 или пустым вектором. Через 16 часов после трансфекции клетки были стимулированы 1 цг/мл стЛПС или 1 |1г/мл ПГН и лизированы через 4 часа после начала стимуляции Моноциты периферической крови (Мф) были стимулированы I цг/мл стЛПС и лизированы через 4 часа после начала стимуляции. Экспрессия 11^8, МСР-1, IP-10,1Ы(! (30 циклов для САСО-2 и 20 циклов для Мф), IL-

12 р40 (30 циклов) и ß-актин (24 цикла) была анализирована методом PCR и< обратно транскрибированной общей РНК. изолированной из каждого клеточного лизата

САСО-2

Использование гена-репортера NF-кВ зависимой люциферазы продемонстрировало, что стимуляция TLR1/TLR2, TLR2/TLR6 и TLR4/MD2 ведет к активации NF-кВ. ЭТО подтверждает общепринятую концепцию о том, что М^88-зависимая активация NF-кВ является общим свойством для всех членов семейства TLR. Существование М^88-независимой активации для TLR3 и TLR4 свидетельствует о существовании дополнительных сигнальных путей (Barton and Medzhitov 2003). Вариации в комбинации тех или иных сигнальных путей могут вести к индивидуальному ответу определенных TLR. Так. адапторная молекула TIRAP вовлечена в Муй88-зависимую активацию TLR2 и TLR4, но не обнаружена в сигнальных каскадах других TLR (Turvill. Mourad et al. 1998). Более того. MyD88-независимые адапгоры TRAM и TRIF вовлечены в сигнальный каскад TLR4, но не TLR2, и отвечают за активацию фактора транскрипции IRF3, индуцирующего продукцию IFN-p (Yamamoto. Sato et al. 2003, Yamamoto. Sato et al. 2003). Несмотря на различия между сигнальными каскадами TLR2 и TLR4. данное исследование демонстрирует, что стимуляция TLR1/1LR2. TLR2/TLR6 или TLR4/MD2 в клеточной линии САСО-2 ведет к идентичному клеточному ответу, и. в частности, продукции хемокинов 11,-8. МСР-1 and iP-10. Хотя. различия могут быть выявлены при тестировании более широкою спектрагенов-мишеней.

Интересно отметить, что продукция хемокинов в ответ на стимуляцию тестированных TLR свойствена эпителиальной клеточной линии, но не моноцитам.

которые в ответ на стимуляцию ЛПС не способны синтезировать МСР-1 и IP-10, но эффективно продуцируют IL-8, IL-ip and IL-12. Данные различия между двумя клеточными типами не коррелируют с фактом наличия NF-кВ-связывающих сайтов в промотерах тестированных генов (Plevy, Gemberling et al. 1997; Roebuck 1999; Huang, Han et al. 2000). Это означает, что активация NF-кВ не является критической для индукции NF-кВ-зависимых генов-мишеней. Учитывая вовлеченность других факторов транскрипции в передаче сигнала от TLR, различия в комбинции сигнальных путей в зависимости от типа клеток могут вести к тканевой специфичности клеточного ответа. С другой стороны, реорганизация генов, зависящая от биологических функций конкретной клеточной популяции, может проявляться в различной доступности факторов транскрипции к одним и тем же промотерам в разных клеточных типах.

Продукция хемокинов вследствие стимуляции TLR может быть одним из возможных результатов активации TLR-положительной субпопуляции кишечного эпителия in vivo. Такой ответ кишечного эпителия может играть критическую роль в привлечении про-воспалительных иммунных клеток в область бактериального поражения. Так как элиминация лимфоидных клеток в слизистой кишечника мыши не отражается на скорости развития и остроте бактериального (S. typhimurivm) колита (Barthel, Hapfelmeier et al. 2003), это подтверждает идею о важности эпителия в инициации иммунного ответа слизистой кишечника.

Факт принадлежности TLR экспрессирующей эпителиальной субпопуляции к энтероэндокринным клеткам предлагает интригующую гипотезу о том, как бактериально-эпителиальные взаимодействия могут регулировать физиологическое и патологическое воспаление. Бактериальная активация энтероэндокринных клеток была описана ранее: токсин холеры - секреторный энтеротоксин, продуцируемый холерным вибрионом - вызывает секрецию жидкости и электролитов вследствие стимуляции GM1 ганглиозида на энтероэндокринных клетках с последующим выбросом серотонина и индукции рефлексов нервной системы кишечника (Turvill, Mourad et al. 1998; Farthing 2000). Таким образом, эпителиальная субпопуляция, экспрессирующая TLR, может играть роль "дозорных" слизистой кишечника, способных распознавать ранние признаки бактериальной инвазии с последующим вовлечением защитных механизмов иммунной и нервной систем кишечника.

Таким образом, можно предположить, что нарушение эпителиального барьера ведет к проникновению кишечных бактерий в слизистую, где происходит стимуляция эпителиальных TLR. Такой механизм может вызывать инициацию и поддерживание хронического воспаления, лежащего в основе хронических неспецифических воспалительных заболеваний кишечника (болезнь Крона, неспецифический язвенный колит). В качестве примера, отсутствие TLR4 значительно улучшает клинические симтомы спонтанного энтероколита у мышей с излишней продукцией IL-12 р40 вследствие отсутствия в миелоидных клетках STAT-3 (Kobayashi, Kweon et al. 2003). Для более детальной характеристики TLR экспрессирующей эпителиальной субпопуляции в иммунном ответе слизистых кишечника потребуется создание соответствующей модели in vivo.

выводы

1. Иммуногистохимический и иммунофлюоресцентный анализ гистологических срезов тканей тонкого и толстого кишечника человека выявил субпопуляцию кишечного эпителия, коэкспрессирующую TLR1, TLR2 и TLR4 и принадлежащую к энтероэндокринной линии.

2. На основе клеточной модели 293Т было показано, что совместная экспрессия TLR1 и TLR2 ведет к физическому взаимодействию двух молекул с формированием рецепторной пары TLR1/TLR2.

3. Для изучения роли эпителиальных TLR в эпителиально-бактериальных взаимодействиях была создана модель функциональных рецепторных комплексов TLR1/TLR2, TLR2/TLR6 и TLR4/MD4 на основе клеточной линии эпителия кишечника человека САСО-2 с использованием гена-репортера NF-кВ-зависимой люциферазы.

4. TLR1/TLR2, TLR2/TLR6 и TLR4/MD2 дифференцируют между Грам-

отрицательными и Грам-положительными бактериальными патогенами. TLR1/TLR2 и TLR4/MD2 распознают грам-отрицательные Salmonella и Shigella, TLR2/TLR6 распознает грам-положительную Listeria. TLR4/MD2 обладает специфичностью к ЛПС, TLR1/TLR2 специфичен к другому, неизвестному, компоненту клеточной стенки грам-отрицательных бактерий. ПГН, выделенный из грам-положительных бактерий, активирует TLR2/TLR6.

5. Аналогично кишечным патогенам, кишечная микрофлора также способна активировать TLR1/TLR2, TLR2/TLR6 и TLR4/MD2.

6. Стимуляция эпителиальных TLR1/TLR2, TLR2/TLR6 и TLR4/MD2 ведет к

продукции провоспалительных хемокинов IL-8, МСР-1 и IP-10.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Bogunovic M., Huabao Xiong, Scott Plevy, Lloyd Mayer. Recognition of grampositive and gram-negative enteric pathogens requires distinct TLR heterodimers. Digestive Disease Week, New Orlean, USA, May 2004, abstract, p. 1129.

2. Bognnovic ML, Xiong H., Plevy S., Mayer L.

Enteronedocrine cells express Toll-like Receptors: role of enteroendocrine cells in innate immune responses of the intestinal mucosa. Eeuropean cytokine network. Special issue ICS/ISIR, 2002,11, p 287. Cytokines and Interferons, Turino, Italy, October 2002.

3. Bognnovic M., Edwards E., Yager K., Gagnidze S., Plevy S.

A novel intestinal cell type co-expressing TLR1 and TLR2: potential functional relevance ofTLR1 and TLR2 interactions. FASEB, Orlando, USA, April 2001, abstract p. 687.

4. Bogunovic M., Reka S., Evans K., Mayer L, Sperber K., Plevy S.

Functional Toll-Like Receptors (TLRs) are expressed on intestinal epithelial cells. Материалы конференции Digestive Disease Week, San Diego, May 2000, abstract p. 987.

Благодарности

Данная работа выполнялась на базе Медицинского центра Mount Sinai, New York, США. Автор благодарит за помощь, оказанную в ходе выполнения работы, научных консультантов: руководителя отделом интерферонов Института эпидемиологии и иммунологии им. Гамалеи Н.Ф. академика РАМН, профессора Ершова Ф.И., заведующего центром иммунобиологии медицинского центра Mount Sinai, профессора доктора Mayer L. и ассистента профессора медицинского центра Mount Sinai доктора Plevy S.

Отпечатано в ООО «Компания Спутник+» ПД № 1-00007от25.06.2000г. Подписано в печать 15.12.2004 Тираж 80 экз. Усл. печ. л. 1,38

Печать авторефератов730-47-74,778-45-60

Cû

Г » ' ?

T- ÎСДР 2C05

172

Актуальность проблемы

Все многоклеточные организмы колонизированы множеством микробов, формирующих так называемую микрофлору. Более 1013 бактериальных микроорганизмов населяют кишечник, играя жизненно важную роль в физиологической деятельности желудочно-кишечного тракта и обеспечивая организм множеством незаменимых факторов. Установление взаимовыгодных отношений между организмом-хозяином и паразитирующим микробом ведет к формированию симбиотического равновесия [1]. Метаболизм питательных веществ и органических молекул, поддержание роста кишечного эпителия, индукция процесса васкуляризации, развитие лимфоидной ткани, а также препятствие колонизации патогенных бактерий являются только некоторыми примерами полезного эффекта, оказываемого кишечной микрофлорой [2].

Иммунная система в норме обладает свойством относительной толерантности к кишечной микрофлоре. После заселения тканей кишечника новорожденных нормальной бактериальной микрофлорой местная иммунная реакция ограничивается так называемым "физиологическим воспалением", проявляющимся в необратимой инфильтрации слизистой кишечника лейкоцитами, формировании лимфоидных фолликулов и создании эпителильного барьера в результате усиления межэпителиальных взаимодействий [3]. Вследствие установления биологического равновесия между бактерильной флорой и организмом хозяина жизнедеятельность кишечной микрофлоры ограничивается кишечным просветом.

В отличие от нормальной микрофлоры, большинство бактериальныхпатогенов,поражающихкишечный тракт, обладают способностью проникать в клетки кишечного эпителия, пересекать эпителиальный барьер и заселять подлежащие ткани, вызывая немедленную реакцию со стороны иммунной системы и развитие острого воспаления слизистой кишечника [4].

При наличии определенной генетической предрасположенности присутствие бактериальной микрофлоры играет критическую роль в инициации и развитии неспецифических воспалительных заболеваний кишечника, включающих болезнь Крона и неспецифический язвенный колит [5]. Данная группа заболеваний характеризуется формированием хронического воспаления кишечника, главной причиной которого считается неадекватный ответ иммунной системы к кишечной микрофлоре [6].

Понимание механизмов взаимодействия кишечной микрофлоры с иммуной системой хозяина представляет как высочайший научный, так и клинический интерес. Ключевые факторы, сдерживающие постоянный натиск бактериальной микрофлоры, но быстро реагирующие на инвазию бактериальных патогенов, остаются практически не изученными. Учитывая недавнее открытие семейства Толл-лайк Рецепторов (Toll-like Receptors - TLR), специализирующихся на распознавании бактериальных компонентов, целью исследования явилось изучение экспрессии и функций TLR на кишечном эпителии — клеточной популяции, первой вступающей в контакт с кишечными бактериями.

Для реализации данной цели были поставлены следующие задачи:

1. охарактеризовать экспрессию ТЬЮ - ТЬК5 в эпителии кишечника человека;

2. базируясь на результатах экспрессии TLR в первичном эпителии, создать модель in vitro на основе клеточной линии эпителия кишечника, экспрессирующую функциональные TLR;

3. на базе созданной клеточной модели охарактеризовать специфичность эпителиальных TLR как к изолированным бактериальным компонентам, так и к интактным бактериальным энтеропатогенам.

4. на базе созданной клеточной модели оценить чувствительность эпителиальных TLR к кишечной микрофлоре;

5. определить потенциальные гены-мишени для эпителиальных TLR.

Научная новизна и практическая значимость

Дана характеристика экспрессии TLR1, TLR2 и TLR4 в кишечном эпителии.

Впервые выявлена дифференцированная субпопуляця клеточного эпителия, коэкспрессирующая TLR1, TLR2 и TLR4 и принадлежащая к энтероэндокринной линии.

Впервые показано, что функциональная синергия между TLR1 и TLR2 базируется на физическом взаимодействии двух молекул.

Впервые при помощи экспериментальной модели in vitro, созданой на базе клеточной линии эпителия кишечника человека, определена специфичность TLR1/TLR2, TLR2/TLR6 и TLR4/MD2 к грам-положительным и грам-отрицательным кишечным патогенам.

Впервые с использованием той же экспериментальной модели проведена оценка чувствительности TLR1/TLR2, TLR2/TLR6 и TLR4/MD2 к кишечной микрофлоре.

Впервые охарактеризованы гены-мишени для экспрессированных в клеточной линии эпителия человека TLR1/TLR2, TLR2/TLR6 и TLR4/MD2.

На основе полученных результатов была предложена новая концепция о роли эпителиальных TLR в иммунном ответе слизистых кишечника.

Благодарности

Данная работа выполнялась на базе Медицинского центра Mount Sinai, New York, США. Автор благодарит научных консультантов за оказаннуюв ходе .выполнения работы помощь: руководителя отдела интерферонов Института эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи академика РАМН профессора Ершова Ф.И., заведующего центром иммунобиологии медицинского центра Mount Sinai профессора доктора L. Mayer, ассистента профессора медицинского центра Mount Sinai доктора S. Plevy.

Часть I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

выводы

1. Иммуногистохимический и иммунофлюоресцентный анализ гистологических срезов тканей тонкого и толстого кишечника человека выявил субпопуляцию кишечного эпителия, коэкспрессирующую TLR1, TLR2 и TLR4 и принадлежащую к энтероэндокринной линии.

2. На основе клеточной модели 293Т было показано, что совместная экспрессия TLR1 и TLR2 ведет к физическому взаимодействию двух молекул с формированием рецепторной пары TLR1/TLR2.

3. Для изучения роли эпителиальных TLR в эпителиально-бактериальных взаимодействиях была создана модель функциональных рецепторных комплексов TLR1/TLR2, TLR2/TLR6 и TLR4/MD4 на основе клеточной линии эпителия кишечника человека САСО-2 с использованием гена-репортера NF-кВ-зависимой люциферазы.

4. TLR1/TLR2, TLR2/TLR6 и TLR4/MD2 дифференцируют между Грам-отрицательными и Грам-положительными бактериальными патогенами. TLR1/TLR2 и TLR4/MD2 распознают грам-отрицательные Salmonella и Shigella, TLR2/TLR6 распознает грам-положительную Listeria. TLR4/MD2 обладает специфичностью к ЛПС, TLR1/TLR2 специфичен к другому, неизвестному, компоненту клеточной стенки грам-отрицательных бактерий. ПГН, выделенный из грам-положительных бактерий, активирует TLR2/TLR6.

5. Аналогично кишечным патогенам, кишечная микрофлора также способна активировать ТЬЮ/ТЬМ, ТЬЯ2ЛГЬК6 и ТЬЯ4/М02.

6 .-Стимуляция эпителиальных Т1Л11/Т1Л12, Т1Я2ГТи& и ТЬЯ4/М02 ведет к продукции провоспалительных хемокинов 1Ь-8, МСР-1 и 1Р-10.