Автореферат и диссертация по медицине (14.03.05) на тему:Экспериментальное обоснование путей лекарственной профилактики гипоксии закрытого пространства в жарком микроклимате

АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ Інститут фармакології' та токсикології

- ■ '~r.CS

САВЧЕНКОВА Лариса Василівна

УДК: 615.084:616.24-36-001.1-127:612.57

ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНЕ ОБГРУНТУВАННЯ ШЛЯХІВ ЛІКАРСЬКОЇ ПРОФІЛАКТИКИ ГІПОКСІЇ ЗАМКНУТОГО ПРОСТОРУ в НАГРІВАЮЧОМУ МІКРОКЛІМАТІ

14.03.05 - фармакологія

Автореферат дисертації иа здобуття наукового ступеня доктора медичних наук

Київ - 1999

Роботу виконано в Луганському державному медичному університеті

Науковий консультант: доктор медичних наук, професор Лук’янчук, Віктор Дмитрович, Луганський державний медичний університет, завідувач кафедрою фармакології.

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, головний науковий співробітник Соловьов Анатолій Іванович, Інститут фармакології та токсикології АМН України

доктор медичних наук, професор член-корес-пондент НАН та АМН України Комісарон Ігор Васильович, Донецький державний медичний університет, завідувач кафедрою фармакології

доктор медичних наук, професор Степанюк Георгій Іванович, Вінницький державний медичний університет, завідувач кафедрою фармакології

Провідна установа: Одеський державний медичний університет, кафедра фармакології

. . О'С-

Захист відбудеться «-/О »Лі1 ОЛІУїСХрс^ 1999 р. о /р годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.26.550.01 при Інституті фармакології та токсикології АМН України за адресою: 252027, м.Київ, вул. Ежена Потьє, 14

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фармакології та токсикології АМН України за адресою: 252027, м.Київ, вул. Ежена Потье, 14

Автореферат розіслано « ^ 1999 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, кандидат біологічних наук

І.В.Данова

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми В останнє десятиріччя XX століття в Україні, як і в нших регіонах земної кулі, має місце значне збільшення кількості техногенних, іійськових, транспортних та природних катастроф. Практично повсюдне погір-неїшя екологічної обстановки в Україні внаслідок збільшення кількості катастроф а аварій на підприємствах військово-промислового комплексу, вугледобувної та ін. ■алузей негативно впливають на стан здоров’я та життєдіяльність працюючих і іаселення в цілому. Все це спонукало до того, що в медичній науці та практиці >хорони здоров’я -сформувався новий напрямок - “медицина катастроф”, головна сонцепція якої - надання невідкладної медичної допомоги постраждалим в іадзвичайних ситуаціях (В.Ф.Москаленко, 1998, ДЗербина, 1999).

Для Донецького вугільного басейну особливої актуальності набувають аварії га катастрофи на вугледобувних підприємствах, які складають значну частину промисловості Донбасу: 218 шахт, з яких 114 є вибухопожежонебезпечнкми (В.СЛуд-ішн,1990). Загальний промисловий травматизм на вугільних підприємствах приблизно у 8-10 разів, а з летальним виходом - у 9-12 разів вищий, ніж у нерудних •алузях промисловості. За даними Центрального штабу воєнізованих .гірничо-іятувальних частин Мінвуглепрому України, кількість загиблих внаслідок аварій іа шахтах країни за рік в середньому складає близько 400 чоловік. Так, тільки у 1998 році при аваріях на шахтах України загинуло 350 чоловік, з яких лише в Туганській області - 111 шахтарів та гірничорятувальників. Зокрема слід згадати іварії на шахтах “Південно-Донбасська” (1992 рік) та “Суходольска” (1993 рік) Луганська область), на шахті “Скочинського” (1992 та 1998 роки) (Донецька >бласть), в яких загинуло близько 200 шахтарів.

Загроза шахтного травматизму в умовах Донбасу постійно зростає у зв’язку з цорічним збільшенням глибини шахт на 10-12 метрів, яка в цілому досягає 12001500 метрів, ускладненнями гірсько-геологічних умов, підвищенням температури ювітря до 35-50°С, зниженням вмісту кисню та підсиленням виділення рудових 'азів в підземних виробітках (Б.М. Газетов,1990). Така потенційно небезпечна жологічна ситуація в шахтах при аваріях та катастрофах призводить не тільки до касових уражень працюючих, але й створює умови для тяжких поєднаних ба-•атофакторних травм, викликаних, як правило, одночасною дією двох-трьох іинників - механічного, термічного та токсичного (В.В.Кузьменко, 1990; Л.Д.Во-гановская, 1992; Б.ОГрядушев, 1993; ПА.Можаев, 1995.). Особливо велику за-розу представляють пошкодження, що виникають при завалах, раптових викидах нудного газу та пилу, вибухах та пожежах в підземних виробітках вугільних шахт шаслідок дуже складних гірсько-геологічних умов. Такі пошкодження вкрай тяжкі, максимально швидко призводять до розвитку критичних станів і супроводжуються іисокою летальністю (А.И.Потапов, 1990; Ю.М.Фурсов, 1990).

Комплексний аналіз травматизму гірників та гірничорятувальників за умов шахтних травм свідчить про те, що в основі генезу майже всіх патологічних станів, які розвиваються в нагріваючому мікрокліматі, лежить гіпоксичний синдром (ГС). Суттєве значення має і психологічний фактор замкнутого простору у завалах, що супроводжується вельми вираженим емоційним стресом постраждалих (Г.А.Мо-жаев,І995).

У зв’язку з щш приоритетним напрямком екологічної фармакології є вивчення молекулярно-біохімічних основ патогенезу і на цій основі пошук та розробка високоефективних засобів лікарської профілактики екстремальних патологічних станів, що формуються при поєднаному впливі на організм гострої гіпоксичної гіпоксії з гіперкапнією на тлі перегріву. Поряд з цим, першочергового значення набуває пошук ефективних та безпечних засобів подовження життєздатності людей, що опинилися в замкнутому просторі при аваріях та катастрофах як у глибоких вугільних шахтах, так і в інших умовах.

На сучасному етапі як перша медична допомога, так і подальше лікування потерпілих в умовах різкого дефіц иту кис то на тлі гіперкапнії та наявності високої температури повітря проводяться лише шляхом застосування засобів симптоматичної терапії, які не забезпечують необхідного терапевтичного ефекту. У той же час науково обгрунтовані засоби патогенетичної терапії таких гіпоксичних станів, на жаль, відсутні, що суттєво відбивається на ефективності та кінцевих результатах лікування постраждалих.

Мета і завдання дослідження: на підставі вивчення патогенезу та встановлення лімітуючих ланок гіпоксії замкнутого простору (ГЗП), що розвивається е умовах нагріваючого мікроклімату, теоретично та експериментально обгрунтуватт шляхи її лікарської профілактики.

Для досягнення зазначеної мети вирішували такі завдання:

1 .Розробити адекватну експериментальну модель патологічного стану, який виникає при гострому поєднаному впливі на організм фізичних факторів зовнішньогс середовища, що мають місце при аварійних ситуаціях у вугільних шахтах.

2.Вивчити патогенез ГЗП, що розвивається в умовах нагріваючого мікроклімату та встановити лімітуючі ланки, які потребують фармакологічної корекції.

3.Теоретично обгрунтувати вибір потенційних засобів, які володіюті профілактичною дією при ГЗП в умовах нагріваючого мікроклімату, і провесп їхнє скринінгове дослідження.

4.Дослідити вплив найбільш перспективних засобів лікарської профілактики (і плані їхньої ефективності та безпечності) на стан енергетичного та вуглеводногх обмінів, а також окислювально-антиоксидантного гомеостазу при ГЗП, що роз вішається в нагріваючому мікрокліматі.

5.Встановити основні механізми реалізації профілактичної дії найбільц ефективних препаратів при вивчаємому екстремальному' стані.

з

6.Визначити профілактичну ефективність лікарських засобів при їх комбінованому використаній при ГЗП на тлі нагріваючого мікроклімату.

Наукова новизна отриманих результатів. У роботі вперше вивчені молекулярно-біохімічні основи патогенезу ГЗП, яка розвивається в умовах нагріваючого мікроклімату, що склало основу теоретичного обгрунтування та експериментального дослідження шляхів цілеспрямованої фармакокорекції даного патологічного стану, а також дозволило обгрунтувати перспективи подальшого фармакологічного вивчення протигіпоксичних засобів з метою їхнього раціонального використання в профілактиці та терапії патологічних станів, в основі генезу яких нежить ГС. Вперше розроблена адекватна експериментальна модель патологічного стану, що формується в умовах поєднаної дії на організм гострої гіпоксичної гіпоксії з гіперкаггніею па тлі перегріву.

Встановленні лімітуючі ланки патогенезу ГЗП в умовах нагріваючого мікроклімату свідчать, що в основі формування цього екстремального стану лежать значні порушення окислювально-антиоксидантного та енергетичного гомеостазів організму, підвищення інтенсивності метаболізму арахідонової кислоти (АК) за тпоксигеназною і циклооксигеназною гілками з одночасним підсиленням передачі внутрішньоклітинного сигналу за аденілатциклазним та гуанілатщдавдним шляхами. Виявлені також особливості функціонування мітохондріального та мікро-сомального електротранспортних ланцюгів гепатоцитів в умовах ГЗП, що розвивається в нагріваючому мікрокліматі.

Теоретично обгрунтовані та експериментально доведеш принципово нові методичні підходи до лікарської профілактики порушень, що виникають при ГЗП в нагріваючому мікрокліматі.

Вперше доведена висока ефективність використання при патологічних станах, викликаних ГЗП в гіпертермічному середовищі препаратів таких фармакологічних груп: біофлавоноїдів (кверцетин), нестероїдних протизапальних засобів (кислота ацетилсаліцилова), блокаторів кальцієвих каналів (БКК) (цннаризин) та похідних ксантину (пентоксіфілін), а також розроблено дозовий режим їхнього застосування. Вивчені основні аспекти механізмів антигіпоксичної дії цих засобів.

Теоретичне значення роботи визначається вперше встановленими і перегаченими вище даними та полягає у з’ясуванні ключової ролі вільнорадикального переписного окислення ліпідів (ПОЛ) як тригерного механізму у ланцюзі послідовних реакцій організму на знижений вміст кисню на тлі зростаючої гіперкапнії і зисокої температури оточуючого середовища з подальшим періодом реоксигенації.

Отримані нові відомості про основні сторони механізму захисної (анти-гіпоксичної) дії біофлавоноїду кверцетину в комбінації з ацетилсаліциловою кислотою (АСК), а також БКК - цинаризину і похідного ксантину - пентоксіфіліну. Розширені і поглиблені існуючі уявлення про стан динаміки метаболізму АК та ролі продуктів її перетворення у формуванні окремих ланцюгів патогенезу ГС та при

профілактичному використанні вивчаємих антитіпоксантів. Обфунтована до цільність фармакологічної корекції вмісту вторинного посередника аденілатцик лазного месенджерного каскаду циклічного аденозинмонофосфату (цАМФ) прі ГЗП на тлі перегріву. Намічені перспективні шляхи фармакокорекції неспеци фічішх захисно-адаптацііпшх механізмів організму від пошкоджуючої дії гіпоксії: гіперкапніао на тлі перефіву за допомогою засобів комбінованої фармакотерапії.

Практичне значення отриманих результатів. На підставі отриманих ре зультатів експериментальних досліджень розроблені та видані методичні рекомен данії: “Фармакокорекція гііюксичного синдрому у робітників вугледобувного т< вуглепереробного виробництв” (Луганськ, 1996); “Методические рекомендации пс использованию метода биохемилюмшшсценции в фармакологии” (Луганск, 1997) “Фармакология средств, регулирующих прооксидантно-антиоксидантное состоянш организма” (Луганск, 1999), “Ксантины: фармакология и фармакотерапия (методи ческие рекомендации)” (Луганск, 1999) та інформаційні листи: “Использование ан тиоксидантов с ангипшоксичсскими свойствами в терапии заболеваний, вызван ных воздействием на организм некоторых повреждающих факторов” (1994); “Опыт применения биофлавоноидов при воздействии на организм рабочих неблагоприятных факторов” (1994); “Спосіб підвищення ефективності фармакотерапії гіпо ксичного синдрому у робітників вугледобувного та вуглепереробного вироб ницгв”(1995); “Спосіб оптимізації фармакотерапії гіпоксичного синдрому у гірни ків” (1996); “Оптимізація похідними ксантину фармакотерапії гіпоксичного синд рому” (1997), матеріали яких впроваджені в практику роботи закладів охорони здо ров’я України.

За матеріалами дисертації отримано авторське свідоцтво СРСР на винахід N 1732646 “И-(3-Пиперидиносульфоланил-4)-К-метилпиперидиниймонометилсуль фат, обладающий антиокевдантаой активностью”, Патент України на винахід М 25687А “Спосіб профілактики порушень, що виникають під впливом на організ\ гіпоксичної гіпоксії на фоні перефіву”, а також отримане позитивне рішеню НДЦПЕ про видачу патенту України № 97094687 “Спосіб комбінованої лікарсько профілактики гіпоксичного синдрому”.

Отримані в роботі дані використано при плануванні НДР кафедрі фармакології Луганського державного медичного університету (ЛДМУ) на 19992003 рр за темою: “Експериментальна розробка засобів фармакокорекції екстремальних станів організму” (№ держ. реєстрації0198и009100).

Матеріали досліджень використовуються в роботі лабораторії фармакотерапі Київського інституту ендокринології, лабораторії біохімії Інституту екогігієни тг токсикології їм. Л.І.Медведя та відділу медико-біологічних досліджень Інституту біоорганічної хімії і нафтохімії НАН України, лабораторії фармакології тканинню препаратів Інституту очних хвороб та тканинної терапії ім. В.П.Філатова, а такти впроваджені у навчальний процес на кафедрах фармакології Дніпропетровської

Івано-Франківської та Тернопільської державгаїх медичних академій, Полтавської стоматологічної академії, Української фармацевтичної академії, Вінницького, Донецького, Луганського та Львівського державних медичних університетів, на кафедрах анестезіології та реанімації Вінницького державного медичного університету та Сумського державного університету', використовуються в післядипломній підготовці фармацевтів та провізорів при Луганському обласному державному комунальному підприсмстві “Фармація”.

Основні результати досліджень, які відображають ефективність використання кверцетину в комбінації з АСК, цинаризину та пеігшксіфіліну при ГС використовуються в роботі відділень профпатаяогії та реанімації Луганської обласної клінічної лікарні їм. Ф.Е. Дзержинського, Донецькій обласній клінічній лікарні ім. М. І. Калініна, терапевтичних відділень Ювілейної лікарні м. Луганська та Краснодонського ТМО Луганської області.

Отримані в роботі дані можуть служити експериментальним обгрунтуванням для клінічних досліджень по оптимізації фармакопрофілактики і терапії ГС.

Особистий внесок дисертанта. Автором особисто було визначено мету, завдання, методичні підходи та програма дослідження, проведено патентно-інформаційний пошук, у тому числі за допомогою пошукового індексу “Альта Виста“ Ін-тернету. Самостійно виконано усі експериментальні дослідження та статистичну обробку отриманих даних, оформлення їх у вигляді таблиць і графіків. Проведено аналіз результатів роботи, а також сформульовані висновки та основні положення дисертації.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась у межах пріоритетного конкурсного фінансування МОЗ України в області фундаментальних досліджень “Молекулярні механізми мембранопротекгорної дії, біотранспорту і біотрансформації кверцетину при застосуванні його в екстремальних умовах (гіпоксія, гіпертермія, інтоксикація)” (1992-1994 рр.), теми НДР кафедри фармакології ЛДМУ “Фармакологічна корекція метаболічних процесів при гіпоксичному синдромі (№ держреєстрації 0195/026228. 1996-1998 рр.), госпрозрахункової теми “Розробка високоефективного антигіпоксанту з термопро-текторними властивостями для осіб, які працюють в умовах глибоких вугільних шахт” (1993-1995 рр), пріоритетного фінансування по лінії НАН України “Експериментальна розробка шляхів патогенетичної терапії ішемічних станів на основі антигіпоксантів та адаптогенів” (№ держреєстрації 02.03/04645) (1997-1998 рр), а також на прохання зацікавлених підприємств (лист керівництва трестом “Красно-доншахтобуд” № 5/117 від “11 квітня 1993р. і адміністрації шахти “Самсонівська-Західна” ВП “Краснодонвугілля”, лист № 117 від 10 вересня 1994 р.). .

Апробація матеріалів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи доповідалися та отримали позитивну оцінку на конференції «Актуальні питання використання лабораторних тварин в медико-біологічішх дослідженнях» (Чернівці,

б

1992), І Українській науковій конференції за участю країн СНД “Актуальні проблеми клінічної фармакології (перспективи розвитку науки та викладання)” (Вінниця, 1993), конференції “Школа академіка О.І.Черкеса: ідеї, розвиток, перспективи1’ (Київ, 1994), Cinferintei stiintifici ашаїе (Chisinau, 1994), XIY з’їзді українського фізіологічного товариства ім. І.П.Павлова (Київ, 1994), 1 національному з’їзді українського наукового товариства фармакологів “Сучасні проблеми фармакології” (Полтава, Київ, 1995), науково-практичній конференції, присвяченій 100-річчіо зі дня утворення 4-й міської лікарні (Луганськ, 1996), IY Конгресі світової федерації українських лікарських товариств (Одеса, 1996), конференції “Актуальные проблемы педиатрии” (Луганск, 1997), II Українській науковій конференції' з міжнародною участю «Актуальні проблеми клінічної фармакології» (Вінниця, 1998), International conference Environmental and Occupational Health and Safety in Agriculture on the Boundary of Two Millennia (Kiev, 1998), V Національному з’їзді фармацевтів України (Харків, 1999), засіданні Луганського відділення Українського науковою товариства фармакологів (Луганськ, 1996,1997,1998,1999).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 44 наукових робіт, з них 26 статей у центральних наукових журналах, в тому числі 9 одноосібних, 1 Патент України, 1 авторське свідоцтво на винахід, 4 методичних рекомендацій, а також 12 тез доповідей на наукових форумах.

Обсяг та струюура дисертації. Дисертація складається із вступу, розділу аналітичного огляду літератури, опису матеріалу та методів дослідження, 9 розділів експериментальних досліджень, обговорення, висновків та списку використаної літератури. Дисертація викладена на 338 сторінках машинопису. Ілюстративний матеріал поданий в 40 таблицях та 25 малюнках. Бібліографія складається з 643 джерел, зокрема 257 надруковані в іноземних видавництвах.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Досліди проведені на 1950 білю безпородшх та лінії Wistar щурах обох статей стадного розведення вагою 160-2001 та білих мишах, вагою 20-25 г. Всі тварини були статевозрілими обох статей. Е експеримент тварин брали після проходження карантину протягом 14 днів.

Експериментальною моделлю служив патологічний процес, що розвивається у тварин при поєднаному впливі на організм неблагоприємних факторів, що мають місце при аваріях та катастрофах, зокрема в глибоких вугільних шахтах: гострг гіпоксична гіпоксія з наростаючою гіперкапнією (ГЗП) в нагріваючому мікрокліматі (перегрів).

Моделювання ГЗП в нагріваючому мікрокліматі проводили в спеціально розробленій і сконструйованій у лабораторії кафедри ЛДМУ гермокамері. Вміст кисню в камері складав 10 об.%, що досягалося шляхом подачі в гермокамеру газоподібного азоту зі швидкістю 10 л/хв в першу хвилину експозиції тварин та в по-

дальшому зі швидкістю 0,6 л/хв протягом 14 хвилин. Вміст вуглекислоти постійно підвищувався на протязі перебування тварин у камері, що дозволяло констатувати формування у експериментальних тварин ГЗП. Контроль за вмістом кисню та вуглекислоти проводили за допомогою мас-спектрометра “МХ-6203”. Температура повітря в камері складала +50°С, вологість - 60-80%. Вказані параметри вимірювались в кожній серії досліджень за допомогою відповідішх приладів.

Препаратами поглибленого дослідження були кверцетин (виробництво Борща-говського хіміко-фармацевтичного заводу) в дозі 100 мг/кг та ацетилсаліцилова кислота (АСК) (виробництво фармацевтичної фірми “Даршщя”) в дозі 50 мг/кг, які вводились комбіновано перорально з профілактичною метою за -2 годили до розміщення тваріш у гермокамері. Іншими засобами, що використовуватись за подібною схемою, були представник групи БКК - цинаризин (виробництво Дослідного заводу ДНЦЛЗ), який вводили в дозі 60 мг/кг і один з похідних ксантину -пентоксіфілін (виробництво фірми “Дарниця”) в дозі 150 мг/кг. Контролем слугували тварини з розгорнутою картиною ГЗП, що розвивалась на тлі перегріву, яким перорально вводили відповідний об’єм дистильованої води.

Коефіцієнт антигіпоксичного захисту (К3) вивчаємих лікарських засобів розраховували виходячи із співвідношення часу життя в гермокамері тварин, котрим з профілактичною метою вводили відповідні препарати, до часу життя контрольних тварин (без введення препаратів) у відповідності з методичними рекомендаціями (Л.Д.Лукьянова, 1990). Екстраполяцію експериментальних доз вивчаємих лікарських засобів на людину проводили за допомогою констант біологічної активності (Ю.Р.Риболовлев, Р.С.Риболовлев, 1980).

Первинний фармакологічний скринінг потенційних антиоксидантів проводили в дослідах in vitro на моделі ініційованого окислення метилових ефірів ненасичених жирних кислот (H.Femandez, 1982). Аліквоти середовища інкубації відбирали в динаміці через 10, 20 та ЗО хвилин від моменту ініціювання ПОЛ Fe2+. Ліпоперекиси визначали за накопиченням активних продуктів ПОЛ, які реаіують з 2-тіобарбпуровою кислотою (ТБК) (Н. Okhawa et al., 1979).

Скринінг потенційних антигіпоксантів проводили на різних моделях ГЗП (у нагріваючому мікрокліматі або без перегрівання), як серед відомих лікарських засобів з різними механізмами дії, так і оригінальних органічних сполук різної будови. Ефективність препаратів оцінювали за виживаємістю, перебігом клінічної картини та строками загибелі тварин. При визначенні токсичності (ЛД») досліджуваних сполук використовували експрес-мєтод В.Б.Прозоровського (1978).

Газовий склад крові та окремі показники кислотно-лужної рівноваги (pH, р02, рС02, ВІС - актуальна концентрація бікарбонату, ТС - сумарна концентрація вуглекислоти, BE - надлишок луги, ЕВЕ - надлишок лупі зовнішньоклітинної рідини, ВВ

- сума всіх основ, SB - стандартний бікарбонат, SAT - відношення гемоглобіну, насиченого киснем до загальної кількості гемоглобіну) оцінювали за допомогою

"Анализатора газов и pH крови” типу ОР-226 фірми “RADELKIS” (Будапешт). Температуру тіла експериментальних тварин виміряли ректально за допомогою електротермометру ТМП в динаміці перебування в камері.

Про енергетичний обмін у щурів інтактної, контрольної та дослідних груп судили за показниками обміну аденілових нуклеотидів, а також за станом вуглеводного обміну. Визначення рівня АТФ, АДФ і АМФ в тканинах мозку проводили з використанням наборів “Test-Combination ATF” і “Test-Combination ADF/AMF’ фірми “Boehringer Mannheim GmbH” (Німеччина). Вміст неорганічного фосфору (Ф„) в тканині мозку визначали за допомогою тест-систем “Bio-La-Test” (“Laxema”, Чехія). На підставі отриманих даних розраховували показники, що характеризують стан енергетичного обміну у вивчаємих умовах експерименту: енергетичний заряд (ЕЗ), енергетичний потенціал (ЕП), термодинамічний контроль дихання (ТКД), ступінь та індекс фосфор ллговашія (СФ та ІФ), порівняльний коефіцієнт (Кпор.)-

Для оцінки стану вуглеводного обміну визначали вміст глюкози в тканині печінки з використанням тест-снстеми “Glu enz” “Bio-La-Test” (“Laxema”, Чехія). Вміст глікогену та молочної кислоти (МК) визначали за методами (А.М.Базарнова, 1991). Рівень піровиноградної кислоти (ІТВК) оцінювали з використанням тест-систем “AST ALT’ “Bio-La-Test“ (“Laxema”, Чехія). Визначення ферментного спектру сироватки крові (лактатдегідрогеназа - ЛДГ, креатинфосфокіназа - КФК, у-ґлутамілтранспептідаза - у-ГТП) проводили з використанням відповідних тест-систем “Bio-La-Test” (Чехія).

Про антиоксидантно-прооксидантний гомеостаз організму тварин при ГЗП, що розвішається в нагріваючому мікрокліматі та профілактичному використанні вивчаємих антигіпоксантів судили за інтенсивністю протікання процесів ПОЛ та станом ашиоксвдантної системи (АОС) організму. Так, реакції вільнорадикального ПОЛ оцінювали за вмістом в крові та гомогенатах печінки первинних (дієнові конъюгата - ДК) та проміжних (гідроперекиси - ГП) продуктів цього процесу за методом (И.Д. Стальная, 1977). Вміст кінцевих продуктів ліпідпереокислення, які реагують з ТБК визначали за H.Okhawa (1979). Про рівень тригліцеридів (ТГ) у сироватці крові судили за допомогою тест-систем “Bio-La-Test” (Чехія).

При вивченні функціонування окремих ланок АОС організму визначали активність основних компонентів ферментативної гілки цієї системи, тобто каталази (М.А,Королюк,1988) і суперокеиддісмутази (СОД) (В.А.Костюк, 1990). Визначеній вмісту сульфгідрильних груп проводили за методом H.EUman (1959), а глутатіону -за методом I.Sedluck (1968). Забезпеченість організму ендогенними антиоксидантами оцінювали за станом перекисної резистентності еритроцитів (ПРЕ) (О.Г. Архипова, 1988).

Показником співвідношення в організмі про- і антиоксидантів були обрані інтенсивність та характер біохемілюмінісценції (БХЛ), яку проводили на люмінометрі EMILITE-1105 фірми “БиоХимМак”, котрий був скомутований з IBM

PC XT/AT-386. У роботі використаний метод реєстрації БХЛ сироватки крові, індукованої перекисом водню (К.П.Сидорик,1990) в модифікації О.А.Лисенко ( 1997). При цьому визігачшіи такі параметри: амплітуду швидкого (І|) та повільного спалахів (12) БХЛ та час індукції повільного спалаху БХЛ (т).

Для оцінки стану енергетичної та детоксикуючої систем організму у вивчас-мих умовах використовували ЕПР-спектрометрію печінки. ЕПР-спектри записували на спектрометрі фірми “Varian” (США), марки Е-109 в умовах низькотемпературної (77°К) стабілізації. Вивчали ЕПР-сигнали з g-факторами: 2,25 - цитохром Р-450; 2,17 - марганецьвміщуючі парамагнітні комплекси; 2,03 - нітрозильні комплекси заліза (НКЗ); 2,00 - вільні радикали (ВР); 1,97 - молібденвміщугочі парамагнітні комплекси; 1,94 - Fe,S-білки, або залізосірчані білки (ЗСБ) (Я.И.Ажипа,1983).

Ііггенсивність метаболізм АК оцінювали за допомогою радіоімунного методу на сцінціляціонних лічильниках “Гамма-12” або “Бетга-1”. Дослідження рівня продуктів ліпоксигеназної гілки метаболізму цієї ненасиченої жирної кислоти в плазмі крові проводили шляхом визначення вмісту лейкотриєнів В4 з використанням набору “Leukotriene В4 assay system” фірми “Amersham” (Англія). Вивчання вмісту продуктів іншої гілки перетворень АК - за циклооксигеназним шляхом - простагландину Е2 проводили з використанням набору “Prostaglandin Е2(І25І) assay system with magnetic separtion”, а простагландину I2 за допомогою набору “6-Keto-Pros-taglanlin Fia (125I) assay system with magnetic separtion" фірми “Amersham” (Англія).

Визначення рівня вторинних посередників передачі внутрішньоклітинного сигналу за аденілат- та іуанілатщшіазним шляхами - цАМФ та цГМФ при ГЗП в нагріваючому мікрокліматі та фармакопрофілакгичному використанні вивчаємих антигіпоксантів проводили з використанням радіоімушюго набору “Cyclic AMP” фірми “Immunotech” (Франція), та “Cycl іс GMP” (Чехія).

Визначення показників, що досліджувались, проводили в динаміці, на протязі трьох діб після закінчення моделювання вивчаємого патологічного стану.

Всі використані при виконанні цієї роботи одиниці вимірів та параметри наведено відповідно до міжнародної системи одиниць (ГЛипперт,1980). Отримані результати обробляли статистично загальноприйнятими методами з використанням програми Statgraf, оцінюючи вірогідність на рівні значимості не менше 95% (Р<0,05) за критерієм Стьюдента (Л.В.Иванов,1990), та непараметричного критерія Фішера (Е.В.Гублер, 1978).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Результати окремої серії досліджень по розробці експериментальної моделі, котра є адекватною гострому впливу на організм фізичних факторів оточуючого середовища, які мають місце в аварійних ситуаціях, зокрема в глибоких вугільних шахтах, дозволили довести, що у вивчаємих умовах першочергове значення має поєднаний вплив екстремальних чинників, коли одночасна дія на організм гострої

гіпоксичної гіпоксії з гіперкапнією на тлі перегріву призводить до потенціювання пошкоджуючої дії кожного агента окремо і проявляється значним (до 87,5%) підвищенням загибелі тварин. Для підтвердження адекватності розробленої моделі вивчаємого патологічного стану досліджували газовий склад крові, включаючи зміни кислотно-лужної рівноваги та температуру тіла експериментальних тварин. Отримані дані переконливо довели, що в умовах впливу на організм гострої гіпоксичної гіпоксії на тлі перегріву виявляються ознаки метаболічного ацидозу при дуже низькій насиченості гемоглобіну киснем та підвищення ректальної температури у щурів. Враховуючи вищенаведене, експериментальною моделлю досліджуваного екстремального • стану була обрана ГЗП, що розвивається н нагріваючому мікрокліматі, виживаємісгь тварин при цьому складала 12,5%.

При вивченні молекулярно-біохімічній основ патогенезу ГЗП в нагріваючому мікрокліматі, було встановлено суттєве порушення енергетичного обміну у вивчає-мих умовах: стану аденілнуклеотидної системи та показників біоенергетичних процесів в тканині мозку. Це проявляється зниженням вмісту АТФ та суми нуклеотидів на тлі зростання кількості АДФ, АМФ та Фн, що свідчить про наявність порушень низькоенергетичного характеру та енергодефіцитний стан у вивчаємих умовах експерименту (див. рис. 1).

Рис. 1 Динаміка вмісту аденілових нуклеотидів в тканині мозку тварин при ГЗП б нагріваючому мікрокліматі Примітка: *- Р<0,05 відносно інтактних тварин

Ці дані були підтверджені і в серії досліджень вуглеводного обміну в тканин печінки при ГЗП в умовах нагріваючого мікроклімату, які досить впевнено свідчаті про переключення процесів окислення вуглеводів та синтезу АТФ на анаеробнш гліколіз.

Методом БХЛ та з використанням комплексу біохімічних методик показане різке зрушення окислювально-антиоксидантного гомеостазу при ГЗП в нагрі-

ваючому мікрокліматі в бік підсилення продукції прооксидантів (ДК, ГП, ТБК-продукти) (див. рис. 2). Водночас спостергаегься виснаження ендогенних антиоксидантів (СОД, каталаза, глутатіон. ЗН-групи), що вказує на мембранопош-коджуючу дію (значне зниження ПРЕ) вивчаємих фізичних чинників і потребує відповідної фармакологічної корекції.

Рис. 2 Динаміка змін окремих показників ПОЛ в крові тварин при ГЗП в нагріваючому мікрокліматі

Примітка: * - Р<0,05 відносно інтактних тварин Аналіз динаміки змін стану окислювального гомеостазу організму при ГЗП у нагріваючому мікрокліматі дозволяє стверджувати, що найбільш агресивні продукти ПОЛ в плані розгалуження ланцюгів вільнорадикальних реакцій утворюються і накопичуються вже в ранні строки дослідження (3 та 6 годин) і вказують на доцільність використання лікарських засобів антиоксидантного типу дії в перші години з моменту впливу пошкоджуючих факторів.

Для встановлення тонких механізмів мембранопошкоджуючої дії гіпоксії з гі-перкапнією та перегріву, що діють поєднано, вивчали стан компонентів мітохонд-ріального та мікросомального електротранспортних ланцюгів печінки з використанням методу ЕПР-спектрометрії. У проведеїшх дослідженнях було встановлено роз’єднання тканинного дихання та фосфорилювання зі зниженою продукцією мак-роергічних зв’язків, що на ЕПР-спектрах супроводжується значним зішжеїшям вмісту компонентів 1 та II пунктів споріднення - Ге,8-білків та довгоживучих ВР, які беруть участь у передачі електронів в дихальному ланцюзі. Водночас виявлено НКЗ -маркерні показники тканинної гіпоксії, що підтверджує встановлений факт про енергодефіцитний стан при ГЗП в нагріваючому мікрокліматі. При цьому було наведено зниження вмісту компонентів мікросомальної монооксигеназної системи печінки - цитохрому Р-450 та молібдепвмішуючих парамагнітних комплексів, що вказує на порушення процесів детоксикації у вивчаємих умовах експерименту.

З урахуванням ролі компонентів аденілат- та гуанілатциклазного месенджер-них каскадів - і іЛМФ і иГМФ як протекторів гіпоксії, вивчення динаміки змін цих показників при досліджуваному екстремальному стані уявляється досить важливим з точки зору їхньої інформативності. Отримані результати показали, що вплив на організм вивчаємих пошкоджуючих факторів призводить до підвищення рівня цАМФ лише в ранні строки з подальшою тенденцією до його зниження і відповідного підвищення рівня цГМФ, що можна кваліфікувати як компенсаторно-адаптаційну реакцію, яка потребує фармакологічної підтримки.

До біологічно активних сполук, які здатні впливати на протікання патологічного стану, зокрема ГС різної етіології, належать продукти метаболізму АК - ейкоза-ноїди, простагландини та лейкотриски. При вивченні вмісту в плазмі крові тварин з вивчаємою формою ГЗП продуктів циклооксигеназної гілки перетворень даної не-насиченої жирної кислоти встановлено суттєве прискорення перетворень АК з підвищенням продукції в організмі простагландинів Е2 та Ь, а враховуючи неоднозначну роль цих ейкозаноїдів у патогенезі гіпокспчних станів, слід досить обережно підходити до їх фармакологічної корекції. Вміст продуктів ліпоксигеназної гілки перетворень АК при вивчаємому патологічному стані - лейкотриєну В4 та, враховуючи підвищену активність фермент)' у-ГТП, можливо і лейкотриєну 04, також вірогідно збільшується і погіршує протікання ГЗП в нагріваючому мікрокліматі.

Таким чином, проведеними дослідженнями встановлено, що ГЗП на тлі перегріву розвивається внаслідок багато профільних патологічних процесів, які об’єднані в єдину взаємодіючу систему, призводять до розвитку розповсюдженої мембранопатії і потребують включення в комбіновану фармаколрофілактику засобів, спроможних зупинити, чи значно загальмувати розвиток метаболічних порушень в різних ланках патогенезу даного екстремального стану. Комплексні дослідження дозволили також довести, ідо високоефективні антигіпоксанти повинні володіти антиоксидантними та антирадикальними властивостями, мати здатність втручатися в метаболізм АК як за даклооксигеназним, так і ліпоксигеназним шляхами та дію вторинних посередників в передачі внутрішньоклітинного сигналу

- цАМФ та цГМФ. При цьому особливе значення мають і такі властивості препаратів, які забезпечують попередження надходження кальцію в цитозоль та розвиток “кальцієвого перевантаження” клітини.

Враховуючи, що однією з ключових лімітуючих ланок патогенезу вивчасмої форми ГЗП є активація ПОЛ, в подальшому проводили скринінгове дослідження антиоксидантної активності 14 оригінальних органічних сполук та 7 відомих лікарських засобів у модельних дослідах. Встановлено, що більшість з випробуваних речовин проявляють антиоксидантну активність різного ступеня вираженості. При цьому виявлена найбільш висока антиоксидантна активність, яка перевищує таку для а-токоферолу (еталонний препарат) у трьох оригінальних хімічних сполук: 1-(2-адамантш-1-іл-етокси)-3-морфолін-4-іл-пропан-2-ол гідрохлорид, 1 -(2-адамантін-1-

іл-етокси)-3-пірідішл-пропаи-2-ол гідрохлорид та М-(3-піпервдиносульфоланіл~4)-N-метилпіперидиний монометнлсульфат. Слід відмітити досить низьку токсичність вказаних хімічних речовин для теплокровних (пероральне введення мишам в дозі 1000 мг/кг не викликає загибелі тварин). Вивчення антиоксидантної активності відомих лікарських засобів в дослідах in vitro дозволило скласти низку препаратів в убутній послідовності, який має такий вигляд: кверцетин в комбінації з АСК, кверцетин, пентоксіфілін, ліпін, АСК, бемітил, діпірідамол.

Отже, отримані в скринінгових дослідженнях дані вказують на доцільність подальшого поглибленого вивчення в дослідах in vivo препаратів з найбільш високою антиоксидантною активністю як потенційних антигіпоксантш.

В подальшому на моделі ГЗП в нагріваючому мікрокліматі та при ГЗП без перегрівання вивчали порівняльну антигіпоксичну активність 21 препарату різних фармакологічних груп, які потенційно здатні коригувати окремі функціонально-метаболічні порушення, що витікають при змодельованих формах гіпоксичного стану. Результати досліджень in vivo дозволяють стверджувати, що в умовах гострої гіпоксичної гіпоксії з гіперкапнією на фоні перегріву найбільш високу протекторну активність при пероральному введенні реалізує біофлавоноїд кверцетин в комбінації з АСК та представник ірупи БКК - цинаризин, що проявляється виживанням 100% тварин при тому ж показнику в контролі - 12,5%, тобто ефективність застосування цих засобів складає - 87,5%. Слід додати, що величина К, для цих препаратів відповідно складає 1,82 та 1,67. Досить високу проти-гіпоксичну активність проявляє похідний ксантину - пентоксіфілін (ефективність -62,5%; К3 - 1,52). Протигіпоксична дія цих препаратів проявляється також благоприємним впливом на перебіг клінічної картини вивчаємого патологічного стану. Все це лягло в основу подальшого детального вивчення специфічної активності кверцетину в комбінації з АСК , а також цинаргаину і пентоксіфіліну в плані впливу на стан лімітуючих ланок патогенезу ГЗП на тлі перегріву.

В окремій серії досліджень було розроблено дозовий режим використання найбільш ефективних лікарських засобів при профілактичному введенні за умов формування у тварин ГЗП в нагріваючому мікрокліматі. Найбільш високу профілактичну активність кверцетин в комбінації з АСК проявляють в дозах відповідно 100 мг/кг та 50 мг/кг; цинаризин - 60 мг/кг, а пентоксіфілін - 150 мг/кг, що і використовувалось в подшіьших дослідженнях.

Доведена висока профілактична активність потенційних антигіпоксантів нави-чаємій моделі ГЗП в нагріваючому мікрокліматі вказувала на доцільність подальшого вивчення молекулярних механізмів антигіпоксичної активності цих препаратів.

Проведена серія досліджень молекулярно-біохімічних механізмів захисної дії кверцетину в комбінації з АСК в вивчасмих умовах експерименту, яка дозволила визначити центральні фармакодинамічні ефекти, що притамашгі цій комбінації

препаратів, які, з нашої точки зору, і складають основу їхньої протигіпоксичної дії.

Враховуючи, ідо вивчаєма модель ГС супроводжується порушеннями енергетичного гомеостазу досліджували вплив кверцетину з АСК на деякі показники енергетичного забезпечення організму в даних умовах експерименту. Так, встановлено, що кверцетин в комбінації з АСК відновлює виявлений при ГЗП в нагріваючому мікрокліматі дисбаланс в системі АТФ-АДФ-АМФ, нормалізуючи рівень аденілових нуклеотидів та Ф„ (див. рис.З).

Рис. З Вплив комбінації кверцетину з АСК на динаміку змін рівня аденілнуклеотидів в тканині мозку тварин в умовах ГЗП в нагріваючому мікрокліматі Примітка: *- Р<{),05 відносно контролю: *-АТФ: **-АДФ: ***-АМФ

Протекторна активність препаратів була встановлена також при аналізі таких показників енергетичного обміну, як ЕП, ЕЗ, СФ, ІФ, ТКД, які свідчать про енергозберігаючу дію вивчаємої комбінації лікарських засобів. Поряд з цим, виявлено, що кверцетин в комбінації з АСК нормалізує рівень ферментів енергетичного метаболізму (ЛДГ та КФК) у вивчасмих умовах експерименту.

В окремій серії досліджень доведено, що кверцетин з АСК прискорюють процеси глюконеогенезу в умовах ГЗП на тлі перегріву, зменшуючи в печінці рівень ПВК та МК з одночасним підвищенням вмісту глюкози та глікогену'. При цьому' вивчення динаміки змін рівня ТГ (препарати попереджають його підвищення в будь-які строки спостереження) дозволяє припустити, що має місце активація метаболізму ТГ за двома адаптаційно-компенсаторними шляхами: утворення жирних кислот для кетогенезу та гліцерину для глюконеогенезу в екстремальних умовах.

Оскільки розвиток ГЗП в нагріваючому середовищі, як наведено вище, супроводжується різкою активацією процесів ПОЛ, в подальшому визначали вгшив комбінації кверцетину з АСК на вміст у тканинах організму продуктів різних етапів де-

градації фосфоліпідів біомембран. Так, профілактичне застосування них препаратів значною мірою попереджає утворення і накопичення первинних (ДК), проміжних (ГТТ) та кінцевих (ТБК-активних) продуктів процесу ліпідпереокислеїшя на вивчаємій моделі ГЗП.

Вказане положення було підтверджено результатами окремої серії досліджень по вгоначешш інтенсивності БХЛ сироватки крові, які дозволяють стверджувати, що кверцетин у комбінації з АСК проявляє виражені антирадикальні властивості. Останнє реалізується в зниженні амплітуди як швидкого (Гі), так і повільного (І2) спалахів БХЛ з одночасним збільшенням часу індукції повільного спалаху (т) (рис.4). Ці дані дозволяють припустити, що препарати здатні переривати ланцюговий процес ліпідпероксидації, зменшуючи тим самим активацію ПОЛ і мемб-ранопошкоджуючу дію продуктів деградації фосфоліпідів.

Рис.4 Вплив комбінації кверцетину з АСК на динаміку змін інтенсивності БХЛ сироватки крові тварин в умовах ГЗП в нагріваючому мікрокліматі.

Примітка: *-Р<0,05 відносно контролю

Враховуючи, що стан окислювально-антиоксидантного гомеостазу організму підтримується АОС організму, котра, як вже відмічалось, суттєво змінюється при ГЗП у нагріваючому мікрокліматі і потребує фармакологічного втручання, було доцільним вивчити вплив комбінації препаратів на вміст її окремих компонентів.

Встановлено, що біофлавоноїд у комбінації з АСК попереджають зниження активності ключових ферментів антирадикального захисту клітини - каталази та СОД у всі строки вивчення. Так, у тваріш зі змодельованою формою ГЗП, що отримували кверцетин і АСК, активність каталази сироватки крові на протязі всього періоду дослідження практично не відрізняється від таких у інтактних тварин (Р>0,05). Спостерігається схожа картина і змін активності СОД в крові щурів, яким

А

о

Амплітуда повільного спалаху

г

попередньо вводили кверцетин з АСК. Позитивний вплив комбінації препаратів на активність СОД підтверджено також в серії досліджень парамагнітних властивостей тканини печінки, коли було доведено, шо ця комбінація лікарських засобів суттєво підвищує рівень Мп""-вмішуючих парамагнітних комплексів у вивчаємих умовах експерименту. Протекторна активність комбінації біофлавоноїлу з АСК виявлена і відносно загального рівня тіолших груп високо- та низькомолекулярних біологічних субстратів, а також важливого БН-вміщуючого компоненту АОС - глутатіо-ну в усі строки спостереження в умовах. ГЗП, що розвивається в нагріваючому мікрокліматі. . . ;

. Мембраностабілізуючий ефекр кверцетину з АСК проявляється й у вірогідному зниженні відсотку гемолізу еритроцитів щурів зі змодельованою формою ГЗП. Звертає на себе увагу не. тільки суттєве підвищення ПРЕ, але й стабільність ефекту на протязі 24 годин після закінчення моделювання вивчаємого патологічного стану у тварин, які отримували з профілактичною метою комбінацію препаратів.

Таким чином, результати проведених досліджень дозволяють стверджувати, що комбінація біофлавоноїду кверцетину з АСК володіє вираженою антиоксидантною активністю з антирадикальними властивостями, про що впевнено свідчить здатність цих препаратів зменшувати інтенсивність БХЛ сироватки крові, попереджаючи утворення ДК ненасичених жирних кислот, і як наслідок цього, проміжних і кінцевих продуктів ПОЛ. У кінцевому рахунку фармакопрофілактична дія комбінуємих засобів реалізується попередженням витрачання компонентів ферментативної системи антиоксидантного захисту організму, в т. р. рівня ендогенних тіолвміщуючих високо- на низькомолекулярних субстратів, а також вираженою мембраностабілізуючою дією цих препаратів в умовах ГЗП, що розвивається в нагріваючому мікрокліматі.

Поряд з цим методом ЕПР-спектрометрії доведено, що кверцетин з АСК проявляють захисну дію по відношенню до проміжного компоненту мітохондріального електротранспортного ланцюга - Ре,5-білків, рівень яких під впливом вивчаємих екстремальних факторів, як наведено вище, знижується у всі строки спостереження. Слід відмітити стійкий протекторний ефект кверцетину з АСК у відношенні ДО ЦИХ показників, який зберігається до кінця першої доби.

Доведена також здатність вивчаємої комбінації препаратів попереджати утворення НКЗ - загальновідомих “маркерних” показників гіпоксичного стану організму за будь-яких умов. Це слід розглядати як результат мембранопротекторних, в т. р. і антиоксидантних, властивостей цих препаратів і, як наслідок цього, зменшення звільнення вільного заліза, яке утворює з окисом азоту парамагнітні комплекси з §-фактором 2,03. Крім того, відомі амфотерні властивості кверцетину, здатного виступати в ролі як окислювача, гак і відновлювача, дозволяють припустити, що цей препарат попереджає відновлення низькомолекулярних азотистих сполук до окису азоту і утворення НКЗ (М.Н.Царевская, 1997 ). Це сприяє участі заліза в складі за-

лізовміщуючих ферментів у реакціях переносу електронів по дихальному ланцюгу.

Вивчення впливу кверцетину в комбінації з АСК на вміст довгоживучих се-міхінонних BP (g-2,00), які, на думку ЯЛЛжти (1983), входять до складу компонентів транспорту електронів у реакціях окислювального фосфорилювання показало, що ці препарати в умовах ГЗП в нагріваючому мікрокліматі попереджають зниження інтенсивності сигналу ЕПР, який притаманний довгоживучим ВР. Цей факт можна пояснити результатами досліджень Н.П.Максютіної (1997), згідно яких при окисленні кверцетину в якості проміжного продукту утворюються ссміхінонні радикали та хінони, котрі здатні реєструватися методом ЕПР. Безумовне значення при цьому мають мембраностабішуючі властивості вивчаємої комбінації препаратів та структурна схожість кверцетину з флавінами, що дозволяє використовувати його як переносник електронів в дихальному ланцюзі.

Отже, отримані результати дають змогу дійти висновку, що парамагнітні комплекси мітохондріального електротранспортного ланцюга гепатоцигів тварин з вивчаємою формою ГЗП зазнають суттєвих змін, як у кількісному, так і в якісному відношеннях. Застосування кверцетину з АСК дозволяє значною мірою попередити порушення структурно-функціонального стану переносшпсів електронів у дихальному ланцюзі у вивчаєм их екстремальних умовах.

Встановлено також, що в основі механізму регуляції вивчаємою комбінацією лікарських засобів метаболічних порушень, що розвиваються при ГЗП в нагріваючому мікрокліматі, поряд з протекторним ефектом по відношенніо до компонентів мітохондріального електронтранспортного ланцюга лежить їхня здатність реалізувати захисну дію і відносно лімітуючої ланки системи природної детоксикації організму - цитохрому Р-450. Це проявляється збільшенням величини сигналу ЕПР, який належить даному ферменту (на 30-70%), у порівнянні з контролем (ГЗП без профілактичного використання лікарських засобів).

Оскільки вказаний ефект вивчаємої комбінації препаратів реєструється вже через 1 годину після закінчення моделювання досліджуваного патологічного стану, то є всі підстави думати, що в даному випадку мова йде не про індуктивний синтез цитохрому Р-450, а про здатність комбінуємих засобів попереджати конверсію цього ферменту в його неактивну форму - цитохром Р-420. Таке пояснення має теоретичне підгрунтя, яке лежить в площині раніше отриманих результатів досліджень П.В.Сергєєва та його співробітників (1992), а саме: індукція цитохрому Р-450 під впливом ксеногенних чинників de novo відбувається не раніше шести годин з початку їхньої дії. Тому, в нашому випадку слід вести мову не про індуктивний ефект комбінованого засобу, а про його протекторні властивості відносно цитохрому Р-450. Разом з тим не слід виключати і того факту, що кверцетин здатний виступати в ролі індуктора цього ферменту. ЕПР-спектрометрія дозволила встановити також, що вивчаємі препарати нормалізують в усі строки дослідження рівень Мо5+-містких парамагнітних комплексів, які, як відомо (Я.И.Ажипа, 1983),

беруть участь в окислювальній детоксикації і, ймовірно, є наслідком мемб-раностабілізуючих властивостей біофлавонощу кверцетину і АСК (див. рис. 5).

Інтактні 1 3 6 24 години

Рис. .5 Вплив комбінації кверцетину з АСК на динаміку змін окремих компонентіб . мікросомального електронтранспортного ланцюга в печінці тварин при ГЗП < нагріваючому мікрокліматі Примітка: *- Р<0,05 відносно контролю

Особлива увага в роботі приділялась вирішенню завдання, пов’язаного зі з’ясуванням питання про стан передачі сигналу ззовні клітини на внутрішньоклітинні структури в умовах ГЗП в нагріваючому мікрокліматі та застосуванні вивчаемих засобів. У цьому зв’язку було встановлено, що однією з найважливіших сторін фармакодинаміки кверцетину в комбінації з АСК є ‘їхня здатність впливати на вміст вторинних посередників аденілат- та іуанілатщштаз-ного месенджерних каскадів - цАМФ та цГМФ. Так, радіоімунним методом показано, що профілактичне використання комбінації препаратів призводить до суттєвого збільшення рівня цАМФ в плазмі крові у всі строки дослідження на 30-146% у порівнянні з контрольними тваринами. Вивчення ж вмісту цГМФ в цих же умовах експерименту виявило лише тенденцію до його нормалізації.

Встановлений ефект препаратів вірогідно є результатом дії кверцетину як відомою інгібітора фосфодіестерази (ФДЕ) цАМФ, а також комбінованої дії біо-флавоноїяу і АСК на рівень кінцевих продуктів метаболізму АК при ГЗП в нагріваючому мікрокліматі (ПГ І2 та Е2), які здатні підвищувати рівень цАМФ в тканинах (Н.А.Федоров, 1990; Ю.Н.Чернсв, 1992) (диб. рис. 6).

Радіоімунне вивчення основних гілок метаболізму АК в умовах гіпоксії з гіперкапнією на тлі перегріву показало, що антиліпоксигеназні та антицикло-оксигеназні властивості кверцетину з АСК складають значну' частку їх протек-

орної дії. Так, встановлено, що профілактичне використання кверцетину з АСК у варин в умовах формування вивчаємої форми ГЗП вже через 3 години призводить ю зниження вмісту лейкотриєну В4 в плазмі крові на 30%, а через 24 годиш - на 5% у порівнянні з контрольною серією, а також пригнічує активність у-ГГП, яка іере участь в утворенні лейкотриєнів Б4.

Радіоімунне вивчення основних гілок метаболізму АК в умовах гіпоксії з іперкапнією на тлі перегріву показало, що антиліпоксигеназні та антицикло-жснгеназні властивості кверцетину з АСК складають значну частку їх протек-орної дії. Так, встановлено, що профілактичне використання кверцетішу з АСК у ■варин в умовах формування вивчаємої форми ГЗП вже через 3 години призводить ю зниження вмісту лейкотриєну В4 в плазмі крові на 30%, а через 24 години - на 5% у порівнянні з контрольною серією, а також пригнічує активність у-ГТП, яка іере участь в утворенні лейкотриєнів 0.(.

Інтактні х 5 Ю 1 5 Ю години

°ис. 6 Вплив комбінації кверцетину з АСК на динаміку вмісту цЛМФ та цГМФ при ГЗП в умовах нагріваючого мікроклімату

Примітка: Р<0,05 відносно інтактних тварин: *-цЛМФ; **-иГМФ Р<0,05 відносно контролю: “ - цЛМФ

Виявлений ефект препаратів можливо пояснити як здатністю кверцетину інгібувати 5-ліпоксигеназу (ЛОГ), попереджаючи утворення і накопичення лейкотриє-гів у тканинах організму (Ю.Н.Колчин, 1990; В.П.Кухарь, 1992), так і антиокси-іантними та мембранопротекторішми властивостями вивчаємої комбінації взагалі.

Вивчення рівня продуктів циклоокскгеназної гілки метаболізму АК при профі-іактнчному використанні кверцетину з АСК показало, що ця комбінація лікарських іасобів призводить до нормалізації значно підвищеного в екстремальних умовах зівня простагландину Е2 в плазмі крові тварин в усі строки спостереження.

Ефективність профілактичного використання кверцетину в комбінації з АСК три ГЗП на тлі перегріву призводить до зниження вивчаємого показника відносно

“гіпоксичних” тварин (контроль) на 60 - 80 % у різні строки вивчення. Безумовно, в цьому випадку першочергове значення мають не тільки відомі антициклоок-сигеназні властивості АСК, а також і мембраностабілізуюча дія вивчаємої комбінації препаратів в цілому.

Відносно другого продукту перетворень АК за участю циклооксигенази (ЦОГ)

- простацикліну слід підкреслити, що останній володіє відомими суттєвими антигіпоксантними властивостями, і підвищення його рівня при ГЗП, що має місце в умовах нашого експерименту, є позитивним фактом і потребує фармакологічного підтримання. Враховуючи вищенаведене, доза АСК в експерименті була “відтитро-вана” таким чином, щоб незворотньо пригнічувати активність ЦОГ в тромбоцитах, не втручаючись в дію цього ферменту в євдотеліальних клітинах судин, тобто була б в змозі зменшувати синтез тромбоксану у вивчаємих умовах, не впливаючи на синтез простацикліну. Для людини такою е доза АСК 7-8 мг/кг (Ю.Н.Чернов, 1990). При екстраполяції ізоефективної дози АСК з людини на тварин (шурів) за константами біологічної активності (Ю.Р.Риболовлев, 1980) вказана доза повинна складати - 40-50 мг/кг, що і відповідає тій, яка використовувалась в роботі.

Отримані радіо імунним методом дані показали, що в умовах гіпоксії з гіпер-кагагією в поєднанні з гіпертермією відмічається подвійне підвищення рівня 6-кето-простагландину Fia (стійкого метаболіту простагландину І2) в плазмі крові шурів контрольної групи. У той же час використання в цих умовах кверцетину в комбінації з АСК вже через 3 години після закінчення моделювання вивчаємого патологічного стану призводить до підвищення рівня цього продукту перетворень АК вдвічі в порівнянні з тваринами контрольної групи. Слід відзначити, що рівень простацикліну в плазмі крові тварин, яким вводили з профілактичною метою кверцетин з АСК, спостерігається незмінним до кінця першої доби, що дає змогу пояснити цей факт відновленням синтезу простацикліну в ендотеліальних клітших de novo, а також і доведеними вище антиоксидантними та мембраностабілізуючими властивостями препаратів.

Таким чином, проведеними дослідженнями встановлено, що в основі антигіпоксичної активності кверцетину в комбінації з АСК лежать антиоксидантні та антирадакальні властивості, а також здатність препаратів суттєво втручатися в метаболізм АК шляхом пригнічення активності ЦОГ та ЛОГ та виступати в якості інгібіторів ФДЕ цАМФ.

Інша серія досліджень була присвячена вивченню фармакологічних властивостей представника групи БКК - цинаризину, котрий, як було встановлено в попередніх дослідах, володіє високою антигіпоксичною активністю у вивчаємих умовах експерименту.

Аналіз даних по вивченню динаміки змін рівня продуктів ПОЛ в крові та печінці тварин в умовах ГЗП, що розвивається в нагріваючому мікрокліматі, і профілактичного застосування цинаризину, показав, що цей препарат із всією відоо-

«дальністю можна віднести до класу антиоксидантів з антирадикальними власги-юстями. Про це свідчать результати аналізу ЬХЛ сироватки крові тварин з вивчас-иою формою ГЗП, з яких витікає, що цинари жн суттєво попереджає зростання інтенсивності першого (1)) і другого (Ь) спалахів БХЛ, наближаючи їх до рівня, що постерігається у інтактних тварин. Крім того, відмічається подовження часу індук-іії повільного спалаху БХЛ, що свідчить про здатність препарату попереджати зитрачання ендогенних антиоксидантів на нейтралізацію надлишку продуктів ПОЛ.

Результати дослідів по вивченню стану процесів ліпідпереокислення та АОС ш умов дії на нього гострої г'токсіїчно'і гіпоксії з гіперкапнією на тлі перегріву і трофілакшчному використанні цинаризину- ше раз дозволили довести, що цьому препарату притаманні виражені антиоксидантні властивості, які реалізуються у зірогідному зниженні вмісту в тканинах організму в усі строки дослідження як ДК і ГП, так і продуктів ПОЛ. які реагують з ТБК (див. рис. 7).

ДК Пдропср^киси ТВК-иродуюги

Рис. 7 Вплив цинаризину на динаміку змін показників перекисного окислення ліпідів у тварин при ГЗП в нагріваючому мікрокліматі Примітка: * - Р<0,05 відносно контролю

Певний протекторний ефект цинаризину встановлено і відносно основних компонентів ферментативної системи антиоксидантного захисту організму - ката-тази та СОД, коли рівень активності цих ферментів вірогідно вищий, ніж у тварин контрольної групи, хоча і відрізняється від показників, що реєструються у інтактних щурів.

Ще одним підтвердженням антиоксидантних властивостей цинаризину слід вважати протекторну дію препарату відносно тіолвмішуючих компонентів АОС організму - глутатіону та загальної кількості сульфгідрильних груп. Так, в різні строки спостереження цинаризин підвищує вміст глутатіону в середньому на 40150%, що слід рахувати достатнім для відновлення окислювально-антиоксидантного гомеостазу організму в умовах формування вивчаємої форми ГС. В якості

інтегрального показника антиоксидантних властивостей цинаризину використовували перекисну стійкість мембран еритроцитів, яка при профілактичному введенні цього препарату практично не відрізнялась від рівня, що реєструється у інтактних тварин. Щодо механізму антиоксидантної дії цинаризину, то можна припустити, що в цьому випадку суттєве значення має здатність препарату зменшувати тим чи іншим шляхом вміст в цитозолі іонів кальцію, який, безумовно, володіє прооксидантною дією (Л.ДЛукьянова, 1989; Ю.И. Губский, 1994).

Отже, профілактичне використання цинаризину при ГЗП, що розвивається в нагріваючому мікрокліматі, сприяє стрімкому відновленню антиоксидантно-про-оксидантної рівноваги, інгібуючи процеси - радикалоутворення і розгалуження ланцюгів ПОЛ, що з високою інтенсивністю протікають під впливом на організм ґіпоксичної гіпоксії з гіперкашіією на фоні перегріву.

При вивченні основних показників енергетичного та вуглеводного обмінів у вивчаємих екстремальних умовах та профілактичному використанні цинаризину доведено, що препарат здатен перерозподіляти пул аденілових нуклеотидів на користь синтезу АТФ, збільшуючи при цьому такі параметри енергетичного обміну, як ЕЗ, ЕП, ІФ, СФ, Кпор. Водночас відмічається активація глюконеогенезу, що проявляється в підвищенні рівня глюкози та глікогену в тканині печінки при суттєвому зменшенні накопичення молочної та піровиноградної кислот при ГЗП у нагріваючому мікрокліматі.

При вивченні впливу цинаризину на стан залізосірчанопротеідних комплексів (£=1,94) - компонентів І і II пунктів споріднення окислення та фосфоршповання при ГЗП на тлі перегріву, показано, що препарат реалізує індукуючий ефект по відношенню до цих компонентів дихального електротранспортного ланцюга лише в рашті строки дослідження (перші 6 годин). У більш пізніші строки вивчення ця здатність препарату не так добре виражена (див. рис.8).

Щодо маркерного показника гіпоксичного стану - НКЗ, то проведені дослідження показали, що профілактичне застосування цинаризину за 2 години до моделювання вивчаємої форми ГЗП реалізується значним зменшенням величини сигналу ЕПР з ц-фактором, рівним 2,03 у всі строки спостереження. Більш того, на фоні введення препарату вказаний сигнал вже навіть через одну годину після вилучення тварин з камери не реєструється ні в жодному з досліджуваних зразків тканини печінки.

При аналізі ЕПР-спектрів довести протекторні властивості цинаризину по відношешпо до компонентів дихального електротранспортного ланцюга дозволяють також і результати вивчення впливу цього препарату на вміст довгоживучих ВР ^=2,00) у тварин при сформованій ГЗП в окремі строки дослідженій. Встановлені фармакодинамічні ефекти цинаризину вірогідно зумовлені переважно його мембраностабілізуючими властивостями, які повною мірою реалізуються саме у ці ж самі строки спостереження.

Мембраностабілізуючі, втому числі і антиоксидантні, властивості цинаризину прияготь також підвищенню вмісту компоненту мікросомального електронтранс-юртного ланцюга - цитохрома Р-450, коли його рівень значно перевищує показ-іики у тварин контрольної групи в середньому в 1,4 рази. Ще одним підтвердженням протекторної дії препарату відносно основних компонентів детоксикуючої истеми організму в умовах вивчаемої форми ГЗП є результати вивчення Мо5+-міщуючих парамагнітних комплексів (§=1,97), коли в ранні строки дослідження [инаризин призводить до нормалізації цього показника і зберігає протекторну дію ,о кінця першої доби.

Таким чином, одним з -найважливіших фармакодинамічних ефектів штаті ш ну, який вірогідніше всього є наслідком мембраностабілізуючої дії препарату' лід відмітити його протекторну активність по відношенню до компонентів .стоксикуючої системи організму в умовах ГЗП в нагріваючому мікрокліматі, що прияє збереженню структури та функціональної здатності мембран ендо-лазматичного ретикулуму та пов’язаних з ним ферментів.

ис.8 Вплив цинаризину на динаміку змін рівня окремих компонентів мітохонд-ріального еяектронтранспортного ланцюга печінки тварин при ГЗП в нагріваючому мікрокліматі Примітка: * - Р<Ю,05 відносно контролю

Враховуючи, що у функціонуванні кальцієвих каналів важливу роль відіграє роцес фосфорилювання білків, який протікає за участю цАМФ, а також беручи до ваги роль цАМФ в поглинанні іонів кальцію ендоплазматичним ретикулумом ТА.Федоров, 1990; Л.Б.Буравкова,1991), особливо важливо було вивчити вплив инаризину на стан аденілатциклазного месенджерного каскаду в умовах вивчаємої юрми ГЗП. Застосування при цьому з профілактичною метою даного пред-гавника групи БКК призводить до підвищення рівня цАМФ в крові в 1,2 - 2,7 рази всі строки дослідження, шо можна пояснити не тільки зменшенням входу кальцію цитозоль, але й інігбуючим впливом препарату на активність ФДЕ цАМФ.

Встановлена також роль цинаризину як засобу, шо здатний втручатися в метаболізм АК за циклооксигеназним і ліпоксигеназним шляхами. Виявлені антилейко-триєнові властивості цинаризину реалізуються лише в ранні строїш дослідження -через 3 години після закінчення моделювання ГЗП в нагріваючому мікрокліматі і обумовлені перш за все його антиоксидантними властивостями, а також здатністю зменшувати біологічні ефекти лейкогриєнів та пригнічувати активність у-ГТП (Ю.Н.Чернов, 1992).

Радіоімуішим методом встановлено також, що цинаризин змінює метаболізм АК і на етапі синтезу простагландинів та простацикліну. Так, в експерименті доведено, що препарат значною мірою знижує рівень простагландину Е2 в плазмі крові тварин в умовах ГЗП в нагріваючому мікрокліматі у всі строки спостереження. Більш того, в ранні строки дослідження (3 та 6 годин) цей показник практично не відрізняється від такого ж у інтактних тварин, що може свідчити про мембра-нопротекгорні властивості препарату. Слід підкреслити, що першочергове значення при цьому має здатність препарату втручатися в передачу внутрішньоклітинного сигналу за поліфосфоінозитидпим шляхом, де зменшення концентрації іонів кальцію в цитозолі буде попереджати синтез діацилгліцеролу, з якого через декілька перетворень синтезуються простагландини і тромбоксан, котрі відомі як прогіпоксан-ти. Зовсім інша картина спостерігається при вивченні впливу цинаризину на вміст 6-кето-простагландину Ріа при ГЗП на тлі перегріву. Показано, що препарат підвищує рівень вивчаємого показника в 2-4 рази в різні строки спостереження, що свідчить про зміщення синтезу ейкозаноїдів на користь простацикліну. Цей факт лежить в одній площині з даними, отриманими ЛДЛук’яновою (1989) та І.І.Топ-чієм (1995), згідно яких БКК і особливо цинаризин здатні виступати в якості індукторів синтезу простацикліну.

Отже, проведена серія експериментальних досліджень по вивченню молекулярних механізмів антнгілоксичної активності цинаризину дозволяє стверджувати, що виявлені ефекти препарату є наслідком його антиоксидантної дії з антиради-кальними властивостями цинаризину, а головне, здатністю засобу попереджати потік кальцію через плазматичні мембрани і його накопичення в цитозолі. Суттєве значення мають здатність препарату інгібувати ФДЕ цАМФ та індукувати синтезу простацикліну.

При вивченні ангигіпоксичних властивостей пентоксіфіліну радіоімунним методом було встановлено, що препарат здатен втручатися в функціонування аденілатциклазного месенджерного каскаду, підвищуючи рівень цАМФ в умовах ГЗП на тлі перегріву. Крім того, було доведено, що профілактичне застосування пентоксіфіліну призводить до зниження рівня простагландину Е2 з одночасним підвищенням рівня простацикліну, що може свідчити про зрушення метаболізму АК за “простацикліновим” шляхом.

Проведені комплексні дослідження патогенезу ГЗП в нагріваючому мікро-

ііматі. виявлення лімітуючих ланок розвитку цього екстремального стану, а також ізначення найбільш ефективних засобів профілактики виникаючих патологічних . лін та встановлення основних молекулярно-біохімічних аспектів антигіпоксичної співності останніх слугувало передумовою проведення окремої серії досліджень зотигіпоксичної дії комбінованого використання всіх вивчаємих препаратів, итних загальмувати розвиток порушень у різних ланках його патогенезу.

Результати досліджень довели, що при комбінованому застосуванні квер-зтину, АСК, цинаризину та пентоксіфіліну за 2 години до розташування тварин у рмокамері коефіцієнт антитоксичного захисту зростає майже на 20% відносно ійбільш ефективних препаратів - комбінації кверцетину з АСК і складає 1,91. От-імані дані по вивченню часу життя тварин при ГЗП в нагріваючому мікрокліматі і профілактичному використанні вказаних препаратів були підтверджені в серії, ^сліджень БХЛ сироватки крові як показника, що дозволяє комплексно оцінювати ган процесів ПОЛ і АОС захисту' організму у вивчаємих умовах експерименту, оказано, що комбіноване використання лікарських засобів повністю попереджає /дь-які порушення прооксидантно-антиоксіїдангної рівноваги в організмі щурів ри ГЗП на тлі перегріву (див. рис. 9).

ис. 9 Вплив комбінованого використання кверцетину, АСК, цинаризину та пентоксіфіліну на динаміку змін інтенсивності БХЛ сироватки крові тварин при ГЗП в нагріваючому мікрокліматі Примітка: * - Р<0,05 відносно контролю

Отримані дані вказують на перспективність комбінованого застосування ропонуємих препаратів, які с представниками різних фармакологічних груп з ізнимн механізмами дії як високоефективних антигіпоксантів, здатних опереджати порушення у функціонуванні енергетичного і вуглеводного обмінів, кислювально-антиоксидантного гомеостазу та метаболізму АК.

При аналізі отриманих даних узагальнені можливі шляхи лікарської про-

філактики ГЗП, що розвивається в нагріваючому мікрокліматі схематично приведено на рис. 10. Як видно, в основі антитоксичної дії комбінованого використання кверцетину з АСК лежать їхні антирадикальні та антиоксидантні властивості, а також виражена здатність пригнічувати активність ферментів 5-ЛОГ, ЦОГ, що реалізується в мембранопротекторній дії препаратів. Суттєве значення має властивість вивчаєм ої комбінації як інгібітора ФДЕ цАМФ. В основі ж ан-тигіпоксичної активності представника групи БКК цинаризину лежить здатність останнього зменшувати вихід кальцію в цитозоль, а також затримувати деградацію фосфоінозитидів, наслідком чого є антирадикальний та антиоксидантний ефекти. Підсумком цього є стабілізація мембран клітин. Велике значення мають властивості цинаризину як інгібітора ФДЕ цАМФ та індуктора синтезу проста-цикліну. Антитоксичний ефект пентоксіфіліну цілком обумовлений його властивостями як інгібітора ФДЕ цАМФ та блокатора аденозинових рецепторів, тобто здатністю препарату втручатися в аденілатциклазний месенджерний каскад.

ВИСНОВКИ

1. В основі патогенезу гіпоксії замкнутого простору в нагріваючому мікрокліматі, лежить розповсюджена мембранопатія, яка обумовлена порушеннями окислювально-антиоксидантного гомеостазу в результаті активації вільно-радикального ліпідпереокислення з послідуючим надлишковим накопиченням в тканинах первинних, проміжних та кінцевих продуктів цього процесу з одночасним суттєвим зниженням рівня основних компонентів антиоксидантної системи захисту організму. Мембранопошкоджуючий ефект при цьому екстремальному стані реалізується також за рахунок інтенсифікації метаболізму арахідонової кислоти зг циклооксигеназним та ліпоксигеназним шляхами з підвищеною продукцією таких груп ейкозаноідів, як простагландини (Е2)та лейкотриєни (В4).

2. У розвитку патологічних змін при гіпоксії замкнутого простору в умова* нагріваючого мікроклімату центральне місце займають порушення енергетичногс гомеостазу та функціонування природних шляхів детоксикації організму. Це проявляється порушенням пулу аденілнуклеотвдної системи (АТФ, АДФ, АМФ, Фн) з одночасним збільшенням частки анаеробного метаболізму вуглеводів, а також значним зниженням рівня окремих компонентів мітохондріального (залі-зосульфопротеідні комплекси, семіхінонні вільні радикали) та мікросомальногс (цитохром Р-450) електрої і-транспорті шх ланцюгів з утворенням нітрозильнш комплексів заліза в гепатоцитах щурів у всі строки дослідження.

3. В скринінгових дослідженнях на моделі гострої гіпоксії замкнутого простору в поєднанні з гіпертермією встановлено, що з 21 вивченої сполуки найбільїі високу профілактичну активність проявляють біофлавоноїд кверцетин в комбінаці з ацетилсаліциловою кислотою (в дозах, відповідно, 100 і 50мг/кг), а також пред

Аденілатциклазна система

ЦИНАРИЗИН

ПЕНТОКСІФІЛШ

Поліфосфоіноіитидна система

КВЕРЦЕТИН

ВР)

5-АМФ 1

Аденозін ПК-А 1 1 1 ВІДПОВІДЬ

км-пк пк-с

їй Ні

ВІДПОВІДЬ ВІДПОВІДЬ

ТР пг пц 1 і і І ВІДПОВІДЬ

Рис. 10 Можливі точки прикладення в механізмі дії вивчених засобів лікарської профілактики гіпоксичиого синдрому, що розвивається в умовах замкнутого простору в нагріваючому мікрокліматі (ВР - вільні радикали; Р - рецептор; С - білки; А у - аденілатцита-за; цАМФ - циклічний аденозінмонофосфат; ФДЕ - фосфодіестераза; ПК-А - протеінкіназа А; ФІФ, - фосфотіділінозітолдіфо-сфат; ФЛ-С - фосфоліпаза С; ФЛ-А, - фосфоліпаза А;; ІФ} - інозітолтрифосфат; ДАГ - діацилгліцерол; АК- арахідонова кислота; ЦОГ - циклооксигеназа; ЛОГ - ліпоксигеназа; цЕ - циклічні ендоперекиси; КМ-ПК • кальмодулін протеінкіназа; ПК-С -протеінкіназа С; ТР - тромбоксан: ПГ - простагландіїїи; ПЦ - простациклін; ЛТ - лейкотрисни)

ставішк групи блокаторів кальцієвих каналів - щшаризин (60 мк/г) та похідне ксантину - пентоксіфілін (150 мг/кг), що реалізується високою виживаємістю тварин (100%) та благо приємним впливом на перебіг клінічної картини вивчаємого патологічного стану. При цьому коефіцієнт анти г і токсичного захисту складає: для кверцетину в комбінації з ацетилсаліциловою кислотою - 1,82, цинаризину - 1,67 і пентоксіфіліну -1,54.

4. Профілактичне застосування кверцетину в комбінації з ацетилсаліциловою кислотою за 2 годиш до початку моделювання гіпоксії замкнутого простору на тлі перегріву чинить виражену мембранопротекторну дію, в основі якої лежать антиоксидантні властивості, що проявляється-зниженням рівня вільних радикалів, дієнових кон’югатів, гідролерекисів та кінцевих (які реагують з 2-тіобарбітуровою кислотою) продуктів ліпідпереокислення з одночаснім попередженням зниження активності та вмісту основних компонентів антиоксидантної системи захисту організму. При цьому препарати попереджають підсилену продукцію простагландинів Е2 і лейкотриєнів В4, а також розвиток метаболічного ацидозу.

5. Комбіноване профілактичне використання кверцетину з ацетилсаліциловок кислотою при гіпоксії замкнутого простору, що розвивається в нагріваючому мікрокліматі, сприяє перерозподілу пулу аденілових нуклеотидів в бік підсиленню синтезу АТФ з одночасним збільшенням таких показників енергетичного обміну, як термодинамічний контроль дихання, індекс та ступінь фосфоршповання, а такоя енергетичний потенціал та енергетичний заряд. Разом з тим активізуються процесі глюконеогенезу в тканині печінки, що проявляється підвищенням рівня ГЛЮКОЗИ Тс глікогену з відповідним зниженням накопичення молочної та піровиноградно: кислот. У реалізації вказаних ефектів комбінованих засобів профілактики лежиті їхня здатність попереджати зменшення базального рівня компонентів мітохонд-ріального та мікросомального електротранспортних ланцюгів, а також Мп2+- : Мо5+-містких парамагнітних комплексів, суттєво знижуючи при цьому утворенню маркерів гіпоксії - нітрозильних комплексів заліза.

6. Лікарська профілактика гіпоксії замкнутого простору в нагріваючому мікрокліматі кверцетином в комбінації з ацетилсаліциловою кислотою дозволяє ефективно регулювати реакції передачі внутрішньоклітинного сигналу за аденілат-циклазним та гуанілагциклазним шляхами, підвищуючи в плазмі крові тварш рівень ендогенних протекторів гіпоксії- вторинних месенджерів - цАМФ і цГМФ, г також продукту циклооксигеназної гілки перетворень арахідонової кислоти простацикліну (простагландину І2).

7. Мембраностабілізуюча дія цинаризину проявляється попередженням на копичення в тканинах тварин при змодельованій формі гіпоксії надлишку продуктії вільнорадикального перекисного окислення ліпідів, протекторним ефектом з відношенні компонентів антиоксидантної системи (супероксиддисмутази, каталази БН-груп високо- та низькомолекулярних біосубстратів, в тому числі і глутатіону),;

ікож за рахунок антищшюоксигеназного и антилейкотриснового ефектів. Іаслідком цого є попередження зниження рівня компонентів мітохондріального ’е,8-білки, довгоживучі вільні радикали) і мікросомального (цитохром Р-450) анцюгів транспорту електронів гепагоцитів, що сприяє, в кінцевому рахунку, ормалізації енергетичного гомеостазу шляхом активації глкжонеогенезу. (инаризин коригує процеси передачі вііутрішігьо клітинного сигналу за аденілат-иклазним шляхом, а також метаболізм арахідонової кислоти, підвищуючи рівень АМФ та простаїшкліну в плазмі крові тварин.

8. Особливістю фармакодинаміки пентоксіфіліну, що застосовується з профі-актичною метою при гіпоксії замкнутого простору на тлі нагріваючого мікро-лімату є його здатність модифікувати аденілатциклазний месенджерний каскад за ахунок підвищення продукції цАМФ, а також зміни метаболізму арахідонової ислоти шляхом пригнічення синтезу простагландину Е2 та підвищення кількості ростагландину І2 в плазмі крові тварин у вивчаєм их умовах експерименту.

9. Комбіноване пероральне застосування кверцетину, ацетилсаліцилової ислоти, цинаризину і пентоксіфіліну за 2 години до початку формування гіпоксії імкнутого простору в поєднанні з перегрівом реалізується підвищенням коефі-ієнту антигіпоксичного захисту на 20%, а також попередженням порушень анти-ксидантш-прооксидантної рівноваги у порівнянні з окремим введенням вказаних ісобів тваринам в умовах вивчаємого екстремального стану.

СПИСОК ПРАЦЬ, НАДРУКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Сравнительная оценка эффективности фармакотерапевтических средств при токсин на фоне гипертермии // Лікарська справа.- 1994,- №2,- С.47-50 (соавт. [укьянчук В.Д., Козлов А.Г., Лысенко Е.А.).

2. Фармакокоррекция тиол-дисульфидного обмена при экстремальных состоя-иях // Экспериментальная и клиническая фармакология.- 1995.- №1- С. 58 (соавт. [укьянчук В. Д.).

3. Взаимосвязь между перекисным окислением липидов, антиоксидантной истемой, содержанием цАМФ и цГМФ в организме животных при гапоксическом индроме с гипертермией // Украинский биохимический журнал.- 1995.- №6.-:.108-111.

4. Бемитил: фармакодинамтса и фармакокинетика // Физиологически актовые вещества.- 1995,- Вып. №26.- С.3-7 (соавт. Лукьянчук В.Д., Лысенко Е.А.).

5. Роль лейкотриенов в патогенезе шахтной травмы и фармакокоррекция // .рхив клинической и экспериментальной медицины.- 1995.- №2.- С.144-148 (соавт. укьянчук В.Д., Лысенко Е.А.).

6. Возможные механизмы антиоксидантного действия блокаторов кальциевых аналов // Экспериментальная и клиническая фармакология.- 1996.- №2.- С. 53-55 :оавт. Дзубан Е.М., Лукьянчук В.Д.).

зо

7. Новое в механизме действия блокаторов кальциевых каналов // Фармако логічний вісник,- 1996,- №2,- С.ЗО (соавт. Лукьянчук В.Д.)-

8. Вплив антигіпоксантів на зміни вмісту окремих компонентів мікро сомального та мітохондріального електротранспортного ланцюгів у клітина; печінки при гіпоксії на фоні перегріву // Журнал АМН Украины 1996,- №4. С.732-737 (співавт. Лукьянчук В.Д.).

9. Молекулярні основи мембранної проникливості кверцетину і йог< комбінацій з іншими лікарськими засобами // Фармацевтичний журнал.- 1996. №1С.99-102 (співавт. Царевская М.Н., Лук’янчук В.Д., Гудзенко А.П.).

10.Оцінка ефективності блокаторів кальцієвих каналів-при гіпоксичном; синдромі за допомогою біохемілюмінісценції // Ліки,- 1996.- №4,- С.122-12< (співавт. Дзубан Е.М.). ...

11. Комбинированная фармакокоррекция окислительного гомеостаза при ги поксическом синдроме//Лікарська справа.- 1996.- №3-4-.- С. 117-120.

12. Вплив інгібіторів метаболізму арахідонової кислоти на рівень марганець- п молібденвмішуючих парамагнітних комплексів при гіпоксичному синдромі // Ліки. 1997.-№1,- С. 77-80.

13. Ферменты сыворотки крови при гипоксическом синдроме // Украинские биохимический журнал.-1997.-№4.- С. 104-110.

14. Биохемилюминисцентный анализ фармакотерапевтической активности аце тилсалициловой кислоты в комбинации с кверцетином при гипоксическом синдро ме // Экспериментальная и клиническая фармакология - 1997.-№1.- С.62-64 (соавт Лукьянчук В.Д., Семенова И.А.).

15. Принципы фармакопрофилактики и фармакокоррекции гипоксических на рушений на фоне гипертермии: состояние и перспективы // Фармакологічний вісник.- 1997,-№2.-С.28-29 (соавт. Лукьянчук В.Д.).

16. Современные представления о генезе гипоксического синдрома и принци пах его фармакокоррекция (обзор литературы и собственных данных) // Журна; АМН Украины.- 1997.- №4.- С.554-566 (соавт. Лукьянчук В.Д.).

17. Биохимические основы патогенеза гипоксического синдрома// Українській медичний альманах,- 1998,-№1.-С. 90-99.

18. Гіпоксичний синдром: молекулярні механізми патогенезу та фармакотерапі //Ліки - 1998,- №2,- С.66-68.

19. Роль ендогенних простаноїдів в патогенезі гіпоксичного синдрому т: фармакотерапія деякими інгібіторами метаболізму арахідонової кислоти // Журна; АМН України,- 1998.- №3,- С. 540-544.

20. Вивчення стану прооксидантно-аш-иоксидантної рівноваги щурів, ще знаходяться в умовах глибоких вугільних шахт та фармакотерапії виникаючи) порушень //Український медичний альманах.-] 998.-№4.-С,35-39.

21. Взаємозв’язок фармакодинаміки пентоксіфіліну з вмістом ейкозаноїдів з

іарин з гіпоксичним синдромом //Ліки.- 1998,-№4,- С.69-71 (співавт. Белоусова •П.).

22. Антигипоксангы: состояние и перспективы // Экспериментальная и клини-зская фармакология.- 1998.- №4,- С. 72-79 (соавт. Лукьянчук В.Д.).

23. Добові ритми фармакотерапевтичної активності кверцетину в комбінації з детил сал і пиловою кислотою // Фармацевтичний журнал.- 1998.- №1.- С. 67-69 :півавт. Гудзенко А.П., Семенова И.А., Лук’янчук В.Д.).

24. Роль ингибиторов фосфодлэстеразы цАМФ в фармакотерапии гипоксиче-

<ого синдрома // Экспериментальная и клиническая фармакология.- 1998.- №6.- С. 5-38 (соавт. Лукьянчук В.Д., Рыдлевский В.В., Белоусова И.П.). ~

25. Ксаігтини: фармакологія і можливості клінічного застосування // Ліки,-998,- №6.- С. 4СМ8 (співавт. Лук’яшук В.Д., Белоусова І.П.).

26. Деякі сторони енергетичного обміну в тканині мозку при гіпоксичному лндромі та фармакокорекції//Ліки.- 1999,-№3,- С. 50-53.

27. Патент UA 25687 А Україна Спосіб профілактики порушень, що виникають ід впливом на організм гіпоксичної гіпоксії на фоні перегріву / Лук’янчук В.Д., 'зубан К.М. (Україна).- З с. Заявлено 03.08.1995; Зареєстровано 30.10.1998.

28. А.С. № 1732646 СССР “М-(3-Пиперидиносульфоланил-4)-І\1-метшгштери-иниймонометшісульфат, обладающий антиокевдантной активностью / Лукьянчук .Д., Луйк А.И., Дульнев П.Г., Высоцкий И.Ю. (СССР).- Зарегистрировано 8.01.1992.-Зс.

29. Фармакокорекція гіпоксичного синдрому у робітників вугледобувного та іглепереробного виробництв // Метод, рекомендації,- Луганськ, 1996- 6 с. :півавт. Бурмак Ю.Г., Дзубан К.М.).

30. Методические рекомендации по использованию метода биохемилюминис-енции в фармаколопт // Метод, рекомендации,- Луганск, 1997,- 18 с. (соавт. [укьянчук В.Д., Стефанов А.В., Лысенко Е.А. и др.).

31. Ксантины: фармакология и фармакотерапия / Метод, рекомендации.- Лу-анск, 1999.- 27с. (співавт. Лукьянчук В. Д., Белоусова И.П.)

32. Фармакология средств, регулирующих прооксидантно-антиоксидангаое со-гояние организма / Метод, рекомендации.- Луганск, 1999- 40 с. (соавт. Лукьянчук 1.Д., Лысенко Е.А., Бибик Е.В.)

33. Біохемілюмінісценція, як базовий метод вивчення механізму пошкоджуючої ії екстремальних чинників // Матеріали ІУ Конгресу світової федерації Українсь-их лікарських товариств - Одеса, 1996,- С. 235 (співавт. Семенова І.О., Січанова >.В.).

34. Профилактика повреждающих эффектов гипоксии замкнутого пространства Abstrakts international Conference: Environmental and Occupational Health and Safety і Agriculture on the Bodary of Two Millennia, September, 8-11, 1998, Kiev, Ukraine.-:iev,1998. - P. 131 (співавт. Лукьянчук В.Д.).

35. Особенности углеводного обмена у крыс при гипоксии замкнутого прс странства в нагревающем микроклимате // Досягнення сучасної фармації т перспективи її розвитку у новому тисячолітті: Матеріали V Національного з’їзд фармацевтів України,- Харків, 1999.-С.393-394.

36. Радіоімунний аналіз експериментальної терапії гіпоксичного синдрому Школа акад. О.І.Черкеса: ідеї, розвиток, перспективи: Матеріали наукове конференції, присвяченої ІООфіччю з дня народження академіка О.І.Черкеса - К 1994.- С. 78 (співавт. Лук’янчук В.Д.).

37. Роль іонів кальцію в механізмі розвитку гіпоксичного синдрому// Матеріал ХІУ з'їзду Українського фізіологічного товариства ім. І.П.Павлова: Тез. доп.-К 1994.-С. 136-137 (співавт. Лук’янчук В. Д., ДзубанК.М.).

38. Содержание некоторых биометаплов в гепатоштах при гипоксии замкнуте го пространства и его фармакокоррекция // Материалы юбилейной научне практической конференции, посвященной 100-летию со дня основания 4-й горо; ской больницы. - Луганск, 1996.- С. 7.

39. Сравнительная оценка эффективности кверцетина с различным содержат ем ацетилсалициловой кислоты при гипоксии на фоне перегрева // Акту алы проблеми клінічної фармакології (перспективи розвитку науки та викладання Матеріали 1 Української наукової конференції за участю країн СНД,- Вінниці 1993,- С.117-118 (еоавт. Новосельцева Н.В.).

40. Сучасні погляди на механізм дії блокаторів кальцієвих каналів при гіпокс замкнутого простору // Сучасні проблеми фармакології : Матеріали І Націоналі ного з’їзду фармакологів України.- К.,1995,- С. 147-148.

41. Фармакокорекція рівня тригл іцеридів сироватці крові при гіпоксичном синдромі // Актуальні питання охорони здоров’я дітей та підлітків Донбасу: Збірнії наукових робіт. Випуск 2,- Луганськ, 1997,- С.76-78 (співавт. Белоусова І.П Померанцева О.В.).

42. Фармакотерапия гипоксии замкнутого пространства в условиях глубоки угольных шахт // Актуальні проблеми клінічної фармакології: Матеріали ] Української наукової конференції з міжнародною участю. - Вінниця, 1998.- С.246.

43. Экспериментальная модель сочетанной травмы, вызванной дефицитом кг слорода на фоне высокой температуры // Актуальні питання використати лаборг тарних тварин в медико-біологічних дослідженнях: Материали науково-практичне конференції,- Чернівці, 1992.- Т.2.- С. 189-190 (співавт. Лук’янчук В.Д., Сергее С.М., Лисенко О.А.).

44. Blocantele canaleor de calciu - antihipoxante cu proprietati termoprotectoare Tezele cinferintei stiintifici anuale 17-19 mai 1994.- Chisinau, 1994,- P.67 (Nicolai S.L Luchianciuc V.D.).

Анотаци

Савченкова Л.В. Экспериментальное обоснование путей лекарственной про-)илактики гипоксии замкнутого пространства в нагревающем микроклимате. Ру-опись.

Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук по спе-(иальности J4.03.05 - фармакология. - Институт фармакологии и токсикологии iMH Украины, Киев, 1999.

Диссертация посвящена изучению патогенеза и установлению лимитирующих веньев гипоксии замкнутого пространства, развивающейся в нагревающем микро-лимате и, на этой основе, теоретическому и экспериментальному обосновашш ффекптвных путей ее лекарственной профилактики.

Проведенные исследования показали, что в основе патогенеза изучаемой фор-1Ы гипоксического синдрома лежит распространенная мембранопатия, обуслов-енная нарушениями окислительно-антиоксидантного гомеостаза в результате ак-ивации свободнорадикалыюго перекисного окисления л1ШИД0В с выраженным □быточным накоплением продуктов всех этапов деградации фосфолипидов и од-ювременным истощением основных компонентов антиоксидантной системы орга-тама. Особенно важную роль при этом играет резкая активация метаболизма ара-вдоковой кислоты по липокснгеназному и щшюоксигеназному путям с повы-тенной продукцией таких фупп эйкозаноидов, как лейкотриены (В4) и простаглан-ины (Е2). Центральное место занимают выявленные нарушения энергетического омеостаза и функционирования естественных путей детоксикации организма, что роявляется существенным снижением уровня высокоэнергетических фосфатных вязей (АТФ) и соответствующим увеличением содержания АДФ, АМФ и Фн на >оне резкого изменения таких показателей биоэнергетических процессов, как энер-етический заряд и энергетический потенциал, степень и индекс фосфорилирова-ш, термодинамический контроль дыхания и сравнительный коэффициент, а также величением доли анаэробного гликолиза. Методом ЭПР-спектрометрии доказано нижение уровня компонентов митохондриальной (Fe,S-белки, семихинониые сво-одные радикалы) и микросомальной (цитохром Р-450 и Мо5+-содержащие пара-[агнитные комплексы) элеьлротранспортных цепей гепатоцитов.

В скриниговых исследованиях in vitro, а также in vivo на модели острой гипок-ии замкнутого пространства на фоне перегрева, наиболее высокая профилактиче-кая активность выявлена у биофлавоноида кверцетина в комбинации с ацетилса-ищшовой кислотой в дозах, соответственно, 100 и 50 мг/кг; цшшаризина - в дозе 0 мг/кг и пентоксифиллина - 150 мг/кг. При этом коэффгашеггг антипптоксической ащиты составляет: для кверцетина в комбинации с ацетилсалициловой кислотой -,82, для циннаризина -1,67 и для пентоксифиллина - 1,52.

Комплексные исследования молекулярных механизмов антнгипоксического ействия изучаемых лекарственных средств при их профилактическом применении у

животных с моделируемой формой гипоксии замкнутого пространства позволит установить, что в основе протекторного эффекта кверцетина с ацетилсалидиловс кислотой лежат ее антиоксидангные свойства, реализуемые в существенном сниж нии интенсивности генерации и накопления свободных радикалов и продуктов ПО на фоне сохранения активности и содержания основных компонентов антиоксидан ной системы организма (каталаза, супероксиддисмутаза, М гг' -содержащие парама нигные комплексы, 8Н-группы, глутатион). Мембраностабилизирующее действі изучаемой комбинации лекарственных средств является следствием реализации анп липоксигеназных и антидаклооксигеназных свойств. Кроме того, комбинируем!, лекарственные средства-устраняют дисбаланс в системе адениловых нуклеотидов одновременным усилением процессов глюконеогенеза и нормализацией уровня ко; понентогі митохондриальной й микросомальной электротранспорты* цепей гсп тоцитов в изучаемых условиях. Комбинируемые препараты позволяют регулироват реакции передачи внутриклеточного сигнала по аденилат- и гуанилатциклазному гг тям, за счет повышения продукции цАМФ и цГМФ.

В основе же механизма антигипоксического действия циннаризина лежат еі мембраностабилизирующие свойства, как следствие проявления антиоксидантної эффекта, а также способности предупреждать развитие “кальциевого парадокса” изучаемых экстремальных условиях. Антиидклооксигеназные и антилейкотрие» вые свойства циннаризина предотвращают снижение уровня компонентов мин хондриальной и микросомальной электронгранспортных цепей, способствуя, в к< нечном итоге, нормализации энергетического гомеостаза с одновременной актив, цией глюконеогенеза. Применение циннаризина корригирует процессы передав внутриклеточного сигнала по аденилатциклазному пути, а также метаболизм ар, хидоновой кислоты, повышая при этом уровень эндогенных протекторов ГИПОКСІ

- цАМФ и простациклина.

Антигипоксический эффект пентоксифиллина обусловлен его способность модифицировать аденилатцшшазный мессенджерный каскад за счет повышещ продукции цАМФ и изменять метаболизм арахидоновой кислоты в изучаемых эк тремальных условиях путем угнетения синтеза простагландина Е2 и повышещ количества простагландина 12.

Комбинированное применеіпіе кверцетина, ацетилсалициловой кислоты, циі наризина и пентоксифиллина за 2 часа до начала формирования гипоксии замкн; того пространства в нагревающем микроклимате реализуется повышением коэс фициента антигипоксической защиты на 20% по сравнению с раздельным введені ем этих препаратов, а также полным сохранением антиоксидантно-прооксі дантного равновесия у животных в изучаемых экстремальных условиях.

Ключевые слова: гипоксия замкнутого пространства, нагревающий микрокга мат, молекулярно-биохимические механизмы, профилактика, кверцетин, ацетиле лициловая кислота, циннаризин, пентоксифиллин.

Савченкова Л.В. “Експериментальне обгрунтування шляхів лікарської рофілактики гіпоксіїзамкнутого простору в нагріваючому мікрокліматі”. Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора медичних наук за теціальністю 14.03.05 - фармакологія. - Інститут фармакології та токсикології МН України, Київ, 1999.

Дисертація присвячена вивченню патогенезу та встановленню лімітуючих інок гіпоксії замкнутого простору в нагріваючому мікрокліматі і на цій основі їоретичному та експериментальному обгрунтуванню ефективних шляхів її ікарської профілактики.

Проведені комплексні дослідження показали, що в основі патогенезу ивчаємої форми гіпокснчного синдрому лежить розповсюджена мембранопатія, ка обумовлена порушеннями окислювально-антиоксидантного гомеостазу на тлі рискорення метаболізму арахідонової кислоти. Центральне місце займають також орушення енергетичного гомеостазу та функціонування природних шляхів гтоксикації організму.

В роботі проведеш фармакологічне вивчення молекулярно-біохімічних меха-ізмів антигіпоксичної дії біофлавоноїду кверцетину в комбінації з ацетилсапі-шювою кислотою, представника групи блокаторів кальцієвих каналів - іщнари-тоу, та похідного ксантину - пеіггоксіфіліну при гіпоксії замкнутого простору в мовах нагріваючого мікроклімату.

Ключові слова: гіпоксія замкнутого простору, нагріваючий мікроклімат, олекулярно-біохімічні механізми, профілактика, кверцетин, ацетилсаліцилова ислота, цинаризин, пентоксіфілін.

Savchencova L.V. “An experimental substantiation of ways of medicinal preventiv maintenance of hypoxia of the closed space in a heating up microclimate”. The mam script.

The dissertation on competition of a scientific degree of the doctor of medical sc ences 14.03.05 - pharmacology. - Institute of pharmacology and toxicology AMS с Ukraine. Kiev, 1999.

The dissertation is devoted to study of pathogenesis and establishment of limitin parts of hypoxia of the closed space in a heating up microclimate and on this basis to theoretical and experimental substantiation of effective ways of her medicinal preventiv maintenance.

The carried out complex researches have shown, that in a basis of pathogenesis с the investigated form of hypoxic syndrome is widespread (distributed) membranopath; which is caused by infringement of the oxidizing-antioxidanting homoeostasis on a bacl ground of acceleration of an arachidonic acid metabolism. The central place is borrowe also by infringements power of homoeostasis and functioning of natural ways of organisi detoxication.

In work the pharmacological study of molecular-biochemical mechanisms of the ar tihypoxic action of bioflawonoid quercetine with an acetylsalicylic acid, representative с group othe calcium channels blocators - cinnarizine and xanthine derivatives - pentoxify line at hypoxia of the closed space in conditions of a heating up microclimate.

Key words: hypoxia of the closed space, heating up microclimat, moleculai biological mechanisms, preventive maintenance, quercetine, an acetylsalicylic acid, cir narizine, pentoxifylline.

Підписано до друку 03.09.99 p. Формат 60x90/16 Ум. друк. арк. 2,0. Тираж- 100 прим. Зам. №47 Видавничий центр ЛДМУ м. Луганськ, кв. 50-річчя оборони Луганська, I