Автореферат и диссертация по медицине (14.00.44) на тему:Экспериментальное обоснование использования гистидинсодержащих дипептидов в кристаллоидном кардиоплегическом растворе

на правах рукописи

АЛИХАНОВ САРДАР АМИРХАНОВИЧ

«ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ГИСТИДИНСОДЕРЖАЩИХ ДИПЕПТИДОВ В КРИСТАЛЛОИДНОМ КАРДИОПЛЕГИЧЕСКОМ РАСТВОРЕ»

(сердечно - сосудистая хирургия 14.00.44) (анестезиология и реаниматология 14.00.37)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

Москва-2009

003470415

Работа выполнена в Научном Центре сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н. Бакулева РАМН.

Научные руководители:

Доктор медицинских наук, профессор

Профессор, академик РАМН Бокерия Лео Антонович

Доктор медицинских наук Мовсесян Рубен Рудольфович

Официальные оппоненты:

Иванов Алексей Сергеевич - доктор медицинских наук, профессор, руководитель отделения хирургии врождённых пороков сердца Российского научного центра хирургии им. Б.В. Петровского РАМН

Григорьянц Рачик Гагикович - доктор медицинских наук, руководитель отделения переливания крови Научного Центра сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н. Бакулева РАМН

Ведущая организация: «Федеральный Научный Центр трансплантологии и искусственных органов им. В.И. Шумакова» Минздравсоцразвития РФ.

Защита диссертации состоится ¿¿С 2009 г. в /^ъ часов на заседании Диссертационного Совета Д 001.015.01. при Научном Центре сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н. Бакулева РАМН (121552, Москва, Рублёвское шоссе, 135, конференц-зал №2).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Научного Центра сердечно-сосудистой хирургии им А.Н.Бакулева РАМН.

Автореферат разослан «^Г» еСб&ъ?^ 200^?.

Учёный секретарь Диссертационного Совета,

доктор медицинских наук Газизова Динара Шавкатовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

С момента выполнения операций на открытом сердце в условиях искусственного кровообращения, сохранение жизнеспособности миокарда является одной из главных проблем хирургии сердца. Были предложены различные методы остановки сердца: методы фармакохолодовой и кровяной кардиоплегии (КП), электрические и др. методы. Сравнение эффективности защиты миокарда с помощью тех или иных методов являются основными темами большинства работ, посвященных кардиоплегии.

До сих пор, вопросы состава КПР, коллоидно-осмотического давления и осмолярности, наличия биологически активных веществ, экспозиции и кратности введения, способов их доставки, давления при нагнетании, температурных режимов и т.д. остаются открытыми.

Оптимальным методом кардиоплегической защиты явилась бы ситуация, при которой ишемические повреждения миокарда, имеющие место до операции, подвергались бы обратному развитию в ходе выполнения защиты миокарда. Таким образом, одной из основных задач КП, с целью предупреждения ишемических повреждений, является повышение буферной ёмкости КПР, по возможности, естественными буферными субстратами. Основным недостатком кристаллоидных КПР по сравнению с растворами на основе крови является отсутствие естественных буферных систем, для нейтрализации кислых продуктов метаболизма, образующихся при ишемии миокарда.

Как известно, белковые буферы предпочтительнее для стабилизации внутриклеточного рН, метаболизма и лучше способствуют восстановлению сократительной способности миокарда, по сравнению с

бикарбонатным буфером, который используется в кристаллоидных растворах внеклеточного типа. Исходя из этого, было бы разумно использовать в КПР белковые буферы, обладающие сродством с белковыми системами миокарда. Оптимальным КПР может считаться раствор, в котором используются несколько буферных субстратов. Из известных дипептидов, обладающих высокой буферной активностью, целесообразно использование карнозина, состоящего из р-аланина Ь-гистидина, его производного - М-ацетилкарнозина, и Ь-гистидина. Такое сочетание позволило бы повысить буферную ёмкость раствора с поддержанием в физиологических пределах рН и осмолярности.

Цель исследования:

Теоретически обосновать и экспериментально апробировать новый состав кардиоилегического раствора на основе естественных дипептидов.

Задачи исследования:

1. Провести теоретическое обоснование использования дипептидов в составе кардиоплегического раствора.

2. Разработать модель для проведения экспериментального обоснования и апробации нового кардиоплегического раствора.

3. Провести комплексную оценку эффективности нового раствора с использованием мониторинга сердечной деятельности, а также методов биохимического и морфологического исследования.

4. Провести сравнительную оценку эффективности различных кардиоплегических растворов на одной экспериментальной модели.

Научная новизна В настоящей работе впервые проведено теоретическое обоснование использования природных дипептидов в составе кардиоплегического раствора внеклеточного типа. В результате теоретического обоснования

предложен новый состав кардиоплегического раствора на основе естественных дипептидов. Впервые определена эффективность сочетанного использования трёх дипептидов: карнозина, его ацетилированного производного и гистидина в КПР.

Практическая ценность исследования

Создана модифицированная модель изолированного сердца животного. Особенностью установки является проведение перфузии изолированного сердца двумя методами: по Ьаг^епс1огГ и по >1се1у. Установка снабжена полиграфом для ЭФИ, модулем для ЭКГ, датчиком растворённого в крови (растворе) кислорода, датчиком давления, позволяющие с максимальной точностью изучить параметры работы изолированного сердца. Модульная организация установки позволяет настраивать систему для решения различных задач при каждом эксперименте. Появилась возможность экспериментально обосновать применение различных добавок в растворах для перфузии, с изучением их влияния на электрофизиологию сердца, с возможным последующим применением полученных результатов в клинической практике Центра.

Разработан новый КПР с использованием природных дипептидов, буферная емкость которого превышает многие существующие аналоги. Экспериментальное обоснование кардиопротекторных свойств карнозина, ацетилкарнозина, гистидина в гиперкалиевом КПР с пониженной концентрацией ионов кальция позволяет начать клиническое испытание нового гиперкалиевого КПР.

Основные положения, выносимые на защиту.

Использование гистидинсодержащих дипептидов в гиперкалиевом КПР, с пониженной концентрацией кальция, способствуют более эффективной защите миокарда по сравнению с раствором №3 НЦ ССХ и

раствором «Кустодиол», на модифицированной модели изолированного сердца крысы, в условиях длительной ишемии (480 минут), при гипотермии +12°С +14°С. Комплексное экспериментальное исследование работы изолированного сердца животного, включающее компьютерный мониторинг сердечной деятельности, определение биохимических и морфологических маркёров, позволяет оценить структуру и функцию сердца на этапах реперфузии.

Реализация результатов исследования

Теоретическое обоснование, а также результаты экспериментального исследования, позволили приступить к клинической апробации предложенного КПР. Оформлена заявка на изобретение. Разработанная и созданная модель изолированного сердца, может с успехом использоваться в других научных исследованиях.

Апробация работы

Материалы исследования были доложены и обсуждены: на XI и XII ежегодной научной сессии Научного Центра сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н. Бакулева с Всероссийской конференцией молодых ученых (Москва, 2007, 2008); на XIII Всероссийском Съезде сердечнососудистых хирургов (Москва, 2007); на V Конференции молодых ученых России с международным участием: "Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины" (Москва, 2008). Материалы исследования были доложены и обсуждены на Ученом Совете центра в 2008 году.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, принята заявка на изобретение.

Объём и структура диссертации

Объём диссертационной работы составляет 125 страниц машинописного текста. Диссертация состоит из введения, четырёх глав, заключения, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы. Иллюстративный материал представлен 8 рисунками, 14 диаграммами и 29 таблицами.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ Материал и методы

В работе проанализирован материал 60 экспериментов на изолированном сердце крысы. Эксперименты проводили на базе биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова, лаборатории кардиоплегии, лаборатории экспресс - диагностики биохимии и отдела патологической анатомии НЦ ССХ им. А.Н. Бакулева РАМН, в период с июня 2006 года по февраль 2007 года. С целью проведения сравнительного анализа эксперименты разделены на 3 группы: I группа -кардиоплегия осуществлялась раствором КЗ НЦ ССХ; II группа -кардиоплегия «НТК»-раствором; III группа - кардиоплегия «АСН»-раствором.

В эксперименте использовали сердца белых крыс, линии Вистар, самцов, массой от 300 до 350 грамм, в возрасте 5-6 месяцев.

Крысу декапитировали, затем фиксировали на препаровальном столике. Производили разрез кожи, брюшных мышц и диафрагмы. Захватив пинцетом мечевидный отросток, делали разрезы по обеим сторонам от грудины и обнажали сердце. Находили аорту и, как можно дистальнее, рассекали трахею и сосудистый пучок, подходящий к аорте. Сердце помещали в ванночку с раствором Кребса-Хензеляйта (+4°С).

Таблица № 1. Составные компоненты кардиоплегических растворов.

Компоненты (ммоль/л) I группа (п = 20) раствор КЗ НЦ ССХ II группа (п = 20) «НТК»-раствор III группа ( п = 20) «АСН»-раствор

Натрий 110 15 110

Калий 15 10 15

Кальций 0,09 0,02 0,03

Магний 16 4 16

Маннит 104 30 25

Гистидин - 180/18 5

Карнозин - - 100

А цетилкарнозин - - 40

Глюкоза 5,6 - -

Кетоглютарат - 1 -

Триптофан - 2 -

МаНСОз 24 - -

Аорту очищали от пленок и соединительной ткани и отрезали непосредственно перед изгибом и местом отхождения плечевых и мозговых артерий. В результате образовывался остаток аорты, представляющий собой трубку длинной 5-6 мм, который натягивали на канюлю. Поверх аорты накладывали лигатуру, после чего сердце оказывалось фиксированным в установке для перфузии (от момента извлечения сердца до начала его перфузии проходило не более 3 минут). После чего следовал 15 минутный период адаптации сердца к условиям перфузии с непрерывной регистрацией всех параметров. Перфузия осуществлялась в соответствии с традиционной схемой Лангендорф

раствором Кребса - Хензеляйта (рН 7,3-7,4) при температуре 37°С. Затем прекращали перфузию, и вводили КПР с температурой +12°С - +14°С, в течение 5 минут, по 15-20 капель в минуту.

Сердце в ванночке с раствором Кребса - Хензеляйта помещали в камеру с температурой +7°С - +8°С на 480 минут, моделируя тотальную ишемию, после чего проводили реперфузию в течение 45 минут (Рис.1).

Рисунок № 1. Схема эксперимента на изолированном сердце крысы.

Перфузия Ишемия Реперфузия

* » <- » < »

15 мин 480 минут 45 минут

Буферную емкость рассчитывали по формуле (по вал Слайку):

p = JL = 2303

í/pH

+РЛ+[01П

цл:+[н+])2 ) (к+[н+])

«2.303- ^

где db - количество в эквивалентах сильного основания, добавленное к 1 л буферного раствора, с - общая молярная концентрация слабой кислоты и ее соли MA, К - константа диссоциации кислоты.

Оценка параметров сердечной деятельности.

Оценку сердечной деятельности проводили непрерывной регистрацией кривой давления в левом желудочке (ЛЖ). Для этого в полость JDK через аорту вводился полиэтиленовый катетер толщиной 0.75 мм, заполненный жидкостью и подсоединённый к датчику давления. Сигнал датчика давления через предусилитель подавался на вход аналого-цифрового преобразователя компьютера каждые 5 миллисекунд (в среднем 100 точек на сердечный цикл) и регистрировался с помощью программы Pulsar (разработанной на кафедре ФЧЖ биологического факультета МГУ). Регистрация шла с частотой дискретизации аналогового сигнала 0.2 кГч,

что позволяло достаточно точно регистрировать кривую давления в ЛЖ. Затем, с помощью программы Pulsar рассчитывались следующие параметры: систолическое давление (СД, мм.рт.ст.), конечно -диастолическое давление (КДД, мм.рт.ст.), развиваемое давление -амплитуда, вычислялась как разница между СД и КДД, в мм.рт.ст.; частоту сердечных сокращений изолированного сердца (ЧСС, уд./мин). ЧСС вычислялась как величина, обратная длительности периода (Р) между максимумами давления в ЛЖ в минутах (ЧСС=1/Р). Сократимость вычислялась как произведение амплитуды на ЧСС/мин, и выражалась в мм.рт.ст/мин. Также рассчитывали +dp/dt max и -dp/dt шах -максимальную скорость фронта и спада пульсовой волны в ЛЖ. При анализе показателей сравнивали исходные значения работы изолированного сердца со значениями параметров сердечной деятельности на 15, 30 и 45 минутах реперфузии во всех группах. Достоверность различий между ними вычисляли с помощью критерия Манна - Уитни в программе Statistica 6.0.

Биохимическое исследование проводили взятием проб раствора оттекающего от правого сердца до введения КПР (проба 1). Остальные пробы забирались во время реперфузии в динамике на 15 (проба 2), 30 (проба 3) и 45 минутах (проба 4). Были изучены одни из важных биохимических критериев адекватности защиты миокарда: рН, р02, уровень лактата в оттекающем перфузате от «правого сердца». Исследования проводились на газовом анализаторе ABL 800 FLEX (Radiometer Medical ApS., Дания).

Таблица № 2. Значения рН и осмолярности КПР.

Параметры раствор №ЗНЦ ССХ НТК-раствор АСН-раствор

рН 7.7-7.8 7.02-7.2 7.2-7.4

Осмолярность 340-345 мосм/л 310 мосм/л 320-340 мосм/л

Гистохимическое исследование миокарда выполнено во всех группах. Для гистохимического исследования после реперфузии, сердце снимали с канюли и погружали на 20 секунд в петролейный эфир, охлаждённый до -70°С. Затем, в микротоме при -19°С, компании «Leica Microsystems CM 1510» (Германия), изготавливали срезы толщиной 10 микрон всех исследованных сердец крыс. Срезы фиксировали на предметных стёклах в криостате, затем их окрашивали гематоксилином и эозином по Ван Гизон в модульном аппарате «Leica/Jung Autostainer XL» (Германия), а также гистохимически выявляли активность сукцинатдегидрогеназы (СДГ) по методу Nachlas. Определяли содержание нейтральных липидов при помощи масляного красного О (Oil red О) по Лилли с помощью микроскопа «Leica DM LS» (США).

В кардиомиоцитах оценивали степень развития и распространения жировой дистрофии (ЖД) и/или суданофилии:

А) Определяли выраженность ЖД: отсутствие очагов ЖД, диффузная суданофилия (ДС), мелкоочаговая мелкокапельнаая жировая дистрофия (ММЖД), крупноочаговая мелкокапельнаая жировая дистрофия (КМЖД), очаговая распространённая жировая дистрофия (ОРЖД), диффузная жировая дистрофия (ДЖД). В) Оценивали локализацию очагов повреждения: верхушка, передняя и задняя стенка, базальные отделы ЛЖ. С) И их расположение по слоям миокарда: ЖД в эпикардиальном отделе и эндокардиальном отделе ЛЖ, интрамурально. D) По выраженности контрактурного повреждения определяли слабую, среднюю и выраженную степень повреждения миокарда.

Результаты исследования и их обсуждение

При изучении буферной ёмкости, по данным теоретических расчётов, получены значения буферной ёмкости 30 » 33 мэкв/л ед.рН, при

pli 7.4 и осмолярности 320-340 мосм/л. При титровании, с измерением pli, в эксперименте при добавлении определённой концентрации сильного основания к 1 л буферного раствора наблюдали изменения рН на единицу. В результате подсчёта получили буферную ёмкость 35,7 мэкв/л-ед.рН., при тех же показателях рН, осмолярности и температуры.

Мониторинг показателей сердечной деятельности в режиме «онлайн», как и интраоперационное мониторирование в клинике, является одним из наиболее доступных методов оценки работы изолированного сердца, а в клинике - как метод оценки системы кровообращения в режиме реального времени. В данном исследовании для оценки состояния миокарда в режиме реального времени использовали несколько показателей. Это, прежде всего величина амплитуды, отражающая давление в ЛЖ в единицу времени (диагр. 1).

Диаграмма № 1. Динамика средних значений амплитуды.

В I группе на всех этапах реперфузии значения амплитуды были достоверно низкими. Во II группе на первом этапе реперфузии амплитуда была сниженной по сравнению с III группой, но выше чем в I группе. На двух следующих основных этапах реперфузии во II группе отмечалось повышение средних значений амплитуды. В III группе на всех этапах реперфузии значения амплитуды были достоверно выше (р<0,05), чем в I

группе. Во II и III группе показатели значений амплитуды достоверно не различались и оставались в пределах нормальных значений амплитуды.

Важным показателем сердечной деятельности в клинике и эксперименте является ЧСС. В данном исследовании за частоту сердечных сокращений принимали нормальные сокращения сердца (с одинаковой амплитудой на определённом равном расстоянии друг от друга) и экстрасистолы (внеочередные сокращения сердца с различной амплитудой), так как последние компенсировали сердечный выброс.

Во всех группах ЧСС была максимальная на последнем этапе реперфузии. Во I группе средняя ЧСС была достоверно меньше, по сравнению со II и III группой (р<0,05). Во II и III группе достоверных различий по ЧСС не отмечалось.

Диаграмма № 2. Динамика ЧСС на основных этапах реперфузии.

В клинической практике, как и в эксперименте, если в период реперфузии на ЭКГ регистрируются частые экстрасистолы, принято считать о неадекватной защите миокарда.

Минимальные нарушения ритма и единичные экстрасистолы в III группе, по-видимому, связано концентрацией магния в растворе «ACH» с минимальной концентрацией кальция.

Диаграмма № 3. Динамика экстрасистолии, % от общей ЧСС.

По мнению Grubbs R. D добавление магния в КПР снижает частоту развития послеоперационных аритмий и улучшает защиту миокарда несколькими способами. Например, способность магния контролировать как вход кальция в клетку, так и его высвобождение из мембраны сарколеммы, где кальций находится в связанном состоянии. По данным Buckberg G.D., применение магния в КПР с низкой концентрацией калия может вызвать асистолию, в связи с этим в растворе «ACH» концентрация калия и магния осталась такой же, как и в растворе КЗ.

Во всех группах отмечалась тенденция к увеличению +dp/dt шах и -dp/dt max, параллельно увеличению ЧСС, к концу реперфузии.

Таблица № 5. Динамика средних значений +dp/dt шах на основных этапах реперфузии.

Этап I группа II группа III группа

реперфузии (раствор №3) (НТК-раствор) (АСН-раствор)

15 минут 1082+46 1458.6+59 1618.4+63

30 минут 1168+62 2197.8+52 2080.2+61

45 минут 1303.2+64 2374.6±62 2268.7+48

При анализе полученных данных, было отмечено, что максимальная скорость фронта (таб.5) и максимальная скорость спада пульсовой волны (таб.6) на 15 минуте реперфузии в III группе была достоверно больше,

чем в I и II группах (р<0,05). Затем, на 30 минуте реперфузии, наблюдалось достоверное увеличение максимальной скорости фронта и спада пульсовой волны во II и III группе по сравнению с I группой (р<0,00001). На 45 минуте отмечалось увеличение +dp/dt max и -dp/dt max в трёх группах. Максимальная скорость фронта пульсовой волны во II и III группе была достоверно выше по сравнению с I группой (р<0,00001). При анализе средних значений максимальной скорости фронта и спада пульсовой волны на 30 и 45 минуте, достоверных различий между II и III группами отмечено не было.

Таблица № 6. Динамика средних значений -dp/dt max.

Этап реперфузии I группа (раствор №3) II группа (НТК-раствор) III группа (АСН-раствор)

15 минут 632.5+42 997.1+42 1232.5+42

30 минут 828+38 1501.3+48 1498+43

45 минут 951.5+48 1657+37 1627.8+62

В эксперименте, сократительную способность миокарда мы изучали по показателям компьютерного мониторинга. Сердце крысы рассматривалось как сердце с высоким миокардиальным резервом, а не больное.

Диаграмма № 5. Динамика сократительной активности миокарда, %

от исх. значений.

К началу рсперфузии во всех группах отмечалась тенденция к увеличению сократительной способности миокарда от 15 минуты к 30 минуте рсперфузии, и от 30 минуты к 45 минуте реперфузии. Сократимость миокарда ЛЖ в III группе была достоверно больше, чем в I (р<0,001) и была достоверно больше, чем во II группе (р<0,05).

Высокая сократительная активность во II группе по сравнению с I группой, объясняется наличием в растворе «Кустодиол» гистидина, его солянокислой фракции и триптофана. В эксперименте на крысах, на модели изолированного сердца, Алабовский В.В. с соавт., улучшали сократительную активность миокарда добавлением во внеклеточный раствор природного дипептида, Ы-ацетилкарнозина, существующий в определенной концентрации в здоровой сердечной мышце. По-видимому, хорошая сократимость миокарда в III группе, которая была выше сократимости в I и II группе, связано с добавлением в АСН-раствор № ацетилкарнозина.

Биохимическая оценка состояния миокарда многими авторами выделяется как важный критерий для оценки эффективности защиты миокарда. В комплексе с компьютерным мониторированием, динамика биохимических показателей даёт более точное представление о функциональном состоянии сердечно-сосудистой системы.

Для оценки состояния метаболизма миокарда на основных этапах оперативного вмешательства были использованы биохимические показатели, информативность которых подтверждена в исследованиях, анализирующих состояние миокарда у больных во время операций на открытом сердце.

Критического снижения значений рН не наблюдалось ни в одной группе. Критическим принято считать снижение значений рН ниже 7.0,

когда происходит угнетение активности фермента фосфофруктокиназы, участвующего в превращении глюкозы в пируват, что является неотъемлемым этапом как аэробного, так и анаэробного гликолиза. Это приводит к быстрому истощению запаса макроэргических соединений.

Таблица № 8. Динамика рН, в отекающем от «правого сердца» растворе.

Этап реперфузии I группа (раствор №3) II группа (НТК-раствор) III группа (АСН-раствор)

15 минут 7.223+0.02 7.251+0.03 7.338+0.06

30 минут 7.242+0.02 7.298+0.02 7.381+0.04

45 минут 7.281+0.04 7.341+0.04 7.381+0.05

В I группе значения рН в отекающем от «правого сердца» растворе в течение всего реперфузионного периода оставались низкими. Отмечалось достоверное снижение показателей рН в сторону ацидоза (р<0,001), по сравнению со значениями рН в III группе. По-видимому, это связано с тем, что происходило вымывание недоокисленных продуктов метаболизма, накопленных за время кардиоплегической ишемии. Описание подобных изменений биохимических показателей в клинике связывают с синдромом «wash-out».

Во II группе значения рН на начальном этапе реперфузии оставались низкими. Как и в I группе отмечалось достоверное снижение показателей рН в сторону ацидоза (р<0,05) по сравнению со значениями рН в III группе. К концу реперфузии, значения рН во II группе были достоверно выше, по сравнению со значениями рН в I группе.

При анализе кислотно-щелочного равновесия по величине рН в I и II группах отмечался ацидотический сдвиг, однако если в I группе сдвиг носил постоянный характер, то во II группе сдвига на последнем этапе реперфузии не наблюдали, что свидетельствует об обратимости

метаболического ацидоза по мере усиления сократительной активности миокарда.

В III группе уровень рН на всех этапах реперфузии оставался в пределах физиологических значений. Достоверных различий между показателями рН до введения КПР и на основных этапах реперфузии отмечено не было, что свидетельствует об эффективной защите миокарда в III группе. Значения рН в III группе были достоверно выше, по сравнению со значениями рН в I группе (р<0,001) на всех этапах реперфузии и достоверно высокими, по сравнению со значениями рН во II группе (р<0,05). Ацидоза в III группе не наблюдалось.

Одним из важных биохимических показателей, исследуемых в практике для оценки метаболического сдвига, является определение БЕ. Исследование величины показателя БЕ является определяющим фактором расчёта количества оснований, необходимого для коррекции их дефицита в экстрацеллюлярной жидкости. Однако, в данном исследовании, в качестве перфузионного раствора в системе изолированного сердца был раствор Кребса- Хензеляйта, а не кровь, где определение БЕ не существует. В нашем исследовании об адекватности миокардиального метаболизма можно судить по таким биохимическим критериям, как лактат и показателям обмена кислорода.

О потреблении кислорода миокардом можно косвенно судить по насыщению кислородом крови из коронарного синуса. В данном исследовании потребление миокардом кислорода косвенно судили по разнице рОг в притекающем к сердцу растворе и отекающем от «правого сердца» растворе.

Таблица № 9. Динамика разницы pCh и лактата (М+ш).

Время Параметры Кардиоплегическне растворы Р

КЗ Кустодиол лен

15 мин р02, MMHg 2.0+0.94 9.0+1.15 26+1.41 p(U)<0.0001(3) рз<0.05(и)

лактат, ммоль/л 0.37+0.016 0.3+0.04 0.15+0.015

30 мин р02, MMHg 6+0.96 9+1.24 14+1.67 р<1Д)<0.0001(з) Р5<0.05(1Д>

лактат, ммоль/л 0.32+0.03 0.19+0.0+ 0.07+0.02

45 мин р02, MMHg 7+1.76 11+1.76 3+1.67 рз<0.0001(1,2) рз<0.05(1,2)

лактат, ммоль/л 0.25+0.03 0.15+0.03 0.05+0.02

Таким образом, динамика показателей КЩС на этапе перфузии и основных этапах реперфузии показала обратимость метаболического ацидоза по мере восстановления сократительной активности миокарда. При сравнении показателей КЩС на основных этапах реперфузии подтверждена эффективность кардиоплегии в III группе по сравнению с I и II группами, где проявления метаболического ацидоза были выражены.

Морфологическая картина препаратов в эксперименте явилась дополнением к полученным результатам компьютерного мониторинга и биохимического анализа. При проведении гистохимического анализа в некоторых препаратах отмечались изолированные выраженные контрактурные изменения в субэндокардиальном слое в области верхушки. Вероятно, эти изменения могли быть связаны и с контактным повреждением, отдатчика, помещённого в ЛЖ.

Во всех препаратах I группы наблюдали более значительную выраженность контрактурных повреждений миокарда по сравнению с препаратами II и III группы. Во II группе контрактурные изменения

наблюдались преимущественно в субэпикардиальном отделе, по сравнению с препаратами I группы, где они располагались субэпикардиально, субэндокардиально и интрамурально. В 2 препаратах III группы контрактурных повреждений не отмечали. В 13 препаратах III группы распределение контрактурных повреждений было таким же, как и в препаратах II группы, преимущественно в субэпикардиальном слое ЛЖ. В 5 препаратах III группы, распределение контрактурных повреждений было таким же, как в I группе.

В I группе диффузная суданофилия, как предвестник ЖД, наблюдалась во всех препаратах. Во всех препаратах, обнаружены очаги ЖД с различной степенью её развития, от мелкоочаговых мелкокапельных участков до диффузного распространения. В I группе отмечено достоверное увеличение степени развития ЖД в 2,5 раза по сравнению с III группой (р<0,001), где были обнаружены очаги ЖД только в 9 препаратах. Во II группе в 11 (55%) препаратах обнаружили участки диффузной суданофилии, которые были расположены преимущественно в субэндокардиальном слое в области верхушки ЛЖ. Очаги ЖД во II группе были представлены мелкоочаговыми мелкокапельными, крупноочаговыми мелкокапельными и очаговыми распространёнными участками. Диффузной ЖД не обнаружено ни в одном препарате. В 11 препаратах II группы обнаружили участки ДС. Степень развития ЖД в препаратах II группы была достоверно выше в 1,5 раза по сравнению с III группой (р<0,05), где очаги ЖД были обнаружены в 5 препаратах. В III группе диффузная суданофилия наблюдалась в 13 (65%) препаратах. В III группе очаги ЖД были расположены в виде мелкоочаговых и крупноочаговых мелкокапельных участков. Очаговой распространённой и диффузной ЖД в препаратах III группы не обнаружено.

На основании полученных результатов можно заключить, что ни при одном из применённых методов защиты миокарда, в условиях гипотермии и длительной ишемии не было идеального сохранения миокарда. Но в сравнительном аспекте, раствор, содержащий карнозин, ацетилкарнозин и гистидин, с пониженной концентрацией кальция лучше защищает миокард (количество повреждений миокарда резко снижено, особенно в субэпикардиальном отделе.), чем раствор «Кустодиол» и раствор №ЗНЦ ССХ.

Выводы

1. Теоретически обосновано использование естественных дипептидов в составе кардиоплегического раствора. Расчетная буферная емкость предложенного раствора составляет 33 - 35 мэкв/л ед.рН., что в 1,5 раза превосходит буферную емкость крови.

2. Разработана модифицированная модель изолированного сердца, которая позволила наиболее адекватно провести сравнительное исследование по изучению кардиопротекторых свойств различных КПР, результаты которых подтвердились морфологическими и биохимическими исследованиями.

3. В сравнительном аспекте раствор «ACH», содержащий карнозин, ацетилкарнозин и гистидин, после длительной ишемии (480 минут) и гипотермии (+12СС - +14°С), способствует более эффективному восстановлению сердечной деятельности и повышению сократимости миокарда с минимальными нарушениями ритма и проводимости, по сравнению с растворами КЗ НЦ ССХ и «Кустодиол».

4. При использовании КПР «ACH» в постишсмическом периоде отмечалось преобладание аэробного окисления, кислородная

задолженность и уровень лаката были минимальными (/111(0.05+0.02)</П(0.15+0.03 )</1(0.25+0.03).

5. Гистохимическое исследование миокарда при различных способах защиты показало, что использование гиперкалиевого КПР «АСН» с пониженной концентрацией кальция способствует снижению контрактурных изменений в миокарде, а гистидинсодержащие дипептиды препятствуют образованию в очагах ишемии жировой дистрофии.

Практические рекомендации

1. При изучении эффективности защиты миокарда, после кардиоплегии, нового кристаллоидного КПР рекомендуется проводить сравнительную его оценку с наиболее известными растворами внеклеточного типа «Госпиталя Св.Томаса» и внутриклеточного типа «Кустодиола».

2. Для создания дополнительного противоишемического эффекта КПР рекомендуется добавление природных дипептидов в концентрациях: ацетилкарнозина 40 ммоль/л, карнозина 100 ммоль/л, гистидина 5 ммоль/л с поддержанием рН раствора в диапазоне от 7.2 до 7.6, осмолярности на уровне 320-340 мосм/л и буферной ёмкости свыше 20 мэкв/л*ед.рН.

3. В связи, с химической особенностью дипептидов, изменять рН кардиоплегического раствора в зависимости от температуры, как в кислую, так и в щелочную сторону, рекомендовано соблюдать температуру хранения кардиоплегического раствора от +8°С до +15°С.

4. Для снижения интенсивности метаболизма сердечной мышцы и предупреждения холодовой ишемической констрикции сосудов сердца рекомендуется введение КПР при температуре +12°С - +14°С.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДЕССЕРТАЦИИ:

1. Мовсесян, P.P. Дополнительный протиЕ шшемический эффект карнозина и его производных в кардиоплегическом растворе / P.P. Мовсесян, С.А. Алиханов, Э.Д. Нисневич и др. // Бюллетень НЦ ССХ им. А.Н. Бакулева РАМН «Сердечно-сосудистые заболевания». -2008. - Том 9. С. 98.

2. Мовсесян, P.P. Кардиопротекторный эффект гистидинсодержащих дипептидов при фармакохолодовой кардиоплегии / P.P. Мовсесян, С.А. Алиханов, Э.Д. Нисневич и др. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2008. - Том 145. - №3. - С. 291.

3. Алиханов, С.А. Оценка степени повреждения миокарда гистохимическим методом / С.А. Алиханов, Т.В. Артюхина, P.A. Серов и др. // Бюллетень НЦ ССХ им. А.Н. Бакулева РАМН «Сердечно-сосудистые заболевания». - 2007. - Том 8 . - №6. - С.208.

4. Алиханов, С.А. Экспериментальная оценка влияния на миокард кардиоплегического раствора №3 НЦ ССХ им. А.Н. Бакулева РАМН, кустодиола, и калиевого раствора на основе N-ацетилкарнозина, карнозина, и L-гистидина (ACH) в условиях длительной ишемии / С.А. Алиханов, Л.А. Бокерия, P.P. Мовсесян и др. // Бюллетень НЦ ССХ им. А.Н. Бакулева РАМН «Сердечно-сосудистые заболевания» -2007. - Том 8. - №6. - С. 209.

5. Алиханов, С.А. Противоишемический эффект гистидиновых дипептидов при фармакохолодовой кардиоплегии на модели изолированного сердца крысы / С.А. Алиханов // Бюллетень НЦ ССХ им. А.Н. Бакулева РАМН «Сердечно-сосудистые заболевания». -2008.-Том 9.-№3.-С. 118.

6. Бокерия, JI.A. Сравнительная оценка ацетилкарнозина и бикарбоната натрия в калиевом кардиоплегическом растворе (КПР) в условиях длительной ишемии / J1.A. Бокерия, P.P. Мовсесян, A.A. Болдырев* и др. // Бюллетень НЦ ССХ им. А.Н. Бакулева РАМН «Сердечнососудистые заболевания». - 2007. - Том 8. - №3. - С. 120.

7. Бокерия, Л.А. Изучение параметров работы сердца на модифицированной модели изолированного сердца крысы до и после кардиоплегии / Л.А. Бокерия, Р.Р. Мовсесян, В.Т. Костава и др. // Бюллетень НЦ ССХ им. А.Н. Бакулева РАМН «Сердечно-сосудистые заболевания». - 2008. - Том 9. - №6. - С. 221.

Подписано в печать:

03.04.2009

Заказ № 1806 Тираж -150 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

С момента выполнения операций на открытом сердце в условиях искусственного кровообращения, сохранение жизнеспособности миокарда является одной из главных проблем хирургии сердца. Были предложены различные методы остановки сердца: фармакохолодовая и кровяная кардиоплегии, электрические и др. Сравнение эффективности защиты миокарда с помощью тех или иных методов являются основными темами большинства работ, посвящённых кардиоплегии.

Адекватная защита миокарда является существенным условием успеха операций на открытом сердце с искусственным кровообращением. Существуют классификации кардиоплегических растворов (КПР), наиболее полно учитывающие их патофизиологические и методические особенности: по механизму воздействия на миокард, способу применения раствора для кардиоплегии, основному составу раствора для кардиоплегии, месту введения кардиоплегического раствора, температурному режиму и т.д.

До сих пор, вопросы состава кардиоплегических растворов, коллоидно-осмотического давления и осмолярности, наличия биологически активных веществ, экспозиции и кратности введения, способов их доставки, давления при нагнетании, температурных режимов и т.д. остаются открытыми.

Оптимальным методом кардиоплегической защиты явилась бы ситуация, при которой ишемические повреждения миокарда, имеющие место до операции, подвергались бы обратному развитию в ходе выполнения защиты миокарда.

Таким образом, одной из основных задач кардиоплегии, с целью предупреждения ишемических повреждений, является повышение буферной ёмкости кардиоплегического раствора, по возможности, естественными буферными субстратами. Основным недостатком кристаллоидных КПР по сравнению с растворами на основе крови является отсутствие естественных буферных систем, для нейтрализации кислых продуктов метаболизма, образующихся при ишемии миокарда. Из имеющихся на сегодняшний день в арсенале кардиохирургии кристаллоидных кардиоплегических растворов, только «НТК - раствор» (Custodiol*) обладает высокой буферной ёмкостью. В качестве буферного субстрата в «НТК-растворе» используется гетероциклическая аминокислота - гистидин, которая является основным компонентом белкового буфера. Как известно, белковые буферы предпочтительнее для стабилизации внутриклеточного рН, метаболизма и лучше способствуют восстановлению сократительной способности миокарда, по сравнению с бикарбонатным буфером, который используется в кристаллоидных растворах внеклеточного типа.

Исходя из этого, было бы разумно использовать в кардиоплегических растворах белковые буферы, обладающие сродством с белковыми системами миокарда. Оптимальным кардиоплегическим раствором может считаться раствор, в котором используются несколько буферных субстратов. Из известных дипептидов, обладающих высокой буферной активностью, целесообразно использование карнозина, состоящего из Р-аланина L-гистидина, его ацетилированного производного - N-ацетилкарнозина, и L-гистидина. Их сочетанное использование в растворе позволило бы повысить буферную ёмкость раствора с поддержанием в физиологических пределах рН и осмолярности. А также поддержать внутриклеточную кислотность за счёт различной степени диссоциации имидазольных групп гистидинсодержащих дипептидов и, следовательно, более эффективно сохранить уровень АТФ.

Исходя из этого, были определены цель и задачи нашего исследования.

Цель исследования

Теоретически обосновать и экспериментально апробировать новый состав кардиоплегического раствора на основе естественных дипептидов.

Задачи исследования:

1. Провести теоретическое обоснование использования дипептидов в составе кардиоплегического раствора.

2. Разработать модель для проведения экспериментального обоснования и апробации нового раствора.

3. Провести комплексную оценку эффективности нового кардиоплегического раствора с использованием мониторинга сердечной деятельности, а также методов биохимического и морфологического исследования.

4. Провестр! сравнительную оценку эффективности различных кардиоплегических растворов на одной экспериментальной модели.

Научная новизна

В настоящей работе впервые проведено теоретическое обоснование использования природных дипептидов в составе кардиоплегического раствора внеклеточного типа.

В результате теоретического обоснования предложен новый состав кардиоплегического раствора на основе естественных дипетидов.

Впервые определена эффективность сочетанного использования трёх дипептидов: карнозина, его ацетилированного производного и гистидина в кардиоплегическом растворе.

Практическая ценность

В лаборатории кардиоплегии НЦ ССХ им. А.Н. Бакулева РАМН, спустя 20 лет после последних исследований кардиоплегических растворов на изолированной модели сердца крысы, вновь создана модифицированная модель изолированного сердца животного. Особенностью установки является проведение перфузии изолированного сердца двумя способами: по методу Langendorf и по методу Neely. Новая модифицированная модель изолированного сердца крысы снабжена полиграфом для электрофизиологических исследований, модулем для ЭКГ, датчиком растворённого кислорода в крови (растворе), датчиком давления, позволяющими с максимальной точностью изучить параметры работы изолированного сердца. Модульная организация позволяет настраивать систему для решения различных задач при каждом эксперименте. Появилась возможность экспериментально обосновать применение различных добавок в растворах для перфузии, с изучением их влияния на электрофизиологию сердца, с возможным последующим применением полученных результатов в клинической практике Центра.

Разработан новый кардиоплегический раствор с использованием природных дипептидов, буферная емкость которого превышает многие существующие аналоги. Экспериментальное обоснование кардиопротекторных свойств карнозина, ацетилкарнозина, гистидина в гиперкалиевом кардиоплегическом растворе с пониженной концентрацией ионов кальция, в условиях длительной ишемии и гипотермии, позволяет начать клиническое испытание нового гиперкалиевого кардиоплегического раствора.

Основные положения, выносимые на защиту.

Использование гистидинсодержащих дипептидов в гиперкалиевом кардиоплегическом растворе, с пониженной концентрацией кальция, способствуют более эффективной защите миокарда по сравнению с раствором №3 НЦ ССХ и раствором «Кустодиол», на модифицированной модели изолированного сердца крысы, в условиях длительной ишемии (480 минут), при гипотермии +12*С - +14*С.

Комплексное экспериментальное исследование работы изолированного сердца животного, включающее компьютерный мониторинг сердечной деятельности, определение биохимических и морфологических маркёров, позволяет оценить структуру и функцию сердца на этапах реперфузии.

Реализация результатов исследования

Теоретическое обоснование, а так же результаты экспериментального исследования, позволили приступить к клинической апробации предложенного кардиоплегического раствора. Оформлена заявка на изобретение. Разработанная и созданная модель изолированного сердца, может с успехом использоваться в других научных исследованиях.

Апробация работы

Материалы исследования были доложены и обсуждены:

- на XI Ежегодной научной сессии Научного Центра сердечнососудистой хирургии им. А.Н. Бакулева с Всероссийской конференцией молодых ученых (2007г.)

- на XIII Всероссийском Съезде сердечно-сосудистых хирургов (2007г.)

- на XII Ежегодной научной сессии Научного Центра сердечнососудистой хирургии им. А.Н. Бакулева с Всероссийской конференцией молодых ученых (2008г.)

- на V Конференции молодых ученых России с международным участием: "Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины" (2008г.)

Материалы исследования были доложены и обсуждены на Ученом Совете центра в 2008 году.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, принята заявка на изобретение.

106 выводы

Теоретически обосновано использование естественных дипептидов в составе кардиоплегического раствора. Расчетная буферная емкость предложенного раствора составляет 33 — 35 мэкв/л-ед.рН., что в 1,5 раза превосходит буферную емкость крови.

Разработана модифицированная модель изолированного сердца, которая позволила наиболее адекватно провести сравнительное исследование по изучению кардиопротекторых свойств исследуемых кардиоплегических растворов, результаты которых подтвердились морфологическими и биохимическими исследованиями.

В сравнительном аспекте раствор «АСН», содержащий карнозин, ацетилкарнозин и гистидин, после длительной ишемии (480 минут) и гипотермии (12-14*С), способствует более эффективному восстановлению сердечной деятельности и повышению сократимости миокарда с минимальными нарушениями ритма и проводимости, по сравнению с растворами КЗ НЦ ССХ и «Кустодиол».

При использовании КПР «АСН» в постишемическом периоде отмечалось преобладание аэробного окисления, кислородная задолженность и уровень лаката были минимальными (/ш(0.05±0.02)</п(0.15±0.03)</i(0.25±0.03).

Гистохимическое исследование миокарда при различных способах защиты показало, что использование гиперкалиевого кардиоплегического раствора «АСН» с пониженной концентрацией кальция способствует снижению контрактурных изменений в миокарде, а гистидинсодержащие дипептиды препятствуют образованию в очагах ишемии жировой дистрофии.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При изучении эффективности защиты миокарда, после кардиоплегии, исследуемого нового кристаллоидного кардиоплегического раствора рекомендуется проводить сравнительную его оценку с наиболее известными растворами внеклеточного типа «Госпиталя Св.Томаса» и внутриклеточного типа «Кустодиола».

2. Для создания дополнительного противоишемического эффекта КПР рекомендуется добавление природных дипептидов в концентрациях: ацетилкарнозина 40 ммоль/л, карнозина 100 ммоль/л, гистидина 5 ммоль/л с поддержанием рН раствора в диапазоне от 7.2 до 7.6, осмолярности на уровне 320-340 мосм/л и буферной ёмкости свыше 20 мэкв/л*ед.рН.

3. В связи, с химической особенностью дипептидов, изменять рН кардиоплегического раствора в зависимости от температуры, как в кислую, так и в щелочную сторону, рекомендовано соблюдать температуру хранения кардиоплегического раствора от +8*С до +15*С.

4. Для снижения интенсивности метаболизма сердечной мышцы и предупреждения холодовой ишемической констрикции сосудов сердца рекомендуется введение кардиоплегического раствора при температуре 12-14*С.