Автореферат и диссертация по медицине (14.00.07) на тему:Экспериментальное и теоретическое обоснование системы краткосрочных тестов на цитотоксичность малорастворимых промышленных пылей для их гигиенической оценки

РГ6 оа НА ПРАВАХ РУКОПИСИ

ШАРАПОВА Надежда Евгеньевна

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ И ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ СИСТЕМЫ КРАТКОСРОЧНЫХ ТЕСТОВ НА ЦИТОТОКСИЧНОСТЬ МАЛОРАСТВОРИМЫХ ПРОМЫШЛЕННЫХ ПЫЛЕЙ ДЛЯ ИХ ГИГИЕНИЧЕСКОЙ

ОЦЕНКИ

14.00.07. - Гигиена

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1996

Работа выполнена в Медицинском научном Центре профилак тики и охраны здоровья рабочих промпредприяти г.Екатеринбурга

Научный руководитель:

доктор медицинских наук

JI. И. Привалова

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук кандидат медицинских наук

С.М.Павленко, Л.А.Луценко .

Ведущая организация - Уральская Государственная медицинская Академия

Защита состоится "_" _ 1996 г. г

_ час.

На заседании Диссертационного совета Д.084.05.01 при Московском ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательском институте гигиены им. Ф. Ф.Эрисмана по адресу:

141000, г.Мытищи, Московской обл., ул.Семашко, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского НИИ

гигиены им.Ф.Ф.Эрисмана

Автореферат разослан " -/С- " ff 1996г.

т- -^-

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор медицинских наук,

профессор A.A. Комарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Промышленная пыль является одним из самых распространенных вредных факторов 'Производственной среды, и пневмокониозы, пылевые заболевания легких, занимают ведущее место в структуре профессиональных заболеваний (Лебедева Н.В.,1986). Несмотря на значительные успехи в развитии технических мер пылеподавления, опасность возникновения новых случаев профессиональных заболеваний от действия пыли не устранена в ряде отраслей промышленности, в т.ч. и в высоко развитых промышленных странах (Fraumeni J.F., Foreward А.,1986), что наносит значительный экономический и социальный ущерб обществу. Поэтому наряду с поиском эффективных методов борьбы с пылеобразованием и методов биологической профилактики пылевых заболеваний легких, актуальное значение сохраняют задачи прогнозирования вредного действия на организм промышленных аэрозолей, образующихся при технологических процессах, и регламентации их допустимого содержания в воздухе рабочей зоны. Решение этих задач не должно отставать от освоения новых месторождений ископаемых, внедрения в производство новых материалов .

Для целей гигиенической характеристики промышленных пылей по-прежнему широко используются хронические экспериментальные исследования, но такие эксперименты требуют больших временных и материальных затрат, что делает актуальным создание набора адекватных краткосрочных тестов "in vivo" и "in vitro".

Способность пыли вызывать повреждение макрофага, независимо от механизмов такого повреждения, принято называть ее цитотоксичностью. Эту характеристику оценивают в различных кратковременных тестах, что связано с господствующими представлениями о ключевой роли повреждения пылевыми частицами макрофагов в патогенезе силикоза и других пнев-мокониозов (Величковский Б.Т., Кацнельсон Б.А., 1964; Ве-личковский Б.Т.,198 0; Кацнельсон Б.А. и соавт.,1995). Используются также тесты, основанные на регистрации феноменов активации макрофага или на том или ином сочетании этих явлений. Однако трактовка результатов тестирования и их использование для прогнозирования действия пыли на организм часто проводятся без учета роли процессов активации и

повреждения макрофага как в механизмах, лежащих в основ теста, так и в патогенезе пневмокониозов.

Недостаточно учитывается в такой трактовке и то, чт кинетические характеристики накопления пыли в легких, яв ляющегося обязательным условием развития пневмокониоза также зависят от её цитотоксичности для легочных макрофа гов.

При этом совершенно не развиты подходы к использовани: показателей цитотоксичности для прогнозирования способно сти пылевых частиц к их накоплению в легких, что делае1 использование указанных тестов недостаточно полным.

Большинство исследований ограничивается использование; какого-либо одного из известных тестов на цитотоксичность Однако едва ли может быть назван краткосрочный метод предпочтительный для всех случаев, поскольку каждый ускоренный тест имеет свои достоинства-и недостатки. Следовательно, для повышения надежности скрининга возникает необходимость создания и использования минимальной, но достаточной батареи тестов. В связи с этим необходимы поиск новых информативных тестов, а также развитие1 теоретически: основ их использования, уточнение показаний к применениь тех или иных тестов, их ограничений, сравнительная оценка информативности отдельных тестов.

Не изучено, в какой мере соответствует сравнительна; оценка цитотоксичности, полученная на крысиных клетках, сравнительной цитотоксичности тех же пылей для клеток человек. Выяснение этого вопроса необходимо для обосновани; экстраполяции на человека выводов о сравнительной цитотоксичности разных пылей, которые получены при тестирована на клетках крысы.

Для всех тестов на цитотоксичность пылей "in vitro", наряду с их общими достоинствами (быстрота, дешевизна ^ т.д.), характерен й общий недостаток, связанный с существенными отличиями культуральных сред от того микроокружения, в котором происходит взаимодействие макрофага и пылевых частиц "in vivo". Широко используемый способ оценка цитотоксичности по клеточному составу бронхо-альвеолярногс лаважа, полученного после интратрахеального введения малы* доз пыли, с оценкой числа нейтрофилов и отношения нейтро-филы:альвеолярные макрофаги, дает возможность получения более объективных результатов, но лишь в тех случаях, ко-

гда экспериментальные животные не подвержены скрытым воспалительным изменениям в легких. Такие воспалительные изменения нередко становятся причиной иск0женных показателей, из-за чего страдает надежность метода. Таким образом, возникает необходимость разработки других методов оценки цитотоксичности "in vivo".

Цель и задачи исследования. Целью исследования явля-

лось углубление теоретических основ и расширение возможности тестирования цитотоксичности малорастворимых пылевых частиц для прогнозирования их пневмокониозоопасности и ускорения гигиенической оценки, а также регламентации новых пылеобразующих материалов.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи .

1. Разработать новые тесты на цитотоксичность пыли "in vitro" на основе изменения способности макрофагов к адгезии и активности 51-нуклеотидазы, а также сопоставить их данные с результатами оценки цитотоксичности тех же пылей на основе снижения жизнеспособности в тесте с трипановым синим.

2. Исследовать соотношение процессов повреждения и активации макрофага в культуре макрофагов и причинно-следственную связь между этими эффектами на примере тех же тестов.

3. Разработать новый тест на цитотоксичность пылей "in vivo", основанный на количественной оценке реакции перито-неального фагоцитоза, и оценить его информативность.

4. Обосновать прогноз сравнительной способности к накоплению пыли в легких и лимфоузлах по данным оценки их сравнительной цитотоксичности с использованием математической модели кинетики накопления пыли и результатов хронических ингаляционных экспериментов.

5. Сопоставить ранговую оценку цитотоксичности разных пылей, полученную на крысиных и человеческих клетках.

6. Оценить информативность батареи краткосрочных тестов при сопоставлении показателей сравнительной цитотоксичности некоторых групп промышленных пылей с результатами хронических экспериментов и использовать этот экспериментальный материал для их гигиенической регламентации.

Научная новизна работы. В результате проведенных исследований :

- впервые с применением математической модели кинетики накопления пыли в легких и лимфоузлах показана возможность использования показателей цитотоксичности разных пылей для прогнозирования количественных различий этого накопления и интенсивности пневмокониотических изменений;

- разработан и апробирован новый способ оценки цито-токсического действия пылей на культуру макрофагов по снижению активности 5'-нуклеотидазы, показана высокая информативность этого метода, признанного изобретением;

- выявлена зависимость показателей реакции перитоне-ального фагоцитоза от дозы и цитотоксичности пыли, тем самым впервые показана перспективность его использования в качестве теста на сравнительную цитотоксичность "in vivo";

- продемонстрировано совпадение ранговой оценки цитотоксичности разных пылей, полученной на человеческих и крысиных клетках;

- обнаружено, что стишовит, одна из модификаций кремнезема, существенно более цитотоксичен, чем силикозогенная кварцитная пыль, и не может считаться биологически инертным.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Повреждающее действие пылевой частицы на макрофаг (цитотоксичность) является ключевым свойством, определяющим вероятность длительной задержки этой частицы в легочной ткани и в ткани легочно-ассоциированных лимфоузлов и интенсивность их ответной реакции.

2. Эффекты повреждения и активации макрофага, наблюдаемые в культуре макрофагов при инкубации с пылевыми частицами, оказывают различное влияние на показатели цитотоксичности в тестах "in vitro", причем активация имеет по преимуществу вторичное происхождение по отношению к повреждению макрофагов.

3. Для получения надежных прогнозов кониозоопасности пыли необходимо применять батарею краткосрочных тестов. В составе такой батареи информативным и адекватным является новьгй тест по оценке активности 5'-нуклеотидазы.

4._Культура крысиных перитонеальных макрофагов является адекватным тест-объектом для целей сравнительной оценки цитотоксичности "in vitro".

5. Ранговые порядки цитотоксичности и фиброгенности в пределах группы пылей, родственных по физико-химическим

характеристикам, в большинстве случаев соответствуют друг другу, что подтверждает важное значение тестирования цито-токсичности для обоснования ПДК малорастворимых промышленных аэрозолей.

Практическая значимость работы заключается в разработке методических подходов по ускоренной гигиенической оценке и регламентации малорастворимых промышленных аэрозолей .

Материалы проведенных исследований использованы при разработке:

1) методических рекомендаций "Использование клеточных систем "ин витро" и "ин виво" для ускорения гигиенической регламентации малорастворимых промышленных аэрозолей" ( утверждены 21.02.95 г. ГК Санэпиднадзора РФ, №01-19/2417) ;

2) ПДК в воздухе рабочей зоны для четырех групп пыле-образующих материалов:

- фторидов редкоземельных металлов (утверждено Постановлением №4 Гбскомсанэпиднадзора России от 18 марта 1993 г., дополнение №8 к перечню ПДК №4617-88);

пыли стекла и стеклянных строительных материалов (утверждено Постановлением №4 Госкомсанэпиднадзора России от 18 марта 1993 г., дополнение №8 к перечню ПДК №4617-88 ) ;

- пыли молотого угольного шлака и стройматериалов на его основе /шлакозит/ (утверждено Постановлением №12 от 20 октября 1993 г., дополнение №9 к перечню ПДК №4617-88);

- дунита и изготавливающихся на его основе магнезиаль-но-силикатных (форстеритовых) изделий (утверждено Постановлением N4 Госкомсанэпиднадзора России от 18 марта 1993 г., дополнение №8 к перечню ПДК №4617-88).

3) патента на изобретение "Способ определения цитоток-сичности малорастворимых пылей"( № 2019832 от 15.09.94 г. ) .

Методика по оценке активности 5'-нуклеотидазы применяется в научных и практических целях (Справка №09/106 МНЦ профилактики и охраны здоровья рабочих промпредприятий г.Екатеринбурга от 05.04.96.; Справка №01/3-119 Областного Центра санитарно-эпидемиологического надзора Свердловской области от 04.04.96.).

Апробация диссертации. Материалы исследований докладывались и обсуждались на конференциях МНЦ профилактики и охраны здоровья рабочих промпредприятий г.Екатеринбурга (14.06.90г., 22.11.90г., 05.12.91 г., 16.04.92г., 30.09.93г., 12.05.95 г.), 7-ом Всероссийском съезде гигиенистов и сан. врачей (Ростов-на-Дону, 1991г.), международном симпозиуме "Проблемы токсикологии и прикладной экологии" (Москва-Пермь, 1991г.), 2-ом Международном симпозиуме "Silica, Silicosis and Cancer" (San Francisco, California, USA, 1993), Всероссийской конференции "Актуальные проблемы теоретической и прикладной токсикологии" ( Санкт-Петербург, 21-23 ноября 1995г.), межотдельческой конференции в Московском НИИ гигиены им.ф.ф.Эрисмана (31.05.96 г. ) .

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 12 научных публикаций, 4 из них - в зарубежных научных журналах.

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, главы методов исследования, 3-х глав собственных исследований, обсуждения, выводов, списка использованной литературы, содержащего 194 источника, в том числе 101 работа зарубежных авторов. В объем диссертации входят Ii страницы машинописного текста, включая 2 6 таблиц и 6 рисунков .

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объем и методы исследований.

В соответствии с программой работы проведен комплекс экспериментальных исследований, включающий биохимические, цитологические, химические методы исследования, гравиметрический и дисперсометрический контроль при хронических ингаляционных пылевых воздействиях, метод математического моделирования.

Экспериментальные исследования проводились на лабораторных животных (беспородных белых крысах и мышах) и клеточных культурах (перитонеальных макрофагах этих видов, а также на моноцитах, изолированных из крови крыс и людей). Всего в работе использовано 980 крыс и 250 мышей, а также моноциты крови 18 здоровых лиц. В общей сложности выполнена 21 серия отдельных экспериментов, в том числе 5 хрони-

ческих, длительностью до б мес.(1 ингаляционный и 4 ин-тратрахеальных).

Были использованы экспериментальные модели пылевого повреждения перитонеальных макрофагов и моноцитов/макрофагов крови "in vitro" и пылевые экспозиции "in vivo" (интратрахеальный, внутрибрюшинный и ингаляционный способы запыления).

Перитонеальные макрофаги получали путем промывания брюшной полости животных стерильным физиологическим раствором через 48 ч после внутрибрюшинного введения 10-15 мл стерильного вазелинового масла. Цитотоксическое действие исследуемых пылей на культуру макрофагов "in vitro" определялось с помощью широко распространенного теста на невключение трипанового синего (Waters,1975) после 1,5 ч инкубации 2,5х106 макрофагов/мл с пылевой суспензией в дозе 3 мг/мл. Наряду с этим в нескольких сериях экспериментов для сравнительной оценки цитотоксичности малорастворимых пылей были апробированы два новых теста. В тесте на адгезию макрофагов к нейлоновой вате (Veninga, 1986) оценивали индекс прилипания (ИП) после 2,5 ч инкубации суспензии макрофагов, содержащей ЗхЮ6 клеток/мл, с суспензиями пылей, отличающихся по степени цитотоксичности (Ti02,DQ12), в дозах от 0,015 до 2,0 мг/мл. Во втором тесте проводилась оценка активности 5'-нуклеотидазы по модифицированному методу И.Д.Мансуровой (1973) после 2,5 ч инкубации культуры макрофагов, содержащей 2,5х106 клеток, с различными пылями в виде суспензий. В экспериментах по изучению соотношения эффектов активации и повреждения макрофагов эта оценка осуществлялась в интервале доз от 0,008 до 5 мг/мл. Оценка сравнительной цитотоксичности разных пылей этим методом проводилась при дозе пыли 5 мг/мл.

Оценка цитотоксичности пылей "in vivo" осуществлялась исследованием фагоцитарной реакции легких через 24 часа после интратрахеального введения 10 мг пыли в 1 мл физ.раствора (или после ингаляционного воздействия) с анализом соотношения нейтрофильных лейкоцитов и альвеолярных макрофагов в промывных водах легких крыс (Привалова Л.И., 1979).

Изучение сравнительной цитотоксичности 2-х пылей, значительно отличающихся по степени повреждающего действия на макрофаги (кварца DQ12 и Первоуральском кварцита) , и шее-

ти групп промышленных пылей проводилось как "in vitro", так и "in vivo", а сравнительной цитотоксичности кварцита и стишовита - только на первой модели.

Для решения вопроса о возможности использования фагоцитарной перитонеальной реакции для ускоренной сравнительной оценки цитотоксичности пылей было проведено несколько экспериментальных серий на нелинейных белых мышах, которым внутрибрюшинно вводились низкие дозы (5, 50 , 1000 и 2500 мкг ) пылей диоксида титана, Первоуральского кварцита и кварца DQi2. Исследовалась цитология перитонеального эксудата, полученного через различные временные интервалы (1; 4; 24 ч) после введения пылей.

Необходимым условием проведения экспериментов с целью изучения межвидовых различий чувствительности макрофагов к цитотоксическому действию пылей являлось применение однотипных клеток человека и животных. Оценка осуществлялась на культурах моноцитов периферической крови, которые при фиксации на пластиковой поверхности приобретают свойства макрофагов. Моноциты получали методом центрифугирования в градиенте плотности фиколл-верографин (Вядро М.М.,1977; Хейфец Л.Б. и др.,1973). Цитотоксичность пылей оценивали с помощью теста на невключение трипанового синего в монослое после 1 часовой инкубации 4х106 клеток с 3 мг пыли в 1 мл инкубационной среды.

В специальной серии экспериментов для выявления соотношения эффектов повреждения и активации макрофагов в культуре при экспозиции с пылями разной цитотоксичности были использованы продукты разрушения макрофагов (ПРМ), получаемые после 3-х кратного замораживания и оттаивания клеток перитонеального эксудата (Осипенко A.B., 1971; Привалова Л.И., 1989) .

Описание кинетики накопления в легких и в легочно-ассоциированных лимфоузлах пылей, существенно отличающихся по степени цитотоксичности (диоксида титана, Первоуральского кварцита и кварца DQ12), осуществлялось с помощью математической модели, разработанной Б.А. Кацнельсоном и соавт. (1991). Прогноз -количественных различий накопления пылей основывался на изменении параметров этой модели в соответствии с собственными данными оценки их сравнительной цитотоксичности в разных тестах. Проверка полученного прогноза проводилась по данным хронических ингаляционных

экспериментов. Одна группа крыс подвергалась хроническому запылению пылью Первоуральского кварцита в концентрации 81,2±7,9 мг/м3, а другая - пылью диоксида титана в концентрации 78,8±11,2 мг/м3 в течение 20 недель. Часть подопытных и контрольных животных умерщвлялась через 10 и 20 недель после начала запыления, оставшаяся часть - через 10 недель после прекращения эксперимента. Для проверки модельного прогноза кинетики накопления кварца О012 использовались результаты хронического ингаляционного эксперимента, проведенного западногерманскими исследователями (МогЬ и. et а1.,1989).

Количественная оценка развития силикотического фиброза в ингаляционном и 4-х хронических интратрахеальных экспериментах осуществлялась по изменению массы легких и трахе-обронхиальных узлов и содержания в них суммарного оксипро-лина (Хвапил М., 1960), а также по содержанию суммарных липидов экстракционно-весовым методом. В ингаляционном эксперименте эта оценка сопоставлялась с прогнозом, основанном на вычислении так называемого "интеграла действия" (Кацнельсон Б.А. и соавт.,1981) и учете сравнительной ци-тотоксичности кварцита и диоксида титана.

Во всех экспериментах оценка статистической значимости различий среднегрупповых значений показателей проводилась по критерию Стъюдента при использовании компьютерной

программы.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Использование показателей цитотоксичности для математического моделирования особенностей кинетики задержки пы-лей различной цитотоксичности: Первоуральского кварцита, диоксида титана и стандартного кварца Базовая матема-

тическая модель, параметры которой были проверены на основании данных нашего хронического эксперимента с пылью кварцита, обеспечила получение прогноза, очень близкого к экспериментальном результатам. При этом наблюдалось: 1) нарастание массы пыли в легких за период ингаляций и выход "на плато"; 2) снижение ее после их прекращений; 3) продолжающееся нарастание пыли в трахеобронхиальных лимфоузлах. Такое хорошее соответствие прогнозов результатам хронического эксперимента в целом подтвердило адекватность модели.

Моделирование особенностей кинетики задержки инертно! пыли диоксида титана и пыли особо высокой цитотоксичности, кварца DQi2, осуществлялось изменением значений тех констант скоростей переноса в базовой модели, которые зависят от цитотоксичности частиц. Эти изменения по знаку и степени обосновывались сопоставлением показателей сравнительно; цитотоксичности названных видов пыли, полученных нами npi их .тестировании "in vitro" и "in vivo". Такая имитация дала прогноз, удовлетворительно соответствующий собственном! хроническому эксперименту с диоксидом титана и ингаляционному эксперименту с кварцем DQ12 (Mohr U. е.а., 198 9).

Для диоксида титана модель прогнозирует меньшую задержку пыли в легких и ТБЛУ по сравнению с задержкой кварца, -а также более быстрое освобождение легких от диоксиде титана в постэкспозиционном периоде. Именно эти различия типичны для пылей высокой и низкой цитотоксичности.

Для кварца DQ12 модель дала аппроксимацию ко всем экспериментальным точкам, а также имитировала все особенности эмпирических данных. Во-первых, к концу ингаляционного периода имелось незначительное различие по содержанию кварца DQi2 ■ в легких и трахеобронхиальных узлах. Во-вторых, после прекращения эксперимента масса пыли в легких снизилась, а в трахеобронхиальных узлах возросла. В-третьих, в течение длительного ингаляционного периода наметилась тенденция к выходу легочной задержки "на плато".

Развитие пневмокониоза зависит не только от массы задержанной пыли, но и от длительности ее действия на ткань и интенсивности этого действия. Вычисленные на основе той же кинетической модели величины так называемого "интеграла действия" с учетом величины, соответствующей соотношению показателей цитотоксичности сравниваемых пылей "in vitro", позволили удовлетворительно прогнозировать количественные различия интенсивности пневмокониотических изменений, развивающихся после хронической ингаляционной пылевой экспозиции к кварциту и диоксиду титана.

Таким образом, цитотоксичность частиц оказывается определяющим фактором для математического прогнозирования сравнительной опасности развития пневмокониоза, поскольку это свойство определяет кинетику накопления и задержки пыли в легких и лимфоузлах, а также - интенсивность вредного действия на ткань этих органов. Это подтверждает значение

цитотоксичности как ключевого свойства, определяющего сравнительную пневмокониозоопасность малорастворимых промышленных аэрозолей, и адекватность ее оценки с помощью используемой нами системы тестов.

Влияние эффектов повреждения и активации макрофагов на показатели цитотоксичности. Оценка информативности новых тестов "in vitro". В работе исследовалась причинно-следственная связь феноменов активации макрофага, наблюдаемых при действии на него цитотоксичных пылевых частиц, с разрушением части макрофагов в этой же клеточной системе. Выявлена зависимость двух новых показателей, впервые апробированных с целью использования для ускоренной оценки цитотоксичности малорастворимых пылей "in vitro", от соотношения эффектов повреждения и активации макрофагов в зависимости от степени цитотоксичности и дозы пыли. В качестве одного из этих показателей использовали индекс прилипания макрофагов на нейлоновой вате, а в качестве другого - оценку активности 5'-нуклеотидазы.

Как показали результаты исследований, в обоих тестах не удается отыскать дозы пылей, которые оказывали бы только активирующее действие. Уже при минимальных активирующих дозах кварца и диоксида титана жизнеспособность культуры макрофагов была несколько снижена, т.е. часть клеток была погибшей (таблицы 1 и 2).

Таблица '

Индекс прилипания (ИП) и процент жизнеспособных клеток в суспензии ма!уэофагов при действии кварца 0(312 и оксида титана (х± Б*)

KOMI 1РНТПЯ1 11ИЯ ПЫЛИ DQ,2 T¡02

жизнеспосо б-ность (°/сЛ ИП (%) жизнеспосо б-ность (%) ИП (%)

контроль 88,4±1, 41,6±1, 85,3+3, 34,8±5,0

0,015 82,9+3, 48,4±2. 81,5+2, 37,1 ±3,4

0,03 78,3±3, 56,1±3, 81,0+2, 32,7±3,4

0,06 79,0±2, 49,8±7, 85,0+3, 37,4+4,7

0,12 76,9+3, 51,1+4, 80,8±3, 34,5±3,4

0,25 69,4±4, 46,2±4, 73,5+2, 34,8±3,1

0,5 51,3+4, 38,3±5, 72,0±0, 34,7+10,5

1,0 36,6±5, 30,4+5, 58,8±3, 42,5±4,3

2,0 22,1±4, 26,6+5, 48,8±5, 44,9+3,6

Примечание: значком "*" обозначены статистически значимые различия с контрольной группой (Р < 0,05 по "Г критерию Стьюдента).

Таблица 2

Активность фермента 5'-нуклеотидазы и жизнеспособность перитонеальных макрофагов при воздействии различных концентраций пыли стандартного кварца 00,2(^3.;)

Концентрации пыли DQ12 Активность 5'-нуклеотидазы Жизнеспособное ть клеток (%)

в мкг отщепленного неорганического фосфата в % от активности контрольной пробы

контроль 12,7±2,6 100 87,6±1,0

0,008 13,2+2,6 106,0+2,2 83,4±1,4

0,04 13,9+2,5 112,2±4,5 84,0±2,0

0,2 12,0±2,4 94,5+3,7 76,3+2,9*

1,0 10,1±2,2 79,2+5,3 63,6±3,7*

5,0 2,4±0,8* 23,0±5,3* 11,8+4,2*

Примечание: знаком "*" обозначены статистически значимые различия с контрольной группой (Р<0,05 по Т'-критерию Стьюдента).

Кроме того, в эксперименте при инкубации культуры макрофагов с искусственно полученными продуктами разрушения макрофагов -в отсутствии пыли зарегистрирована активация этих клеток по снижению активности 5'-нуклеотидазы. Эти факты свидетельствуют в пользу гипотезы, ранее высказанной и подтвержденной Л.И.Приваловой (1989), о вторичном характере активации макрофагов, еще сохранивших жизнеспособность, под влиянием продуктов разрушения макрофагов, погибших в результате цитотоксического действия пыли.

В тесте на адгезию макрофагов было обнаружено противоположное влияние эффектов повреждения и активации макрофагов на индекс прилипания (ИП). Сложная зависимость этого показателя от дозы пыли приводит к тому, что при определенной пылевой концентрации эффект столь различных по агрессивности пылей как высокоцитотоксичный кварц DQ12 и малоцитотоксичный диоксид титана оказывается не различим. Например, при концентрации 0,5 мг/мл эти пыли дали близкие значения ИП, но существенно отличались по проценту нежизнеспособных клеток (таблица 1).

Разработанный нами новый тест на цитотоксичность, основанный на измерении активности 51-нуклеотидазы макрофагов, обладает тем преимуществом, что активность указанного фермента под влиянием как повреждения, так и активации макрофагов изменяется в одном направлении, а именно, снижается. В целом степень этого снижения тем больше, чем ци-тотоксичнее пыль (рис.1). Кроме того, выявлено совпадение ранговых оценок цитотоксичности при тестировании пылей известной цитотоксичности на активность 5'-нуклеотидазы и тесте на жизнеспособность. Поэтому мы включили его в батарею тестов для ускоренного скрининга промышленных аэрозолей .

Зависимость количественных закономерностей реакции пе-ритонеального фагоцитоза от цитотоксичности и дозы пыли.

Параллельно с апробацией новых тестов "in vitro" был проведен поиск нового теста "in vivo". Для сравнительной оценки цитотоксичности малорастворимых пылей был испытан перитонеальный тест (рис.2 и 3) . Было обнаружено, что сдвиги клеточного состава перитонеального экссудата при внутрибрюшинном введении малых доз пылей подчиняются тем же закономерностям, что и сдвиги клеточного состава брон-хо-альвеолярного лаважа после пылевого воздействия на крыс. Для перитонеальной реакции мышей также характерна преимущественная мобилизация нейтрофильных лейкоцитов, причем число нейтрофильных лейкоцитов и отношение нейтрофильных лейкоцитов к перитонеальным макрофагам (НЛ/ПМ) повышаются с увеличением дозы и цитотоксичности пыли. Зависимость показателей внутрибрюшинного теста от цитотоксичности пыли, а также большая техкическая простота и меньшая материальная затратность теста, позволяют считать, что перитонеальный тест заслуживает дальнейшей разработки и бо

Активность 5'-нуклеотидазы Жизнеспособность клеток

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

ОКонпроль

Е2 Диоксид ггигтна

ШПереоуральс кий кварцит

ПКварц 00 -12

Рис. I. Сравнение ранговых порядков цнтотоксичности пылей в двух тестах. (Статистическая значимость отличий обозначена по сравнению с контрольной группой значком»+» , по сравнению с кварцем РСМ2 -."0").

Число НЛ *!06

4

3 ,5 3

2,5 2 -1 ,5 ' 1 ■ 0,5 ■ О

1 час

4 часа

2 4 часа

Рис.2 .Зависимость числа нейтрофилов от продолжительности действия кварца В<3-12 при внутрибрюшинном введении. (Значком "+" обозначено статистически значимое отличие от контроля). НЛ/ ПМ

2 5 0 0 м к г

Рис. 3. Зависимость отношения нейтрофилы / перитонеальные макрофаги от дозы пылей при внутрибрюшинном введении. (Статистическая значимость отличий обозначена по сравнению с контрольной группой значком'и+».'по сравнению с той же дозой диоксида титана - "О").

лее широких испытаний для целей ускоренного скрининга промышленных пылей.

Совпадение ранговой оценки цитотоксичности пылей, полученной на клетках человека и крысы. При параллельном тестировании одного и того же набора пылей разной цитотоксичности на однотипных клетках человека и крысы с применением теста на жизнеспособность тестируемые пыли расположились в одном и том же порядке по степени возрастания цито-токсичности как при испытании на клетках человека, так и клетках крысы: Первоуральский кварцит < кварц DQ12.

Такие результаты свидетельствуют о том, что крысиные клетки являются адекватным тест-объектом, и полученные на них данные о сравнительной цитотоксичности могут экстраполироваться на человека в целях прогнозирования сравнительной пневмокониозоопасности этих пылей.

Сравнительная цитотоксичность кварцита и стишовита. В кратковременных экспериментах с использованием теста на жизнеспособность макрофагов была сопоставлена цитотоксичность проб кварцита и диоксида титана с цитотоксичностью проб стишовита, являющегося особой структурной модификацией кремнезема (Stober, 1964) . Результаты исследований показали, что стишовит оказался существенно более цитотоксич-ным по сравнению с безусловно силикозогенной кварцитной пылью. За 90 мин.' инкубации процент нежизнеспособных клеток в контрольных культурах повысился до 22,6±1,5%, в культурах с диоксидом титана - до 34,6±9,9% (Р<0,001), с кварцем - до 45,б±3,1% (Р<0,001), со стишовитом до 58,4±2,-9% (Р<0,001); разница между двумя последними величинами также статистически значима. Таким образом, стишовит не может считаться биологически инертным.

Прогнозирование кониозоопасности и гигиеническая регламентация некоторых пылеобразующих материалов с использованием батареи краткосрочных тестов. В соответствии с утвердившейся в нашей стране методологией сравнительного принципа гигиенической регламентации аэрозолей нами бьш проведен прогноз сравнительной пневмокониозоопасности шести групп промышленных пылей, основанный на оценке результатов тестирования их цитотоксичности с помощью батареи тестов " in vitro" и "in vivo". Были исследованы следующие пылеобразующие материалы:

1) пыли, образующиеся в производстве угольных графити-рованных электродов;

2) пыли стекла и стеклянных строительных материалов;

3) пыли молотого угольного шлака и стройматериалов на его основе;

4) пыли производства огнеупорных изделий из дунита Кытлымского месторождения;

5) пыли производства ванадийсодержащих агломерата и окатышей;

6) фториды редкоземельных металлов.

Проверка прогноза для 4 групп осуществлялась в хронических интратрахеальных экспериментах. В итоге было установлено, что использование батареи ускоренных тестов на цитотоксичность с целью прогнозирования кониозоопасности пылей надежно в том случае, когда ранговые порядки цито-токсичности пылей совпадают во всех или в большинстве тестов. При значительной противоречивости результатов, полученных в разных тестах, как и при регламентации пылей, не имеющих групповых аналогов, проведение хронических экспериментов остается необходимым.

ВЫВОДЫ

1. Подтверждено значение цитотоксичности как ключевого свойства, определяющего сравнительную пневмокониозо-опасность малорастворимых промышленных аэрозолей, и адекватность его оценки с помощью использованной системы тестов по результатам математического моделирования кинетики задержки пыли в легочной ткани и в легочно-ассоциированных лимфоузлах, основанного на использовании количественных характеристик цитотоксичности "in vitro" и "in vivo" для пылей кварцита, стандартного кварца DQ12 и диоксида титана .

2. Эффекты повреждения и активации макрофага, наблюдаемые в культуре макрофагов при инкубации с пылевыми частицами, оказывают различное влияние на показатели цитотоксичности в тестах "in vitro", причем активация имеет по преимуществу вторичное происхождение по отношению к повреждению макрофагов.

3. Новый тест на цитотоксичность, основанный на измерении активности 5'-нуклеотидазы макрофагов, показал высокую информативность при ускоренной оценке цитотоксичность 6 групп пылеобразующих материалов.

4. Внутрибрюшинный тест, обладающий технической простотой, перспективен для оценки цитотоксичности пылей "ir vivo", поскольку его показатели зависимы от цитотоксичности 'пыли.

5. Стишовит, особая модификация кремнезема, обладает более высокой цитотоксичностью по сравнению с кварцитом v не может считаться биологически инертным.

6. Крысиные клетки являются адекватным тест-объектов для целей сравнительной оценки цитотоксичности малорастворимых промышленных пылей по итогам сравнения ранговых оценок цитотоксичности разных пылей на крысиных и человеческих моноцитах/макрофагах.

7. Для целей ускоренного тестирования промышленные аэрозолей на цитотоксичность необходимо применение батарее краткосрочных тестов из-за возможного неполного совпадения сравнительных оценок цитотоксичности одних и тех же ве-.ществ в разных тестах.

8. Соответствие друг другу ранговых порядков цитотоксичности, оцененной с помощью батареи ускоренных тестов, v фиброгенности, установленной в хронических экспериментам на крысах, в пределах группы пылей, родственных по физико-химическим характеристикам, подтверждает важное значение тестирования цитотоксичности для обоснования ПДК малорастворимых промышленных аэрозолей.

Список опубликованных работ по теме диссертации.

1. О влиянии кварцевой пыли на активацию перитонеаль-ных макрофагов "ин витро", оцениваемой по адгезии клеток к нейлоновой вате//ПроФ.болезни пылевой этиологии.

М.,1990.-с.126-134.

2. Способ сравнительной оценки цитотоксичности малорастворимых пылей по снижению активности 5'-нуклеотидазы е культуре макрофагов // -Медицина труда и промышленная экология. - 1994.- №8.-с.16-20.

3.- К обоснованию ПДК в воздухе рабочей зоны для пылей, образующихся в производстве нового строительного материала из стеклянного боя // Профессиональные болезни пылевой этиологии. - Екатеринбург: МНЦ профилактики и охраны здо-

ровья рабочих промпредприятий, 1992.-с.70-78.(в соавторстве ) .

4. Особенности клеточной реакции на внутрибрюшинное введение малых доз практически нерастворимых пылей неодинаковой цитотоксичности //Профессиональные болезни пылевой этиологии. - Екатеринбург: МНЦ профилактики и охраны здоровья рабочих промпредприятий, 1992. - с.79-89.( в соавторстве ) .

5. О значении системы кратковременных тестов на.цито-токсичность для гигиенической характеристики промышленных аэрозолей // Медицина труда и промышленная экология. 1993. - №1.-С.2-7. (в соавторстве) .

6. О групповой гигиенической регламентации пыли магне-зиально-силикатных минералов и огнеупорных материалов из них // Медицина труда и промышленная экология. - 1993. -N11-12. - с.18-20.( в соавторстве).

7. Патент 2019832 Способ определения цитотоксичности малорастворимых пылей. Опубл.15.0 9.94 г.

8. Экспериментальное изучение пневмокониозоопасности пылевого фактора в производстве нового типа строительных материалов из стекла и угольного шлака //Медицина труда и промышленная экология. - 1994. - №8. - с.8-12. ( в соавторстве ) .

9. A contribution to the establishment of a battery of short-term tests for estimating comparative cytotoxicity (an overview) // Current Toxicology. - 1993. - v.l,№l. -p. 63-69.( в соавторстве)

10. Mathematical modelling of key cellular mechanims which control the kinetics of the retention of cytotoxic dust particles in the pulmonary region and in the lung-associated lymp'n nodes //2-nd Int. Symposium on Silica, Silicosis and Cancer. October 28-30,1993. - Western Consortium for Public Health. USA. - p.238-244. ( в соавторстве) .

11. On the relationship between activation and breakdown of macrophages in silicosis //2-nd Int.Symposium on Silica, Silicosis and Cancer. October 28-30,1993.-Western Consortium for Public Health. USA. - p.245-251.( в соавторстве).

12. Prediction of the comparative intensity of pneumoconiotic changes caused by chronic inhalation exposure to dusts of different cytotoxicity by means of a mathematical model //Occupational and Environmental Medicine. - 1994. - v.51,N3. - p. 173-180. ( в соавторстве) .