Автореферат и диссертация по медицине (14.00.10) на тему:Диагностика клещевого энцефалита методом лантанидной иммунофлуоресценции

На правах рукописи 003451Уи<

КОЗЛОВА Елена Геннадьевна

ДИАГНОСТИКА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА МЕТОДОМ ЛАНТАНИДНОЙ ИММУМОФЛУОРЕСЦЕНЦИИ

14.00.10 - инфекционные болезни 14.00.46 - клиническая лабораторная диагностика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

о 6 ноп

Санкт-Петербург 2003

003451907

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Пермская государственная медицинская академия им ак. Е.А. Вагнера»

Научные руководители:

доктор медицинских наук профессор Воробьева Наталья Николаевна доктор биологических наук Помелова Вера Гавриловна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук профессор Антонова Тамара Васильевна

доктор медицинских наук профессор Пастушенков Владимир Леонидович

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная медицинская академия им. И.И. Мечникова»

Защита состоится 15 декабря 2008 года в 10 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 215.002.01 при Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова (194044, Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, д. 6).

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова

Автореферат разослан « _» октября 2008 г.

Ученый секретарь совета Доктор медицинских наук профессор Пономаренко Гм^йздой Николаевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Необходимость поиска новых высокочувствительных методов диагностики клещевого энцефалита (КЭ) обусловлена расширением ареала этой инфекции, высокой заболеваемостью, тяжелым течением с нередкой инвалидизацией, возможным летальным исходом и, в ряде случаев, сложностью серологического подтверждения.

Пермский край - один из наиболее активных очагов КЭ на территории РФ с показателем заболеваемости в 2007 г. 4,3 (средний показатель по РФ - 1,8) на 100 тыс. населения (Злобин В .И. и соавт., 2007). В последние десятилетия 20 века в структуре заболеваемости преобладали лихорадочная и менингеальная формы, на долю очаговой приходилось менее 10%, в сравнении с 1950-и гг. наблюдалась тенденция нарастанию тяжести заболевания и учащению двухволнового течения (Устинова 0.10. и соавт., 1997). Кроме того, отмечался рост случаев сочетанной инфекции КЭ с другими «клещевыми» инфекциями, чаще с иксодовыми клещевыми боррелиозами (ИКБ), что, возможно, связано с улучшением диагностики (Масалев В.В., 2000, Фризен В.И., 2005). С учетом этого, одной из задач исследования, проводимого в 2001-2004 гг., явилось изучение особенностей КЭ в сравнении в течением его в предыдущие годы.

В начале заболевания клинические проявления КЭ неспецифичны, что делает необходимой дифференциальную диагностику этой инфекции в эндемичном регионе с другими лихорадочными заболеваниями, возбудители которых передаются клещами, и требует обязательного серологического подтверждения. В последние годы для серодиагностики острого КЭ наиболее часто используют твердофазный иммуноферментный анализ (ТИФА). Он позволяет подтвердить диагноз уже на 4-5 день заболевания на - основании выявления антител (AT) класса М (Топычканова Н.Г., 1999). При отсутствии IgM диагноз может быть поставлен на основе появления или не менее чем 4-кратного нарастания титров IgG Однако у жителей эндемичного региона иммунный ответ (ИО) часто развивается на фоне уже существующих до начала заболевания IgG к вирусу клещевого энцефалита (ВКЭ), что влияет на срок появления, характер изменения уровня и скорость достижения максимальных титров AT классов М и G и должно учитываться при интерпретации результатов серологического тестирования (Кветкова Э.А., 1984). Некоторые авторы (Gunter G. и соавт., 2005) рекомендуют определять IgM и IgG одновременно уже в 3-й пробе сыворотки, чтобы выявить сероконверсию IgG и провести дифференциацию острого и персистешного течения инфекции. Кроме того, необходимо учитывать сложность диагностики бессимптомных, хронических форм, контроля их лечения, а также возможные случаи серонегативного КЭ (Фролова Т.В. и соавт., 2008). Поэтом)' разработка более чувствительных и специфичных методов серодиагностики КЭ остается актуальной.

В настоящей работе для серодиагностики КЭ был использован метод

лантанидного иммунофлуоресцентного анализа (ЛИФА). Он также прост в исполнении, как ТИФА, отличаясь видом метки и способом регистрации сигнала. Несомненным преимуществом ЛИФА по сравнению с ТИФА является более высокая чувствительность при индикации вирусов и серодиагностике вирусных инфекций, в том числе при выявлении AT к ВКЭ (Помелова и соавт., 1992, 1999). Вместе с тем, к моменту начала наших исследований в широкой клинической практике метод не применялся и его диагностическая эффективность оставалась практически неизученной.

При проведении масштабных лопуляционных исследований взятие и нанесение капиллярной крови на специальную фильтровальную бумагу (ФБ) является более простой, безопасной и экономичной процедурой в сравнении с венепункцией. Его преимущества были продемонстрированы при выявлении AT к возбудителям вирусных (ВИЧ-инфекция, вирусные гепатиты А и В, краснуха, корь, лихорадка Денге), бактериальных (лептоспироз, столбняк, сифилис, туляремия, среднеазиатский клещевой боррелиоз) и протозойных (малярия, токсоплазмоз, лейшманиоз) инфекций (Parker S.P. и соавт., 1999), одггако для диагностики КЭ ранее этот метод не использовался. В связи с этим мы оценили возможность использования высушенной капиллярной крови в качестве источника AT, альтернативного сыворотке, при серодиагностике КЭ методом ЛИФА.

Цель исследования.

Оценка диагностической чувствительности и специфичности иммунолюминесцентных тест-систем на основе ЛИФА для выявления специфических IgM- и IgG-AT ВКЭ в пробах сывороток и сухих пятен крови (СПК).

Задачи исследования:

1. Охарактеризовать современное течение клещевого энцефалита на Западном Урале.

2. Выявить особенности формирования специфического гуморального иммунитета при клещевом энцефалите у жителей эндемичного региона с помощью ЛИФА.

3. Определить показатели диагностической чувствительности и специфичности ЛИФА при выявлении IgM и IgG к ВКЭ в сыворотках крови в сравнении с коммерческими иммуноферментными тест-системами.

4. Установить диагностическую ценность ЛИФА, ее чувствительность и специфичность при определении IgM и IgG к ВКЭ в сухих образцах крови в сравнении с результатами анализа сывороток. .

Научная новизна исследования. Доказано, что показатели чувствительности и специфичности ЛИФА при выявлении IgM-AT к ВКЭ у пациентов, заболевших острыми лихорадочными заболеваниями в период сезонной активности клещей-переносчиков в эндемичном регионе сопоставимы

с показателями, полученными методом ТИФА.

Выявлено, что метод ЛИФЛ в 2,5 раза в сравнении с ТИФА более чувствителен при определении ^М-АТ у пациентов с длительно протекающим инфекционным процессом.

Показана возможность использования высушенной на ФБ капиллярной крови в качестве альтернативного источника АТ при серодиагностике КЭ. По сравнению показателями, достигнутыми при анализе сывороток в ТИФА, диагностическая чувствительность (ДЧ) ЛИФА при определении к ВКЭ в СПК составила 95,8%, диагностическая специфичность (ДС) - 97,1%.

Практическая значимость. Метод ЛИФА позволяет снизить трудоемкость лабораторных исследований при серодиагностике КЭ за счет исключения процедуры титрования проб. Благодаря более высокой чувствительности метода по сравнению с ТИФА, его использование предпочтительно при верификации клинического диагноза у больных с низким уровнем специфических ^М-АТ.

Методика ЛИФА для определения АТ к ВКЭ в сухих пятнах крови более экономична и доступна за счет простоты забора, хранения и доставки исследуемого материала и наиболее удобна в случаях затруднения с взятием крови из вены и во врем*' проведения массовых сероэпид<?миологических исследований.

Сформирована информационная база клиника-лабораторных данных и создан банк сывороточных л сухих образцов крови от обследованных групп населения Пермского края, используемые для выполнения ретроспективных популяционных и научных исследований.

Личное участие автора в получении результатов. Автором самостоятельно осуществлен набор пациентов в группы наблюдения, их клинико-анамнестическое обследование и взятие от них биоматериала (сыворотки, СПК). Создай банк охарактеризованных клинических проб (сыворотки и СПК) от обследуемых пациентов в эндемичном по КЭ регионе -Пермском крае. Все результаты клинико-анамнестического и лабораторного обследования перенесены в специально созданную электронную базу данных. Автор освоила методики выполнения ТИФА и ЛИФА для выявления противоэнцефалитных АТ в сыворотках и СПК, принимала участие в выполнении серологических исследований. Самостоятельно проведен статистический анализ первичной документации и результатов лабораторных данных.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Современное течение КЭ на Западном Урале характеризуется развитием лихорадочной формы у 50% больных, менингеалыюй у 41,1% и очаговой у 8,9%, с преобладанием среднетяжелых и тяжелых форм (87,0%) и нередким двухволновым вариантом (22,5%), формированием прогредиентного течения в 1,1%.

2. Установлена высокая диагностическая чувствительность и

специфичность ЛИФА при выявлении IgM к ВКЭ в сыворотке крови больных КЭ - 97,2 и 96,6% соответственно по отношению к коммерческой тест-системе ТИФА. В острый период заболевания оба метода одинаково эффективны. При длительно протекающем инфекционном процессе метод ЛИФА в 2,5 раза чувствительнее метода ТИФА.

3. Одновременное определение AT обоих классов у больных КЭ дает возможность прогнозировать иммунный ответ, вероятность выявления специфических IgM и IgG в первой и последующих порциях сыворотки.

4. Между коэффициентами позитивности (КП) сывороточных и сухих образцов крови выявлена высока? степень, корреляции (г > 0,8). Диагностическая чувствительность ЛИФА при выявлении IgM в СПК составляет 95,8%, специфичность - 97,1% по отношению к ТИФА, что позволяет использовать технологию сухого образца крови в сочетании с ЛИФА для лабораторного подтверждения диагноза КЭ.

Реализация и внедрение полученных результатов работы. Банк сывороточных и сухих образцов крови используется в ЗАО «Иммуноскрин» (Москва) для разработки новых диагностических тестов. Данные настоящего исследования внедрены в учебный процесс кафедры инфекционных болезней ГОУ ВПО «ПГМА им. ак. Е.А. Вагнера'», г. Пермь.

Апробация и публикация материалов исследования. Основные положения диссертации доложены и представлены на международной научной конференции, посвященной 50-летию Национального института аллергических и инфекционных болезней США (NIAID NIH DHHS USA) (г. Опатия, Хорватия, 2006 г.), всероссийской научной конференции "Современные научные и прикладные аспекты клещевого энцефалита" (к 70-летию открытия вируса клещевого энцефалита) (Москва, 2007 г.), Российской научно-практической конференции «Инфекционные болезни: современные проблемы диагностики и лечения» (Санкт-Петербург, 2008 г.), научно-практической конференции «Терапия неотложных и реанимационных состояний в медицине» (г. Пермь, 2008 г.), научной сессии ГОУ ВПО «ПГМА им. ак. Е.А. Вагнера» (г. Пермь, 2008 г.).

По материалам диссертации опубликовано 6 работ, из них 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК для опубликования результатов исследований, выполненных на соискание ученой степени кандидата медицинских наук.

Объем и структура работы. Диссертация объемом 135 страниц состоит обзора литературы, главы «Материалы и методы исследования», 4 глав собственных исследований, заключения, выводов и практических рекомендаций, списка литературы. Текст диссертации содержит 21 таблицу, 18 рисунков. Список литературы включает 248 источников (в том числе 148 отечественных и 100 - зарубежных авторов).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

В 2001 - 2004 гг. проведено обследование 1530 человек, находившихся на лечении в краевой клинической инфекционной больнице (ККИБ) г. Перми.

Группа 1 состояла из 316 больных КЭ. Клиническое обследование включало получение анамнестических и объективных данных, проведение лабораторных, общеклинических исследований, по показаниям выполнялась спинномозговая пункция с последующим исследованием ликвора. Диагноз заболевания ставился соответственно действующей инструкции (Приказ МЗ СССР №141 от 9 апреля 1990 г.). Серологическое подтверждение КЭ проводилось с помощью ТИФА.

'В этой группе 107 пациентов (221 образец сыворотки и/или СПК) были обследованы в ЛИФА с целью выявления AT к ВКЭ. Кровь для исследований у больных брали при поступлении в стационар (на 1-й нед. заболевания), затем на 2-3-й нед., а также, по возможности, в ясриод реконвалесценции (с 4-5-й до 723-й нед. от начала заболевания).

Группа 2 включала 273 человек, перенесших КЭ или микстинфекцию (МИ) КЭ и ИКБ в эпидсезоны 2001 -2004 гг. и находившихся под диспансерным наблюдением в краевом центре «клещевых» инфекций (КЦКИ), г. Пермь. Пациенты на протяжении 3-х лет регулярно осматривались инфекционистом и неврологом, обследовались в ТИФА.

Из них 22 человека (24 образца сыворотки и/или СПК) были протестированы в ЛИФА на 407 (365; 772) день после начала заболевания.

Группу 3 составили 48 пациентов с МИ КЭ и ИКБ, обследованных в том же объеме, что и больные КЭ. Диагноз ИКБ ставился на основании обнаружения AT к боррелиям в НРИФ или ИФА или наличия патогномоничного признака - мигрирующей эритемы (МЭ).

В этой группе 10 человек (23 сыворотки и/или СПК) были протестированы в ЛИФА.

Группа 4 (контрольная) включала в себя 674 пациента (1549 образцов сыворотки и/или СПК) с острыми инфекционными (ИКБ, ОРЗ, ангины, рожа) и неинфекционными (желудочно-кишечные, сердечно-сосудистые, легочные) заболеваниями.

В группу 5 (контрольная) входило 214 практически здоровых лиц (доноров), обследованных в 2002 - 2003 гг. (вне эпидемического сезона).

Сыворотки крови готовили из крови пациентов стандартным образом, добавляли консервант (1% раствор азида натрия) и хранили до использования при -20 °С.

Для получения СПК кровь брали стерильным скарификатором из пальца обследуемого человека, наносили на бланк ФБ (Whatman 903) падающей каплей, высушивали и хранили при +4DC. Перед исследованием панчером из

СПК выбивали диск диаметром 3,2 мм и помещали его в лунку микропланшета. Далее иммунореакцию проводили аналогично анализу сыворотки.

Выявление IgM- и IgG-AT в сыворотках крови пациентов в ТИФА было проведено в вирусологической лаборатории ККИБ, г. Перми и в лаборатории молекулярной диагностики ГНЦ ФГУП «ГосНИИБП», Москва с использованием коммерческих тест-скстем «ВестоВКЭ - IgM - стрип» и «ВектоВКЭ - IgG - стрип» (ЗАО1 «Вектор-Бест», г. Новосибирск) в соответствии с инструкциями по применению.

Для выполнения ЛИФА использовали экспериментальные тест-системы (ЗАО «Иммуноскрин», Москва). Методика определения IgM- И IgG-AT в ЛИФА была аналогична ТИФА. Результаты ЛИФА представляли в виде значений интенсивности флуоресценции (ИФ), которую регистрировали на специализированном флуориметре с временным разрешением Аркус 1234 (Perkin Elmer, USA). Для интерпретации результатов использовали значения КП, рассчитываемые для каждой пробы по формуле: КП = ИФ пробы / Котр. +1500, где Котр. - ИФ отрицательного контроля из состава тест-системы. Результат исследования пробы считали положительным при значении КП > 1.

Для полуколичественной оценки уровня AT в ЛИФА предварительно проводили титрование части исследуемых проб сывороток в диапазоне разведений ог 1/10 до 1/819200. По его результатам строили калибровочный график. Далее сыворотки исследовались в разведении 1/200, а их титры определялись по калибровочному графику. При определении IgM, значения титров 1:200 и выше считали положительными, значения от 1:200 до 1:800 -«сомнительными». При оценке результатов титрования IgG учитывали все титры, начиная со значения 1/10. Результаты интерпретировали следующим образом: отрицательный (титр менее 1/10), низкий (от 1/10 до 1/200), высокий (выше 1/200). СПК не титровали.

Статистический анализ проводили с использованием пакета программ STATISTICA 6.0 (StatSoft Inc, USA) с применением методов непараметрической статистики (Реброва О.Ю., 2003). Центральные тенденции и дисперсии количественных признаков описаны медианой и интерквартильным размахом (25 и 75 процентили). Выявление статистически значимых различий выборок по количественным показателям проводили с помощью U-критерия Манна-Уитни, по качественным (сравнение долей) - с помощью точного двустороннего критерия Фишера и метода определения доверительных интервалов (ДИ). Для исследования взаимосвязи признаков использовали корреляционный анализ Спирмена.

Расчет ДЧ и ДС ЛИФА проводили общепринятыми методами с использованием четырехпольных таблиц (Флэтчер Р. и соавт., 1998), при этом ТИФА использовали в качестве метода сравнения.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Клиническая характеристика клещевого энцефалита на Западном Урале

Клиническая характеристика мононнфекции КЭ. Проведен анализ течения КЭ у 316 больных б 2001 - 2004 гг. с целью выявления клинико-эпидемиологических особенностей этой инфекции на Западном Урале в сравнении с предшествующим л годами.

Лихорадочная форма (ЛФ) выявлена у половины больных (158 чел.), менингеальная (МФ) у 41,1% (130 чел.), очаговая (ОФ) - у 8,9% (28 чел.). Преобладали срсднетяжелыс (76,2%) и тяжелые (10,8%) формы, легкие составляли 13%. Летальные исходы имели место у 1,6% (5 чел.).

IgM к ВКЭ обнаружены в сыворотке крови или ликворе у 98,1% (310 чел.), в остальных случаях диагноз установлен по совокупности клинико-анамнестических данных и наличию сероконверсии по IgG (6 чел.).

Заболевание начиналось остро с повышения температуры, головной боли и выраженного общеинфекционного синдрома. Умеренно выраженная лихорадка наблюдалась у 47,8% больных, высокая - у 34,5%, субфебрильная - у 17,7% в течение 6 (4; 9) и 9 (7; 13) дней при ЛФ и МФ соответственно (р < 0,05), и 8 (5; 10) дней при ОФ (р > 0,05).

Общемозговые симптомы (выраженная головная боль, повторная рвота, упорная тошнота) наблюдались в 70,6%, чаще при МФ и ОФ (96,8%), чем при ЛФ (44,3%), в течение 8 (6; 11) дней и 6 (4; 10) дней соответственно (р < 0,05).

Оболочечные симптомы обнаруживались в 60,8%. При ЛФ у 10,1% развились явления менингизма, исчезнувшие в течение 2-3 дней одновременно с нормализацией температуры.

Очаговая неврологическая симптоматика проявлялась чаще в виде глазодвигательных расстройств (стробизм, диплопия, внутренняя и наружная офтальмоплегия), нарушения сознания (оглушенность, делирий, онейроидный синдром, кома), двигательных расстройств (парезы, подкорковые гиперкинезы, генерализованный эписиндром), поражения каудальной группы черепно-мозговых нервов (девиация *зыка, поперхивание, икоты, гнусавость голоса, нарушение дыхания, глотания, кашлевого рефлекса, речи).

При двухволновом варианте КЭ, зарегистрированном в 22,5% случаев, МФ встречалась чаще (59,2%), чем при одноволновом (35,9%) (р < 0,001). В сравнении с первой волной во время второй наблюдалась более высокая (р < 0,05 для ЛФ, р < 0,001 для МФ) и более длительная лихорадка (р > 0,05 для ЛФ, р < 0,05 для МФ).

В начале заболевания у 18% пациентов отмечалось увеличение количества лейкоцитов, у 20,4% - их снижение. Часто наблюдался сдвиг лейкоформулы влево (45,6%) и нарастание СОЭ (63,6%). Лейкоцитарный индекс интоксикации (ЛИИ), уровень повышения которого свидетельствует о

степени интоксикации (в норме 1 - 1,5), был повышен у 64% больных КЭ. Расчет ЛИИ проводился по Я.Кальф-Калифу (Чебаненко Н.В., 2003).

При ЛФ в отличие от МФ и ОФ нередко отмечалась лейкопения (29,5%) (р < 0,001). Тяжелые формы с поражением оболочек и вещества мозга в сравнении с ЛФ достоверно чаще сопровождались значительным повышением ЛИИ и лейкоцитозом (р < 0,001). В начале первой волны у половины больных с двухволновым вариантом наблюдалась лейкопения, а на второй волне часто регистрировался лейкоцитоз (33,6%).

Клиническая характеристика МИ КЭ и ИКБ. Под нашим наблюдением в 2001 - 2004 гг. находилось 48 больных с сочетанным течением КЭ и ИКБ. Соотношение МИ и моноинфекции КЭ в эти годы составило 1:6,6. У пациентов наблюдались следующие формы КЭ: инаппарантная у 31,5% (15 чел.), ЛФ у 47,9% (23 чел.) и МФ у 18,8% (9 чел.). У 1 пациента (2,1%) развилась ОФ. Доминировали среднетяжелые формы (81,8%), тяжелое и легкое течение встречались одинаково часто - в 9,1% случаев.

ИКБ у 29 больных МИ протекал с развитием МЭ (60,4%), безэритемная форма зарегистрирована у 17 (35,4%), при этом в 8 случаях наблюдались органные поражения, чаще со стороны НС (острый «мягкотекущий» энцефалит у 6 пациентов, невропатия лицевого нерва у 1). В 4 случаях к неврологическим изменениям присоединились поражения со стороны печени, сердца, опорно-двигательного аппарата. Диагноз инаппарантной формы ИКБ поставлен 2 больным на основании выявления АТ к боррелиям и отсутствия характерной дня данной инфекции клиники.

Общеинфекционный синдром при МИ в сравнении с моноинфекцией КЭ был менее выраженным, особенно у больных с эритемной формой ИКБ (р < 0,05).

Сочетание КЭ с безэритемной формой ИКБ (17 случаев) характеризовалось выраженной интоксикацией, высокой (47,0%) и двухволповой (41,2%) лихорадкой. В трети случаев зарегистрирован серозный менингит. Напротив, КЭ в сочетании с МЭ обычно протекал в виде легких форм - лихорадочной и инаппарантной (90,0%), температура тела была субфебрильной.

При МИ КЭ и ИКБ общемозговые (41,7%) и менингеальные (33,3%) симптомы наблюдались гораздо реже, чем в случае моноинфекции КЭ (р < 0,01).

При анализе показателей белого ростка крови у больных МИ обнаружено, что увеличение ЛИИ (40,6%) и лейкоцитоз (3%) в отличие от моноинфекции КЭ встречается реже (р < 0,05), у трети регистрируется лейкопения. Сочетанное течение КЭ и безэритемной формы ИКБ сопровождалось снижением количества лейкоцитов и учащением сдвига лейкоформулы влево в сравнении с этими показателями у больных с эритемой (р < 0,05).

Клиническая характеристика периода поздней реконвалесценции КЭ. Известно, что для снижения риска ХКЭ, который встречается в 1-3%, и

своевременного его выявления, переболевшие нуждаются не только в клиническом, но и в иммунологическом контроле, проводимом после выписки из стационара (Иерусалимский А.П., 2001).

Во время проведения исследования в КЦКИ г.Перми наблюдалось 278 реконвалесцентов, перенесших острые формы КЭ и МИ КЭ и ИКБ в 2001 -2004 гг. Более чем через 1 год после выписки из ККИБ у 57,6% (160 чел.) из них сохранялись симптомы церебрастении (головные боли, головокружение, повышенная утомляемость, раздражительность), у 5,4% (15 чел.)- циркуляция 1£М к ВКЭ (по данным ТИФА), у 2,2% (6 чел.) - признаки поражения НС (парезы с атрофией мышц, недостаточность черепно-мозговых нервов, гипокоординаторный синдром, рефлекторная асимметрия). Хроническое течение КЭ установлено в 3 случаях (1,1%).

Уровень ^М к ВКЭ в поздние сроки заболевания нередко низок, поэтому стандартные методы диагностики не всегда достаточно результативны (Фролова Т.В. и соавт., 2008). Происхождение выявленных симптомов у реконвалесцентов острых форм КЭ и МИ может быть связано как с постинфекционной церебрастенией, так и с персистенцией ВКЭ в организме. Важно разграничить эти два состояния для своевременных профилактических, терапевтических и реабилитационных мероприятий.

Таким образом, в клинической картине современного КЭ отмечается преобладание среднетяжелых и тяжелых форм (87,0%) с развитием ЛФ у 50%, МФ у 41,1% заболевших, ОФ - у 8,9%. Нередок двухволновый вариант (22,5%), в 59,2 % случаев на высоте второй волны развивается менингит.

Сочетание КЭ с безэритемной формой ИКБ характеризуется выраженной интоксикацией, частым двухволновым характером лихорадки и вовлечением в патологический процесс НС. В трети случаев зарегистрирован серозный менингит. Напротив, КЭ в сочетании с МЭ протекает в виде легких форм -лихорадочной и инаппарантной (90,0%).

При оценке гемограммы замечено, что лейкоцитоз и значительное повышение ЛИИ в дебюте заболевания предшествуют развитию тяжелых форм КЭ, а выраженная лейкопения, свидетельствуя о пониженной сопротивляемости организма, появлению второй волны. Сочетанное течение КЭ и безэртемной формы ИКБ сопровождается лейкопенией и частым сдвигом лейкоформулы влево в сравнении с ассоциацией КЭ и эритемной формы ИКБ (р < 0,05).

После перенесенного острого КЭ и МИ КЭ и ИКБ у 57,6% реконвалесцентов КЭ выявлен церебрастенический синдром, у 2,2% обнаружены неврологические нарушения, в 5,4% случаев установлена длительная циркуляция IgM к ВКЭ в крови по данным ТИФА, что требует углубленного серологического тестирования с использованием высокочувствительных методов для дифференциации остаточных явлений и ХКЭ.

Итак, мы подтвердили наметившиеся в конце 20 века тенденции к формированию более тяжелых форм КЭ на Западном Урале и удостоверили

прогностическое значение изменений некоторых показателей гемограммы, предшествующих их развитию (Устинова О.Ю. и соавт., 1997, Волкова Л.И. и соавт., 2002, Чебаненко Н.В., 2003).

Сравнение результатов ЛИФА и ТИФА при выявлении ^М к вирусу клещевого энцефалита в сыворотоках крови Результаты обследования больных клещевым энцефалитом па наличие ^М в сыворотке крови. В 2002 - 2003 гг. мы обследовали 928 пациентов (1579 сывороток крови) для сравнения чувствительности тест-систем ТИФА и ЛИФА при выявлении 1!>М к ВКЭ.

В зависимости от результатов ТИФА происходило первоначальное разделение на группы. При исследовании 1579 сывороток всех групп в ТИФА и ЛИФА их результаты совпали для 1517 проб (96,1%, 95,0 - 97,1%), установлена сильная степень взаимосвязи между значениями КП, полученными в ТИФА и ЛИФА: г = 0,9; р< 0,001, п= 1579.

Анти-ВКЭ-^М в ЛИФА были обнаружены в большинстве сывороток групп 1, 2, 3 ив единичных - остальных групп. Чувствительность ЛИФА и ТИФА были близки - 81,1 и 78,1% соответственно (табл. 1).

Таблица 1

Чувствительность и специфичность ТИФА и ЛИФА при определении 1£>М к

вирусу клещевого энцефалита

Группа, Из них с результатом'

кол-во ТИФА ЛИФА

больных Положительным Отрицательным Положительным Отрицательным

(сып-к) Абс. % Абс. 1 % Абс. % Абс %

1 105 98,1 2 1 1,9 102 95,3 5 4,7

107 (201) (157) (78,1) (44) ' (17,4) (163) (81,1) (38) (16,4)

2 4 18,2 18 81,8 10 45,5 12 54,5

22 (24) (4) (16,7) (20) 1 (83,3) (10) (41,7) (14) (58.3)

3 15 100 0 | 0 9 90 1 10

10(23) (65,2) (8) i (34,8) (17) (73.9) (6) (26,1)

4 0 0 657 | 100,0 26 4,0 631 96,0

657(1199) (0) (0) (1199) | (100,0) (38) (3,2) 1161 (96.8)

5 1 0,8 131 | 99,2 1 0,8 131 99,2

132(132) (1) (0,8) (131) 1 (99,2) (1) (0,8) (131) (99,2)

Всего 120 12,9 808 1 87,1 148 15,9 780 84,1

928 (1579) (177) (11.2) (1402) ! (88,8) (229) (14,5) (1350) (85,5)

Примечание: в скобках указано количество сывороток.

Доля сывороток с 1§М-АТ у больных КЭ составляла примерно 70% к концу 1-й нед. от начала заболевания, достигала пика (93-100%) к 3-й нед., затем медленно снижалась. Среднегеометрический титр (СГТ) положительных проб в ЛИФА составлял 12,3 на 1-й нед. заболевания, достигал максимума -13,9 на 3-й нед. и снижался до 9,4 в поздние сроки (рис. 1).

и

ига т----г 16

1-7 8-14 16-21 22-42 43-00 >В0 День болезни

Рис. 1. Доля сывороток с ^М-антителами у больных КЭ в разные сроки заболевания в ЛИФА и ТИФА с динамикой СГТ в ЛИФА.

По оси абсцисс - день болезни. По оси ординат слева - доля сывороток с 1§М, в %, справа - СГТ в 1од2.

При МФ доля сывороток с 1|>М (75%) была существенно, хотя и не достоверно (р = 0,09), выше по сравнению с ЛФ (50%) уже на 1-й нед. заболевания. На 3-й нед. разница стала статистически значимой - при ЛФ доля 1§М-положительных сывороток 73,9-78,3%, а при МФ 96,8-100% в ТИФА и ЛИФА соответственно (р < 0,05).

СГТ ^М-АТ во все сроки заболевания также был достоверно выше при МФ : 13,3 уже на 1-й нед., с максимальным значением 14,5 на. 2-й нед. и снижался до 12,3 после 43 дня (р < 0,05). Динамику 1§М-АТ при ОФ проследить не удалось в связи с недостаточным числом образцов, доступных для исследования в разные сроки заболевания (рис. 2).

Рис. 2. Доля сывороток с 1§М-антителами у больных лихорадочной или менингеальной формой КЭ в разные сроки заболевания в ЛИФА и ТИФА с динамикой СГТ в ЛИФА.

По оси абсцисс - день болезни. По оси ординат слева - доля сывороток с ^М, в %, справа - СГТ в 1о§2.

Показатель ДЧ при выявлении ^М к ВКЭ в ЛИФА составил 97,2% (93,3 - 100%,), ДС - 96,6% (95,2 - 98,0%) (табл. 2).

Таблица 2

Четырехпольная таблица по результатам обследонания сывороток в ЛИФА и

ТИФА больных клещевым энцефалитом и лиц контрольных групп

Результат: Больные КЭ Лица коьгп зольных групп

ТИФА ЛИФА Полоясительный Отрицательный Обследовано в ЛИФА Полоясительный Отрицательный Обследовано в ЛИФА

Полоясительный 106 6 112 0 27 27

Отрицательный 3 14 17 1 761 762

Обследовано в ТИФА 109 20 129 1 788 789

Как показано в четырехпольной таблице (см. табл. 2), результаты ЛИФА сравнивались с коммерческой тест-системой ТИФА, в соответствии с этим существовали два варианта правильного результата теста ЛИФА (истинно положительный и истинно отрицательный, когда результаты совпадают с ТИФА) и два варианта ошибочного результата (ложноположительный и ложноотрицательный результаты).

Выявление 1йМ к ВКЭ в сыворотке крови больных микстинфекцией клещевого энцефалита и иксодовых клещевых боррелиозов. В первые 2 нед заболевания ^М к ВКЭ обнаруживались в 2/3 исследованных проб, на 3-6 нед. они были выявлены примерно в 80%) в ЛИФА, и в 44% в ТИФА. В более поздние сроки АТ обнаружены во всех пробах. СП' колебался от 9,9 в 1-ю нед. болезни до максимальных цифр 12,4, достигнутых на 3-й нед. В поздние сроки СГТ снижался до 11,4.

Выявление специфических ^М в сыворотке крови реконвалесцентов острого клещевого энцефалита. При обследовании с помощью ТИФА 22 реконвалесцентов КЭ и МИ КЭ и ИКБ (на 407 (365; 772) день после начала заболевания) в крови 4 человек (18,2%) были выявлены специфические ^М. При этом чувствительность ЛИФА в этих образцах была в 2,5 раза выше -45,5%. Статистически значимой разницы между клиническими проявлениями в серонегативной (12 чел.) и серопозитивной (10 чел.) по ЛИФА группах не обнаружено (р > 0,05).

Благодаря более высокой чувствительности ЛИФА у больных, перенесших острые формы КЭ и МИ, персистенция ^М к ВКЭ была выявлена у 40,9% (9 чел.) В 4,5% случаев по совокупности клинико-инструментальных и лабораторных данных поставлен диагноз ХКЭ (1 чел.).

Итак, метод ЛИФА был одинаково эффективен по сравнению с ТИФА при ранней серологической диагностике КЭ и имел существенные преимущества в чувствительности (выше в 2,5 раза) при выявлении ^М АТ у пациентов с длительно протекающим инфекционным процессом. Важно отметить, что при МФ доля и СГТ Т^{-положительных проб во все сроки заболевания выше по

сравнению с ЛФ. При МИ КЭ и ИКБ динамика развития ИО сходна с ЛФ при моноинфекции КЭ.

Оценка уровня специфических и методом ЛИФА в зависимости от типа иммунного ответа Оценка уровня специфических 1«М и 1цС у больных КЭ. Как известно, наличие к ВКЭ до начала заболевания может влиять на динамику накопления противоэнцефалитных АТ (Кветкова Э.А., 1984). В связи с этим мы изучили особенности антителообразоьания в зависимости от типа ИО -первичного (^О отсутствуют в крови до развития КЭ) и вторичного (^Ст циркулируют в крови до заболевания).

Между значениями КП при определении АТ к ВКЭ в ЛИФА и ОП в ТИФА у пациентов всех групп наблюдалась высокая степень корреляции, (г = 0,9, р < 0,001, п = 300). ДЧ ЛИФА при выявлении к ВКЭ составила 95,1% (89,1 - 100,0%), ДС - 98,4% (94,0-100,0%).

Анализ результатов ЛИФА в группе доноров показал, что в титрах 1/10 и выше выявлялись у 151 человека из 214 (70,6%). Преобладали пробы с низкими титрами, тогда как доля сывороток с высокими составляла 21,0%. При наличии в анамнезе только вакцинации против КЭ (57 чел.) или присасывания клещей (10 чел.) менее 5 лет назад доля проб с высокими титрами ^О достоверно повышалась до 26,3% (р = 0,03) или 40% (р = 0,022), соответственно (в среднем до 33,2%), по сравнению с значением этого показателя (11,3%) у доноров, отрицавших получение прививки и контакты с клещами в прошлом (80 чел.). У лиц с сочетанием присасывания клещей и вакцинации менее 5 лет назад з анамнезе (16 чел.) доля проб с титрами выше 1/200 была наибольшей - 62,5% (р = 0,003) и превышала среднее значение, рассчитанное исходя из предположения о независимости влияния каждого из указанных факторов. Возможно, наблюдаемый эффект был обусловлен усилением протективного действия вакцины в результате дополнительной реиммунизации людей ВКЭ в естественных условиях.

С учетом полученных результатов было проанализировано соотношение уровней 1§С к ВКЭ в разных группах. Они выявлены у 56,3% обследованных лиц в контрольных группах 4, 5, из них 18,2% обладали выраженным гуморальным иммунитетом к ВКЭ. Это позволяет говорить о том, что у населения эндемичных регионов в значительном числе случаев КЭ развивается на фоне уже имеющихся к ВКЭ.

Примечательно, что у больных КЭ и МИ КЭ и ИКБ (группы 1 и 3) доля проб с титрами выше 1/200 была достоверно большей (р < 0,001) по сравнению с 4 и 5 1руппами. Поскольку вакцинированных против КЭ в этой группе было сравнительно мало (9,6%), наиболее вероятной причиной повышения доли проб с титрами выше 1/200 могли являться предыдущие присасывания клещей. У всех 22 пациентов группы 2, обследованных более чем через год после перенесенного острого заболевания, были обнаружены к ВКЭ, причем у 17

они выявлены в высоких титрах (77,3%) (табл. 3).

Таблица 3

Уровень IgG Группы

1 (104) Iх (54) 2 (22) 3 (Ю) 3 (6) 4 (674) 5 (214) 5# (80) 5## (16)

Абс. % Абс. % Абс. % Абс. % Абс. % Абс. % Абс. % Абс. % -Абс. %

Отрицагельный 21 20,2 17 31,5 0** 0 1 10,0 1 16,7 325** 48,2 63 29,4 32 40,0 0* 0

Низкий 22** 19,2 12** 22,2 5** 22,7 3 30,0 3 50,0 232** 34,4 ¡06 49,5 39 48,8 6 37,5

Высокий 61** 58,7 25** 46,3 17** 77,3 6* 60,0 2 33,3 117 17,4 45 21,0 9* 11.3 10** 62,5

Примечания:

• в скобках - число обследованных людей в данной группе;

• группы 1, 3, 4- сыворотки взяты при поступлении в стационар, из них Iх, 3х - сыворотки взяты в первые дни заболевания;

• 5# - доноры группы 5 без вакцинации против КЭ и присасывания клеща в анамнезе, 5## -доноры, с сочетанием присасывания клещей и прививки против КЭ менее пяти лет назад;

• различия статистически значимы при сравнении значений доли в данной группе относительно группы 5 - * р < 0,05; ** р < 0,001.

Нами было установлено, что доля пациентов с IgM зависела от наличия или отсутствия IgG, но не от их уровня: IgM выявлены в 6 из 17 (35,3%) сывороток, без IgG, и в 83,3-88,0% проб с IgG в любом титре выше, чем 1/10 (р <0,05).

Был изучен характер изменения доли и СГТ проб с IgM и IgG в разные сроки заболевания у 54 больных КЭ (115 сывороток), в зависимости от наличия (68,5%) или отсутствия IgG (31,5%) в первые дни (вторичный или первичный ИО) (Кветкова ЭЛ., 2004).

При первичном ИО (ПИО) доля проб с IgM быстро возрастала от 35,3% на 1-й нед. до 100% на 2-й нед. от начала заболевания, сохраняясь на этом уровне до конца периода наблюдений. У больных КЭ с развитием вторичного ИО (ВИО) доля IgM-положительных сывороток увеличивалась с 86,5% в начале заболевания до 100% на 2-й нед. болезни, затем снижаясь до 81,8-84,2%. Показатели СГТ IgM-AT бурно нарастали при ПИО - от 8,7 в дебюте заболевания до максимума (13,0) на 3-й нед., при ВИО СГТ высок с самого начала - 11,6, далее его колебания были незначительны (максимум — 11,9 на 2-й нед.).

Доля сывороток с IgG и их СГТ при ПИО нарастали от нулевых значений в первые дни болезни, 4-х кратное нарастание встречалось у 64,3% больных. При ВИО эти изменения были невыраженными, а нарастание титра в 4 раза замечено в 24% случаев (р = 0,02). Динамика уровня IgG зависела не только от типа ИО, но и от клинической формы КЭ: при ЛФ нарастание титров в 4 раза и более выявлено лишь у 17,6% больных, а при МФ и ОФ - у 55,6% (р = 0,04) (рис. 3).

ГА 100 80 60 ^ 40 -200 -I 1 дм 1 \ р (■ 10 4- 8 14 6 ь 12

V, . 1-7 6-14 16-42 43-9 Первичный ИО )

1д6

100 I

80

60 т

40 т

20

0 1

□—

1-7 8-14 16-42- 43-90

Вторичный И О

Рис. 3. Изменение доли (гистограммы) и СГТ (кривые) сывороток, с (А и Б) или (В и Г) при ПИО (А и В) и ВИО (Б и Г) у больных КЭ и МИ. По левой оси ординат - доля проб, с 1§М или (в %); по правой - СГТ или (в 1о§2), по оси абсцисс - день болезни.

Оценка уровня специфических 1§М и С у больных микстинфекцией КЭ и ИКБ. Развитие гуморального иммунитета было прослежено с самого начала заболевания у 6 пациентов (17 сывороток). При ПИО (1 чел.) IgM-AT в первой порции не обнаружены, в последующих пробах сывороток крови отмечалась выраженная сероконверсия с ростом АТ обоих классов. У больных с ВИО изменения доли проб с и в в разные сроки заболевания практически отсутствовали. На 1-й - 3-й нед. от начала заболевания ^М были обнаружены в 80% проб с СГТ 5 ,7 , а позднее 40 дня заболевания в трети исследованных. Все сыворотки содержали с колебаниями СГТ от 7,5 в течение острого периода до 5,8 в более поздние сроки.

Таким образом, мы установили, что ДЧ и ДС ЛИФА при определении к ВКЭ не уступают ТИФА и равны по отношению к нему 95,1 и 98,5% соответственно. Нами показано, что у жителей эндемичного региона преобладает ВИО - у 68,5% больных инфекция развивается на фоне уже имеющихся к ВКЭ. Более выраженная картина нарастания доли проб с АТ и

СГТ регистрируется при ПИО (4-х кратное нарастание титров 1§0 встречается у 64,3% больных в сравнении с 24% при ВИО) и формах с поражением оболочек и вещества мозга (рост титров в 4 раза и бопсс вьивляется у 55.6% в сравнении с 17,6% при ЛФ). Формирование гуморального иммунитета при МИ протекает сходным образом: у больных также преобладает ВИО. Динамика ^М и подобна таковой при моноинфекции, лишь значения СГТ несколько ниже.

Применение ЛЙФА для выявления 1«М и АТ в сухих пятнах крови

Для оценки возможности использования СПК в качестве источника АТ, альтернативного сыворотке, мы сравнили результаты выявления ^М и ^О к ВКЭ в сывороточных и сухих образцах крови от пациентов всех трупп (табл. 4).

Таблица 4

Результаты ЛИФА и ТИФА при выявлении специфически;; IgM и ^С в _ сывороточных и сухих пятнах крови____

Группа, иследовано сквороток/СПК (кол-во пациентов) Число проб с АТ Выявлены I Выявлены 1(гО

ЛИФА, -сыворотка ЛЙФА, СПК ТИФА ЛИФА, сыворотка ЛИФА, СПК ТИФА

1 178(97) Абс. % 142/178 79,8 149/178 83,7 105/12 5 84 122/165 73,9 119/178 66,9 40/71 56,3

2 3(3) Абс. % 1/3 33,3 1/3 33,3 1/3 33,3 3/3 100 3/3 100 3/3 100

3 17(9) Абс. % 14/17 82,4 13/17 76,0 11/14 78,6 7/11 63,6 8/11 72,7 5/9 55.6

4 226(114) Абс. % 3/226 1,3 1/226 0,4 0/186 0 44/226 19,5 Н.и. Н.и.

5 199(199) Абс % 2/199 1,0 8/199 4,0 1/130 0,7 83/199 41,7 83/199 41,7 66/132 50,0

Примечания: в числителе - число проб (сывороток или СПК) с igM или ^<3, в знаменателе -всего исследовано проб; в скобках - количество обследованных пациентов. Н.и. - не исследовали.

Между значениями КП при определении АТ в сыворотках крови и СПК в ЛИФА наблюдалась высокая степень корреляции. В случае обнаружения 1§М г составил 0,87 (р < 0,001; п = 623), а - 0,84 (р < 0,001; п = 378). При сравнении значений, полученных методами ЛИФА в СПК и ТИФА в сыворотках крови, также установлена высокая степень взаимосвязи. При определении ^М г составил 0,83 (р < 0,001, п = 263), а в - 0,82 (р < 0,001; п = 202). Совпадение положительных и отрицательных результатов ЛИФА при определении специфических IgM в сывороточных и сухих образцах крови всех групп составило 94,2% (92,2 - 96,2%), а совпадение результатов исследования СПК в ЛИФА и сывороток в ТИФА - 96,7 % (94,8 - 98,6%).

ДЧ ЛИФА при выявлении !§М к ВКЭ в СПК (по группе больных КЭ) составила 95,8% (90,7 - 100%), ДС (по лицам контрольных групп) - 97,1% (94,9

- 99,3%) (табл. 5).

Таблица 5

_Результаты исследования СПК в ЛИФА и сывороток в ТИФА__

Результат: Больные КЭ Лица конт зольных групп

ТИФА ЛИФА Положительный Отрицательный Обследовано в ЛИФА Положительный Отрицательный Обследовано в ЛИФА

Положительный 92 1 93 0 9 9

Отрицательный 5 0 4 0 303 303

Обследовано в ТИФА 96 1 97 0 312 312

При анализе обоих видов биоматериала были выявлены в

большинстве проб групп 1, 2, 3 и в немногих пробах контрольных групп 4 и 5 (табл. 4).

Характер изменения доли 1§М-положительных проб СПК у больных КЭ в разные сроки от начала заболевания КЭ (на каждом сроке исследовано от 23 до 59 проб) соответствовал данным, полученным при исследовании сывороток в ЛИФА и ТИФА (рис. 4).

День болезни

| ЛИФАИ1СПИ -6-ЬгТ_ЯЛИ«А|_,

Рис. 4. Доля проб с ^М в разные сроки от начала заболевания КЭ в ЛИФА (сыворотки, СПК) и ТИФА (сыворотки), с динамикой СГТ в ЛИФА. По оси абсцисс - день болезни; по оси ординат слева - доля проб с ¡¿М, в %, справа - СГТ в 1о§2.

В целом, результаты определения 1§в-АТ в СПК от больных КЭ и

МИ КЭ и ИКБ подтверждали закономерности, выявленные ранее при исследовании сывороток. Значения КП при выявлении 1§М в СПК были достоверно ниже при ЛФ КЭ, чем при более тяжелых МФ и ОФ (р < 0,001).

При определении к ВКЭ все три методики также показали сходную эффективность. АТ этого класса выявлялись примерно в 70% проб (сывороток и СПК) больных КЭ. В контрольных группах доля проб с ^(З, также была достаточно высокой (табл. 4).

В заключение можно отметить, что чувствительность ЛИФА при выявлении ^М-АТ в разные сроки от начала заболевания сопоставима при исследовании обоих видов биоматериала и практически не отличается от чувствительности коммерческой тест-системы ТИФА. ДЧ ЛИФА при выявлении 1§М в СПК составляет 95,8%, ДС - 97,1%. Закономерности, выявленные при тестировании сывороток от больных КЭ и МИ КЭ и ИКБ и зависимость их параметров от клинической формы и срока заболевания, подтвердились при исследовании СПК. При определении 1^3 к ВКЭ все три методики также показали сходную эффективность.

Сочетание особого подхода к сбору исследуемого материала в виде использования СПК и высокочувствительного метода ЛИФА, простого в выполнении, открывает широкие перспективы в разргботке стратегии масштабных сероэпидемиологических исследований. На периферии, отдаленной от центра, содержать высокоспециализированные лаборатории экономически невыгодно. Удобный способ получения и хранения материала дает возможность разделить во времени и пространстве место забора и исследования проб. На территории России существует 60 медико-генетических центров, применяющих технологию СПК и ЛИФА для скрининга новорожденных, возможности которых можно использовать полнее. Таким образом, методика имеет высокий потенциал с точки зрения централизации исследований, проведения крупных популяционных исследований и диагностики природноочашвых заболеваний в эндемичных регионах.

ВЫВОДЫ

1. Выявлена тенденция к формированию более тяжелых форм КЭ на Западном Урале: превалируют лихорадочная (50%) и менингеальная (41,1%) формы, очаговая встречается в 8,9%, 1 заболевание чаще протекает в среднетяжелой и тяжелой формах (87,0%), нередко развивается двухволновый вариант (22,5%) с формированием менингита в 59,2% случ1ев. Хроническое течение инфекции наблюдается у 1,1% больных.

2. В эндемичном регионе у больных КЭ преобладает вторичный иммунный ответ с развитием инфекции на фоне уже имекнщ хся 1^0 к вирусу. При первичном иммунном ответе и формах с поражением оболочек и вещества мозга выявлено более значительное нарастание доли IgM- и ТдО-положительных проб и их СГТ в сравнении с вторичным иммунным ответом и лихорадочной формой.

3. Определены высокие показатели диагностической чувствительности и специфичности тест-систем ЛИФА при выявлении 1£М- (97,2 и 96,6% соответственно) и 1§С-антитсл к ВКЭ (95,1 и 98,5%) по отношению к коммерческим тест-системам ТИФА, что позволяет верифицировать клинический диагноз примерно у 70% пациентов уже в 1-ю нед. заболевания. Чувствительность ЛИФА в 2,5 раза выше по сравнению с ТИФА в случае

низкой концентрации IgM у лиц с длительно протекающим инфекционным процессом (персистенция JgM, хронический КЭ).

4. Диагностическая чувствительность ЛИФА при определении специфических IgM в сухих пятнах крови составила 94,9%, специфичность -97,5% по сравнению показателями, достигнутыми при анализе сывороток в ТИФА.

5. Применение технологии сухого пятна, крови наиболее целесообразно при проведении сероэпидемиологического мониторинга и серодиагностике острога КЭ у гс спитализированных людей, у которых взятие венозной крови затруднено.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Тест-системы ЛИФА обладают высокой диагностической значимостью и их использование целесообразно для серологической верификации острых и хронических форм КЭ и МИ и исследования популяционного иммунитета.

2. Применение технологии сухого пятна крови необходимо при проведении крупномасштабных сероэпидемиологических исследований и наличии затрудненного венозного доступа у некоторых больных.

3. Для исследования особенностей формирования гуморального иммунитета при КЭ у жителей эндемичного региона целесообразно использование банка сывороточных и сухих образцов крови.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Помелова В.Г. Метод лантанидной иммунофлуоресценции для серодиагностики клещевого энцефалита / В.Г. Помелова, Т.А. Быченкова, Н.И. Бекман, Е.Г. Козлова, H.H. Воробьева // Медицинская паразитология и паразитарные болезни. - 2006. - №2. - С. 13-18.

2. Помелова В.Г. Выбор порогового уровня при выявлении антител к возбудителям иксодовых клещевых боррелиозов методом лантанидного иммунофлуоресцентного анализа / В.Г. Помелова, Т.А. Быченкова, Е.Г. Козлова, В.И. Фризен // Медицинская паразитология и паразитарные болезни. - 2005. - №4. - С. 26-30.'

3. Помелова В.]". Оценка уровня специфических антител у больных клещевым энцефалитом (методом лантанидной иммунофлуоресценции / В.Г. Помелова, Н.И. Бекман, Т.А. Быченкова, Е.Г. Козлова, H.H. Воробьева, В.И. Фризен // Медицинская паразитология и паразитарные болезни. - 2006. - №3. - С. 9-14.

4. Козлова Е.Г. Клиническая характеристика клещевого энцефалита в Пермском крае в 2002 - 2004 гг. / Е.Г. Козлова, H.H. Воробьева, Л.М. Наумова, Е.Л. Веселова // Мат. юбилейной научн. сессии ГОУ ВПО «ПГМА им. ак. Е.А. Вагнера». - Пермь, 2006. - С. 291-292.

5. Помелова В.Г. Тестирование антител к вирусу клещевого энцефалита с

применением высушенной на фильтровальной бумаге крови / В.Г. Помелова, Т.А. Быченкова, Н.И. Бекман, Е.Г. Козлова, H.H. Воробьеве, В.И. Фризен // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 2008. - №1. - С. 50-55.

6. Помелова В.Г. Серологические исследования на клещевой энцефалит с применением высушенной на фильтровальной бумаге крови / В.Г. Помелова, Т.А. Быченкова, Н.И. Бекман, Е.Г. Козлова и др. // Тез. доки, всероссийской научной конф. "Современные научные и прикладные асгекты клещевого энцефалита" (К 70-летию открытия вируса клещевого энцефалита). - М., 2007. - С. 96.

Формат 60x84 '/16. Заказ № ВО 7

Подписано в печать 21J0.08

Объем 1 пл._* Тираж 100 экз.

Типография ВМедА, 194044, СПб , ул. Академика Лебедева, 6

Актуальность исследования. Необходимость поиска новых высокочувствительных методов диагностики клещевого энцефалита (КЭ) обусловлена расширением ареала этой инфекции, высокой заболеваемостью, тяжелым течением с нередкой инвалидизацией, возможным летальным исходом и, в ряде случаев, сложностью серологического подтверждения.

Пермский край — один из наиболее активных очагов КЭ на территории РФ с показателем заболеваемости в 2007 г. 4,3 (средний показатель по РФ - 1,8) на 100 тыс. населения [37]. В последние десятилетия 20 века в структуре заболеваемости на Западном Урале преобладали лихорадочная и менингсальная формы, на долю очаговой приходилось менее 10%, в сравнении с 1950-и гг. наблюдалась тенденция нарастанию тяжести заболевания и учащению двухволнового течения [133]. Кроме того, отмечался рост случаев сочетанной инфекции КЭ с другими «клещевыми» инфекциями, чаще с нксодоными клещевыми боррелиозами (ИКБ), что, возможно, связано с улучшением диагностики [83, 137]. С учетом этого, одной из задач нашего исследования, проводимого в 2001-2004 гг., явилось изучение особенностей КЭ в сравнении в течением его в предыдущие годы.

В начале заболевания клинические проявления КЭ неспецифичны, что делает необходимой дифференциальную диагностику этой инфекции в эндемичном регионе с другими лихорадочными заболеваниями, возбудители которых передаются клещами, и требует обязательного серологическою подтверждения. В последние годы для серодиагностики острого КЭ наиболее часто используют твердофазный иммуноферментный анализ (ТИФА). Он позволяет подтвердить диагноз уже на 4-5 день заболевания на основании выявления антител (AT) класса М [126]. При отсутствии IgM диагноз может быть поставлен на основе появления или не менее чем 4-кратного нарастания титров IgG. Однако у жителей эндемичного региона иммунный ответ (НО) часто развивается на фоне уже существующих до начала заболевания IgG к вирусу клещевого энцефалита (ВКЭ), что влияет на срок появления, характер изменения уровня и скорость достижения максимальных титров AT классов М и G и должно учитываться при интерпретации результатов серологического тестирования [47]. Некоторые авторы [180] рекомендуют определять IgM и IgG одновременно уже в 1-й пробе сыворотки, чтобы выявить сероконверсию IgG и провести дифференциацию острого и персистентного течения инфекции. Кроме того, необходимо учитывать сложность диагностики бессимптомных, хронических форм, контроля их лечения, а также возможные случаи серонегативного КЭ [136]. Поэтому разработка более чувствительных и специфичных методов серодиагностики КЭ остается актуальной.

В настоящей работе для серодиагностики КЭ был использован метод лантанидного иммунофлуоресцентного анализа (ЛИФА). Он также прост в исполнении, как ТИФА, отличаясь видом метки и способом регистрации, сигнала. Несомненным преимуществом ЛИФА по сравнению с ТИФА является более высокая чувствительность при индикации вирусов и серодиагностике вирусных инфекций, в том числе при выявлении AT к ВКЭ [105, 109]. Вместе с тем, к моменту начала наших исследований в широкой клинической практике метод не применялся и его диагностическая эффективность оставалась практически неизученной.

При проведении масштабных популяционпых исследований взятие и нанесение капиллярной крови на специальную фильтровальную бумагу (ФБ) является более простой, безопасной и экономичной процедурой в сравнении с венепункцией. Его преимущества были продемонстрированы при выявлении AT к возбудителям вирусных (ВИЧ-инфекция, вирусные гепатиты А и В, краснуха, корь, лихорадка Денге), бактериальных (лептоспироз, столбняк, сифилис, туляремия, среднеазиатский клещевой боррелиоз) и протозоиных (малярия, токсоплазмоз, лейшманиоз) инфекций [221], однако для диагностики КЭ ранее этот метод не использовался. В связи с этим мы оценили возможность использования высушенной капиллярной крови в качестве источника AT, альтернативного сыворотке, при серодиагностике КЭ методом ЛИФА.

Цель исследования.

Оценка диагностической чувствительности и специфичности иммунолюминесцентных тест-систем на основе ЛИФА для выявления специфических IgM- и IgG-AT к ВКЭ в пробах сывороток и сухих пятен крови (СПК) в сравнении с коммерческими тест-системами ТИФА.

Для ее достижения необходимо было решить следующие задачи:

1. Охарактеризовать современное течение клещевого энцефалита на Западном Урале.

2. Выявить особенности формирования специфического гуморального иммунитета при клещевом энцефалите у жителей эндемичного региона с помощью ЛИФА.

3. Определить показатели диагностической чувствительности и специфичности ЛИФА при выявлении IgM и IgG к ВКЭ в сыворотках крови в сравнении с коммерческими иммуноферментпыми тест-системами.

4. Установить диагностическую ценность ЛИФА, ее чувствительность и специфичность при определении IgM и TgG к ВКЭ в сухих образцах крови в сравнении с результатами анализа сывороток.

Научная новизна исследования. Доказано, что показатели-чувствительности и специфичности ЛИФА при выявлении IgM-AT к ВКЭ у пациентов, заболевших острыми лихорадочными заболеваниями в период сезонной активности клещей-переносчиков в эндемичном регионе сопоставимы с методом ТИФА.

Выявлено, что метод ЛИФА в 2,5 раза в сравнешш с методом ТИФА более чувствителен при определении IgM-AT у пациентов с длительно протекающим инфекционным процессом.

Показана возможность использования высушенной на ФБ капиллярной крови в качестве альтернативного источника AT при серодиагностике КЭ. 11о сравнению показателями, достигнутыми при анализе сывороток в ТИФА, диагностическая чувствительность (ДЧ) ЛИФА при определении IgM к ВКЭ в СПК составила 95,8%, диагностическая специфичность (ДС) - 97,1%.

Практическая значимость. Метод ЛИФА позволяет снизить трудоемкость лабораторных исследований при серодиагностике КЭ за счет исключения процедуры титрования проб. Благодаря более высокой чувствительности метода по сравнению с ТИФА, его использование предпочтительно при верификации клинического диагноза у больных с низким уровнем специфических IgM-AT.

Методика ЛИФА для определения AT к ВКЭ в сухих пятнах крови более экономична и доступна за счет простоты забора, хранения и доставки исследуемого материала и наиболее удобна в случаях затруднения с взятием крови из вены и во время проведения массовых сероэпидемиологических исследований.

Сформирована информационная база клинико-лабораторных данных и создан банк сывороточных и сухих образцов крови от обследованных групп населения Пермского края, используемые для выполнения ретроспективных популяционных и научных исследований.

Личное участие автора. Автором самостоятельно осуществлен набор пациентов в группы наблюдения, их клинико-анамнестическое обследование и взятие от них биоматериала (сыворотки, СПК). Создан банк охарактеризованных клинических проб (сыворотки и СПК) от обследуемых пациентов в эндемичном по КЭ регионе - Пермском крае. Все результаты клинико-анамнестического и лабораторного обследования перенесены в специально созданную электронную базу данных. Автор освоила методики выполнения ТИФА и ЛИФА для выявления протнвоэнцефалитных AT в сыворотках и СПК, принимала участие в выполнении серологических исследований. Самостоятельно проведен статистический анализ первичпой документации и результатов лабораторных данных.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Современное течение КЭ на Западном Урале характеризуется развитием лихорадочной формы у 50% больных, менингеальной у 41,1% и очаговой у 8,9%, с преобладанием среднетяжелых и тяжелых форм (87,0%) и нередким двухволновым вариантом (22,5%), формированием прогредиентного течения в 1,1%.

2. Установлена высокая диагностическая чувствительность и специфичность ЛИФА при выявлении IgM к ВКЭ в сыворотке крови больных КЭ - 97,2 и 96,6% соответственно по отношению к коммерческой тест-системе ТИФА. В острый период заболевания оба метода одинаково эффективны. При длительно протекающем инфекционном процессе метод ЛИФА в 2,5 раза чувствительнее метода ТИФА. ,

3. Одновременное определение AT обоих классов у больных КЭ дает возможность прогнозировать иммунный ответ, вероятность - выявления специфических IgM и TgG в первой и последующих порциях сыворотки.

4. Между коэффициентами позитивности (КП) сывороточных и сухих образцов крови выявлена высокая степень корреляции (г более 0,8). Диагностическая чувствительность ЛИФА при выявлении IgM в СПК составляет 95,8%, специфичность — 97,1% по отношению к ТИФА, что позволяет использовать технологию сухого образца крови в сочетании с ЛИФА для лабораторного подтверждения диагноза КЭ.

Апробация и публикация материалов исследования. Основные положения диссертации доложены и представлены на международной научной конференции, посвященной 50-летию Национального института аллергических и инфекционных болезней США (NIAID NIH DHHS USA) (г. Опатия, Хорватия, 2006 г.), всероссийской научной конференции "Современные научные и прикладные аспекты клещевого энцефалита" (к 70-летию открытия вируса клещевого энцефалита) (Москва, 2007 г.), Российской научно-практической конференции «Инфекционные болезни: современные проблемы диагностики и лечения» (Санкт-Петербург, 2008 г.), научно-практической конференции «Терапия неотложных и реанимационных состояний в медицине» (г. Пермь, 2008 г.), научной сессии ГОУ ВПО «ПГМА им. ак. Е.А. Вагнера» (г. Пермь, 2008 г.).

По материалам диссертации опубликовано 6 работ, из них 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК для опубликования результатов исследований, выполненных на соискание, ученой степени кандидата медицинских наук.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 135 страницах печатного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы исследования», 4 глав собственных исследований, заключения, выводов и практических рекомендаций. Указатель литературы включает 148 отечественных и 100 зарубежных источников. Диссертация иллюстрирована 21 таблицей, 18 рисунками. Приведено 4 клинических наблюдения.

105 ВЫВОДЫ

1. Выявленные данные соответствуют наметившимся в конце 20 века тенденциям к формированию более тяжелых форм КЭ на Западном Урале: превалируют лихорадочная (50%) и менингеальная (41,1%) формы, очаговая встречается в 8,9%>, заболевание чаще протекает в среднстяжелой и тяжелой формах (87,0%о), нередко развивается двухволновый вариант (22,5%)) с формированием менингита в 59,2%> случаев. Хроническое течение инфекции наблюдается у 1,1%.

2. В эндемичном регионе у больных КЭ преобладает вторичный иммунный ответ с развитием инфекции на фоне уже имеющихся IgG к вирусу. При первичном иммунном ответе и формах с поражением оболочек и вещества мозга выявлено более значительное нарастание доли IgM- и IgG-положительных проб и их СГТ в сравнении с вторичным иммунным ответом и лихорадочной формой.

3. Определены высокие показатели диагностической чувствительности и специфичности тест-систем ЛИФА при выявлении IgM- (97,2 и 96,6% соответственно) и IgG-антител к ВКЭ (95,1 и 98,5%о) по отношению к коммерческим тест-системам ТИФА, что позволяет верифицировать клинический диагноз примерно у 70%> пациентов уже в 1-ю неделю заболевания. Чувствительность ЛИФА в 2,5 раза выше по сравнению с ТИФА в случае низкой концентрации IgM у лиц с длительно протекающим инфекционным процессом (персистенция IgM, хронический КЭ).

4. Диагностическая чувствительность ЛИФА при определении специфических IgM в сухих пятнах крови составила 94,9%, специфичность -97,5% по сравнению показателями, достигнутыми при анализе сывороток в ТИФА.

5. Применение технологии сухого пятна крови наиболее целесообразно при проведении сероэпидемиологического мониторинга и серодиагностике острого КЭ у госпитализированных людей, у которых взятие венозной крови затруднено.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1) Тест-системы ЛИФА обладают высокой диагностической значимостью и их использование целесообразно для серологической верификации острых и хронических форм КЭ и МИ и исследования популяционного иммунитета.

2) Применение технологии сухого пятна крови необходимо при проведении крупномасштабных сероэпидемиологических исследований и наличии затрудненного венозного доступа у некоторых больных.

3) Для исследования особенностей формирования гуморального иммунитета при КЭ у жителей эндемичного региона целесообразно использование банка сывороточных и сухих образцов крови.

107