Автореферат и диссертация по медицине (14.01.01) на тему:Диагностика и лечение эпителиальной дисплазии шейки матки, ассоциированной с вирусом папилломы человека, у женщин репродуктивного возраста

На правах рукописи

Бабкина Наталия Андреевна

ДИАГНОСТИКА И ЛЕЧЕНИЕ ЭПИТЕЛИАЛЬНОЙ ДИСПЛАЗИИ

ШЕЙКИ МАТКИ, АССОЦИИРОВАННОЙ С ВИРУСОМ ПАПИЛЛОМЫ ЧЕЛОВЕКА, У ЖЕНЩИН РЕПРОДУКТИВНОГО

ВОЗРАСТА

Специальность: 14.01.01 - Акушерство и гинекология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 5 НОЯ 2010

Воронеж - 2010

004613861

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Воронежская государственная медицинская академия имени Н.Н. Бурденко Министерства здравоохранения и социального развития»

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет»

Защита состоится « 26 » ноября 2010 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 208.009.04 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Воронежская государственная медицинская академия имени Н.Н. Бурденко Министерства здравоохранения и социального развития» по адресу: 394000, Россия, г. Воронеж, ул. Студенческая, д.Ю.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Воронежская государственная медицинская академия имени Н.Н. Бурденко Министерства здравоохранения и социального развития».

Автореферат разослан « 2010 г.

Ученый секретарь

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Коротких Ирина Николаевна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Бычков Валерий Иванович доктор медицинских наук Шемаринов Герман Анатольевич

диссертационного совета

Семенов С.Н.

Актуальность проблемы

Эпителиальная дисплазия является предраковым состоянием одной из самых распространенных форм онкологической патологии во всем мире -плоскоклеточной карциномы шейки матки. Рак шейки матки является глобальной проблемой здравоохранения мирового масштаба: заболеваемость составляет 371 ООО в год, смертность - 190 ООО случаев в год (Bosch F. X., Manos M. M., 1995; Parkin D. M., 1999). Ежегодно в России регистрируется 12,3 тысячи новых случаев рака шейки матки (Козаченко В. П., 2000; Прилепская В. Н., 2007).

Развитие эпителиальной дисплазии и рака шейки матки тесно связано с активностью вируса папилломы человека (ВПЧ) (Киселев Ф. JI.,1997; Киселев В. И.,2003; Роговская С.И., 2008; Giroglou Т., 2001; Eltoum I. А., 2005). Для стран с высокой заболеваемостью эпителиальной дисплазии и рака шейки матки характерна высокая распространенность ВПЧ (Franco Е. L.,1999; Schlecht N. F., 2001).

Введение массового цитологического скрининга в развитых странах позволило значительно повысить выявляемость предраковых состояний шейки матки но, тем не менее, эффективность метода ограничена при рассмотрении чувствительности и специфичности (Smith А.Е, 2000; Quddus M.,2001). Ложноотрицательные результаты при диагностике дисплазии и рака шейки матки варьируют от 15 до 50%, а ложноположительные результаты выявляются в 30% случаев (Brewer С. А., 1997; Gage J. С., 2006).

Гистологический анализ в настоящее время является решающим в диагностике эпителиальной дисплазии, хотя показывает лишь статическую картину изменений эпителия шейки матки, не неся информации об активности диспластического процесса (Ostor A. G, 1993; Abulafia О., 2003). Более того, гистологическое заключение выносится на основании субъективной оценки, и могут встречаться расхождения в интерпретации патогистологической картины. Развитие эпителиальной дисплазии - процесс динамический, течение которого зависит от ряда клинических и биологических параметров, таких как активность иммунной системы, агрессивность типа ВПЧ, возраст пациентки, давность заболевания, наличие сопутствующей инфекции. Согласно данным литературы 57% дисплазии легкой степени, 44% дисплазии средней, 32% дисплазии тяжелой степени

з

спонтанно регрессируют (McCluggage W, G., 1995; Nobbenhui M. A., 2001). Конизация шейки матки, являющаяся основным методом лечения, связана с рядом проблем для будущей беременности, поскольку несет значительный риск преждевременных родов (Подистов Ю, И., 2005; Серова О. Ф., 2009; Crane J. М., 2003; Jakobsson М. ,2007).

Таким образом, ограниченность чувствительности и специфичности цитологического метода массового скрининга у женщин по выявлению предраковых состояний шейки матки, субъективность гистологического исследования заставляют вести поиск специфических маркеров эпителиальной дисплазии, способных улучшить диагностику. Учитывая то, что большая часть дисплазии легкой степени может спонтанно регрессировать и лишь в небольшом проценте случаев будет прогрессировать, возникает необходимость более точного прогнозирования течения эпителиальной дисплазии, определения тактики ведения пациентов, снизив частоту агрессивного лечения. Использование специфических маркеров эпителиальной дисплазии в комплексе с клиническими, цитологическими и гистологическими исследованиями позволит повысить точность и чувствительность диагностики. Цель и задачи исследования:

Целью исследования является оптимизация диагностики и тактики ведения пациентов с эпителиальной дисплазией шейки матки, ассоциированной с вирусом папилломы человека, на основании клинических, патогистологических и молекулярно-биологических показателей. Задачи исследования:

1. Изучить клинические, цитологические и патогистологические параметры больных с эпителиальной дисплазией шейки матки, ассоциированной с вирусом папилломы человека.

2. Сформировать комплекс иммуногистохимических и молекулярно-биологических маркеров эпителиальной дисплазии шейки матки.

3. Провести сравнительную оценку диагностической эффективности молекулярно-биологических и иммуногистохимических маркеров эпителиальной дисплазии шейки матки, ассоциированной с вирусом папилломы человека.

4. Оценить прогностическое значение иммуногистохимических и молеку-лярно-биологических маркеров эпителиальной дисплазии шейки матки различной степени тяжести.

5. Разработать алгоритм ведения пациентов с эпителиальной дисплазией шейки матки с привлечением результатов цитологического, пато-гистологического, иммуногистохимического и молекулярно-биологического исследований.

Научная новизна:

Впервые проведена комплексная оценка состояния больных с эпителиальной дисплазией шейки матки, ассоциированной с вирусом папилломы человека, с использованием молекулярно-биологических и иммуногистохимических маркеров

Проведены иммуногистохимические исследования маркера пролиферации Кл67, ингибитора циклиновых киназ Р16ШК4а, маркера дендритных клеток СБ 1а, молекулярно-биологическое исследование типа ДНК ВПЧ у пациентов с эпителиальной дисплазии шейки матки, позволяющая повысить точность диагностики степени дисплазии.

Разработан алгоритм ведения пациентов с эпителиальной дисплазией шейки матки, ассоциированной с вирусом папилломы человека, с привлечением результатов цитологического, патогистологического, иммуногистохимического и молекулярно-биологического исследований.

Показано прогностическое значение иммуногистохимических и молекулярно-биологических маркеров при эпителиальной дисплазии шейки матки различной степени тяжести.

Научно - практическая значимость

Сформирована комплексная программа обследования пациентов с эпителиальной дисплазией шейки матки, включающая определение маркера пролиферации Кл67, ингибитора циклиновых киназ Р16ШК4а, маркера дендритных клеток СБ 1а, молекулярно-биологическое исследование типа ДНК ВПЧ, позволяющая повысить точность диагностики степени эпителиальной дисплазии шейки матки.

На основании проведенных исследований разработан алгоритм диагностических и лечебных мероприятий для пациенток с эпителиальными дисплазиями шейки матки.

Предложены иммуногистохимические маркеры для прогнозирования течения эпителиальной дисплазии шейки матки.

Апробация работы

Диссертационная работа была апробирована на совместном заседании кафедр акушерства и гинекологии №1, №2, ИПМО ВША им. H.H. Бурденко. Основные положения диссертационной работы были представлены на отечественных и международных конференциях: Международном конгрессе «HPV in Human Pathology» (Прага, 2008); Международном конгрессе по реабилитации в медицине и иммунореабилитации (Дубай, 2009); 14 национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2010); ежегодных научных конференциях ВГМА им. Н.Н.Бурденко (Воронеж, 2004,2007,2009); заседаниях научно-практического общества акушеров-гинекологов г. Воронежа.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 10 работ, в том числе - 2 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Положения, выносимые на защиту

1. Иммуногистохимические исследования маркера пролиферации Ki67, ингибитора циклиновых киназ P16INK4a, маркера дендритных клеток CDla, молекулярно-биологическое исследование типа ДНК ВПЧ у пациентов с эпителиальной дисплазии шейки матки, позволяют повысить точность диагностики степени эпителиальной дисплазии шейки матки.

2. Дисплазия тяжелой степени ассоциирована с повышенной экспрессией pl6INK4a, Ki67, положительным тестом на ДНК ВПЧ и сниженной экспрессией CDla, а дисплазия легкой степени - с низкой экспрессией pl6INK4a, Ki67 и нормальной экспрессией CDla.

3. Прогноз течения эпителиальной дисплазии определяется уровнем экспрессии маркера пролиферации Ki67 и уровнем экспрессии CDla

Структура и объем работы

Диссертация состоит из следующих частей: введения, 4 глав, заключения, выводов, библиографии и приложения. Материалы диссертации изложены на 137 страницах машинописного текста. Работа иллюстрирована 14 таблицами и 24 рисунками. Библиография представлена 233 литературными источниками отечественных и зарубежных авторов.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследования

В настоящее исследование были включены 276 женщин, обратившиеся на консультацию в Центр Планирования Семьи Областного родильного дома г. Воронежа в период с 2004 по 2009 год по поводу патологии шейки матки. В группу исследования были включены 169 пациенток, отвечающих ряду критериев. Критериями являлись наличие эпителиальной дисплазии шейки матки легкой, средней или тяжелой степени, подтвержденной патогистологическим исследованием и срок наблюдения не менее двух лет. Возраст пациентов в группе исследования был от 19 до 57 лет, средний возраст составил 33,3±8,5 года. Срок наблюдения в Центре Планирования Семьи Областного родильного дома варьировал от 2,79 до 5,52 года и в среднем составил 3,9±0,7 года.

Контрольную группу составили 107 пациенток с реактивными изменениями шейки матки, диагностированными на основании гистологического исследования, в возрасте от 20 до 46 лет (средний возраст 32,37±6,04 года). Срок наблюдения был от 3,5 до 4,05 лет и в среднем составил 3,51±0,19 года.

Исследование включало кольпоскопию с использованием видео-кольпоскопа Sensitec SCL2000 с последующим взятием материала для цитологического исследования и биопсией измененных участков шейки матки. Патогистологическая верификация и иммуногистохимические исследования проводились в Институте Патологии Университета им. Гуттенберга г. Майнца, Германия.

ВПЧ в фиксированных препаратах определяли с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и иммуногистохимическим методом. ПЦР проводилась по стандартной методике в два этапа. Сначала проводилась ПЦР на групповую специфичность ВПЧ альфа-группы высокого онкогенного риска: 6, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 или 68. При положительной реакции определяли тип вируса.

Для иммуногистохимической реакции на ВПЧ использовались мышиные моноклональные антитела (Clone К1Н1, Cat. No: ab75574, Abeam, Великобритания). В качестве иммуногена использовалась ДНК ВПЧ 1 типа, спектр реактивности включал ВПЧ 6, 11, 16, 18, 31, 33, 42, 51, 52, 56 и 58 типов.

Проведены иммуногистохимические исследования протеина pl6INK4a - супрессора опухолевого роста и ингибитора циклин зависимых киназ, маркера пролиферации Ki 67 и дендритных клеток CDla. Иммуногисто-химическая окраска проводилась по стандартному протоколу в фиксированных гитстологических препаратах.

Для выявления P16INK4a использовался мышиные моноклональные антитела к pl6INK4a (Clone 2D9A12, Cat. No: ab54210, Abeam, Великобритания) в разведении 1:100. В качестве положительного контроля окраски на P16INK4a использовались препараты ткани головного мозга человека.

Реакция на Ki 67 проводилась с использованием мышиных моноклональных антител к Ki 67 (Clone МШ1, Cat. No: M7240 Dako, Германия) в разведении 1:10. Положительным контролем для Ki67 были срезы миндалин.

Для иммуногистохимической реакция на CDla применялись мышиные моноклональные к CDla (Clone OlO, Cat. No.: 1590, Immunotech, Франция) в разведении 1:25. В качестве положительного контроля для иммуногистохимической окраски на CDla использовались срезы кожи согласно рекомендациям производителя.

Анализ 1600 микрофотографий 600 препаратов проведен с использованием приложения ImageJ для Windows ХР (Maryland, USA). Подсчет позитивных клеток в каждом препарате проводился на участке эпителия длиной 0,01 мм. Результаты представлены как процент положительных клеток на 100 клеток в данном фрагменте эпителия. Для Ki 67 введено было понятие стратификационного индекса SI, рассчитываемого по формуле: SI=(dl/S +d2/S+..dn/S)/n, где п - количество клеток положительных на Ki 67, d-расстояние каждой положительной клетки от базальной мембраны и S-толщина эпителия.

Статистическая обработка данных производилась тестом ANOVA для нормального распределения данных, Kruskal-Wallis для ненормального распределения данных, корреляционным анализом Спирмена и тестом Фишера в компьютерном приложении Statistica 7.0. Тест Холмогорова-Смирнова был использован для тестирования на нормальное распределение

данных. Разработка алгоритма диагностики и эпителиальной дисплазии проводилась с помощью метода С 5.0 алгоритма «деревья решений».

Основные результаты исследования

Анализ амбулаторных карт и специальных анкет всех женщин позволил установить клинические особенности исследуемой группы пациенток. Из гинекологических заболеваний имели место инфекции у 30(17,7%)женщин, эндометриозы- у 19(11,2%), аднекситы- у 5(8,8%), миомы-у 12(7%), рак шейки матки- у 2(1,1%), рак грудной железы- у 1(0,7%). Курили 25(14,8%) женщин. Раннее начало половой жизни (до 18 лет) выявлено в 37(21,8%) случаях. Одного полового партнера в браке имели 101(59,7 %) женщин, двух - 16 (9,5%), более двух -19 (11,2%). Все пациентки были разделены на 3 группы в зависимости от степени эпителиальной дисплазии: CIN 1 (cervical intraepithelial neoplasia), CIN 2, CIN 3 и контроль (Табл. 1).

Таблица 1

Клинические группы больных

№ группы Степень дисплазии Число случаев Средний возраст, лет

п %

1 CIN 1 65 23,6 31,4±6,6

2 CIN 2 56 20.0 33,8±3,1

3 CIN 3 48 17,5 34,2±3,5

4 Контроль 107 38,9 33,4±3,5

Всего 276 100 32,4±6,0

В исследуемой группе преобладали пациентки молодого возраста от 21 до 30 лет и от 31 до 40 лет (соответственно 32% и 25,4%).

На рисунке 1 показано возрастное распределение пациенток в зависимости от степени CIN. В возрастной группе от 21 до 30 лет преобладали женщины с CIN 2 (59,8 %). В возрасте от 31 до 40 лет у большинства пациенток была выявлена CIN 3 и CIN 2 (соответственно 43,8%

и 30,8%), а у женщин от 41 до 50 лет чаще встречались CIN1 и CIN 2 (43,8% и 43,8% соответственно).

%

□з 02 ■ 1

Возраст

Рис. 1. Возрастное распределение пациенток в зависимости от степени CIN

Таким образом, установлены некоторые возрастные и клинические особенности пациенток с различной степенью эпителиальной дисплазией шейки матки.

Цитологические и патогистологические исследования больных с эпителиальной дисплазией шейки матки

Нами проанализированы кольпоскопические картины у 98 пациенток. Отклонения выявлены у 58 женщин. Из 58 пациенток, имевших отклонения от нормальной кольпоскопической картины, 34 (58,3%) находились в возрастной группе от 18 до 30 лет, а 24 (41,6%)- в возрастной группе от 31 года и старше. Йод-негативная окраска была выявлена у 45(77,6%) пациенток. Кондиломы были диагностированы у 10 (17,2%) пациенток, лейкоплакия - у 25 (43,7%), эктропион - у 19 (32,7%), явления атипии - у 16(27,4%) пациенток.

Молекулярно-биологические и иммуногистохимические исследования ВПЧ Тестирование на ДНК ВПЧ методом ПЦР проводилось в 45 фиксированных препаратов пациенток группы исследования и 11 препаратов контрольной группы. ДНК ВПЧ вирусов группы альфа в количестве,

достаточном для определения типа, по результатам реакции на А6/А8п и/или на ß-Globin, была обнаружено в 29(64%) пробах. Семнадцать из 29 пациенток были молодого возраста от 21 до 30 лет, 9 пациенток были в возрасте от 31 до 40 лет и только 3 женщины в возрасте от 41 до 50 лет.

Специфическая реакция с праймерами типов 16, 18,31,33,35,45, 52, 56 и 58 была положительной в семи случаях. В шести случаях из 45 (13,3%) был обнаружен ВПЧ 16 типа и в одном случае из 45 (2,2%) ВПЧ 33 типа. У шести из семи пациентов, положительных на ДНК ВПЧ, гистологический диагноз был CIN 3, и только в одном случае CIN 2. Так, шесть из 15 пациентов (40%) группы CIN 3 и одна из 18 пациенток (5,6%) группы CIN 2 были положительными на ВПЧ высокого онкогенного риска в гистологических препаратах. Тестирование фиксированного материала на ДНК ВПЧ показало, что частота обнаружения вируса была значительно выше в пробах с CIN 3, чем с CIN 1и 2 (р<0.005).

Иммуногистохимическая реакция на ВПЧ проводилась на 45 препаратах группы исследования и 11 контрольной группы. В группе с CIN 1 количество ВПЧ-позитивных клеток варьировало от 12,5 до 84,4 %, в среднем составило 47,36±25,08. В группе CIN 2 количество ВПЧ-позитивных клеток было от 15,56 до 76,92% (ср. значение 47,13±17,55). В группе CIN 3 ВПЧ-позитивных клеток было от 17,0 до 78,57% (ср.значение 45,27±22,8).

Таким образом, интенсивность иммуно-гистохимической реакции на ВПЧ не отличалась в группах с эпителиальной дисплазией легкой, средней или тяжелой степени тяжести.

Иммуногистохимическое исследование протеина - ингибитора циклиновых киназ P16INK4a Наименьшее количество протеин P16INK4a - позитивных клеток было обнаружено в контрольной группе (0,4±0,7 %), наибольшее - в группе с CIN 3 (88,0±18,4%). По результатам теста ANOVA различия между количеством P16INK4a позитивных клеток в группах с CIN 1,2,3 и контрольной группе были достоверными (р<0,05). Наблюдалось увеличение P16INK4a позитивных клеток по мере прогрессирования эпителиальной дисплазии. Более того, отмечена тесная корреляция между количеством P16INK4a позитивных клеток и степенью эпителиальной дисплазии (г=0,91, р<0,05). Следует отметить, что при оценке интенсивности окраски P16INK4a позитивных клеток по трехбалльной системе, установлены различия в

зависимости от степени эпителиальной дисплазии. Так, у пациенток с эпителиальной дисплазией CIN 1 в 50% случаев интенсивность окрашивания соответствовала 1 баллу, а в 50% была негативной. При эпителиальной дисплазии CIN 2, у большинства пациенток интенсивность окрашивания соответствовала 1-2 баллам, и только в 5,6% случаев - трем баллам. Для эпителиальной дисплазии CIN 3 характерна более интенсивная окраска, соответствующая 2-3 баллам (соответственно 13% и 87%). Выявлена прямая положительная корреляция между степенью эпителиальной дисплазии и интенсивностью окраски в баллах на экспрессию протеина P16INK4a при г=0,83 (р<0,05).

Иммуногистохимическое исследование протеина Р16ШК4а позволило определить экспрессию этого белка при эпителиальной дисплазии шейки матки. Выявлена прямая корреляция экспрессии P16INK4a со степенью эпителиальной дисплазии: наименьшая в случаях при эпителиальной дисплазии CIN 1; умеренная при СШ 2 и наибольшая при CIN 3.

Иммуногистохимическое исследование маркера пролиферации Ki67

Иммуногистохимическое исследование маркера пролиферации Ki 67 показало, что при CIN 1 количество клеток, экспрессирующих Ki 67, варьировало от 12 и до 41%, при CIN 2 - от 14 до 60%, CIN 3- от 24 и до 95%, в контрольной группе от 22 до 41% клеток на участке эпителия с длиной базальной мембраны 0,01 мм. В контрольной группе среднее значение было 29,3±5,9%, при CIN 1- 21,9±3,1%, при CIN -2 32,3±3,2%, при CIN 3: 63,4±5,7%. ANOVA - анализ выявил достоверное отличие между группами (р<0.001). Tukey HSD post hoc тест был использован для определения конкретных групп, между которыми были различия. Между группой CIN 1 и группой CIN 2 достоверных различий нет (р>0.25), а группа CIN 3 достоверно отличается от контрольной группы (р=0.008), CIN 1 (pO.OOl) и CIN2 (р<0.001).

Для стандартизации и объективизации результатов исследования было введено понятие стратификационного индекса (SI). Группы сравнивали тестом Kruskal-Wallis. В случаях CIN 1 SI варьировал от 0,04 до 1 и в среднем составил 0,15±0,01, в случаях CIN 2 SI был от 0,02 до 0,99 (средне значение 0,27±0,01) и в случаях CIN 3 SI варьировал от 0 до 1 (среднее значение 0,49±0,01). SI контрольной группы варьировал от 0,01 и до 0,29 и в

среднем составил: 0,07 ± 0,01. Сравнение групп CIN 1, CIN 2 и CIN 3 тестом Kruskal-Wallis показало, что группы достоверно отличаются. В группе CIN 3 SI был достоверно выше, чем в группе с CIN 1 и CIN 2, в группе с CIN 2 достоверно выше, чем в группе с CIN 1 (pO.Ol). Tukey HSD post-hoc тест выявил достоверные различия между всеми парами групп (р<0,001), кроме пары контроль - CIN 1 (р=0,3) (рис. 2).

CD 1а - антиген является кластерной детерминантой антигенпрезенти-рующих дендритных клеток, имеющих отношение к тимическим и опосредующих иммунный ответ. Экспрессия этого антигена, позволяющего идентифицировать дендритные клетки в эпителии шейки матки, дает возможность констатировать наличие иммунокомпетентных клеток при дисплазиях различной степени.

0.500 0.450 0.400 0.350 0.300

0.200 0.150 0.100 0.050 0.000

Контрольная группа I степень II степень Шетепень

Рис. 2. Распределение SI при различной степени дисплазии и в контроле. *- достоверные различия между контрольной группой и CIN2 и CIN3, р< 0,05.

Определение антигенов CD 1а проведено в гистологических препаратах у 45 пациенток группы исследования и И пациенток группы контроля. В препаратах пациенток с CIN 1 количество CDla-позитвных клеток варьировало от 5,08 до 20,0 на 100 клеток эпителия и в среднем составило 10±1,55. В группе пациенток с CIN 2 диапазон был от 0 до 21,43 при среднем количестве 8,4±1,57, в группе пациенток с CIN 3 количество клеток было от 0

* |ggg —

щ

—и* -. ,— 1 ¡¡ЕВ if i:.:.,;,

до 6 и в среднем составило 2,21±0,44. ANOVA тест выявил достоверные различия между группами (pO.OOl). Tukey HSD post-hoc тест подтвердил, что количество CD 1а положительных клеток при CIN 3 было достоверно меньше, чем в группе контроля, в группе с CIN 1 и с CIN 2.

Результаты иммуногистохимического исследования pl6INK4a, Ki-67, HPV, CD la при различной степени эпителиальной дисплазии и в контрольной группе представлены на рис.3.

Рис. 3. Уровень экспрессии pl6INK4a, Ki-67, HPV, CDla при различной степени эпителиальной дисплазии и в контрольной группе.

Проведены параллельные цитологические и молекулярно биологические исследования фиксированного материала 45 пациенток с эпителиальной дисплазией 11 пациенток контрольной группы в динамике. Как показали результаты анализа материала, в кольпоскопической картине такие признаки как лейкоплакия, кондиломы, признаки атипии, пунктации, мозаицизм присутствовали в 33% CIN 1, 61% CIN 2, 67% CIN 3 и 27% пациенток контрольной группы. В группе CIN 1 и в контрольной группе преобладали признаки лейкоплакии, а при CIN 2 и CIN 3 признаки атипии.

14

Достоверных различий в показателях кольпоскопической картины у женщин с различной степенью дисплазии не выявлено. Кольпоскопия несет в себе черты субъективной оценки признаков, зависящих от условий и профессионализма исследователя, и, следовательно, не дает объективных диагностических критериев. Гистологические признаки ВПЧ инфекции были выявлены в 75% случаев CIN 1, во всех случаях CIN 2 и CIN 3. У пациенток с CIN 1 присут-ствовали явления воспаления в 29% случаев и паракератоза - в 21% случаев. У женщин с CIN 2 воспалительная реакция наблюдалась в 33%, явления паракератоза - в 18%, появились случаи с участками метаплазии (8%). У женщин с CIN 3 воспалительные изменения присутствовали в 38%, паракератоз - в 3,4%, метаплазия зарегистрирована в 9% случаев.

В таблице 2 представлены результаты проведенных нами молекулярно-биологических и иммуногистохимических исследований по выявлению ВПЧ онкогенного риска, ингибитора циклиновых киназ P16INK4a, проли-феративного потенциала по Ki 67, а также показателей клеточного иммунитета по экспрессии антигенов дендритных клеток CDla.

Установлено, что в 29% случаев группы исследования выявлена положительная реакция на ДНК ВПЧ, а в группе CIN 3 - 40% случаев были положительными на ДНК ВПЧ, причем тип 16 высокого онкогенного риска выявлен только у больных с CIN 3. Гистологические признаки ВПЧ и имму-ногистохимическая реакция на ВПЧ свидетельствуют о присутствии вируса во всех препаратах, в том числе в контрольной группе. ПЦР проводилась на фиксированном материале, и положительная реакция наблюдалась в препаратах с наибольшим количеством копий. Это подтверждается реакцией на pl6INK4a. Позитивная экспрессия pl6INK4a также выявлена в этих же 29% случаев, которые были положительными на ДНК ВПЧ.

Интенсивность экспрессии была выше, по сравнению с пробами, с отрицательной реакцией ПЦР на ДНК ВПЧ. Более того, в случаях, положительных на ВПЧ, количество pl6INK4 а-позитивных клеток превышало 80% (р<0,05). Максимальная экспрессия pl6INK4a, наличие ДНК ВПЧ наблюдалось преимущественно у пациенток с CIN 3. При сопоставлении данных по экспрессии CDla дендритных клеток и наличием ДНК ВПЧ выявлена обратная корреляция (г= -0,56, р<0,002).

Сопоставление результатов клинических, молекулярно-биологических и

иммуно-гистохимических исследований у женщин с эпителиальной _дисплазией и в контрольной группе._

Группа CIN 1 Группа CIN 2 Группа CIN 3 Группа контроля Достоверность различий

ДНК ВПЧ высокого онко-генного риска (ПЦР), п (%) 0 1 (5,6%) б (40%) 0 р 1-з<0.005 Р2-3 <0.005 Рк-з <0.005

Количество ВПЧ-позитивных клеток, М ± m (%) 47,3±8,7 41,9±5,9 51,9±5,б 29,9±7,6 р=0.68

Количество Ki-67 позитивных клеток, М ± m (%) 21,9±3,1 32,3±3,2 63,4±5,7 29,3±5,9 pi-3<0.001 р2-з <0.005 рк.3 =0.008

SI, M±m 0,15±0,01 0,27±0,01 0,49±0,01 0,07±0,01 pi.3<0.001 р2-з <0.001 Рк-з <0.001 Pi-2 <0.001 Рк-1 =0.3

Количество pl6INK4a-позитивных клеток, М±т(%) 4,2±6,1 30,1±26,4 88,0±18,4 0,4±0,7 р ьз<0.05 р2-з <0.05 Рк-з <0.05 pi.2 <0.05 Рк-1 <0.05

Количество CDla-позитивных клеток, М±т(%) 10±1,55 8,4±1,57 2Д1±0,44 13,8±3,8 р 1.з<0.005 р2-з <0.005 Рк-з <0.005

Отклонения в кольпоскопии, п (%) 4 (33%) 11 (61%) 10 (67%) 3 (27%)

Гистологические признаки ВПЧ, п. (%) 9 (75%) 18(100%) 15 (100%) 11 (100%)

Число пациентов L 12 18 15 11

Выявлена обратная корреляция между наличием дендритных клеток и стратификационным индексом (г= -0,515; р<0,01). В то же время между

наличием положительной реакцией ПЦР на ВПЧ и агрессивностью пролиферации, выраженной значением SI, установлена прямая тесная зависимость при коэффициенте корреляции г=0,6 (р<0,05). Пролиферация была достоверно выше при более тяжелой степени дисплазии, о чем свидетельствует более высокий SI при нарастании тяжести дисплазии.

Таким образом, иммуногистохимические маркеры: показатель пролиферации Ki 67, стратификационный индекс и экспрессия pl6INK4a ДНК ВПЧ могут быть объективными критериями в дифференциальной диагностике эпителиальной дисплазии. CIN 1, CIN 2 и CIN 3.

Методы и результаты лечения эпителиальной дисплазии в исследуемой группе В наших исследованиях применялись такие методы лечения пациенток как динамическое наблюдение в 18 случаях, конизация скальпелем и радионожом (соответственно в 29 и 56 случаях). Пациентам с легкой степенью дисплазии, которым не проводилась конизация шейки матки, а осуществлялось только динамическое наблюдение, в случае персистенции эпителиальной дисплазии по результатам кольпоскопии по окончании периода наблюдения проводилась повторная биопсия и конизация в случае гистологического подтверждения. Все пациенты контрольной группы динамически наблюдались после взятия биопсии. Период наблюдения после взятия биопсии или конизации составил 2,28±0,8 лет. Методы и результаты лечения указаны в таблице 3.

У 35 пациентов с CIN 1, которым была проведена конизация, при кольпоскопии наблюдалась полная эпителизация без йод-негативных участков и атипии. У 5 женщин (16%), при гистологической биопсии которых была выявлена CIN 2, после повторной конизации эпителизация была полной, и кольпоскопическое исследование йод-положительных фокусов не выявило атипичных изменений цервикального эпителия.

Пациенткам с CIN 2 в 24 случаях проводилась конизация и только в 6-динамическое наблюдение. После конизации в 20 случаях эпителизаця была полной, в - 2 неполной, в одном случае при повторном исследовании была диагностирована карцинома in situ. В этой группе женщин проведено две операции экстирпации, из них 1- по поводу миомы матки.

Лечение пациенток с эпителиальной дисплазией шейки матки.

Лечение Количество пациенток, п (%) Всего

CIN 1 CIN 2 CIN3

Конизация п (%) скальпелем 10 (20) 11(36,6) 8 (36,4) 29

Конизация п (%) радионожом 25(52) 13(43,3) 8 (36,4) 56

Наблюдение п(%) 10 (20) 6(20) 0 16

Только биопсия, п (%) 8(16) 0 5 (22,7) 13

Повторная ионизация п (%) 5(10) 0 1 (4,5%) 6

Экстирпация п (%) 3(6) 2(6,7) 3 (13,6) 8

Карцинома in situ, n (%) 0 1 (6,7) 3 (13,6) 4

Эпителизация, полная п (%) 35(70) 20 (66,7) 7(31,8) 2

Эпителизация неполная, п (%) 2(4) 2(6,7) 5 (22,7) 9

Прогрессирование CIN 1 в CIN 2 п (%) CIN 2 в CIN 3 п(%) 5 (10) 2(6,7) 0 7

При CIN 3 в большинстве случаев проводилась конизация скальпелем или радионожом. Полная эпителизация наблюдалась в 7 случаях, неполная -в 5, прогрессирование процесса констатировано в 3 случаях, по поводу чего была произведена экстирпация. Следует отметить, что у 7 пациенток после повторной биопсии зарегистрировано изменение степени дисплазии на более тяжелую. Так, у 5 пациенток с первоначально установленной CIN 1, окончательно была уточнена CIN 2, а у 2-х пациенток с первоначальным диагнозом CIN 2 окончательно была констатирована CIN 3.

Таким образом, выбор метода лечения, исход и прогноз течения заболевания во многом зависит от первоначального диагноза. Неправильная тактика ведения пациенток с эпителиальной дисплазией ведет к прогрессированию заболевания или развитию рецидива.

На основании теории «деревьев решений» построен алгоритм диагностики эпителиальной дисплазии шейки матки с использованием 17 клинических, цитологических и иммуногистохимических признаков, из них наиболее значимыми для оценки степени CIN оказались: активность протеина р 16NK4a в диапазоне от 50% до 80%, интенсивность окраски, положительная ДНК ВПЧ, койлоциты. Маркеры пролиферации Ki-67-стратификационный индекс SI более 0,4 и маркеры дендритных клеток CD 1а менее 3 на 100 клеток являются факторами неблагоприятного прогноза и возможного рецидива у пациенток с эпителиальной дисплазией, которым

18

проводилась конизация. Точность диагностики степени CIN с использованием алгоритма « деревья решений» составила 95,2%.

Корреляционный анализ Спирмена позволил выявить факторы, ассоциированные с неблагоприятным прогнозом, а именно персистенцией или прогрессированием заболевания при динамическом наблюдении и рецидивом или персистенцией заболевания после конизации. Так, умеренная корреляция наблюдалась между SI и рецидивом или персистенцией после конизации: г=0,418; р=0,005. Прогрессирование заболевания при динамическом наблюдении было обратно связано с количеством дендритных клеток (г=-0,36; р=0,031).

На основании наших исследований составлен алгоритм ведения пациенток с эпителиальной дисплазией шейки матки (рис. 4). Первый скрининговый этап включает цитологическое исследование. В данном исследовании не проводилось определение ДНК ВПЧ в цитологическом материале при цитологическом заключении, отличном от нормального. Согласно данным литературы подобное исследование значительно повышает чувствительность цитологического анализа, но может снижать специфичность в зависимости от популяции пациентов. При положительной реакции на ДНК ВПЧ из группы высокого онкогенного риска следует провести кольпоскопию с прицельной биопсией. При выявлении или подозрении на эпителиальную дисплазию иммуногистохимическое исследование на молекулярные маркеры: pl6INK4a, Ki-67, SI значительно повышает точность диагностики, а определение экспрессии CD 1а свидетельствует о состоянии локального иммунитета. При выявлении CIN I возможно динамическое наблюдение с повторным исследованием через б месяцев. При выявлении CIN 2 или CIN 3 иммуногистохимическое исследование позволит определить прогноз заболевания. При диагностировании CIN 3 по результатам биопсии и в случае принятия решения об экстирпации матки необходимо провести конизацию шейки матки с целью исключения инвазивного процесса, так как при наличии атипичных клеток за пределами базальной мембраны простая экстирпация без удаления параметрия и лимфатических узлов будет неправильной тактикой.

Выбор метода лечения, исход и прогноз течения заболевания во многом зависит от первоначального диагноза. Неправильная тактика ведения

пациенток с эпителиальной дисплазией ведет к прогрессированию заболевания или развитию рецидива.

Рис. 4. Алгоритм диагностики и ведения пациенток с эпителиальной дисплазией шейки матки.

Таким образом, применение современных цитологических, молеку-лярно-биологических и иммуногистохимических методов исследования для диагностики эпителиальной дисплазии шейки матки несомненно имеет практическое значение и может служить основанием для более детального клинического исследования пациентов.

ВЫВОДЫ

1. Сформирован комплекс иммуногистохимических и молекулярно-биологических маркеров эпителиальной дисплазии шейки матки различной степени тяжести, включающий ДНК ВПЧ, р161Ж4а, Ю-67, стратификационный индекс Кл-67, Сс11а.

2. Дисплазия тяжелой степени ассоциирована с повышенной экспрессией р161МК4а, Ш67, высоким стратификационным индексом 81, положительным тестом на ДНК ВПЧ и сниженной экспрессией СБ1а, а

дисплазия легкой степени - с низкой экспрессией pl6INfC4a, Ki67, низким стратификационным индексом SI и нормальной экспрессией CD 1а.

3. У пациентов, у которых определялась ДНК ВПЧ, экспрессия pl6INK4a была достоверно выше. В пробах, положительных на ВПЧ, количество р16ВДК4а-позитивных клеток превышало 80% (р<0,05)

4. Рецидив или персистенция эпителиальной дисплазии кореллирует со стратификационным индексом SI маркера пролиферации Ki 67.

5. Прогрессирование заболевания при динамическом наблюдении обратно связано с количеством дендритных клеток CD 1а, их отсутствие или малое количество может свидетельствовать о снижении локального иммунитета и ассоциировано с менее благоприятным прогнозом, прогрессированием дисплазии.

6. Разработан алгоритм диагностики и ведения пациентов эпителиальной дисплазией шейки матки с привлечением результатов цитологического, патогистологического, иммуногистохимического и молекулярно-биологического исследований.

РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ ПРАКТИЧЕСКОГО ВНЕДРЕНИЯ

1. Для более точной оценки степени эпителиальной дисплазии шейки матки целесообразно включать в диагностический алгоритм определение ингибитора циклиновых киназ P16INK4a, интенсивность окраски, определение маркера пролиферации Ki67 и ДНК ВПЧ.

2. Для улучшения прогнозирования течения дисплазии шейки матки и оптимизации тактики ведения пациенток с данной патологией целесообразно определять SI и маркер дендритных клеток CD 1а.

3. Предложенный алгоритм ведения больных с различной степенью эпителиальной дисплазии шейки матки позволяет оптимизировать объем исследований и применяемых методов лечения и может быть использован как в акушерских стационарах, так и в женских консультациях.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ Д ИССЕРТАЦИИ

1. Экспрессия протеина P16INK4a и определение ДНК вируса папилломы человека при различной степени эпителиальной дисплазии шейки матки / H.A. Бабкина, И.Н. Коротких, Г. Пфистер, В. Герайн // Системный анализ и управление в биомедицинских системах: журнал практической и теоретической биологии и медицины. - М., 2009. - Т.8, № 4. - С. 1072-1075.

2. Бабкина H.A. Экспрессия протеина P16INK4a при эпителиальной дисплазии шейки матки / H.A. Бабкина // Аллергология и иммунология. -М.,2009. - Т. 10, № 1. - С.81-82.

3. Коротких И.Н. Лапароскопическое лечение и тонкоигольная аспирация под контролем УЗИ при доброкачественных кистах яичников / И.Н. Коротких, Н.А. Бабкина // Материалы 1 международной конференции ВГМА им. Н.Н. Бурденко.- Воронеж, 2006. - С.224-226.

4. Коротких И.Н. Роль тонкоигольной аспирации под ультразвуковым контролем в ведении овариальных и параовариальных кист / И.Н. Коротких, Н.А. Бабкина, Л.В. Адианова // Актуальные проблемы охраны материнства и детства: сб. материалов международной Российско - Американской научно -практической конференции. - Тула, 2004. - С.96-97.

5. Children and partners of patients with recurrent respiratory papillomatosis have no evidence of the disease during long-term observation / V. Gerein, I.L. Soldatski, N. Babkina. II Int. J. Pediatr. Otorhinolaryngol. - 2006, -Vol. 70, № 12. -P. 2061-2066.

6. Human papilloma virus (HPV) - associated gynecological alterations in mothers of children with respiratory recurrent papillomatosis during long term observation / V. Gerein, S. Schmandt, N. Babkina, N. Barysik, H. Pfister // Cancer Detect. Prev.-2007. -Vol. 31, № 4. -P. 276-281.

7. HPV infection In Mothers of Children with Recurrent Respiratory Papillomatosis. Results of German and Russian Studies / N. Babkina [et al] / Central Eur. J. Public Health. -2008. -Vol. 16. -P. S3 8.

8. Бабкина H.A. ВГГЧ - ассоциированные гинекологические заболевания матерей и респираторный папилломатоз у детей / Н.А.Бабкина, И.Н.Коротких, В.И. Герайн // Актуальные проблемы педиатрии: сб. материалов 14 Конгресса педиатров России с международным участием, Москва, 15-18 февраля 2010. -М., 2010. - С.48.- 2010.- С.48.

9. Бабкина Н.А. ВПЧ - ассоциированные гинекологические изменения у матерей пациентов с рецидивирующим респираторным папилломатозом в течение долгосрочного периода наблюдения / Н.А. Бабкина, И.Н. Коротких, В. Герайн // Журнал теоретической и практической медицины. - М.,2010. -Т.8, №2. - С. 251-257.

10. Бабкина Н.А., Коротких И.Н. Определение ДНК вируса папилломы человека в гистологических препаратах у женщин с эпителиальной дисплазией шейки матки / Н.А.Бабкина, И.Н Коротких // Человек и лекарство. Москва , 12-16 апреля, 2010: сб. материалов 17 Российского национального конгресса-М., 2010 - С. 36.

Подписано в печать 20.10.2010 г. Формат 60 х 84/16 . Бумага офсетная. Усл. печ. л. 1,0 Тираж 100 экз. Заказ №2300

Отпечатано в типографии Воронежский ЦНТИ - филиал ФГУ «РЭА» Минэнерго России

394730, г. Воронеж, пр. Революции, 30