Автореферат и диссертация по медицине (14.00.06) на тему:Диагностическое значение выявления антител к белку 67kD мембраны кардиомиоцитов при некоронарогенных заболеваниях миокарда

Государственное лечебмо-оздоровидельное объединение ЦЕНТРАЛЬНАЯ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКАЯ ЛАБОРАТОРИЯ

На правах рукописи УДК 616.127—017.1—07

РЯЗАНОВ Сергей Леонидович

ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К БЕЛКУ 67 кО МЕМБРАНЫ КАРДИОМИОЦИТОВ ПРИ НЕКОРОНАРОГЕННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ МИОКАРДА

14.00.06 — Кардиология

14.00.36 — Аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва — 1991

ч • Работа выполнена'в Центральной'ордена "Трудового Красного Знамени клинической больнице Лечебно-оздоровительного объединения при" Кабинете Министров СССР,

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Б. А. СИДОРЕНКО; доктор медицинских наук, профессор Ю. И. ЗИМИН

Официальные оппоненты:

доктор медицинских паук, профессор В. С. МОИСЕЕВ; доктор медицинских наук Е. Л. НАСОНОВ

Ведущее учреждение—Медицинская академия им. И. М. Сеченова.

на заседании Специали: г .. _ . _ .. _____. .... ... ,_____сследо-

вательской лаборатории Лечебно-оздоровительного объединения при Кабинете Министров СССР (К. 074.43.01) по адресу: 103009, Москва, ул. Грановского, д. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Лечебно-оздоровительного объединения при Кабинете Министров СССР.

Защита состоится

часов

Автореферат разослан «.

г.

Ученый секретарь Специализированного совета доктор медицинских наук Н. К- РОЗОВА

«АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Некоронарогенные заболевания мио-

каряф к числу которых относят миокардит (Ы), в последнее

Т й

привлекают внимание многих специалистов. Это связано с тем, что отмечается увеличение числа больных, страдающих этим заболеванием, их относительно молодой возраст и быстрая инва-лидизация. В настоящее время отсутствуют единая теория патогенеза, надежные методы диагностики и четкие схемы лечения М. Известно, что в патогенезе М иммунные механизмы играют важную роль. Зимин Ю. И. с соавт. (1988) считает М аутоиммунным заболеванием, являющимся следствием нарушения толерантности к своим собственным белкам. Одним из возможных механизмов патогенеза заболевания является иммунное воспаление, возникшее в результате воздействия вируса, бактерий, физических факторов и т.д., когда происходит модификация антигенов, расположенных на мембране кардиомиоцитов или высвобождение "скрытых" в обычных условиях тканевых антигенов, которые распознаются рецепторами Т -хелперов и цитотоксических Т лимфоцитов в ассоциации с антигенами главного комплекса гистосовместимости. В результате происходит гиперпродукция ацтител CAT) и сенсиби-лизированныых цитотоксических лимфоцитов, вызывающих деструктивные изменения в миокарде.

Среди методов диагностики наиболее точным считается эндоми окардиальная биопсия, однако в силу ряда недостатков, она не может удовлетворить потребности диагностики и лечения М в широкой клинической практике (Maze S. S. , 1990). В последнее

время особое внимание уделяется иммунологическим методам исследования, поскольку участие иммунологических механизмов в развитии миокардита подтверждается многочисленными экспериментальными и клиническими исследованиями (Кипшидзе Е Н. с соаьт. , 1984; Насонов Е. JL , 1986; Kereiakes D., et al., 1984). Выявлены циркулирующие и фиксированные на кардиомиоци-тах AT к миокарду (Maisch В. , et al. , 1983; Gr a van is M. , et al. , 1988), обнаружено снижение активности Т-супрессоров ( Keteiakes D. , et al. 1984), естественных киллеров (Терещенко С. £. с соавт., 1989), увелечение соотношения Т-хелперы/Тсул-рессоры в основном за счет снижения уровня Т-супрессоров (Gravanis М. , et al. , 1988; Kereiakes D. , et al. , 1984). Удалось воспроизвести in vitro кардиоспецифическую цитотокси-ческую иммунную реакцию у больных неспецифическим М и высказано предположение о существовании аналогичного механизма поражения in vivo (Зимин Ю. И. с соавт. , 1988). Для подтверждения иммунологической природы поражения миокарда необходимо иметь четкое представление о "виновном" антигене, т. к. без его выявления диагноз представляется гипотетическим (Зимин Ю. И. с соавт. , 1988). Однако только в последнее время появилось ряд работ, посвященных изучению аутоантигенов при некоронаро-генных заболеваниях миокарда (Liims С. , et al. , 1989; Shulze К. , et al. , 1989).

Данные литературы о связи иммунологических нарушений с клиническими проявлениями и особенностями течения некоронаро-генных заболеваний миокарда немногочисленны и противоречивы. Вместе с тем, оценка функционирования иммунной системы в ком-

плексе с клиническими данными может иметь важное значение как с теоретических позиций в плане расшифровки патогенеза болезни, так и с клинической точки зрения, для уточнения степени активности патологического процесса, диагностики, оценки результатов лечения и прогноза заболевания.

Цель исследования: изучение спектра АТ к мембранным белкам кардиомиоцита (БМК) при некоронарогенных заболеваниях миокарда в сопоставлении с их клиническими проявлениями и особенностями течения заболевания для выработки диагностических критериев оценки аутоиммунного воспаления, что может быть использовано для назначения иммунологически обоснованного лечения и контроля за его эффективностью.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи исследования:

1. Провести клиническое и инструментальное обследование больных с некоронарогенными заболеваниями миокарда.

2. Выделить структурные белки мембраны кардиомиоцитов

из сердец человека для проведения кардиоспецифического иммунологического обследования больных и здоровых доноров.

3. Разработать и внедрить метод определения АТ к антигену миокарда в сыворотках крови.

4. Исследовать сыворотки крови больных с различными заболеваниями на наличие АТ к белкам мембраны кардиомиоцитов.

5. Изучить взаимосвязь мевду выявлением АТ и клиническими проявлениями заболевания.

Научная новизна. Впервые в кардиологической практике был разработад и внедрен для выявления АТ к миокарду метод, осно-

ванный на принципе иммуноблогтинга. С помощью этого метода удалось выявить АТ к БЫК. Обнаружили высокую частоту выявления АТ с белком мембраны кардиомиоцитов, имеющим молекулярную массу 6? кВ (БМК67). Так при М антитела обнаруживались в 60% случаев, при дшнтационной кардиомиопатии (ДКМП) в 20%, в то время как при других заболеваниях частота их выявления была достоверно ниже и не отличалась от показателей здоровых доноров. На основалии изучения литературы и данных собственных исследований можно сделать заключение, что выявленный БМК67 против которого осуществляется иммунный ответ при -М, является ранее неизвестным БМК. Изучена взаимосвязь мевду выявлением АТ к БМК67 и клиническим течением М. Впервые убедительно показано, что обнаружение антител к данной детерминанте связано с более тяжелым течением заболевания. В настоящей работе сделан еще один шаг к пониманию причин части идиопатических аритмий. Обнаружение АТ к определенной детерминанте в сыворотках крови таких больных предполагает патогенетическую сеязь части идиопатических аритмий с воспалительным процессом в миокарде или его последствиями.

Практическая значимость работы. Разработан метод диагностики М. лишенный многих недостатков, ранее применяемых методов, являющийся высокочувствительным (60%) и выеокоспецифич-ным (92%). Его особенностью является возможность предварительной заготовки большого количества диагностикумов (полос нитроцеллюлозы с нанесенными на них фракциями белков) и простота собственно процедуры определения АТ в сыворотке крови. Это позволяет использовать настоящий метод в широкой сети ле-

чебно-диагностических учреждений, не имеющих специального лабораторного оборудования. Кроме того он позволяет определить спектр ЛТ против БЫК в сыворотке крови исследуемых пациентов, с целью обнаружения иммунных нарушений против миокарда (выявление в сыворотке крови больных антител к миокарду). Полученные данные свидетельствуют о целесообразности использования метода иммулоблоттинга в качестве диагностического критерия при оценки активности патологического процесса у больных с некоронарогенными заболеваниями миокарда.

• Внедрение результатов работы в практику. Метод иммуноб-лоттинга используется в лаборатории клинической иммунологии Центральной клинической больницы ЛОО при КМ СССР.

Апробация диссертации. Апробация диссертации состоялась на объединенной научной конференции кафедры кардиологии и общей терапии УНЦ Л00 при КМ СССР и кафедры иммунологии и нефрологии УНЦ ЛСЮ при КМ СССР с участием врачей ЦКБ ЛОО при КМ СССР.

Публикации. Но теме диссертации опубликовано 5 работ.

Обьем и структура диссертации. Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4 глав, выводов и практических рекомендаций. Работа иллюстрирована таблицами. рисунками. Указатель литературы включает 69 отечественных и 156 зарубежных источников.

- 6 -СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Под наблюдением находилось 160 больных. Из них 30 больных М в возрасте от 17 до 62 лет, 21 мужчина, 9 женщин. 20 больных ДКШ в возрасте от 25 до 60 лет, 20 мужчин. 10 больных идиопатическими нарушениями ритма,и проводимости (ИНРП) в возрасте от 17 до 54 лет, 8 мужчин,2 женщины. 26 больных ИБС в возрасте от 48 до 72 лет, 17 мужчин, 9 женшин. 19 больных ревматизмом в возрасте от 18 до 20 лет. 14 мужчин, 5 женщин. 15 больных СКВ в возрасте от 18 до 37 лет. Контрольную группу составили 40 здоровых людей, сопоставимых по возрасту и полу группам обследованных больных.

Всем больным при поступлении в стациионар кроме клинического и физического обследования регистрировалась ЭКГ, проводилось ЭхоКГ исследование. В ВКНЦ АМН СССР 26 больным проведена биопсия миокарда. С целью верификации диагноза ИБС проводились нагрузочные пробы и части больным коронаровентрику-лография. Для регистрации нарушений ритма и проводимости использовалось холтеровское мониторирование. Части больным проведено иммунологическое обследование. Определение содержания лейкоцитов и лимфоцитов в периферической крови проводили на автоматическом счетчике клеток Coulter ZBIC-2000 с приставкой Channelvser (Greendyke R. М. , et al. , 1985). Содержание T- и В-лимфоцитов и субпопуляций CD4 и СВ8 лимфоцитов определяли методами прямой и непрямой иммунофлюоресценции с использованием моноклональных и поликлональных антител против

поверхностных детерминант клеток (Hoffman R. А., et al. . 1980). Содержание различных классов иммуноглобулинов в сыворотке крови определяли в радиальной иммунодиффузии (Manciru G. , et al. , 1965). Всем Сольным проводилось исследование сывороток крови на наличие антител к белкам мембраны кардиомио-цитов. В процессе работы был разработан и применен новый метод определения кардиоспецифических AT в сыворотках крови пациентов контрольной и основной группы. Постановка метода включала несколько стадий. Вначале была выделена мембранная фракция кардиомиоцитов (Kühl U., et al.. 1987, Limas С., et al. , 1989), поскольку геардиоспецифические антигены расположены на плазматической мембране клетки. С целью разделения фракции на отдельные белки проводили электрофорез в градиенте плотности 5-152 полиакриламидного геля в присутствии додецил-сульфата натрия (Pharmacia fine chemicals. Uppsala. Sweden. 1980). Для получения диагностических полос осуществляли перенос БМК на нитроцеллюлозу методом электроблоттинга при охлаждении с напряженностью поля 25 v/sm. силе тока 0,45 А в течение 1,5 ч. на приборе Trans-Blot (фирма Bio -Rad)(Towbiii Н. , et al. , 1979). Затем проводили иммуноферментную реакцию с сыворотками крови на наличие AT к БМК На первом этапе сыворотки пациентов инкубировали с БМК иммобилизованном ка полоске нитроцеллюлозы. Во время второй инкубации связавшиеся человеческие AT метили коньюгатом AT кролика к иммуноглобулинам человека с пероксидазой хрена. После стадии промывки полоски инкубировали с раствором субстрата д/я развития окраски.

С целью идентификации ЕМКБ7 бетаадренорецепторам изучали

влияние AT к ЕМК67 на связывание дигидроальпренолола с бета-адренорецепторами. Статистическую обработку результатов исследования проводили с использованием пакета статистических программ "Statgraphics" (1985). Достоверность различий определяли по критериям Стьюдента (t) и хи-квадрат (хг). За достоверные принимали различия на уровне значимости 95% при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты клинического и инструментального обследования больных М, ДКМП и ИНРП представлены в табл.1.

Было установлено, что у 17 из 30 пациентов страдающих М началу заболевания предшествовал инфекционный процесс (5?%). Практически подобное соотношение наблюдалось у больных ДКМП и ИНРП Нарушения ритма и проводимости яеились первыми симптомами заболевания у 13 пациентов (43%) и 8- ДКМП (40%). Начало заболевания у 57% больных М и у 60% пациентов с ДКМП проявлялось признаками сердечной недостаточности (СН). У наших пациентов болевой синдром не носил самостоятельный характер и сочетался либо с нарушениями ритма и проводимости либо с явлениями СН, поэтому в работе он не был выделен отдельно. В последующем явления СН отмечались у 26 из 30 больных М (87%) и у практически всех пациентов с ДКМП. I стадия CII по классификации В. X. Василенко наблюдалась у 5 пациентов с М (17%) и у 2 больных ДКМП (10%). Признаки II и III стадии СН выявлялись у 21 больного М (70%) и у 18- ДКМП (80%). Увеличенные

Рис. 1 Выделение мембранной фракции карлиомиоцитов по Kühl U. et al.

размеры сердца по данным ЭхоКГ наблюдали у 23 из 30 пациентов с М 177%) и у всех 20 больных ДКМП. В отличии от пациентов с ДКМГ1 и М у больных ЙНРП размеры сердца были в норме и отсутствовали явления Ott Но характеру нарушений ритма и проводимости различий медду пациентами с М, ДКМП и ИНРП не было. 'Громбоэмболические осложнения (.Т'ЗЛА, эмболия сосудов головного мозга; отмечали у 6 из 30 больных М (20%) и у 5 из 20 пациентов с ДКМП (25%).

Таким образом, результаты клинического и инструментального обследования свидетельствовали об отсутствии патогномо-ничных симптомов М и существовании сходно протекающих некоро-нарогенных заболеваний миокарда, что ставит вопрос о поиске диагностических маркеров М.

Учитывая, что иммунные рарушения занимают важное место е патогенезе некоронарогенных заболеваний миокарда в работе были использованы иммунологические методы исследования для уточнения диагноза, выработки дополнительных диагностических критериев ваболеваия и тактики ведения пациентов. В процессе работы был рразработан и применен метод определения кардиос-пс-цифических AT в сьюоротках крови пациентов контрольной и основной группы. О целью разработки, и применения метода получали мембранную Фракцию кардиомиоцитов. Выделение мембранной фракции из миокарда человека и крысы проводили двумя различными способами: 1) предложенным Kühl (J. , et al. , 1987 (рис. 1) и Z) предложенным Limas 0. , et al. . 1989. В основе обоих способов лежит получение гомогената миокарда с его последующим неоднократным центрифугированием. Отличительной чертой перво-

Таблица 1

Сравнительная характеристика больных с не-коронарогенными заболеваниями миокарда

I Больные Больные Больные Элементы характеристики I миокардитом ДКМП ИНРП

I п=30 п=20 п=10

Возраст (в годах)

Пол

мужчин

женщин

40+12

21 5

43+1 г 20

36+18

Связь заболевания

с ОРВИ Дебют заболевания сердечная недостаточность нарушения ритма и

проводимости

17(56,77.) 9(45%) 5(50%)

17(56,7%) 12(60%) ----

13(43,3%) 8(40%) 10

23(76,7%) 20

6( 20%) 9( 45%) 3(10%) 1(5%)

Сердечная недостаточность

I стадия 5(16,7%) 2(10%)

II и III стадия 21(70%) 18(90%) Кардиомегалия Мерцательная аритмия:

Парокеизмальная форма Постоянная форма Экстрасистолия: Суправентрикулярная 13(43,3%) 5(25%)

Желудочковая 20(66,6%) 9(45%)

Желудочковая тахикардия 1(3,3%) 5(25%)

Нарушения проводимости 16(53,3%) 8(40%)

Тромбоэмболические

осложнения 6(20%) 5(25%)

6(60%)

2(20%) 2(20%)

2( 20%)

го способа является конечное центрифугирование в градиенте плотности сахарозы. Мембранная фракция, полученная способом, предложенным Kühl U., et- al. , была чище, содержала меньше белков и поэтому этот способ использовался в последующих исследованиях. По данным Kühl U. , et al. ,1989 мембраны концентрировались е двух интерфазах между 1? и 35% сахарозы (035) и мевду 35 и 45Z сахарозы (045). После получения белковой фракции проводили электрофорез в полиакриламидном геле для разделения фракции на отдельные белки. Для проведения фореза использовалась препаративная гребенка с двумя дополнительными лунками: 1) для белков-стандартов 2) для иммуноглобулина человека е качестве положительного контроля. На одну пластинку для электрофореза наносилось 400 БМК из фракции 035, на другую пластинку- 400 БМК из фракции 045. Фракция мембран содержит белки с мол. массой от 200 до 10 KD, которые хорошо разделимы при форезе ( рис 2).

4

Рис. 2 Электрофорез и иммуноблоттинг мембран кардиомиоцитов.

1- стандартные белки

2- мембраны кардиомиоцитов

3- проявление иммунной сывороткой

4- проявление неиммунной сывороткой

MHfK^J

94 »mm

67 -41 g

43

3» — с

шш

Затем проводили электроблаттинг для переноса белков с геля на нитроцеллюлозу с целью приготовления диагностических полос. Конечным этапом явилась инкубация полос нитроцеллюлозы с сыворотками крови больных некоронарогенными заболеваниями миокарда. Наблюдали специфическое окрашивание БМК67 (рис 2) в мембранной фракции 045, которая использовалась в дальнейших исследованиях. В некоторых случаях выявляли АТ к белкам другой молекулярной массы, но это выявление не носило характера закономерности.

Таким образом, разработан новый метод определения АТ к миокарду, включающий электрофорез белков мембранной фракции кардиомиоцитов, с последующим переносом белков с геля на нитроцеллюлозу с помощью электроблоттинга и инкубацией диагностических полос нитроцеллюлозы с исследуемыми сыворотками.

В соответствии с поставленными задачами следующим этапом работы было исследование сывороток крови больных и здоровых доноров на наличие АТ к ЕМК67. При первичном анализе сыворотки ее разводили 1: 100 и обнаружение АТ к БМК57 считалось положительным результатом. Однако, в некоторых сыворотках (как правило, при тяжелом течении заболевания) выявлялся очень высокий титр АТ к БМК6У (1:500 или даже 1:1000). Данные анализа сывороток представлены в табл 2.

Таблица N 2

Частота выявления антител к БМК67 у больных неко-ронарогенными заболеваниями миокарда.

Группы по забо- Число Возраст БМК 67 +

леваниям обследованных число больных

Миокардит 30 40112 18 (60%)

ДКМП 20 43±12 4 (20%)

ИНРП 10 Зб±18 4 (40%)

СКВ 15 28£9 0

ИБС 26 61 ±10 1 (3,5%)

Ревматизм 19 19±1 0

Доноры 40 4Я±8 1 (2,5%)

АТ к БМК67 выявлялись у 18 из 20 больных М (60%). у 4 из 20 пациентов ДКМП (20%). у 4 из 10 больных ИНРП (40%), у 1 пациента ИБС и у 1 донора. АТ к БМК67 не обнаруживались в сыворотках крови больных ревматизмом и системной красной волчанкой (СКВ).

Как видно из таблицы 2 АТ к БМК67 выявлялись значительно чаще у больных М, ДКМП. ИНРП чем у остальных пациентов. Учитывая это мы считали практически важным рассмотреть особенности клинических проявлений заболеваний у этих трех групп

пациентов в зависимости от реактивности сыворотки крови с БМК67. Больные М. ДКМП и ИНРП были разделены на 2 подгруппы согласно реактивности сыворотки крови с ЕМК67. В 1-ю подгруппу вошли пациенты в сыворотках крови которых не содержались АГ к БМК67. Больные сыворотки крови которых содержали АГ к БМК67 составили подгруппу 2. При М, ДКМП и ИНРП выявлена тенденция к увелечению числа пациентов перенесших ОРВИ в подгруппе больных, содержащих AT к БМК67. Статистически значимые различия, обусловленные степенью тяжести СН обнаружены между двумя подгруппами больных М. Вторая и третья стадия СН выявлялась значительно чаще у пациентов (89%) сыворотки крови которых содержали AT к БМК67, чем у больных (42%) сыворотки крови которых не содержат AT к ЕМК67 (р<0,05). По-видимому персистирование кардиоспецифических АГ способствует повреждению миокарда и усугубляет явления СН. С этой точки зрения понятно узелечение числа пациентов с кардиомегалией ео 2 подгруппе по сравнению с 1. Кардиомегалия отмечалась у 67% больных 1 подгруппы и у 83 2> пациентов 2 подгруппы. ЖЭ наблюдалась значительно чаще у пациентов второй подгруппы (83%) чем у больных первой подгруппы (42%) (р<0,05). Статистически значимые различия возможно обусловлены более тяжелым клиническим течением заболевания и кардиомегалией у пациентов с выявленными AT к БМК67, т. к по нашим данным 67% всех ЖЭ выявлялись у больных с II и III стадией СН, а кардиомегалия присутствует у 70% б-х с ЖЭ. В то же время электрическая нестабильность миокарда может быть обусловлена воспалительными измененими кардиомиоцитов и клеток проводящей системы. ПроЕе-

дено исследование- иммунологического статуса у 16 больных М. В целом показатели не отличались от нормальных значений. Отметили незначительно повышенный уровень IgM как в целой группе, так и по подгруппе. В двух подгруппах отсутствовали статистически значимые различия в показателях иммунологического статуса.

Выявление AT к ЕМК67 в сыворотках крови больных ДКМП демонстрирует тесную патогенетическую связь между М и ДКМП. В многочисленных экспериментальных и клинических работах было показано, что оба заболевания протекают с выраженными иммунологическими нарушениями. При анализе подгрупп следует обратить внимание, что 2 подгруппу составили пациенты с более выраженными явлениями ОН и практически в ней отсутствуют больные с I стадией СН. Двое больных из 1 подгруппы (13%) имели признаки I стадии ОН. Вторая и III стадии СН выявлялись у 14 пациентов (882) 1 подгруппы. Вторая и III стадии СН отмечались у 14 больных 1 подгруппы (88%) и у всех 4 пациентов 2 подгруппы (100%). В группе больных М выявление AT в сыворотке крови также обуславливало более выраженную степень тяжести СН. Обращает внимание преобладание более тяжелых по характеру желудочковых нарушений ритма сердца у пациентов с выявленными в сыворотке крови AT к ЕМК67. В первой подгруппе ЖЭ наблюдалась у 8 больных (50 %), а пароксизмы ЖТ у 2 пациентов (13%). Желудочковые нарушения ритма отмечались у всех больных 2 подгруппы. ЖЭ у одного больного(25%). Пароксизмы ЖГ фиксировались у 3 пациентов (75%) и наблюдались чаще, чем в 1 подгруппе. Как и у больных М антитела к БМК67 выявлялись чаще

у пациентов с более тяжелыми желудочковыми нарушениями ритма. В данном случае это трудно объяснить, только наличием явлений ОН. поскольку разница в выраженности явлений СН между двумя подгруппами незначительна и практически все пациенты имеют кардиомегалию. Вполне вероятно, что в данном случае в основе аритмии лежат отек и воспалительно-клеточная инфильтрация миокарда, приведшие к его к электрической нестабильности.

(юнаружение AT к БМК67 у пациентов с ИНРП безусловно вызвало интерес. Существуют много предположений о патогенетическом значении воспалительных изменений в миокарде в развитии аритмий, однако доказательства этому практически отсутствуют. обращает внимание тот факт, что у 3 из 4 больных ИНРП. содержащих в сыворотке крови AT к БМК67, появлению симптомов заболевания предшествовал респираторный инфекционный процесс (75%). Практически подобные соотношения наблюдались у пациентов с М и ДКМП. В отличии от больных М и ДКШ у пациентов с ИНРП размеры сердца были в норме и отсутствовали явления СН. Персистирование AT не определяло характер и особенности течения аритмии у данной группы пациентов.

Результаты исследования сывороток крови методом иммуноб-лоттинга позволяют сказать, что у пациентов с М, ДКМП и ИНРП AT к БМК67 выявляются значительно чаще по сравнению с больными ОКБ. ИБС, ревматизмом и здоровыми донорами. При М выявлена взаимосвязь между обнаружением AT к БМК67 и тяжестью клинического течения заболевания. Об этом свидетельствуют статистически достоверные различия в наличии признаков СН II и III стадии п желудочковой зкстрасистолии между двумя подгруппами

обследованных больных М.

В заключении следует сказать о самом белке с мол. массой 67 KD. поскольку впервые выявлены АТ к этому белку при некоронаро-генных заболеваниях миокарда. Специфическое окрашивание БМК67 имело место во фракциях мембран флотирующих в интерфазе 35-45% сахарозы и в меньшей степени во фракциях 17-35% сахарозы. Специфическое взаимодействие отмечалось как с БМК человека, так и крысы. Такое отсутствие видовой специфичности АТ может говорить о достаточной консервативности изучаемого белка. Из 70 г миокарда человека было выделено около 15-30 мг белка. Проведена количественная оценка БМК67. Его содержание в сердечной мышце составило 10 нг/г ткали, или учитывая его молле-кулярную массу 67kD. 0,14 пМ/г ткани.

В недавно проведенных исследованиях (Limas С. et al. , 1989) было показано, что АТ к БМК67, выявленные у больных ДКМП ингибируют связывание [*ШДГА. а белок является бета-ад-ренорецептором. Исследовано ингибирование связывания [*Ш-ди-гидроальпренолола (специфический лиганд) с бета-адренергичес-кими рецепторами пятью сыворотками крови больных, обнаруживающих положительную реакцию с ВМК6? и пятью сыворотками крови здоровых лиц Во веех блучаях влияния контрольных и иммунных сывороток на связывание CJH3 ДГА с бета -адреноре-цепторами в мембранах мозжечка крупного рогатого скота обнаружено не было (рис.3).

Связывание (3Н.1ДГА в % от контрольного

60 40 20

12345 12345 М-сыворотки А £

Рис. 3 Результаты ингибироЕания связывания дигид-роальпренолола (ДГА) с бета-адренергическими рецепторами иммунной (А) и неиммунной (Б) сыворотками.

Удельное связывание С■* НЗДГА во всех случаях составляло 0,5 пкмоль/мг мембранного белка. Данные были получены по 3-м независимым экспериментам. Отклонения результатов от среднего не превышали 5-7%.

Таким образом, мы можем сказать, что выявлен неизвестный белок мембраны кардиомиоцитов, не являющийся бетаадренорецеп-

* * * * * • , « « .

80

тором, к котором/ выявляются антитела в сыворотках крови больных с некоронарогенными заболеваниями миокарда.

ВЫВОДЫ.

1. Результаты клинического обследования больных свидетельствуют об отсутствии патогномоничных симптомов миокардита и существовании сходно протекающих некоронарогенных заболеваний миокарда, что ставит вопрос о поиске диагностических маркеров миокардита.

2. Разработан новый метод определения антител к миокарду, включающий электрофорез белков мембранной фракции кардиомио-цитов, с последующим переносом белков с геля на нитроцеллюлозу с помощью электроблоттинга и инкубацией диагностических полос нитроцеллюлозы с исследуемыми сыворотками.

3. Методом центрифугирования б градиенте плотности сахарозы,

с последующим электрофорезом в полиакриламидном геле выявлен неизвестный белок мембраны кардиомиоцитов с молекулярной массой 67 КБ, к которому выявляются антитела в сыворотках кро'ви больных с некоронарогенными заболеваниями миокарда.

4. У пациентов с миокардитом, дилятационной кардиомиопатией, идиопатическими нарушениями ритма и проводимости показана значительно большая частота обнаружения антител к белку мембраны кардиомиоцитоЕ с молекулярной массой 67 кБ (60%. 20%, 40 % соответственно) по сравнению с больными системной красной волчанкой, ишемической болезнью сердца, ревматизмом и здоровыми донорами, у которых антитела выявлялись значительно реже

(2.5 %).

5. При миокардите выявлена взаимосвязь между обнаружением антител к белку мембраны клрдиомиоцитов с молекулярной массой 67 kD и тяжестью клинического течения заболевания. Об этом свидетельствуют статистически достоверные различия в наличии признаков сердечной недостаточности II и 111 стадии и желудочковой экстрасистолии меэду двумя подгруппами обследованных больных миокардитом.

6. Антитела в сыворотках больных некорокарогенными заболеваниями миокарда взаимодействующие с белком мембраны кардиомиоци-тов 67 kD, не ингибируют связывание дигидроальпренолола с бе-та-адренорецепторами. Результаты свидетельствуют о непричастности белка 67 kD к бета-адренорецепторам.

7. Определение антител к белку мембраны кардиомиоцитов с молекулярной массой 67 kD в сыворотке крови больных миокардитом, наряду с клиническими проявлениями заболевания и данными эн-домиокардиальной биопсии, может быть диагностическим критерием аутоиммунного поражения миокарда.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Метод иммуноблоттинга в сочетании с данными клинического и инструментального обследования может быть рекомендован для диагностики поражения миокарда аутоиммунной природы.

2. Информативность метода существенно повышается при его сочетании с эндомиокардиальной биопсии.

3. Скрининг антител может быть использован для контроля им-мунологически обусловленного лечения.

4. Идентификация белка мембраны кардиомиоцитсв с мол. массой 67 kD будет способствовать более полному пониманию патогенеза заболевания и разработке новых тест-систем для диагностики миокардита.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Зимин Ю. И. , Когелевцев Ю. В. , Рязанов С. Л. , Терещенко С. Е. Циркулирующие антитела против мембранного белка кардиомиоцитов человека с мол. массой 67 k'D в сыворотке крови больных неспецифическим миокардитом. - Иммунология, 1990, N3, с. 52-54.

2. Герешенко С. Е. , Рязанов С. JL , Зимин Ю. И. , Котелев-цев Ю. В. , Беляева С. А., Сидоренко Б. А. Взаимосвязь между выявлением циркулирующих антител к антигену с мол. массой 67 kD и тяжестью клинических проявлений инфекционно-аллергического миокардита -Кардиология, 1991, N9, с. 19-21.

3. Терещенко С. Е. , Рязанов С. Л. , Зимин Ю. И. , Котелев-цев Ю. К Определение циркулирующих антител к белку мембраны кардиомиоцитов с мол. массой 67 kD на принципе иммуноблоттин-га. -Лабораторное дела, 1991, N9, с. 54-56.

4. S. Tereschenko, Yu. Zimin, S. Ryasanov, Yu. Kotelevt-sev. Antibodies to cardiomyocyte membrane protein with molecular mass 67 kD in myocarditis and other heart diseas.es.

- Europ. Heart J. ,1990, vol. 11 (suppl), p. 432. (Abstr)

5. S. Tereschenko, Yu. Zimin, S. Ryaaanov, Yu. Kotelevt-sev. Role of antibody dependant cellular cytotoxicity as possible mechanism of damage of the heart in myocarditis.

- Europ. Heart J., 1991, vol. 12 (suppl), p. 189. (Abstr)