Автореферат и диссертация по медицине (14.00.23) на тему:Биомедицинские аспекты процессов транспорта различных веществ в кожу человека

.. ^ ' л г;

V : 0 ^

71.

На правах рукописи

Томашевич Сергей Владимирович

Биомедицинские аспекты процессов транспорта различных веществ в кожу человека

14.00.23 - гистология, цитология, эмбриология.

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени доктора медицинских наук.

Москва - 1997г.

Работа выполнена в Научно-исследовательском центре биологических структур.

Научные консультанты:

1. Академик РАМН, доктор мед. наук, профессор Ярыгин В.Н.;

2. Академик РАМН, доктор техн., наук, профессор Быков В.А.

Официальные оппоненты:

1. Банин В.В. - профессор, доктор медицинских наук

2. Кузнецов С.Л. - профессор, доктор медицинских наук

3. Добрецов Г.Е. - профессор, доктор биологических наук

Ведущая организация - Российский Университет Дружбы Народов

Защита состоится 1997 в часов на заседании диссер-

тационного совета Д084.14.04 при Российском государственном медицинском университете по адресу: 117869, г.Моасва, ул. Островитянова, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Университета (г. Москва, Островитянова, 1.).

Автореферат разослан 1997 г.

Учёный секретарь Диссертационного совета профессор, д.м.н. Тихомиров А.Н.

Общая характеристика работы Актуальность проблемы.

В настоящее время все большее внимание уделяется изучению роли кожи как в нормальной жизнедеятельности человека, так и при развитии различных патологических состояний. Обладая рядом мор-фо-функциональных особенностей, направленных на реализацию защитных механизмов от воздействия внешней среды, кожа в то же время является активным участником различных лечебных и косметических процедур. В связи с этим одной из актуальных задач практической медицины становится разработка контролируемого транспорта в кожу лекарственных и косметических препаратов, получение "искусственной кожи" с регулированным высвобождением биологически активных веществ, создание банка консервированных кожных и кожно-мышечных трансплантатов за счёт пропитывания биологического материала специальными растворами. В основе активно используемого до настоящего времени способа консервирования целого трупа (бальзамирования) также лежит процедура поэтапной обработки кожи и подлежащих тканей фиксирующими и консервирующими растворами.

Вместе с тем необходимо отметить, что научно-теоретического обоснования основных параметров этих мероприятий, в том числе времени и условий их проведения до настоящего времени не разработано. При этом, если химические, фармакологические, клинические и другие аспекты этих проблем решаются довольно активно, то вопросам привлечения количественных критериев, описывающих раз-

личные процессы в коже, моделирования транспорта веществ в этот орган уделяется значительно меньше внимания.

Характерной особенностью современных научных исследований в биологии и медицине является стремление к формализации полученных результатов, выражению обнаруженных закономерностей абстрактным языком математических символов. Одним из таких направлений является математическое моделирование.

Разработка математических моделей, построенных на основе методов математической физики с учетом морфологических, биологических и физико-химических особенностей той или иной ткани, дает возможность перехода на принципиально новую технологию применения лекарственных средств, консервирующих и бальзамирующих растворов, позволяющую четко определять время и условия их использования. Однако для создания адекватных математических моделей, учитывающих биологическую специфику кожи, необходимо разработать новый системный подход к указанному органу как объекту биомедицинских технологий, формализовать результаты изучения различных систем с помощью математического описания обнаруженных закономерностей.

Всё вышеизложенное и определило основные задачи данной работы:

- объединить данные, характеризующие морфологические и физико-химические особенности кожного покрова, с результатами гистохимического и биохимического анализа процесса кератинизации в структурно-функциональную систему, наиболее полно отражающую биологическую специфику этого органа;

- иа основе морфологических и физико-химических методов и информационного анализа разработать тест-систему, способную выявлять возможные изменения кожи и, в частности, ее наиболее поверхностной части (эпидермиса) в процессе патологических нарушений и воздействия различных химических агентов;

- создать математические модели диффузионного транспорта различных веществ в кожу и подлежащие ткани с учетом морфо-фупкциоиальных особенностей этого органа, топографо-анатомических различий и условий проведения медицинских мероприятий.

Основные положения, выносимые на защиту.

- Для оценки структурно-функционального состояния кожи разработан комплекс биомедицинских показателей, основанный на использовании гистохимических, биохимических, физико-химических, информационных методов исследования и математического моделирования.

- При моделировании процессов транспорта в кожный покров различных топографо-анатомических участков тела человека, кожу целесообразно рассматривать как многослойную систему с характерным для каждого образования коэффициентом диффузии, состоящую: из рогового слоя, обеспечивающего функцию селективной проницаемости; жизнеспособных клеточных слоев, основные барьерные свойства которых связаны с клеточными органеллами; дермы, представленной многомерной матрицей волокнистых образований, заключённых в основное аморфное вещество.

- Морфо-функциональной основой построения защитного барьера является процесс кератинизации, включающий несколько основных направлений терминальной дифференцировки эпидермальных клеток, в том числе: дезинтеграцию ядерного аппарата клеток (уменьшение объёма ядер, снижение содержания ДНК, гистонов, величины отношения ДНК/гистон, повреждение ядрышек) и синтез специальных белков, обеспечивающих формирование рогового слоя.

- Применение методов информационного и математического анализа позволило идентифицировать класс, структуру и параметры математических моделей, описывающих функциональную зависимость между структурными изменениями ядер эпидермальных клеток и состоянием их нуклеиновых и белковых компонентов, определить количественный показатель (величина отношения ДНК/гистон), наиболее полно отражающий состояние системы нуклеопротеидного комплекса ядер клеток в процессе их терминальной дифференцировки, при посмертном аутолизе, в консервированном и бальзамированном материале.

- Эффективность применения различных, в том числе биологически активных веществ, определяется не только условиями их применения, но и структурно-функциональным состоянием клеток эпидермиса. Оценка метаболической активности и экспериментальный анализ влияния эпидермального фактора роста на синтез ДНК эпидермальных клеток на различных стадиях дифференцировки показали, что только клетки базального слоя являются клетками-мишенями, способными воспринимать информационный сигнал и проявлять проли-феративную активность.

- На основании изучения динамики посмертных изменений кожи, результатов её обработки фиксирующими и консервирующими растворами, установлены морфологические показатели нарушений структурной интеграции клеточных органелл, являющиеся регламентирующим фактором для консервирования и бальзамирования трупного материала: изменения клеток базального слоя по типу кариолизиса и пикно-за; переход системы нуклеопротеидного комплекса ядер клеток из квазидетерминированной в вероятностную; изменение коэффициентов диффузии за счёт развития структурных и физико-химических повреждений кожного покрова.

- Длительность посмертного периода, влияние фиксирующих и бальзамирующих растворов, время хранения бальзамированного материала, обуславливают изменения диффузионных параметров различных структур кожи и подлежащих тканей, что определяет необходимость осуществлять предварительный морфологический и физико-химический анализ (определение коэффициентов диффузии, удельного массосодержания) этих систем при моделировании условий их обработки.

- Использование математических моделей, являющихся результатом аналитического решения задач, построенных на основе феноменологической теории диффузии с учётом биологической специфики кожи, даёт основание для перехода на принципиально новую технологию обработки кожного покрова, позволяющую прогнозировать время и условия применения различных, в том числе биологически активных веществ, консервирующих и бальзамирующих растворов, конструиро-

вать лекарственные формы типа "искусственная кожа" с контролируемым выходом применяемых препаратов.

- Проведённые исследования позволяют создать атлас моделей диффузии для основных топографо-анатомических образований в целях разработки оригинальной технологии чрезкожного пропитывания тканей тела человека (бальзамирование) на основе расчёта оптимального времени его пребывания в консервирующих растворах.

Научная новизна.

Теоретически и экспериментально обосновано научно-прикладное направление, позволяющее реализовать новый системный подход к кожному покрову тела человека как к объекту биомедицинских технологий.

Впервые проведён информационный анализ системы нуклеопрогеид-ного комплекса ядер элидермальных клеток в процессе кератиниза-ции. Установлено, что информационные показатели хорошо описывают динамику клеточной популяции и коррелируют с уровнем их метаболической и пролиферативной активности.

Представлены математические модели, отражающие функциональную зависимость между объёмом ядер клеток и гистохимическими показателями, характеризующими изменения их нуклеиновых и белковых компонентов в процессе терминальной дифференцировки.

Экспериментально определены основные условия обработки клеточных популяций эпидермалъным фактором роста (ЭФР). Установлено, что ЭФР вызывает увеличение синтеза ДНК только в ба-зальных (стволовых) клетках эпидермиса.

На основе цитофотометрического определения отношения ДНК/гистон и информационного анализа, впервые предложен количественный морфологический критерий, наиболее полно характеризующий динамику системы нуклеопротеидного комплекса ядер эпидер-мальных клеток на различных стадиях их терминальной дифферен-цировки, при развитии посмертного аутолиза и обработки кожи консервирующими растворами.

Показано, что характер и скорость посмертных изменений клеток эпидермиса определяется уровнем их дифференцировки. Установлено, что процесс аутолиза приводит к образованию гетерогенной популяции эяидермальных клеток (повреждения по типу пикноза со снижением величины отношения ДНК/гистон до 0.6-0.9 и по типу карио-лизиса с увеличением отношения до 2.0) и переходу системы нуклеопротеидного комплекса ядер клеток из квазидетерминированной в вероятностную.

Впервые предложены морфологические и информационные критерии, отражающие изменения пороговых уровней структурной интеграции клеточных органелл при обработке кожи фиксирующими и консервирующими растворами.

Впервые представлены результаты комплексного морфологического и физико-химического анализа ( коэффициенты диффузии) различных морфо-функциональных структур кожного покрова в норме, при посмертном аутолизе, у консервированных объектов различного срока хранения, определяющие основные параметры диффузионного транспорта различных, в том числе биологически активных веществ, консервирующих и бальзамирующих растворов.

Впервые разработаны математические модели процесса диффузии, построенные с учётом морфологических и физико-химических особенностей кожи и подлежащих тканей: многослойности анатомических структур, изменения коэффициентов диффузии при переходе от одного структурного элемента к другому, геометрической специфики различных топографо-анатомических областей и специальных условий сопряжения на границе слоев.

Сформирован атлас математических моделей, позволяющий рассчитывать оптимальное время диффузии консервирующих и бальзамирующих растворов для большинства анатомических зон тела человека.

Предложена методика расчёта оптимального времени пропитывания тканей тела человека консервирующими растворами (бальзамирование).

Научно-практическое значение.

Одним из направлений научно-практического использования полученных результатов является оценка состояния органов и тканей на основе использования цитофотометрического определения величины отношения ДНК/гистон в ядрах клеток и информационного анализа, позволяющего определить уровень организации изучаемой системы (детерминированная, квазидетерминированная, вероятностная). Указанный методический подход даёт возможность выявлять причинно-следственные отношения, изменения указанного показателя от тех или иных зависимых и независимых переменных, идентифицировать

класс, структуру и параметры математических моделей, оценить надежность морфологической системы, ее адаптационные и компенсаторные возможности. Прослеживая изменения информационных показателей во времени, можно определить динамику развития процесса, используя индекс эквивокции, прогнозировать его критические точки.

Разработанная модель диффузии лекарственных веществ в кожу человека с учетом биологических закономерностей ее функционирования представляет интерес для дерматологии и косметологии. Определение количества и времени проникновения в кожу биологически активных или токсических соединений позволяет более эффективно разрабатывать способы защиты кожных покровов, классифицировать различные вещества по проникающей способности на основе использования таких показателей как коэффициенты диффузии.

Расчет концентрации веществ в различных слоях кожи или подлежащих тканях дает возможность более корректно сопоставить выявленные клинические нарушения с предельно допустимой дозой тех или иных агентов, исключить прямое использование некоторых токсических веществ в экспериментах на людях, что может представлять несомненный интерес для токсикологии и промышленной гигиены.

Указанные методические подходы целесообразно использовать в трансплантологии при получении кожных и кожно-мышечных трансплантатов путем консервирования их химическими реагентами или с помощью криоконсервирования. Применение математических моделей позволяет разработать индивидуальный режим консервирования для различных тканей и органов с учетом их многослойности, толщины и формы. Сочетание расчетной технологии обработки с контролем за

морфо-функциональным состоянием ткани для определения развивающихся признаков аутолитической деградации создаёт условия для получения полноценных трансплантатов.

Моделирование процессов диффузии биологически активных веществ из "искусственной кожи" и через неё представляет возможность прогнозировать основные параметры её конструирования ещё до проведения экспериментальных исследований.

Указанные разработки можно кроме того использовать при оценке теплопроводности тканей человеческого тела, так как процессы теплообмена описываются теми же самыми дифференциальными уравнениями, что и диффузия.

Проведенная работа позволила составить своеобразный атлас математических моделей, на основе которого с помощью экспериментального определения диффузионных характеристик и толщины тканей, введения соответствующих условий сопряжения на границе слоев, можно рассчитывать необходимое время обработки и концентрацию консервирующих и бальзамирующих растворов в любой точке тела человека, что представляет научно-практический интерес для патологической анатомии и бальзамирования. Определение характерных для каждого тела анатомических и конституционных особенностей, использование физико-химических параметров для расчета оптимального времени его пребывания в бальзамирующих растворах создает технологию, учитывающую индивидуальную специфику (половые, расовые особенности и т.д.) бальзамированного объекта и позволяет вплотную подойти к научно-теоретическому обоснованию метода бальзамирования.

Апробация работы.

Результаты работы докладывались и обсуждались на 9-м Всесоюзном съезде анатомов, гистологов и эмбриологов, г. Минск, 1981 г. ; конференции "Количественные методы в изучении морфогенеза и регенерации", г. Иваново, 1984 г.; 10-м Всесоюзном съезде анатомов, гистологов и эмбриологов, г. Виница, 1986; 6-ой Всесоюзной конференции по биохимии мышц, г. Тбилиси, 1989 г.; конференциях "Биомедицинские технологии", РАМН, ММА им. И.М. Сеченова, РУДН, г. Москва, 1994, 1995,1996 гг.

Объём и структура диссертации.

Диссертационная работа изложена на 342 страницах и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, пяти глав экспериментальных исследований, заключения, выводов, библиографии, содержащей 325 источников. Работа иллюстрирована 77 рисунками и 38 таблицами.

14.

_Материалы и методы исследования.

Материалом исследования служила кожа двух топографо-анатомических участков кожного покрова тела человека: живота и подошвенной поверхности пятки (тонкий и толстый эпидермис).

Исследование проведено на 7В образцах, взятых от 36 трупов людей мужского пола в возрасте от 18 до 81 года, погибших в результате механической травмы. Посмертный период не превышал 12 часов. В качестве контроля использовались образцы кожи, полученные во время операции у лиц с соматическими заболеваниями. Изучение бальзамированного материала проводилось на 24 образцах кожи от бальзамированных тел со сроком хранения от 2 до 26 лет, а также образцов кожи тела Н.И. Пирогова со сроком хранения более 100 лет.

Для исследования метаболической активности клеток различных слоев эпидермиса, оценки пролиферативного эффекта эпидермального фактора роста, влияния посмертного аутолиза, фиксирующих и консервирующих растворов были проведены специальные модельные эксперименты, в которых использовалась кожа из контрольной группы.

Суспензию клеток различных слоев эпидермального пласта получали с помощью модифицированного метода Stern J.B. et al( 1972). Осадки после гистологического контроля использовали для определения включения предшественников синтеза ДНК, РНК и белка: С14-тимидина,-уридина, -лейцина.

ЭФР выделяли из подчелюстных слюнных желез мышей самцов и рекомбинантных штаммов S. cerevisiae, окончательную очистку росто-

вого фактора проводили с помощью ВЭЖХ и иммуносорбции (Никитина З.К., Томашевич C.B. и др. 1994; Быков В.А., Никитина З.К., Томашевич C.B. и др. 1995).

Для моделирования посмертных изменений кожи образцы биопсий-ной кожи помещали во влажную камеру при температуре 4 и 200С. Гистологическое и гистохимическое изучение осуществляли через 12, 24, 30,48, 60 часов.

Влияние процесса консервирования и бальзамирования изучали на образцах кожи, взятых до и после бальзамирования трупов, разработанным в НИЦБС сосудисто-ванным способом.

Для исследования веществ, переходящих из рогового слоя, эпидермиса, кожи и кожно-мышечного лоскута в фиксирующие и консервирующие растворы, образцы помещались в соответствующие растворы в соотношении ткань :раствор равном 1:5-10.

Идентификацию веществ осуществляли с помощью УФ-спектрометрии и гель-фильтрации.

Анализ материала проводили с помощью морфологических методов, включающих методы свето- и электронно-микроскопического анализа и гистохимические, биохимические и физико-химические методы исследования (табл. 1).

Цитоспектрофотометрические измерения проводили на приборе SMP-0,5 фирмы "Opton".

Возможность использования гистохимических реакций для анализа консервированного материала экспериментально проверялась.

Исследование коэффициентов диффузии (Д) проводили с помощью радиоактивных изотопов. Расчёт коэффициентов диффузии выполняли

в соответствии с рекомендациями Малкович Р.Ш. (1959), используя формулу для диффузии из постоянного источника. Полученные результаты статистически обрабатывались и на их основе проводился информационный анализ и идентификация класса, структуры и параметров математических моделей (табл. 2).

Моделирование транспорта различных веществ в кожу осуществлялось на основе феноменологических законов диффузии с помощью методов математической физики.

Таблица 1.

Методы исследования

МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ Свето- и электронно-микроскопические методы

¡.Сканирующая электронная микроскопия на микроскопе "Philips"SEM515.

- обезвоживание в растворах ацетона восходящей концентрации.

- высушивание методом перехода через критическую точку на приборе "Hitachi" НСР-

- напыление иа приборе "Baizers" CCD 040. 2. Карипметрия.

- эллипсоид вращения V=П/бЫВ, значения L и В измеряли с помощью окуляр микрометра.

Гистохимические методы исследования.

Исследуемые вещества Общие белки

Кислые белки Основные белки

Аргинин Гистидин ДНК и РНК ( суммарно)

ДНК

РНК

ДНК/гистоп

Качественные методы Амидочерный 1 ОБ; Прочный зелёный

рН=2.2 Реакция Буша рН=9.0 Прочный зелёный; Амидочёриый 10Б рН=8.2 Реакция Сакагуши Реакция Макферсона Метиловый зелёный пи-ронии рН=3.5 Метиловый зелёный саф-ронин рН=3.5 Галлоциапин хромовые квасцы рН=1.6 Реакция Фельгена. Метиловый зеленый рН=3.5 Галлоцианин хромовые квасцы рН=1.6 Метод Блоха и Годмана

Количественные .методы

Цитофотомстрия бЗОнм

Цитоспектрофотометрия

Цитофотометрия 570нм

Последовательная цитофотометрия при 570 и бЗОнм

БИОХИМИЧЕСКИЕ И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

1. Препаративные методы.

- Выделение клеток различных слоёв эпидермиса. Выделение ЭФР из слюнных желез мышей самцов. Выделение ЭФР из культуральной жидкости рекомби-нантных штаммов ЗассИагопнсез сегеу181ае.

2. Хроматографические методы.

- Высокоэффективная жидкостная хроматография. Метод иммуносорбции. Иошю-обмепная хроматография.

3. Спектроскопические методы.

- УФ-спсктроскопия. Колориметрическое определение концентрации белков.

4. Гадиоизотоппые методы.

- Определение метаболической активности клеток. Определение коэффициентов диффузии.

Таблица 2. Методы математического моделирования

Информационный анализ. Нтах- сложность или максимальная неопределённость системы Hmax=log п

п- число состояний, принимаемых системой (число разрядов упорядоченного статистического ряда) Н- энтропия или текущая неопределённость системы

H--P(x)Log Р(х) Р(х)- относительные частоты отдельных состояний системы О- абсолютная организация системы

О Нтах-Н R- относительная организация системы R= 1- H/Hrnax

Hmax 6 3

33 32 31

23 22 21

13 12 11

О 0,1 0,3 я Классификационная диаграмма С. Вира.

11-13-простые системы; 21-23-сложные системы; 31-33-очень сложные системы.

11- детерминированные системы; 12-квазидетерминированные системы; 13-вероятностные системы.

Идентификация структуры и параметров математических моделей. Количественная оценка точности аппроксимации проводилась на ЭВМ с помощью метода наименьших квадратов и критерия Фишера. Методы математической физики.

Решение задач нестационарной диффузии на основе второго закона Фика:

_ ¿щ{х,1) Л 1 сЬс (метод разделения переменных)

_Результаты и их обсуждение

Морфо-функциональные закономерности строения кожи раз-лич-ных топографо-анатомнческих участков тела человека

Проведённые с помощью морфологических, гистохимических, ци-тофотометрических и информационных методов исследования кожи двух топографо-анатомических участков (толстый и тонкий эпидермис) показали, что при моделировании процессов транспорта различных веществ в кожный покров тела человека необходимо учитывать биологическую специфику этого органа.

Процесс кератинизации является морфо-функциональной основой построения защитного барьера, состоящего из двух образований: пласта ороговевших чешуек, отличающихся значительной устойчивостью к воздействию различных факторов внешней среды, и клеточных слоев, обеспечивающих физиологическую целостность эпидер-мального пласта.

Роговые чешуйки имеют вид плоских или слегка выпуклых пластинок размером до Юмкм, являющихся уплощёнными тетрадекаэдрами, упакованными за счёт специальных способов соединения в вертикальные колонки. Процесс транспорта через роговой слой осуществляется в основном по межкорнеоцитным пространствам за счёт механизма диффузионного переноса (рис. 1).

При этом важным фактором является наличие достаточно резкого перехода от клеток, содержащих различные клеточные органелды к полностью ороговевшим чешуйкам.

? ГуЙ * -у*!

К *' * ; м Л* - (

I Г V -

г;У «8

ч» да»* ■*•» к ' •»► .

•» * н * * ^ 5 1 *

• - - -л «V

I ч ч' (

.¿лй^.''

Рис. I Эпидермис живота. Глубокие слои рогового пласта пос^о снятия поверхностно расположенных ро го чих чешуек. Между чешуйками выявляется гомогенное клеточное ьещосл'ьо.' СЭМ.

Исследование эпидермальных клеток на различных стадиях диффе-ренцировки показало, что морфологические перестройки, отражающие процесс кератинизации, сопровождаются уменьшением объёма ядер, снижением содержания ДНК, гистонов, изменением величины отношения ДНК/гистон, гистотопографии и концентрации РНК (табл. 3).

Специфика перестройки ядер эпидермальных клеток в процессе кератинизации и особенно их нуклеопротеидных комплексов хорошо иллюстрируется методами информационного и математического анализа. Системы объём ядра- содержание ДНК, гистонов, отношение ДНК/гистоны на протяжении всего процесса демонстрируют чёткую зависимость между её отдельными компонентами, описываемую с помощью различных математических моделей (табл.4). Вместе с тем, обнаруженное с помощью методов математического анализа изменение уровня функциональных связей, а также снижение информационных показателей в системе объём ядра - отношение ДНК/гистон клеток шиповатого и зернистого слоев свидетельствуют о возможном переходе этих клеток в новое структурно-функциональное состояние по сравнению с клетками базального слоя, обусловленное, по-видимому, процессом их терминальной дифференцировки (табл.5).

Результаты информационного анализа нашли своё подтверждение при изучении функциональных биохимических показателей эпидермальных клеток. В модельных экспериментах по включению меченных предшественников синтеза ДНК, РНК и белка в клетки, выделенные из различных слоёв эпидермального пласта, установлено снижение метаболической активности клеток шиповатого и зернистых слоёв.

Таблица 3. Морфологические и гистохимические изменения эпидер-мальных клеток в процессе кератинизации (эпидермис подошвы).

Слои эпидермиса Объём ядер Содержание ДНК Содержание гистонов Отношение ДНК/глстон Концентрация РНК

Базальный 200А6 56.4±3.1 50.1±3.2 1.10±0.03 0.22±0.01

Шиповатый 155±4 31.4±1.2 28.0±1.1 1.11 ±0.04 0.18*0.01

Зернистый 55±3 25.4±1.8 30.2±2.4 0.76±0.03 0.39±0.2

Данные представлены в виде Х:Ыт(х) при Р=0.95

Таблица 4. Результаты информационного анализа системы объём яд-ра-отношение ДНК/'гистон в клетках различных слоев эпидермиса.

Исследуемые Базальный Шиповатый Зернистый

параметры слой слой слой

Нтах Ш5 Ш5 ОЖ"

Н Ш 0/761 (Ш9~

О 0Л86 (Ш4 0Ш

В. 022 0Л1 бТГ

Нтах

23 22 22 21

13 Ш:3 Б 11

0 0.1 0.2 0.3 Я Б- базальный слой; Ш-шнповатый слой; 3-зернистый слой.

Таблица 5. Функциональная зависимость между объёмом ядра и

компонентами нуклеопротеидного комплекса.

Объём ядра-содержание гистонов: /(у,,?) = - 4.32 + 4.00х

Объём ядра-содержание ДНК+гистоны: ./(у,г) = -С.64 + 2.00х

Объём ядра- содержание ДНК:

/(у,я) = 172.01 -32.17* + 2.15хг --0.05*5 4-0.0003*"

Объём ядра- отношение ДНК/гистон у = аа + ф - а]

В базальных клетках обнаружена способность к синтезу ДНК, РНК и белка, в клетках шиповатого слоя включение С14 тимидина в ДНК уже практически отсутствует, а в зернистом слое прекращается включение С14уридина и лейцина в РНК и белок (рис. 2 ).

Гистотопография общих, кислых и основных белков также зависит от локализации эпидермальных клеток в пласте. Зона наиболее интенсивной реакции включает в себя блестящий слой и прилегающие к нему клетки зернистого слоя. При этом для белков этой зоны характерно высокое содержание аргинина и гистидина.

Полученные данные свидетельствуют, что в процессе терминальной дифференцировки эпидермальных клеток можно выделить ряд основных направлений, в том числе дезинтеграцию ядерного аппарата и синтез специальных белков, обеспечивающих формирование рогового слоя.

ЗЕРНИСТЫЙ СЛОЙ

£ ..I

I 2

ВРЕМЯ, час.

Рис. 2 Включение С14-тимидина (1);-уридина (2) и -лейцина (3) в суспензии клеток различных слоев эпидермиса.

Г (

»1

-

„«Л ч

«•¡Л1»' \ г „ .

к гг )

I

^ ^ г ] , -

< л! 'I. гетщг^й

V ч 2

V ' \ - Д4-«?

* " п

IV

Ч Н ^

!

- Х^

ч

'V V

/

1-

Ь «ч

Л ! ** I;

I »

| • т! у -

• ..... .......... - ■ ••Ч

' - ^

«ч

41$

Е

К- ;§

1 - :

? -I

л 4 4

ШШШ11

|§|ШШ

,•1

«Э

Х-.Г-.Г"

V -Ч7

. V»! 4?, > . л . ,

ИЛ

-Дли,__ *•*■*>>« ^ц»

Рис.. 3 Механическое удаление рогового слоя, пласта клвточиш* слоев открывает архитектонику сосочкоього слоя дермы. Справа, верхний угол - участок, на котором роговой слой и клеточные слои эпидермиса сохранены. СЭМ. Р - роговой слой; К - клеточные слои; Д - дерма.

Таблица 6 . Коэффициенты диффузии С14 глицерина, ацетата калия и воды, в роговом, клеточных слоях и дерме.

Исследуемые ткани С14глицерин С14 ацетат С14 вода (27-30%) калия

Роговой слой (кожа подошвы) (2-5)10~7см2/сек (0,5-3)10"7см2/сек (1-6)10-7см2/сек 1

Роговой слой (кожа живота) (l-2)10-W/ceK (0,2-3) 10"9см2/сек (0,6-1)10"9см2/сек

Клеточные слои (5-10) 1 ()"6см2/сек (2-4)10"6см2/сек (3-8)10_6см2/сек

Дерма (2-4) 10~6см2/сек (6-8)1()-6см2/сек (4-9)10"6см2/сек

"Жизнечпособ-ная кожа (клеточные слои и дерма) (1-3)10"6см2/сек (1-4)10~6см2/сек (1-5)10\м2/сек

Третья наиболее обширная часть кожи - дерма характеризуется иным типом морфологического строения. Удаление рогового и клеточных слоев с базальной мембраной нарушает компактную структуру дер-мальных гребешков, обнаруживая принципиально новую архитектонику сосочкового слоя, образованную сетью переплетающихся друг с другом коллагеновых и эластических волокон (рис. 3 ).

Проведённый анализ коэффициентов диффузии в роговом, меточных слоях и дерме установил, что скорость перемещения диффундирующих веществ отличается во всех трёх образованиях. При этом наиболее высокие значения отмечены в дерме, что по-

видимому связано с её гистоархитектоникой и наличием гидратиро-ванного гслеподобного основного вещества (табл. 6).

Таким образом в коже можно выделить три образования, отличающихся морфо-функциональными особенностями: роговой слой, обеспечивающий функцию селективной проницаемости кожи, жизнеспособные клеточные слои, основные барьерные свойства которых связаны с клеточными мембранами, и дерму, представленную многомерной матрицей волокнистых структур, заключённых в основное аморфное вещество. Указанная биологическая специфика кожи отражается на параметрах диффузионных процессов и характеризует этот орган как многослойную систему с коэффициентами диффузии, меняющимися от слоя к слою.

Влияние ЭФР на пролиферагивную активность эпидермальных клеток.

Большое внимание в настоящее время уделяется различным факторам роста, являющимися элементами собственных регулирующих систем организма. Основная функция указанных биологически активных веществ связана со специфическим стимулированием синтеза ДНК и пролиферации клеток.

Для изучения влияния ростового фактора на пролиферативную активность клеток различных слоев эпидермиса к их суспензиям прибавляли ЭФР (от 1 доЮО нг/мл) и 0,5 мкКи С14-тимидина. Инкубация суспензии базальных клеток с ЭФР приводила к увеличению включения С14-тимидина максимально на 30% при концентрации ростово-

ЭФР, иг/мл

Рис. 4 Влияние ЭФР на включение С14 тнмидина в суспензию базальных клеток эпидермиса.

12

со

I

о

X 8 §

с* ,

12 3

ВРЕМЯ, час.

Рис. 5 Влияние времени инкубации ЭФР с суспензией базальных клеток эпидермиса на включение в них С14тимиднна.

го фактора в среде 60 нг/мл (рис.4). Дальнейшее увеличение концентрации ростового фактора в среде не вызывало усиление эффекта. Необходимое время взаимодействия ЭФР с эпидермальной клеткой для стимуляции синтеза ДНК составляло 3-4 часа. Влияние ЭФР на интенсификацию включения тимидина в суспензии шиповатых и зернистых клеток не обнаружено (рис.5 ).

Таким образом, при моделировании транспорта в кожу биологически активных веществ, важным фактором является не только учёт тканеспецифичности этого органа, но и выбор клеток-мишеней, обеспечивающих прохождение информационного сигнала.

Полученные данные позволяют сделать ряд предположений о необходимых свойствах лекарственных форм с включённым в их состав ЭФР: ростовой фактор должен контактировать с базальными (стволовыми) клетками; контакт биологически активного вещества с клеткой-мишенью должен быть не менее 3 часов.

Влияние посмертного аутолиза на структурную сохранность кожи 11 состояние нуклеопротеидов в клетках различных слоев эпидермиса.

Как известно, актуальным вопросом использования трупной кожи является разработка достоверных критериев её пригодности для трансплантации. Цитоспектрофотометрическое исследование нуклеопротеидов в клетках различных слоев эпидермиса представляет в этом плане особый интерес, так как наряду со структурными изменениями клеток позволяет оценивать содержание таких макромолекул

как ДНК, РНК и белка, контролировать состояние нуклсопротеидного комплекса (отношение ДНК/птстон), выявлять динамику организации системы с помощью информационного анализа.

Проведённые исследования показали, что по мере увеличения срока хранения образцов кожи во влажной камере отмечается постепенное нарастание изменений формы эпидермальных клеток, уменьшение объёма их ядер, вакуолизация цитоплазмы, расслоение и частичная отслойка рогового слоя. Морфологические изменения сопровождаются нарушением внутриклеточного распределения и снижением содержания ДНК, гистонов, концентрации РНК. При этом характер и скорость отмеченных нарушений обнаруживали определённую зависимость от принадлежности клетки к тому или иному слою (табл. 7). Установлены основные направления развития деструктивных процессов в эпидермальных клетках при посмертном аутолизе. Выявлено образование морфологически и гистохимически неоднородной популяции клеток, обусловленной развитием повреждений по типу шдаго-за, с характерным снижением величины отношения ДНК/гистон до 0,6-0,9 и увеличением отношения до 2.0 при кариолизисе (табл. 8). Отмечен переход системы из квазидетерминированной в новое качественное состояние-вероятностное, т.е. образование системы с различными вариантами функциональной зависимости между компонентами нуклеопротеидного комплекса (табл.9).

Популяция эпидермальных клеток с кариолизисными нарушениями характеризуется выраженным снижением пороговых характеристик интеграции мембрано-каркасных структур, что приводит к исчезновению этих клеток при обработке материала фиксирующими и консер-

вирующими растворами. Полученные результаты дают основание использовать изменение ядер эпидермальных клеток и их нуклеопроте-идного комплекса в качестве тест-системы для оценки динамики посмертных нарушений кожи с целью определения возможности использования трупного материала для консервирования.

tía фоне выраженного повреждения сохранности клеточных структур волокнистый каркас дермы и роговой слой за указанный период претерпевают менее значительные изменения.

Таблица 7. Изменение нуклеиновых кислот и белков в клетках эпидермиса при хранении образцов кожи во влажной камере. Анализируемые Слои Контроль 24 часа 48 часов показатели эпидермиса влажная влажная

камера камера +20°С +20°С

Объём Назальный слой 153 ±4 138 ±8 89 ±9 ядер Шиповатый слой 98 ± 3 117 ± 5 83 ± 5

Зернистый слой 73 ±4 21 ±2 18 ±2

Содержа- Назальный слой 53,3 ±3,2 48,1 ±4,6 39,6 ±3,9 ние ДНК Шиповатый слой 25,1 ± 1,4 26,9 ±2,8 21,2 ± 1,9 Зернистый слой 20,3 ±1,7 10,4 ±1,5 8,9 ±0,9

Содержа- Базальный слой 43,0 ±2,4 39,7 ±5,4 30,0 ±3,9 ние гисто- Шиповатый слой 19,6 ±0,8 20,4 ±2,6 26,6 ±2,1 нов Зернистый слой 19,7 ±1,4 17,7 ±1,7 13,6 ±1,3

Концентра- Базальный слой 0,22 ±0,01 0,19 ±0,01 0,16 ±0,01 цияРНК Шиповатый слой 0,18 ±0,01 0,15 ±0,01 0,14 ±0,01 Зернистый слой 0,39 ±0,01 0,39 ±0,01 0,32 ±0,01

Таблица 8. Характеристика состояния ядер эпидермальных клеток и их нуклеопротеидного комплекса в процессе развития посмертных изменений.

Морфологическая Объём характеристика ядер Содержание Содержание ДНК гистонов Отношение ДНК/гистон

Контроль 153 ±4 53 ±4 48 ±3 1,10 ±0,03

Пикноз 51 ± 5 32 ±5 39 ± 6 0,82 ± 0,03

Кариолизис 136±9 46 ±4 23 ±2 2,0 ± 0,03

Изменений коэффициентов диффузии в период до 30 часов пребывания образцов кожи во влажной камере при температуре 20° С установлено не было, что делает возможным использовать указанный материал для экспериментального определения диффузионных параметров.

Таким образом, изучение динамики посмертных изменений кожи позволило установить регламентирующие факторы, определяющие возможность использования трупного материала для консервирования кожных трансплантатов.

Влияние процесса консервирования и бальзамирования на структурные н гистохимические характеристики кожного покрова.

В основе способа консервирования тела человека (бальзамирование) лежит процедура поэтапного пропитывания кожи и подлежащих тканей фиксирующими и бальзамирующими растворами. Вместе с тем,

Таблица 9. Результаты информационного анализа системы объём

ядра-нуклеопротеидный комплекс в клетках базального слоя кожи человека в норме и с посмертными аутолитическими изменениями (ПАИ).

Исследуемые Посмертные В норме

параметры изменения

Н тах 1,238 0,845

Н 1,134 0,659

Я 0,08 0,22

Н шах- максимальная неопределённость или сложность системы Н-энтропия системы или текущая неопределённость К- относительная организация системы.

Ншах

ПАИ 1,238 0,08

13 12 N 0,845 0,22 11

0.1 0.2 0.3 0.4 И

Классификационная диаграмма С.Бира.

11-простые детерминированные системы,

12-простые квазидетерминированные системы.

13-простые вероятностные системы.

ПАИ - посмертные аутолитические изменения, N - нормальная ткань.

посмертный аутолиз, применение формалиновой фиксации и консервирующих растворов, условия и время хранения консервированных объектов приводят к структурным и физико-химическим изменениям состояния кожного покрова и особенно эпидермиса, что в значительной степени отражается на диффузионных параметрах пропитывания тканей и делает необходимым проведение комплексного морфологического и физико-химического исследования кожи в процессе бальзамирования.

Изучение кожного покрова тел, бальзамирование которых проводилось по методике разработанной в НИЦ БС, показало, что общий план гистологического строения кожи был н принципе сохранён. Вместе с тем у бальзамированных объектов обнаруживался ряд структурных изменений рогового слоя, клеточных слоев и дермы. Характер и степень выраженности этих нарушений в основном определялись длительностью посмертного периода, сроком хранения после бальзамирования и топографо-анатомическими особенностями кожного покрова. Проведённый гистохимический анализ установил снижение объёма ядер, содержания ДНК, гистонов, концентрации РНК, достигающее в ряде случаев 60-70%. Деструктивные нарушения были наиболее выражены в телах с длительным посмертным периодом.

Однако в огличии от морфологической картины при посмертном аутолгое в эпидермисе бальзамированных тел преобладали ядра клеток на различных стадиях пикноза, что в определённой мере указывало на влияние самого процесса бальзамирования. Сравнительное морфо- и кариометрическое исследование ядер эпидермальных

36.

"1

и

.А

0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0

8

4

_I

Рис. 6 Гистограммы распределения величины отношения ДНК/гистон в ядрах базального слоя эпидермиса кожи живота тела№113до (штриховая линия) и после (сплошная линия) проведения бальзамирования.

Примечание: на оси абсцисс-величина отношения ДНК/гистон; на оси ординат-количествово ядер в %. Распределение ядер по величине отношения ДНК/гистон до и после бальзамирования статистически достоверно (р=0,999) относится к различным генеральным совокупностям. Величина критерия ( X =2,61) превышает третий критический уровень.

37.

клеток до и после бальзамирования тел с посмертным периодом 3 суток показало, что после проведения бальзамирования гистограмма принимает вид одномодального распределения, состоящего из ядер клеток на различной стадии пикнотической дегенерации (рис, 6). Энтропия и сложность системы нуклеопротеидногно комплекса ядер клеток уменьшались, относительная организация возрастала от 0,08 до 0,25 (табл. 10).Система переходит из вероятностной в квазидетермини-рованную, что в определённой мере обуславливает её стабильность при последующем сохранении. Обработка нативного материала при тех же условиях не вызывала существенных морфологических изменений. Анализ фиксирующих и консервирующих растворов при инкубации в них кожи с помощью биохимических методов показал выход УФ-поглощающих веществ как из целой кожи, так и из её отдельных структур (рис. 7.).

Проведённое исследование коэффициентов диффузии в структурах кожи консервированных объектов показало увеличение указанных показателей, обусловленное наличием морфологических повреждений и влиянием фиксирующих и бальзамирующих растворов(табл. 11).

Таблица 10. Данные информационного анализа системы объём ядра клеток-отношение ДНК/гистон в базальном слое эпидермиса до и после бальзамирования тела №113 по схеме Лаборатории.

Исследуемые До бальзамирования После бальзамирования

параметры

Нтах 1,238 0,845

Н 1,134 0,656

Я 0,08 0,23

Ткань Гкань: Суммарный выход,

Р~Р Ä28(/r *канн

Кожа 1:5 55,8^5,7

Эпидермис 1:5 76,3*7,0

Рог 1:5 88,8±б,9

Коха 1:10 50,9-3,6

Эпидермис 1:10 81,8±б,9

Мыща 1:5 35,9^1,6

Рис..? Выход УФ-поглощакшшх веществ при обработке целой кожи, эпидермиса, рогового слоя фиксирующими и бальзамирующими растворами.

Примечание: по оси абсцисс указанны этапы бальзамирования; по оси ординат кол-во УФ-цоглощающих веществ в ед. оптической плотности на г. веса ткани.

А-соотношения ткань :раствор, 1:5. Б-соотношеннеткань:раствор, 1:10.

Таблица 11. Коэффициенты диффузии С'4 глицерина и ацетата калия в структурах бальзамированной ткани.

Исследуемые ткапи С14 глицерин /-(14 С ацетат калия

Роговой слой (3-8)10"6см7сек (3-9)10~6см7сек

Эпидермис (роговой (1-10)10"6см2/сек (2-9)10ч'см7сек

и клеточные слои)

Дерма (5-10)10"5см7сек (3-8)10"5см7сек

Подкожно-жировая (1-2)10'5см2/сек (2-9)10-5см7сек

клетчатка

Мышечная ткань (3-7)10"5см2/сек (2-3)10"5см7сек

Таким образом, проведённые исследования кожи в норме, оценка её изменений в посмертном периоде и у бальзамированных тел различного срока хранения выявили основные биологические и физико-химические закономерности изучаемых процессов, которые и легли в основу разработки математических моделей процессов диффузии в кожу и подлежащие ткани тела человека.

Моделирование процессов транспорта веществ я кожу и подлежащие ткани

Разработанные модели являются результатом аналитического решения задач математической физики, построенных на базе феноменологиче-

ских законов диффузии. Представлены решения 11 задач, отражающих процесс транспорта при условии обработки кожного покрова различными, в том числе биологически активными веществами, применение "искусственной кожи" в качестве лечебного средства, консервирование кожных трансплантатов и бальзамирование тела человека. Десять из них являются оригинальными решениями соответствующих задач, решение одной задачи ранее использовалось для описания диффузии микроэлементов в технике, в медицинской практике она не применялась. Модели позволяют проводить расчет времени обработкой или концентрации диффундирующего вещества в любой точке кожи и подлежащих тканей при обработке её веществами, процесс транспорта которых подчиняется законам диффузии.

В качестве базовой модели, описывающей процессы диффузионного переноса в кожу, использована многослойная система (роговой слой, клеточные слои, дерма) с экспериментальным определением коэффициентов диффузии в более однородных морфологических структурах ( в каждом из указанных образований отдельно) и отражением соответствующих условий сопряжения на границах слоев (рис. 8 ). Данная модель апробирована на кафедре математической физики МИФИ.

Практическое использование моделей создаёт предпосылки для перехода на принципиально новую технологию применения лекарственных веществ, позволяющую прогнозировать время и условия их применения при кожных аппликациях в любой топографе-анатомической зоне кожного покрова. Кроме того, сочетание морфологического анализа с одновременным определением коэффициентов диффузии предоставляет возможность учитывать возрастные, половые

Рис. 8 Модель диффузии в трехслойную, плоскую систему ( кожа) Vio

о

L

L

111111

'и» <0±

Vu Ъг

Къо

Л\\\\\\\\\\\\

ÔX

0,£л, границы слоев: X - расстояние от поверхности.

начальная концентрация в слоях DiD«.©,- коэффициенты диффузии в первой, втором и ... ■• ' ' третьем слое.

Процесс описывается системой уравнений:

где с = 1,2,3

Услоеия сопряжения определяют закон сохранения вещества: диффузионные потоки и концентрация ркцеств слева и спраьа на гр&нице слоев или тканей равнк(Райченко А.И. ][9ôl)

^ —= —та— ;

Аналитическое решение системы уравнений удовлетворяющее начальным, граничным условиям я условиям сопряжения

представлено выражениями :

h'i

оО

st-TJ f. у О

у*-Впхзл.г Ъ

Определение собственных значений проводится с помощью трансцендентного уравнения

£>3

\|

Уравнение имеет бесконечное множество решений А«- каждому из которых соотнетсвуют собственные функции ЭС('х)

Коэффициенты определяются выражениями .

/Ц»

\№г1 " '

После логарифмирования и соответсвутщих преобразований получаем выражение для расчёта времени диффузии

л _ Г~ис-ио р, 4 *т,

Таблица. 12 Расчётная концентрация глицерина (%) при диффузии в кожу человека.

Слои кожи Размер Коэффициент диффузии (см2/сек) 20 Время экспозиции (в 30 80 160 мин.) 200 400

Роговой слой 0,002 см. 2 10"7 21,5 23,1 24,6 21,08 26,4 26,9

Клеточные слои 0,007 см. 5 10"6 18,3 20,7 23,1 25,5 26,1 26,9

Дерма 0,137 см. 2 10'6 1,7 6,6 14,1 22,2 24,1 26,7

со

особенности, наличие патологических нарушений, что существенно расширит диапазон лечебных мероприятий направленного действия.

Результаты расчёта времени диффузии глицерина в кожу человека показали, что несмотря на то, что коэффициенты диффузии глицерина в роговом слое и клеточных слоях на порядок ниже, чем в дерме- эти слои насыщаются довольно быстро. Однако, для пропитывания дермы требуется более продолжительное время обработки (табл. 12).

Учёт биологической специфики процесса является определяющим фактором при моделировании транспорта биологически активных соединений. Анализ экспериментальных результатов по влиянию ЭФР на пролиферативную активность эпидермальных клеток показал, что особенностью применения указанного биологически активного вещества является не только локализация клеток мишеней, способных воспринимать информационный сигнал, но и время контакта ЭФР со стволовыми базальными клетками.

С помощью математического моделирования рассчитаны необходимые параметры лекарственной формы типа "искусственная кожа" с введённым в её состав ЭФР, наносимой на раневую поверхность . Определена необходимая начальная концентрация ЭФР, оптимальная толщина "искусственной кожи"(рис.9), необходимый диапазон коэффициентов диффузии (рис.10), т.е. параметры, позволяющие конструировать лекарственную форму с контролируемым высвобождением биологически активного вещества.

В зависимости от характера медико-биологических процедур при моделировании транспорта биологически активных веществ в кожу

5 10 M0-3cac.

Рис.9 Зависимость плотности диффузионного потока из "искусственной кожи" различной толщины от времени контакта с подлежащими тканями. ¿_io5 t=8000ceK

РисЮ Зависимость плотности потока в подлежащие ткани от коэффициента диффузии лекарственного вещссгаа в "искусственной коже"

целесообразно различать "нежизнеспособный" роговой слой и жизнеспособный участок (клеточные слои и дерма), т.е. разделять процессы, проходящие без участия и с участием мембранных клеточных структур с экспериментальным определением коэффициентов диффузии для каждого из указанных участков.

Использование данной модели позволяет с определённой степенью точности рассчитывать, напри мер, параметры процесса накожного применения стероидных гормонов для прогнозирования их системного воздействия на организм (рис. 11 ).

Анализ с помощью математических моделей различных условий обработки кожных трансплантатов показал, что время обработки, необходимое для пропитывания кожи консервирующими растворами, криопротекторными веществами, с двух сторон будет в 4 раза меньше, чем при пропитывании её с одной стороны. Рассчитаны табличные значения времени обработки в зависимости от толщины тканей (табл. 13), коэффициентов диффузии (табл. 14) и параметра определяющего отношение разности концентраций в начале процесса к разности концентраций в его конце (рис. 12).

Разработана математическая модель, позволяющая учитывать ситуацию, когда концентрация веществ в слоях или тканях в равновесном состоянии не равны между

собой №/и1=К^1. Для реализации указанных условий в модель вводились соответствующие коэффициенты распределения. Тогда условия сопряжения на границах слоёв определялись как ^+1 (Ц Л^КЦ) (1) Д), а окончательная формула для определения времени обработки трёхслойной системы с целью получения в наиболее отдалённой точке необходимой концентрации диффунди-

1Ь

и,;

0,5

и2 (о, Ъ)

х=0,2 см. 1=2 10-5 см. Д|=10-7см2/сск. Д2=Ю"6см2/сск.

5 "ТХГПо^сёкГ

Рис. XI Зависимость концентрации лекарственного вещества в глубине дермы (х-0,2см) и на границе ее с-рогопьш слоем (х=0). от времени обработки.

Т(час)

Рис12 Зависимость времени диффузии от параметра о{ • При Д=3-10-Зсм2/сск; 1=5,0 см.

Таблица13. Время диффузии компонентов бальзамирующего раствора в однослойную ткань при условии одновременного пропитывания с двух сторон (время в сутках).

Коэффициенты Толщина ткани

диффузии Д, см2/сек 0,05см 0,1 см 0,2 см 0,3

см

10"6 0,75 10"4 3 10"4 1,2 10"3 2,7 Ю"3

10'6 0,75 10"2 0,03 0,12 0,27

10"8 0,75 3 12 27

10"9 7,5 30 120 270

10-'° 75 300 1200 2700

Таблица 14. Время диффузии компонентов бальзамирующего раствора в однослойную ткань при условии, что вторая граница(1) непроницаема т.е. их(1,0=0.,и0=30%;и1=29%;и(1д)-29,9%

Д=3 10" '5см2/сек Д=3 106см7сек

толщина время время время время

ткани (г)час ((:)сутки (Очас (г)сутки

(1)см

0,5 2,37 23,7 1

1 9,49 94,9 3,9

2 37,95 1,58 379,5 15,8

3 85,39 3,56 853,9 35,6

4 151,8 6,33 1518 63,3

5 237,2 9,86 2372 98,6

5,5 287 12 2870 120

7 464,9 19,37 4649 193,7

рующего вещества имела следующий вид ^ 1п В 1X3(13) К2(Ш-ию)/К2 ио-из(Ш).

Введение в модель диффузии корректирующих коэффициентов установленных на основе экспериментальных данных, отражающих равновесную удельную активность кожи, подкожно-жировой клетчатки и мышечной ткани при их инкубации в консервирующих растворах содержащих С14 меченный глицерин, позволило уточнить необходимое время пропитывания трёхслойной системы тканей. Проведён анализ процесса бальзамирования тела человека за счёт чрезкожного пропитывания подлежащих тканей консервирующими, растворами. Сложность данной проблемы заключается в том, что ряд топографо-анатомических областей тела человека отличается не только по составу и толщине тканей, но и по форме.

В связи с этим были построены математические модели на базе сферических и цилиндрических координат. Установлено, что время пропитывания топографо-анатомических образований, аппроксимируемых цилиндром и сферой, будет в 1,5-2 раза меньше, чем при пропитывании плоских структур с аналогичными параметрами (рис.13). Проведённые исследования позволили создать своеобразный атлас моделей процесса диффузии для основных топографо-анатомических образований и разработать технологию обработки трупа человека на основе расчёта оптимального времени пропитывания тела в консервирующих растворах.

Рис.13 Зависимость времени диффузии от толщины диффузионной среда плоской (I), цилиндрической (2), сферической (3) структуры.

Сочетание методов морфологического, гистохимического и физико-химического анализа с методологией математического моделирования процессов диффузионного транспорта даёт основание перейти к реализации системного подхода к кожному покрову тела человека , как объекту биомедицинских технологий.

Выводы.

1. На основе использования морфологических и физико-химических критериев выявлены структурно-функциональные особенности диффузионных процессов в коже человека, позволяющие моделировать этот орган как многослойную систему с характерными для каждого образования коэффициентами диффузии.

2. Установлено, что процесс кератинизации характеризуется сложным комплексом морфо-функциональных изменений эпидермальных клеток (снижение содержания ДНК, гистонов, величины отношения ДНК/гистон и т.д.), отражающих их терминальную дифференцировку. Морфологические перестройки коррелируют с уменьшением метаболической активности и изменением информационных характеристик системы нуклеопротеидного комплекса ( увеличение энтропии, снижение относительной организации).

3. Показано, что характер и скорость посмертных нарушений различных структур кожного покрова определяются длительностью и температурой хранения образцов кожи, уровнем дифференцировки эпидермальных клеток. Деструктивные изменения клеток эпидермиса проявляются в образовании неоднородной популяции ( сочетание ка-риопикноза и кариолизиса) и переходе системы из квазидетермини-рованной в вероятностную.

4. На основании результатов морфологического изучения динамики посмертных нарушений, исследования коэффициентов диффузии определена длительность посмертного периода (24 часа при температуре 20°С), в течение которого трупная кожа сохраняет диффузионные параметры относительно неизменными.

5. Выявлены пороговые уровни структурной интеграции системы клеточных органелл при обработке кожи фиксирующими и консервирующими растворами. В зависимости от длительности посмертного периода отмечается выход УФ-поглощающих веществ или морфологическое повреждение клеток с кариолизисными нарушениями.

6. Разработан метод морфо-функционалыюй оценки состояния кожного покрова на основе цитофотометрического определения величины отношения ДНК/гистон в ядрах эпидермальных клеток, информационного анализа динамики организации изучаемой системы и определения диффузионных параметров. Построены математические модели, описывающие функциональную зависимость между объёмом ядер эпидермальных клеток и гистохимическими показателями, характеризующими изменения их нуклеиновых и белковых компонентов.

7. С помощью результатов морфологического, биохимического и физико-химического исследования кожного покрова в норме и при различных воздействиях разработаны и аналитически решены 11 прикладных задач, моделирующих процессы диффузии в коже человека при обработке её различными веществами, использовании "искусственной кожи" с контролируемым высвобождением биологически активного компонента, пропитывании кожных трансплантатов консервирующими растворами и при бальзамировании тела человека.

8. Моделирование кожи как многослойной системы с экспериментальным определением коэффициентов диффузии в соответствующих структурах и введением специальных условий сопряжения на их границах позволяет создать принципиально новую технологию воздействий на кожный покров различных топографо-анатомических зон тела человека, основанную на определении времени и условий применения лекарственных и косметических средств, транспорт которых осуществляется посредством диффузии,

9. На основе моделирования процессов чрезкожного пропитывания основных топографо-анатомических образований разработана технология бальзамирования, построенная на расчёте оптимального времени обработки тела бальзамирующими растворами.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Никитина З.К., Шишкин С.С., Томашевич C.B. "Изучение деграда-ции рибоеомной РНК в скелетной мышце крыс в процессе аутолиза"// Вопросы мед. химии 1978,24, №2.

2. Томашевич C.B. " Особенности гистохимического выявления нуклеиновых кислот и белков в консервированном и бальзамированном материале" // Сборник научных трудов НИЛ при Мавзолее В.И.Ленина., М., 1980, инв.№491, с.65-84.

3. Томашевич C.B." Влияние процесса бальзамирования на состояние нуклеопротеидов эпидермиса человека"// Сборник научных трудов НИЛ при Мавзолее В.ИЛенина., М., 1980, инв.№491, с. 85-96.

4. Томашевич С.В."Цитохимическая характеристика процессов диффе-ренцировки клеток эпидермиса человека"// Тезисы 9 Всесоюз-ного съезда АГЭ. 1981, г. Минск, с.387.

5. Томашевич C.B." Гистохимическое исследование нуклеопротеидов в эпидермисе кожи людей пожилого и старческого возраста"// Сборник научных трудов НИЛ при Мавзолее В.И.Ленина., М.,1982, инв.№519, с. 115-127.

6. Томашевич C.B." Гистохимическое исследование нуклеопротеидов в эпидермисе кожи тела Пирогова Н.И."// Сборник научных трудов НИЛ при Мавзолее В.ИЛенина., М.,1982, инв.№521,с.68-80.

7. Томашевич C.B., Никитина З.К."Сравнительная цитофотометрическая и биохимическая характеристика процесса кератинизации"// Количественные методы в изучении морфогенеза и регенерации. Тезисы докладов областной научной конференции АГЭ, г, Иваново 1984, с. 147.

8. Никитина З.К., Томашевич C.B., Ребров Л.Б.,"Сравнительное изучение УФ-поглощающих веществ, переходящих в растворы при экспериментальном бальзамировании кожи и мышечной ткани'У/Сборник научных трудов НИЛ при Мавзолее В.И.Ленина., М.,1986, инв.№573,с.84-96,

9. Томашевич C.B., Байков Г.В. " О методологии построения и перспективах использования математических моделей для прогнозирования сохранности тканей бальзамированных тел"// Сборник научных трудов НИЛ при Мавзолее В.И.Ленина.,М., 1986,инв.№577, с.34-64.

10. Томашевич C.B. "Применение информационного анализа для количественной оценки свойств систем, описывающих состояние бальза-

мированных тканей"// Сборник научных трудов НИЛ при Мавзолее В.И.Ленина., М., 1986, инв.№577, с.65-79.

11. Томашевич C.B., Морылева О.Н. "Попытка построения математической модели процесса кератинизации на основе морфо-метрического и цитоспектрофотометрического анализа клеток эпидермиса человека"// Тезисы 10 Всесоюзного съезда АГЭ.,г.Полтава 1986, с.345.

12. Томашевич C.B. "Использование методов математической физики для решения задач диффузии компонентов консервирующих растворов в ткани тела человека"// Сборник научных трудов НИЛ при Мавзолее В.И.Ленина.,М., 1988,инв.№609,с.163-184.

13. Томашевич C.B." Математическая модель процесса диффузии в двухслойной системе тканей'У/Сборник научных трудов НИЛ при Мавзолее В.И.Ленина., М., 1988, инв.№609,с.185-194.

14. Томашевич C.B., Горюнов А.Ф." Описание кинетики нестационарного процесса диффузии в трёхслойной системе бальзамированных тканей"// Сборник научных трудов НИЛ при Мавзолее В.И.Ленина. М.,1988,инв.№609,с. 195-211.

15. Томашевич C.B., Никитина 3.К." Оценка математических моделей диффузии консервирующих растворов в мышечную ткань с помощью комплекса биохимических показателей"// 6 Всесоюзная конференция по биохимии мышц., г. Тбилиси, Науч.центр биофизики., 1989, с.240.

16. Томашевич C.B." Математическое моделирование процесса диффузии компонентов бальзамирующего раствора в ткани головы"// Сборник научных трудов НИЛ при Мавзолее В.И.Ленина, М.,1990,инв.№638,с.22-34.

17. Томашевич C.B." Математическое моделирование процесса диффузии компонентов бальзамирующего раствора в ткани Regioness capitis и мозгового черепа"// Сборник научных трудов НИЛ при Мавзолее В.И.Ленина., М.,1990, инв.№638,с.35-44.

18. Томашевич C.B." Математическое моделирование процесса диффузии компонентов бальзамирующего раствора в ткани Regioness capitis"// Сборник научных трудов НИЛ при Мавзолее В.И.Ленина.,М.,1990, инв.№638,с.45-54.

19. Никитина З.К., Спивак С.М., Томашевич C.B., Быков В.А." Разработка иммунохимических методов выделения и очистки эпидермалыюго фактора роста'У/Биомедицинские технологии., М.,ММА им. Сеченова И.М., 1994,с.9-16.

20. Томашевич C.B., Быков В.А."Биомедицинские аспекты диффузионных процессов в коже человека"//Биомедицинские технологии., М., ММА им Сеченова И.М., 1994,с. 17-29.

21. Быков В.А., Никитина З.К., Томашевич C.B." Итоги и перспективы использования эпидермального фактора роста для разработки лекарственных и диагностических средств"//Биомедицинские технологии, М, РАМН,ММА им. Сеченова И.М., РУДН, 1995,с.9-16.

22. Томашевич C.B., Быков В.А." Математическое моделирование процессов диффузии в коже человека"//Биомедицинские технологии, М., РАМН, ММА им. Сеченова И.М., РУДН, 1995, с. 17-27.

23. Томашевич C.B., Никитина З.К., Вещикова Е.В."Влияние ЭФР на пролиферативную активность клеток различных слоев эпидермиса" // Биомедицинские технологии., М, РАМН, ММА им. Сеченова И.М., РУДН, 1996, с.32-39.

24. Томашевич C.B." Математическое моделирование процесса диффузии ЭФР из лекарственных форм типа "искусственная кожа" //Биомедицинские технологии., М., РАМН, ММА им. Сеченова И.М., РУДН, 1996, с. 40-46.