Автореферат и диссертация по медицине (14.00.32) на тему:Биологическое действие криптона на животных и человека в условиях повышенного давления

На правах рукописи

003058381

КУССМАУЛЬ АННА РЕЙНГОЛЬДОВНА

БИОЛОГИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ КРИПТОНА

НА ЖИВОТНЫХ И ЧЕЛОВЕКА В УСЛОВИЯХ ПОВЫШЕННОГО ДАВЛЕНИЯ

14 00.32 - авиационная, космическая и морская медицина

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2007

003058381

Работа выполнена в Государственном научном центре Российской Федерации — Институте медико-биологических проблем Российской академии наук

Научный руководитель доктор медицинских наук

Павлов Борис Николаевич

Официальные оппоненты доктор медицинских наук, профессор

Кобрин Владимир Исаакович

доктор медицинских наук Солдатов Павел Эдуардович

Ведущее учреждение Государственное образовательное учреждение дополнительного профессионального образования «Российская медицинская академия последипломного образования Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (ГОУ ДПО «РМАПО Росздрава»), кафедра анестезиологии и реаниматологии (г Москва)

Защита диссертации состоится «_» мая 2007 г в 10 часов на заседании

диссертационного совета К 002 111 01 в Государственном научном центре РФ — Институте медико-биологических проблем Российской академии наук по адресу 123007, г Москва, Хорошевское шоссе, 76-А

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ РФ - Института медико-биологических проблем РАН

Автореферат разослан «_» апреля 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук ' И П Пономарева

Общая характеристика работы

Актуальность работы

В настоящее время бесспорной является возможность использования индифферентных газов (инертных газов, а также азота и водорода) в составе газовых смесей и сред при глубоководных водолазных спусках [Орбели, Бресткин, Кравчинский, 1944, Bond, 1963, Смолин и др , 1968, Fructus, Brauer, Dimov, 1968, Беннет, 1971, Гении и др, 1992, Семко и др, 2000, Баранов, Павлов, 2004, Смолин, Соколов, Павлов, 2003, 2004, 2005] Кроме того, эти газы уже широко используются в практике создания искусственной среды обитания для замкнутых гермообьектов Так, перспективным является создание пожаробезопасной среды в гермообъектах, включая космические корабли и станции, с использованием аргона [Pavlov, Buravkova, 1999, Солдатов, 2006, Павлов, 2006]

Помимо этого проводятся работы по внедрению новых методов лечения и реабилитации газовыми смесями, содержащими инертные газы Являясь химически инертными, они, тем не менее, обладают широким спектром биологического действия Уже сегодня можно говорить, что инертные газы - это новый класс нетоксичных средств, оказывающих на организм целый ряд биологических эффектов, которые уже используются в медицине [Лазарев, 1941, Павлов и др, 1995, 2006, Буров, Потапов, Макеев, 2000, Логунов, Павлов, Григорьев и др , 2006]

Так, использование кислородно-гелиевых смесей эффективно при лечении ряда заболеваний органов дыхания и сердечно-сосудистой системы, реабилитации после переохлаждения и физических нагрузок нагрузок [Barach, 1935, Orr, 1988, Павлов и др, 1995, Куценко, 2000, Воль, 2006] Применение кислородно-аргоновых гипоксических смесей (с содержанием кислорода 1015%) повышает резистентность организма человека и млекопитающих к гипоксической гипоксии и улучшает сон после психофизических нагрузок [Pavlov, Grigonev, Smohn et al, 1997, Шулагин, Дьяченко, Павлов, 2001, Павлов, 2006] С помощью кислородно-ксеноновых смесей возможна терапия бессонницы, неврозов различной этиологии, реактивных и абстинентных состояний, снижения болевой чувствительности Ксенон на сегодняшний момент, кроме того, является идеальным общим анестетиком, однако его повсеместное использование ограничивается высокой стоимостью [Буачидзе, Смольников, 1962, Буров, Потапов, Макеев, 2000, Наумов и др , 2002]

Наиболее близким к ксенону по физическим свойствам элементом является криптон [Aitkenhead, Smith, 1990], но для его внедрения в медицинскую практику необходимо всестороннее изучение влияния этого газа на организм При этом анестетическая сила криптона несколько слабее, чем ксенона, что может дать новый, более широкий, чем у ксенона спектр применения для лечения и реабилитации при нормальном давлении и обеспечить достаточную анестезию при повышенном давлении [Павлов, Куссмауль и др , 2005] Кроме того, в перспективе возможно использование криптона в водолазной практике, космической и экстремальной медицине для создания безопасной дыхательной газовой среды с заданными свойствами в гермозамкнутых объектах и для проведения анестезии под повышенным давлением

Несмотря на возрастающий интерес к этой области [Abrami, 2003, Preckel, 2004, 2006, Ма, 2007], механизмы действия инертных газов, в частности их наркотического действия, до конца не выяснены

Цель работы — изучение биологического действия криптона на живые организмы различных уровней организации в условиях повышенного давления

Задачи исследования

1 Создание экспериментальных установок

- барокамеры длительного содержания биообъектов и водных животных под давлением в термостате и оптической барокамеры для макрофото- и видеосъемки лабораторных животных (лабораторных планарий, иглистых тритонов, плодовых мушек и др ) под давлением,

- термобоксов и инкубаторов для длительной инкубации яиц японского перепела в газовых средах различного состава под различным давлением в отсеке барокомплекса ГВК-250,

- барокамерного дыхательного аппарата с замкнутой схемой дыхания для проведения исследований с участием человека в барокомплексе под давлением по изучению эффектов дыхательных газовых смесей, содержащих криптон и другие инертные газы, и автоматизированного дыхательного аппарата для нормобарических условий

2 Определение пороговых величин парциального давления криптона, оказывающего анестетический эффект на различных лабораторных животных и человека

3 Оценка влияния криптона на формирование органов и тканей

- в процессе регенерации,

- в эмбриогенезе

4 Исследование влияния воздушно-криптоновых сред и кислородно-криптоновых смесей на клинико-биохимические показатели крови животных и человека

5 Изучение цитогенетических последствий инкубации крыс в воздушно-криптоновой среде

6 Исследование влияния дыхания кислородно-криптоновыми смесями при нормальном и повышенном давлении на электрическую активность мозга человека

Основные положения, выносимые на защиту

1 Биологическая активность химически инертного газа криптона на животных и человека проявляется в различной степени в зависимости от парциального давления и уровня организации живого организма, при этом видимых отрицательных эффектов на организм не отмечено

2 Криптон в водных и газовых средах и смесях при повышенном давлении проявляет выраженный анестетический эффект на лабораторных животных и человека

Научная новизна работы

1 Впервые применен эволюционный подход к изучению действия повышенного парциального давления криптона на живые организмы, и выстроен эволюционный ряд из исследованных объектов по степени их чувствительности к криптоновой анестезии

2 Впервые проведены исследования, в которых полный цикл эмбрионального развития теплокровных животных (японского перепела) происходит в атмосфере анестетика (криптона и закиси азота)

3 Впервые осуществлено исследование влияния криптона, обладающего анестетическими свойствами, на образование органов и тканей как в процессе регенерации, так и в процессе эмбриогенеза

4 Впервые проведены исследования с участием человека по изучению влияния дыхания газовыми смесями, содержащими криптон, при нормальном и повышенном давлении на электрическую активность мозга и клинико-биохимические показатели крови

Практическая значимость и внедрение результатов исследования в практику

В лекционные курсы для аспирантов ГНЦ РФ-ИМБП РАН, студентов МГУ, РГМУ, МАИ, курсантов ИПК ФМБА России включены данные о физиологическом действии криптона на человека и животных при нормальном и повышенном давлении, полученные в рамках данной работы Результаты работы легли в основу обоснования НИОКР МО РФ по созданию подвижного гипербарического госпиталя с барооперационной, в которой для анестезии предполагается использовать криптон и ксенон

По результатам работы разработаны ТУ на медицинскую газовую смесь ТУ 2114-028-397917332007 от 15 01 2007 г Дыхательная газовая смесь «КрипОксА» Потапов ВН, Жданов В Н, Филиппов В М, Потапов А В , Волокитин JIБ, Козин В JI, Павлов Б Н, Амиров Р Р , Демидион П Ю , Павлов Н Б, Куссмауль А Р, Тугушева М П, Логунов А Т (Акт о внедрении результатов от ООО <Акела-Н» от 15 01 2007) Разработаны действующие макеты барокамерного дыхательного аппарата с замкнутой схемой дыхания под давлением до 10 кгс/см2 с применением различных дыхательных газовых смесей на основе криптона, аргона, ксенона, а также автоматизированного дыхательного аппарата для нормобарических условий (Акт о внедрении результатов от ЗАО СКБ ЭО от 19 04 2007)

Апробация работы

Основные результаты и положения диссертации доложены на конференциях молодых ученых ГНЦ РФ-ИМБП РАН, посвященных Дню космонавтики (Москва, 2005, 2006, 2007), конференции «Гипербарическая физиология и водолазная медицина» (Москва, 2005), I Съезде физиологов СНГ (Сочи, 2005), XIII международной конференции по космической биологии и авиакосмической медицине (Москва, 2006), VIII всемирном конгрессе по адаптационной биологии и медицине (Москва, 2006), XXXI академических чтениях по космонавтике «Актуальные проблемы Российской космонавтики» (Москва, 2007) Диссертация апробирована на секции Ученого совета «Гипербарическая физиология и экологическая медицина» ГНЦ РФ-ИМБП РАН (протокол № 3 от 13 апреля 2007 г ) По материалам диссертации опубликовано 16 печатных работ

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, 6 глав собственного исследования, каждая из которых заканчивается обсуждением и выводами по главе, заключения, общих выводов, списка литературы и приложений, содержащих таблицы, фотографии, материалы по внедрению

Работа изложена на 133 страницах машинописного текста, иллюстрирована 21 таблицей и 28 рисунками (а также содержит 32 таблицы и 6 рисунков в приложениях) Библиография включает 181 источник, из них 116 - на английском языке

Содержание паботы Материалы и методы исследования

Используемые установки

Работа выполнялась с использованием комплексных стендов и установок ГНЦ РФ-ИМБП РАН

1) Барокамера длительного содержания биообъектов и водных животных под давлением в термостате и специально собранная установка для макрофото- и видеосъемки лабораторных животных под давлением, включающая в себя барокамеру с прозрачной крышкой из плексиглаза, фотоаппараты Canon PowerShotA70, подключенный к микроскопу МБС-10, Konica Minolta Dimage 7i и Panasonic Lumix FX8, компьютерные программы AM Capture, RemoteCapture, Studio и ImageScope M, а также осветитель A CRUSS-OPTONIC

2) Термобоксы с шлюзовыми камерами и изолированной системой подачи газов и инкубаторы с автоматической системой жизнеобеспечения (температура инкубации - 37,5±0,5 'С, влажность -40-70%) и поворотным механизмом для длительной инкубации яиц японского перепела в дыхательных газовых средах различного состава под различным давлением в ГВК-250 с возможностью контроля температуры, влажности и газового состава

3) Барокамерный дыхательный аппарат с замкнутой схемой дыхания для подачи лечебных дыхательных газовых смесей, содержащих аргон, гелий, азот, ксенон и криптон, а также автоматизированный дыхательный аппарат для нормобарических условий

4) Береговой водолазный комплекс ГВК-250 Объем проведенных исследований

Всего проведено 17 серий экспериментов на 903 объектах (табл 1) Программы исследований на животных и с участием человека утверждены и одобрены комиссией по биоэтике (протоколы № 176а от 8 июня 2006 г и № 177а от 13 июня 2006 г) Исследования выполнены в рамках плановых фундаментальных исследований РАН, определенных для ГНЦ РФ-ИМБП РАН на 2003-2006 гг, ФЦП «Мировой океан» межведомственного проекта «Гипербария» на 2001-2006 гг, ФЦНТП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники» на 20022006 гг Во всех экспериментах использовали медицинские газы производства ООО «Акела-Н»

Таблица 1

Объем проведенных исследований, объекты, используемое воздействие, его длительность и __ обработка полученного материала__

№ Объект Кол-во Воздействие Длительность Обработка

1 Планарии лабораторные Girardia tigrina 178 Вода, насыщенная криптоном, 3 и 6 кгс/см2 (нормоксия) 4 суток 2 суток Оценка скорости регенерации

Вода, насыщенная криптоном, 3 кгс/см2 (гипоксия 1 сутки) 4 суток

Вода, насыщенная криптоном, 3 кгс/см2 (гипоксия 2 суток) 2 суток

Насыщенная криптоном токсичная вода (с МНз), 3 кгс/см2 (нормоксия) 2 суток

Вода, насыщенная криптоном, 6, 15, 18 и 30 кгс/см2 (нормоксия) 10-30 мин Определение особенностей поведения

Вода, насыщенная криптоном, аргоном, гелием, азотом, 30 кгс/см2 (нормоксия) В течение часа

2 Тритоны иглистые Pleurodeles w al til 19 ВКрСр+вода, до 18 кгс/см'1 (нормоксия) До 10 мин изопрессии Определение особенностей поведения

3 Мушки плодовые Drosophila melanogaster 110 ВКрСр, до 20 кгс/см2 (нормоксия) До 10 мин изопрессии Определение особенностей поведения

4 Эмбрионы перепелов японских Coturnix coturmx japónica 60 ВКрСр, 3 кгс/см2 (А - нормоксия, Б -гипоксия) До 16-17 суток Морфология и морфометрия

280 ВКрСр, КАСр, закись азота, 5 кгс/см2 (нормоксия)

5 Перепела японские Coturnix coturnix japónica 17 ВКрСр, до 5 кгс/см'1 (нормоксия) Около 20 мин изопрессии Определение особенностей поведения, подсчет формулы крови

6 Крысы белые Rattus norvegicus 30 ВКрСр, ВКсСр, 0,3 кгс/см2 (нормоксия) 24 часа Клинико- биохимический анализ крови (подсчет формулы крови, биохимия), цитогенетика

7 Человек Homo sapiens (23-45 лет) 5 ККрС (30% 02,70% Кг), 0 кгс/см2 1 час Определение особенностей поведения, ЭЭГ, подсчет формулы крови

4 ККрС (14% 02,86% Кг), 3 кгс/см2 В течение 58 мин

Примечание ВКрСр - воздушно-криптоновая среда, ВКсСр - воздушно-ксеноновая среда, КАСр — кислородно-аргоновая среда, ККрС - кислородно-криптоновая смесь

Применяемые методы

1 Метод физического моделирования факторов повышенного давления водной и газовой среды с контролем и регуляцией давления, газового состава, температуры и влажности

2 Метод наблюдения и фиксации особенностей поведения с возможной оценкой глубины анестезии

3 Морфологические и морфометрические методы

- определение скорости регенерации лабораторных планарий по величине образующейся бластемы,

- определение i стадии развития эмбриона с измерением морфометрических параметров

4 Цитогенетические методы исследования клеток роговицы глаза крыс

- анафазно-телофазный метод подсчета частоты хромосомных аберраций с анализом спектра аберраций,

- методика подсчета митотического индекса для определения пролиферативной активности клеток

5 Стандартные клинико-биохимические методы анализа крови животных и человека

- подсчет формулы крови с определением ядерного индекса (ЯИ) и лейкоцитарного индекса интоксикации (ЛИИ) по Островскому,

- определение биохимических параметров крови (биохимический анализатор «Becman»),

- метод твердофазного иммуноферментного анализа (автоматический анализатор «Ahsei»)

6 Метод электроэнцефалографии (ЭЭГ) для определения изменений электрической активности мозга (программно-аппаратный комплекс «Типология»)

7 Стандартные статистические методы обработки данных (подсчет среднего, стандартного отклонения, стандартной ошибки среднего, оценка достоверности различий по t-критерию Стьюдента)

Результаты исследований и их обсуждение

1 Определение парциальных давлений криптона, оказывающих наркотический эффект на лабораторных животных и человека

Проведенные эксперименты показали, что лабораторные планарии полностью обездвиживаются и не реагируют на раздражители при давлении криптона от 20 до 30 кгс/см2 (при этом такие же парциальные давления других газов - гелия, азота, аргона - подобного эффекта не дают), плодовые мушки - при 18-20 кгс/см2 (при этом самцы оказываются более чувствительными, чем самки), иглистые тритоны - при 14-16 кгс/см2 Анестетическая концентрация криптона в среде для взрослых особей японского перепела составляет 5-5,5 кгс/см2

В экспериментах с участием человека показано, что дыхание кислородно-криптоновой смесью, содержащей 14% кислорода и 86% криптона, при 3 кгс/см2 в течение 3-6 мин через последовательное прохождение стадий анальгезии и возбуждения (1-я и 2-я стадии анестезии по классификации Guedel а) вводит испытуемых в состояние, которое характеризуется амнезией (полной), аналгезией (по меньшей мере, частичной), повышенным мышечным тонусом, наличием неравномерного, в основном глубокого и частого дыхания, повышенным артериальным давлением и учащенным пульсом, наличием грез, сновидений, галлюцинаций По-видимому, это

максимальная стадия анестезии, которую можно достигнуть при данных условиях и времени воздействия, и которая, однако, не полностью соответствует хирургической стадии анестезии

Обобщая данные, полученные в исследованиях на животных и человеке, следует отметить, что особи одного и того же вида отличались по длительности вхождения в «наркоз» и выхода из него, а также степени выраженности ответной реакции У всех организмов стадия восстановления координированных движений (а также стадия восстановления сознания у человека) протекает достаточно быстро При этом у водных животных стадия восстановления удлиняется, что может быть связано как с поглощением криптона не только через дыхательную систему (у тритонов), но и через кожу (а у планарий - всей поверхностью тела), а следовательно большим насыщением тканей этим газом, так и с увеличением давления per se

Результаты проведенных экспериментов показали, что чувствительность к криптоновому наркозу возрастает соответственно эволюционному ряду исследованных объектов Полученные данные соотносятся с данными ПРеньяра [Regnard, 1891], что чувствительность к действию гидростатического давления возрастает с усложнением организмов, а также данными Ч Е Овертона (цитируется по Urban, Bleckwenn, 2002), что для анестезии различных групп червей и простейших требуются большие концентрации анестетиков, чем для млекопитающих, головастиков и крошечных крабов, и служат очередным подтверждением теории Мейера-Овертона и Н В Лазарева о физиологическом действии неэлектролитов, к которым относятся инертные газы Поскольку криптоновый наркоз проявлялся у организмов низкого уровня организации, следовательно, в механизмах задействована не только нервная система, что показал и ЧЕОвертон (цитируется по Urban, Bleckwenn, 2002) в своих экспериментах с эфиром и хлороформом на растительных клетках, мерцательных клетках, мышечных волокнах и других клетках организма. Но с усложнением организации систем организма чувствительность к наркозу возрастает, а значит, нервная система все-таки играет решающую роль

2 Исследование влияния водной среды, насыщенной криптоном, на скорость

регенерации лабораторных планарий

Результаты исследований показали, что криптон в водной среде не оказывает выраженного влияния на скорость регенерации головы лабораторных планарий (табл 2) Не выявлено существенных различий в скорости регенерации головы лабораторных планарий в контроле и в опыте при инкубации в течение 72 ч при давлении 3 кгс/см2 (р>0,05) При этом в воде, содержащей

криптон, наблюдалась тенденция к ускорению регенерации Увеличение парциального давления до

6 кгс/см2 приводит к уменьшению скорости роста головы у лабораторных планарий как по сравнению с контролем, так и по сравнению с инкубацией в течение такого же времени при 3 кгс/см2 (р>0,05) При инкубации в среде, содержащей криптон, в течение 2 суток также не обнаружено достоверных отличий в скорости регенерации, с тенденцией к увеличению средних

значений обоих показателей в опытной группе (р>0,05) При сравнительном анализе скорости регенерации планарий, инкубировавшихся в среде, содержащей криптон, в течение разного времени, была отмечена тенденция к увеличению скорости регенерации при увеличении времени от 2 до 4 суток пребывания планарий в среде, содержащей криптон (р>0,05)

Эксперименты, когда планарии инкубировались в гипоксической среде, показали, что достоверных отличий в скорости регенерации планарий в контроле и опыте не обнаружено, однако отмечена тенденция в снижении темпов роста головы у опытных планарий (р>0,05)

Таблица 2

Скорость регенерации лабораторных планарий в водной среде, насыщенной криптоном, при __различных условиях инкубации__

№ опыта Вариант инкубации ДБ/ДТ ПБ/ПТ

1 Контроль 0,063±0,007 0,033±0,003

Криптон (3 кгс/см' - 4 суток) 0,081 ±0,016 0,039±0,007

2 Контроль 0,062±0,019 0,044±0,012

Криптон (6 кгс/см'1 - 4 суток) 0,045±0,004 0,030±0,006

3 Контроль 0,051±0,004 0,031±0,002

Криптон (3 кгс/см'1- 2 суток) 0,059±0,004 0,034±0,003

4 Контроль 0,089±0,019 0,063±0,012

Криптон (3 кгс/см2 - 4 суток, 1 сутки гипоксия) 0,068±0,004 0,055±0,006

5 Контроль 0,033±0,004 0,023±0,001

Криптон (3 кгс/см2 - 2 суток, гипоксия) 0,030±0,003 0,017±0,003

Примечание ДБ - длина бластемы (мм), ДТ - длина тела (мм), ПБ - площадь бластемы (мм2), ПТ - площадь тела (мм2)

Эксперимент по изучению влияния криптона на выживаемость планарий в токсичной воде (с повышенным содержанием аммиака - 0,5-0,87 мг/л) показал, что число планарий в среде, содержащей криптон, оказалось выше, чем в среде без криптона (рис 1)

? 80

ю

г? о -I-1-1-

сразу после ч-з 1 сутки ч-з 2 суток время после инкубации

Рис 1 Выживаемость планарий в насыщенной криптоном токсичной воде, инкубация - 2 суток, давление - 3 кгс/см2

Следует отметить, что контрольные планарии были менее активны после инкубации в такой воде, чем опытные При длительной инкубации в данной воде погибали и опытные, и контрольные планарии

Результаты могут свидетельствовать об отсутствии ингибирующего влияния криптона на регенерацию элементов нервной системы (головных ганглиев), а увеличение выживаемости планарий

в токсической среде, содержащей криптон, может служить свидетельством в пользу подтверждения гипотезы о возможном протекторном действии криптона

3 Исследования эмбриогенеза японского перепела в воздушно-криптоновой среде под давлением

Результаты экспериментов по влиянию криптона при давлении 3,0 кгс/см2 на развитие японского перепела продемонстрировали достаточно высокую выживаемость эмбрионов в нормоксической воздушно-криптоновой среде (табл 3)

Таблица 3

Выживаемость эмбрионов в средах, содержащих криптон, при 3,0 кгс/см2 на 4-е сутки __развития __

Показатели Опыт 1 (нормоксия) Опыт 2 (гипоксия в первые 12 ч) Контроль

Заложено яиц 21 46 30

Неоплодотворенные яйца 0 4 1

Эмбрионы живые, 19/90,5% 32/76,2% 28/96,6%

соответствуют возрасту (сутки) 3-4 3 6 0

4 13 15 28

4,5 3 11 0

Погибло эмбрионов 2/9,5% 10/23,8% 1/3,4%

соответствуют возрасту (сутки) 1 1 5 0

1-2 0 3 1

2 0 1 0

2-3 1 1 0

Эмбрионы с аномалией развития 1/4,8% 13/31,0% 0

Примечание число эмбрионов указывается в виде - общее число / процент от числа оплодотворенных

На 4-е сутки выживаемость составила 90,5%, погибли всего два эмбриона на первых сутках инкубирования, патология развития (Б-образная форма тела) наблюдалась у одного эмбриона Морфометрические показатели (длина и вес) эмбрионов в опыте практически не отличались от контрольных и соответствовали норме развития (рис 2 1) Следует отметить, что у трех (16% от чиста живых) эмбрионов развитие шло с опережением сроков на 0,5 суток

На 12-е сутки инкубирования (рис 2 2) выживаемость зародышей в опыте составила 52,6% (10 эмбрионов), при этом эмбрионы отставали от срока инкубирования на 0,5-1 сутки Погибло 9 эмбрионов, из них 67% (6 эмбрионов) - на 6-8-е сут, остальные на 8-9-е сут При этом практически у всех погибших эмбрионов не были отмечены патологические изменения Только у одного погибшего эмбриона наблюдалась видимая патология развития (эктопия черепной коробки и брюшной полости, изменение длины клюва)

А) Б)

Рис, 2, Эмбрионы японского перепела: 1 - на 4-с сутки развитая, 2 - на [2-е сутки развития. А -контроль (воздух). воздушно-криптоновая среда

В опыте, когда развитие эмбрионов в первые 12 часов проходило в острой гипоксии (02=0,7% при избыточном давлении 3 кгс/'смг), ожидалось резкое снижение выживаемости и появление множества патологий, поскольку многочисленные работы по исследованию эмбрионального развития птиц продемонстрировали существенную роль гипоксии в возникновении патологий развития у эмбрионов [Nccdham, 1931, Wesselkin, 1943; Grus, RomanofT, 1944; Погорельский, 1947; Gallera, 1951]. Результаты показали, что выживаемость эмбрионов на 4-е сутки развития осталась достаточно высокой и составила 76,2% (32 эмбриона), при этом 26.2% эмбрионов опережали сроки развития на 0,5 сут. (табл 3). Острая гипоксия, как и ожидалось, вызвала у 31,0% эмбрионов различные аномалии развития (S-образная форма тела, двухсторонняя микрофтальмия, многочисленные точечные кровоизлияния на теле). На 17-е сутки опытного инкубирования яиц выживаемость эмбрионов резко сократилась, и составила всего 14,3% (3 эмбриона). При этом все три эмбриона прошли полный никл эмбрионального развития, а один даже проклюнул скорлупу яйца. Из 18 погибших эмбрионов у 50% гибель наступила в первую половину эмбриогенеза (1 -9 сугки), у всех погибших эмбрионов видимой патологии развития не наблюдалось.

Эксперимент по изучению влияния парциального давления криптона 5 кгс/см" показал, что на 4-е стуки эмбрионы в воздушно-криптоне вой среде развивались нормально, без патологий и опережали контроль на 0.5 сут. (рис. 3)

и

У^у I

3'-

Щ-

л) Б) В) Г)

Рис. 3. Эмбрионы японского перепела на 4-е сутки развития в различных средах: Л - контроль (воздух), Б - кислородно-азотная среда (Ог=3,5%, N¡=96,5%), В - среда, содержащая закись азота (Ог=3,5%, N20-14-16%, N,=80-82%), Г- воздушно-криптоновая среда (#=3,5%, N,= 13-¡4%, Кг=82.5-83,5%}; среда во всех инкубаторах - нормоксическая (в пересчете на нормальное атмосферное давление)

На 5-6-е сутки развитие эмбрионов в воздушно-криптоновой срсде останавливалось, при этом видимых патологий развитая в данной труппе не обнаружено В закиси азота выживаемость была низкой, ни один из эмбрионов не достиг 16-суточного возраста, при этом наблюдалось большое число аномалий развития, в том числе редких (рис. 4).

Г) Д) Е)

Рис, 4. Аномалии развития эмбрионов японского перепела в среде, содержащей закись азото: А - на 4-е сутки (8-образная форма и вогнутость гипофиза), В - на 10-е сутки (множественные кровоизлияния), В-Д - на 16-е сутки развитая (8 - эктопия черепа с разрастанием мозга; Г - неестественно поджатые лапки; Д - эктопия брюшной полости; Е - недоразвитие и деформация тела, эктопия брюшной полости)

Т.о. криптон при парциальном давлении 3,0 кгс/см1 в нор мокс и ческой среде не вызывает патологий эмбрионального развития японского перепела, а в гипоксичсской среде, возможно, обладает протекторными, антигишжсическими свойствами, что соотносится с результатами эксперимента по выживаемости планарий в токсичной воде. На начальных стадиях эмбриогенеза

криптон стимулирует развитие эмбрионов. Причины и механизмы прекращения развития эмбрионов на 5-6-с сутки при парциальном давлении криптона 5,0 кгс/см" не выяснены.

4. Исследования влияния дыхательных смесей и сред, содержащих криптон, на изменении лейкоцитарной формулы кропи животных и человека

Для оценки влияния криптона на одни из наиболее реактивных клеток (лейкоциты) организма была определена формула кропи животных (рис. 5А и 5Б}, инкубировавшихся н воздушно-криптоновой среде. 1 [оказано, что инкубация перепелов в такой среде при избыточном давлении 5,0 кгс/см' н течение 20 мин приводит к достоверно значимому увеличению числа нейтрофилов, как пал очко ядерных (более чем в 5 раз, р£0,Й01), так и сешентоядерпых (в 4 раза, р<0,ОШ). и снижении числа лимфоцитов (на 25%, р<0,01). Кроме того, отмечена тенденция к увеличению числа плазматических клеток и метам и ел сшито в (р>0,05).

Б) белые крысы

В) человек, нормобэрия

100% 50%

40% 20% 0%

фон криптон

п Пл

■ Мон Ш П

В & пЭ

■ С

■ Л □ Мм

ом

5 *

ш -

100% 8046 60% 40% 20% 0%

контроль

Г} человек, 3 кгс*см2

б 5 60% ■

0% I

фон криптон

Рис. 5, Изменения лейкоцитарной формулы крови животных и человека после воздействия дыхательных смесей и сред, содержащих криптон (М — миелоциты, ММ - мегамиелоциты, II -пал оч коядер! ¡ые нейтрофилы, С - се гме кто ядерные нейтрофилы, Э - эозинофилы. В - базофилы, Л - лимфоциты, Мон - моноциты, Пл - плазматические клетки)

После суточной инкубации лабораторных крыс в воздушно-криптоновой среде под избыточным давлением 0,3 кгс/см2 происходит увеличение среднего значения числа нейтрофилов (рис 5Б) сегментоядерных - в 4 раза (р<0,001), а палочкоядерных - почти в 5 раз (р<0,001) Средний уровень агранулоцитов - лимфоцитов и моноцитов - достоверно снижается (р<0,001 и р<0,05, соответственно) Кроме того, стоит также отметить тенденцию к снижению эозинофилов (р>0,05)

Определение формулы крови у человека (рис 5В и 5Г) показало, что после дыхания кислородно-криптоновой смесью при нормальном давлении отмечается тенденция к снижению числа эозинофилов, нейтрофилов, лейкоцитов по сравнению с фоновыми значениями у этих же испытуемых (р>0,05), а дыхание кислородно-криптоновой смесью при давлении 3,0 кгс/см2 приводит к увеличению числа сегментоядерных нейтрофилов (р<0,05) и снижению числа лимфоцитов (р<0,05) Также отмечена тенденция к снижению числа моноцитов (р>0,05)

Подсчет ядерного индекса (табл 4) показал, что пребывание в воздушно-криптоновой среде и дыхание кислородно-криптоновой смесью вызвало увеличение данного показателя у перепелов (почти в 2 раза, р<0,05) и у человека как при нормальном (р<0,05), так и при повышенном давлении, что свидетельствует о сдвиге соотношения нейтрофилов в сторону более юных клеток Кроме того, криптон вызывает значительное увеличение лейкоцитарного индекса интоксикации в крови перепелов - более, чем в 6 раз (р<0,001), в крови крыс - почти в 10 раз (р<0,001), у человека при нормобарии - на 10%, в условиях гипербарии - на 40% (р<0,01)

Таблица 4

Ядерный индекс и лейкоцитарный индекс интоксикации белой крови животных после инкубации в воздушно-криптоновой среде и человека после дыхания кислородно-криптоновыми

смесями

Объект Вариант ЯН ЛИИ

Перепела Контроль 0,134 ±0,023 0,061 ±0,009

ВКрСр 0,299 ±0,031* 0,367 ±0,076***

Крысы Контроль 0,434 ± 0,096 0,201 + 0,010

ВКрСр 0,444 + 0,039 1,849 + 0,203***

Человек, Фон 0,154 ±0,034 1,585 ±0,104

нормобария ККрС 0,196 ±0,051* 1,727 ± 0,097

Человек, Фон 0,134 ±0,017 1,299 ±0,074

3 кгс/см2 ККрС 0,145 ±0,027 1,810± 0,201**

* -р<0,05, ** -р<0,01, *** -р<0,001

Таким образом, криптон в средах и смесях при повышенном давлении у теплокровных животных и человека, как правило, вызывает увеличение числа нейтрофилов, как палочкоядерных, так и сегментоядерных (со сдвигом в сторону более юных клеток) и снижение числа агранулоцитов (лимфоцитов и моноцитов) При нормальном давлении реакции менее выражены По мнению некоторых исследователей, эти изменения могут свидетельствовать о наличии неспецифической реакции организма на ингаляцию общими анестетиками Кроме того, в

исследованиях на человеке было показано, что подобные изменения при анестезии ксеноном и закисью азота остаются в пределах физиологической нормы [Вурсв, Потапов, Максе к. 2000].

5. Сравнительный анализ влияния су точно! о воздействия воздушно-криптоновой и возяушно-кгенояовой сред на биохимические показатели крыс

Для опенки стрессорной реакции организма па длительное пребывание в ноздуншо-кршггоновой среде был проведен анализ влияния криптона на уровень стрессорных гормонов и биохимические показатели крови крыс. Поскольку криптон близок но свойствам ксенону, эффекты которого изучены достаточно Хорошо, действие криптона оценивали сравнительно с аналогичным воздействием ксенона. Проведенные эксперименты показали, что криптон и ксенон оказывают сходное воздействие ни изменение уровня (йрмонов, вызывая повышение концентрации коргизола и Прогестерона и снижение концентра!ига общего тироксина ( Гд) и тестостерона к крови крыс (рис. 6).

*-р<0,05; Ш -р<0.01; *** - р<0,001.

Рис. 6. Изменение конЩнтраций гормонов в крови крыс после пребывания н воздушно-ксеноновой и воздушно-криптоновой средах под давлением 0,3 кгс/см в течение суток

Как показано в таблице 5. действие криптона на биохимические показатели отличается от действия ксенона.

Таблица 5

Биохимические показатели крови крыс после пребывания в течение суток в воздушно-ксенононоп и поздуппю-криптопоной средах иод давлением 0.3 кгс/см"

Вариант Показатель

1 люкоаа (мМ/л) лет (мМ/'с-л) ллт (mM/C-JÏ) К-т Ритиса Мочевина (мкМ/л) Мочевая кислота (мк М/л) Лактат (мМ/л) а-амил аза (мг/с-.-) Кальций общий (мМ/л)

Контроль 8.50 ± 0,55 0,408 ± 0,009 0,353 ê 0.024 1,17 ± 0.06 10.74 ± 0.41 120.76 ± 18.07 6,94 ± 0.59 58.88 ± 1.10 2.602 ± 0,162

ВКсСр 8.26 * 0.41 0,509 ± 0.059 0.600 ± 0.175 0.99 ± 0,14 9.64 ± 0,73 138.42 ± 7.18 6,38 ± 0,70 55,24 ± 1.09 2,932 ± 0.049

ВКрС'р 6.74 ± 0.21** 0.375 ± 0,011* 0.325 ± 0,017 1,18 ± 0,12 9,13 ± 0.40** 109,10 ± 6.24 ± 16.40 0,50 56,20 ± 1,11 2.690 ± 0.040

* - р<0.05 ; * * - р<0.0 I : " * - р<0.001.

В воздушно-криптоновой среде наблюдаются достоверное снижение уровней глюкозы и мочевины (р<0,01 в обоих случаях), а также некоторая тенденция к снижению уровней аспартаминотрансферазы (ACT) (р<0,05), аланинаминотрансферазы (АЛТ), лактата, увеличению уровня кальция в крови крыс В воздушно-ксеноновой среде отмечены достоверное снижение уровня а-амилазы (р<0,01) и тенденция к повышению уровней ACT и АЛТ, снижению коэффициента Ритиса и уровня лактата в крови крыс

Таким образом, нами показано, что криптон, как и ксенон, вызывает изменения клинических показателей крови и гормонального статуса лабораторных животных В некоторых случаях эффекты криптона и ксенона разнонаправлены, в других - эффект криптона более ярко выражен по сравнению с эффектом ксенона Эти данные убеждают в невозможности проецировать в полной мере результаты, полученные в экспериментах с ксеноном, на криптон

6 Влияние суточной инкубации в воздушно-криптоновой и воздушно-ксеноновой средах на цитогенетическис показатели эпителиоцитов роговицы глаза крыс

Сравнительный анализ уровня хромосомных аберраций в эпителиоцитах роговицы глаза крыс для оценки влияния криптона на генетический аппарат животных был также проведен в сравнении с аналогичным ксеноновым воздействием Результаты экспериментов показывают, что достоверного увеличения хромосомных мутаций при длительном пребывании крыс в воздушно-криптоновой и воздушно-ксеноновой средах не происходит (табл 6)

Таблица 6

Хромосомные аберрации в клетках роговицы глаза крыс после суточного пребывания в

воздушно-криптоновой и воздушно-ксеноновой средах

Вариант Число анафаз Число анафаз с АХр Типы АХр % анафаз с АХр + т

фрагменты обмены

Контроль 5487 33 19 (58±8,6%) 14 (42±8,6%) 0,60±0,10

ВКсСр 5354 36 21 (58±8,2%) 19 (42±8,2%) 0,67±0,11

ВКрСр 4635 37 29 (78±6,8%) 8 (22±6,8%) 0,80±0,13

Примечание В скобках указан процент от общего числа анафаз с аберрациями, * -р<0,05, ** -р<0,01, *** -р<0,001

Однако следует отметить, что в обеих средах наблюдалась тенденция к увеличению данного показателя В контрольной группе суммарный уровень хромосомных аберраций составлял 0,60%, при этом у разных животных он варьировал в пределах от 0% до 0,81% Индивидуальный уровень хромосомных аберраций в воздушно-криптоновой среде составлял 0% - 0,98%, а в воздушно-ксеноновой среде варьировал от 0 до 1,04%

Кроме того, анализ спектра аберраций показал, что в криптоновой группе происходил сдвиг в сторону фрагментарных перестроек (от 58% в контроле до 78% в воздушно-криптоновой среде)

Более детальное рассмотрение типов хромосомных перестроек показало, что этот сдвиг происходит за счет увеличения доли одиночных фрагментов (почти в 2 раза по сравнению с контролем) После пребывания в воздушно-криптоновой среде также происходит заметное снижение доли хроматидных обменов Распределение типов аберраций после инкубации в воздушно-ксеноновой среде отличается от такового в контроле и при инкубации в воздушно-криптоновой среде Доля одиночных фрагментов возрастает менее значимо, тогда как доля парных и множественных фрагментов сокращается более чем в 2 и 3 раза соответственно, при этом почти в 2 раза возрастает доля хроматидных обменов Более того, здесь появляются множественные аберрации, не наблюдаемые в контрольной и криптоновой группе

Результаты исследования пролиферативной активности клеток эпителия роговицы глаза крыс показали, что при воздействии криптона достоверно не изменяется значение митотического индекса (МИ), тогда как ксенон достоверно снижает значение этого показателя на 33% от контрольного уровня (р<0,01) (табл 7) При подсчете относительной частоты делящихся клеток по фазам митоза нами обнаружено, что криптон, как и ксенон, модулируют соотношение этих фаз, характерное для контроля В воздушно-криптоновой среде наблюдается тенденция к сокращению процента профаз (р<0,05) и телофаз за счет увеличения процента метафаз и, в большей степени, анафаз В воздушно-ксеноновой среде изменения менее выражены Происходит увеличение числа анафаз за счет снижения числа профаз, тогда как число метафаз и телофаз почти не отличается от показателей, полученных в контроле

Таблица 7

Изменения пролиферативной активности клеток роговицы глаза крыс после суточного

пребывания в воздушно-криптоновой и воздушно-ксеноновой средах

Вариант Число клеток Число МИ

профаз метафаз анафаз телофаз

Контроль 6164 36 (36,7 ± 4,9 %) 23 (23,5 ± 4,3 %) 27 (27,6 ± 4,5 %) 12 (12,2 ± 3,3%) 1,59±0,16

ВКрСр 5079 17 (21,5 ± 4,6 %) * 25 (31,6 ±5,2%) 32 (40,5 ± 5,5 %) 5 (6,3 ± 2,7 %) 1,56±0,17

ВКсСр 7372 20 (25,6 ± 5,0%) 19 (24,4 ± 4,9%) 30 (38,5 ± 5,5%) 9 (11,5 ±3,6%) 1,06±0,12 **

Примечание В скобках указан процент от общего числа делящихся клеток, * -р<0,05, ** -р<0,01, ***-р<0,001

Результаты показывают специфичность влияния каждого инертного газа на генетический аппарат различных животных и дополняют данные, полученные для аргона и гелия

6 Изучение влияния дыхания кислородно-криптоновой смесью на электрическую активность мозга человека

При дыхании кислородно-криптоновой смесью в условиях нормо- и гипербарии (3 кгс/см2) спектр ЭЭГ у всех испытуемых достоверно отличался от фонового практически по всем составляющим (р<0,05) При этом изменения варьировали не только у разных испытуемых, но и в разных отведениях ЭЭГ у одного и того же испытуемого Однако были выявлены определенные тенденции, характерные для большинства испытуемых (рис 7) При дыхании кислородно-криптоновой смесью в нормобарических условиях происходит снижете спектральной мощности а-, Д- и 6-волн и увеличение Р-волн, при этом в большинстве случаев при закрытии глаз наблюдаются реакции, аналогичные реакции на закрытие глаз в фоне Изменения электрической активности во время дыхания кислородно-криптоновой смесью при 3,0 кгс/см2 были однонапраытены с изменениями, связанными с пребыванием человека в воздушной среде под давлением (снижение а-, Ргволн, увеличение Д и 0-волн) (рис 7Б) При закрытии глаз во время дыхания кислородно-криптоновой смесью при 3,0 кгс/см2 не отмечается выраженных изменений спектра ЭЭГ, что свидетельствует об отключении сознания и вхождении человека в наркоз Также о вхождении испытуемого в наркоз может свидетельствовать увеличение спектральной мощности Д- и 0-волн в ЭЭГ Следует отметить, что подобные изменения могут быть вызваны также стрессорной нагрузкой на организм, однако находившийся в том же отсеке барокамеры анестезиолог подтверждал наличие одной из стадий анестезии у испытуемых с использованием стандартных методов (по исчезновению болевой чувствительности и реакции на команды, наличию роговичного рефлекса)

А)

т левое теменно-затылочное отведение

ж

I -

£ 25

Л '5

¡3 ю

ж ж ж X

-ОеКа

— ТЬе1а -А1рЬа

— Ве1а1

— 6е1а2

/'//////у///

правое лобно-теменное отведение

-ОаКа

— ТЬеЬ -ДрИа

— Вей1

— Вей2

I I I 1 11 11 11 н

Й 8 е * | |

Б)1

Рис 7 Изменения спектральной мощности, характерные для большинства испытуемых (на примере одного из испытуемых) при дыхании кислородно-криптоновой смесью А - при нормальном давлении, Б — при повышенном давлении

Отмечено, что с увеличением времени дыхания кислородно-криптоновой смесью под давлением изменения у многих испытуемых сначала постепенно усиливаются, а на последних минутах дыхания наблюдается тенденция к возвращению к первоначальным уровням, характерным для пребывания в сжатом воздухе, а иногда и более близким к фоновым При

прекращении дыхания кислородно-криптоновой смесью также отмечается тенденция к возвращению разноволновой спектральной активности к первоначальным показателям

Заключение

Таким образом, в рамках данной работы были созданы экспериментальные установки, с помощью которых были определены пороговые значения парциального давления криптона, оказывающего анестетический эффект на различных лабораторных животных и человека, исследовано влияние криптона при различных парциальных давлениях на формирование органов и тканей в процессе регенерации и в эмбриогенезе, на клинико-биохимические показатели крови животных и человека, на цитогенетические показатели роговицы глаза крыс, а также на электрическую активность мозга человека

В результате проведенных экспериментов было показано, что биологическая активность химически инертного газа криптона в водных и газовых средах и дыхательных смесях на лабораторных животных и человека проявляется в различной степени Криптон при парциальных давлениях ниже анестетических не влияет ни на скорость регенерации плоских червей, ни на эмбриональное развитие теплокровных При этом следует отметить, что криптон оказывает некий протекторный эффект на формировании тканей и органов, механизмы которого пока не ясны

В нормоксических газовых средах и смесях при повышенном давлении криптон проявляет выраженный анестетический эффект на лабораторных животных и человека, не вызывая видимых отрицательных эффектов на организм При этом чувствительность к анестетическому действию криптона возрастает с усложнением организации нервной системы организмов

Полученные данные часто являются неоднозначными и должны послужить триггерной точкой в комплексном изучении свойств криптона и влияния этого газа на организм

Выводы

1 Химически инертный газ криптон в условиях повышенного давления (0,3-30 кгс/см2) обладает выраженным биологическим действием на животных и человека

2 По величине парциального давления криптона, необходимого для обездвиживания и/или анестезии, объекты исследований можно выстроить в соответствующий эволюционный ряд тигровые планарии Girardia tignna (20-30 кгс/см2), плодовые мушки Drosophila melanogaster (18-20 кгс/см2), иглистые тритоны Pleurodeles waltli (14-16 кгс/см2), японские перепела Cotumix coturnix japónica (5-5,5 кгс/см2), человек (3-3,5 кгс/см2)

3 Исследованные концентрации криптона в среде не оказывают выраженного влияния на формирование органов и тканей как в процессе регенерации (лабораторных планарий), так и в процессе эмбрионального развития (японского перепела) При наличии токсического воздействия

(гипоксия, аммиак) криптон в среде способен несколько нивелировать отрицательные эффекты этого воздействия

4 Нормоксические газовые смеси и среды, содержащие криптон, вызывают определенные изменения в крови теплокровных животных и человека

а) при повышенном давлении у теплокровных животных и человека такие смеси и среды как правило вызывают увеличение числа нейтрофилов и снижение числа агранулоцитов (при нормальном давлении реакции менее выражены),

б) суточная инкубация крыс в воздушно-криптоновой среде при избыточном давлении 0,3 кгс/см2 вызывает повышение концентрации кортизола и прогестерона и снижение концентрации общего тироксина и тестостерона, а также глюкозы и мочевины в крови

5 Суточное пребывание крыс в воздушно-криптоновой среде при давлении 0,3 кгс/см2 не вызывает достоверного увеличения хромосомных мутаций и изменения митотического индекса, при этом соотношение фаз митоза изменяется

6 Дыхание нормоксической кислородно-криптоновой смесью при нормальном и повышенном давлении изменяет электрическую активность головного мозга человека

а) при нормальном давлении у большинства испытуемых происходит снижение мощности а-, Д- и 0-волн и увеличение р-волн, при этом в большинстве случаев при закрытии глаз сохраняются изменения электрической активности мозга, аналогичные изменениям при закрытии глаз в фоне

б) при повышенном давлении изменения электрической активности мозга во время дыхания кислородно-криптоновой средой однонаправлены с изменениями, связанными с пребыванием человека в воздушной среде под давлением (снижение а-, Ргволн, увеличение Д и 8-волн), при этом закрытие глаз (при отключении сознания) во время дыхания кислородно-криптоновой смесью не вызывает изменений

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1 Цитогенетические эффекты аргона // Сборник научных работ «Актуальные проблемы биологии» Томск, 2004 Т 3 №1 С 30-32 (соавт Богачева М А, Павлов Н Б, ШкуратТ П, Павлов Б Н)

2 Влияние гелия на развитие ХепориБ 1ае\'13 Боис^п // Сборник научных работ «Актуальные проблемы биологии» Томск, 2004 ТЗ №1 С 162-163 (соавт Богачева М А , Павлов Н Б , Шкурат Т П , Павлов Б Н)

3 Влияние кислородно-ксеноновой и кислородно-криптоновой дыхательных сред на формулу крови, биохимические показатели и гормональный статус животных // Материалы IV молодежной конференции, посвященной Дню космонавтики и 10-летию со дня окончания сверхдлительного космического полета врача-космонавта-исследователя Полякова В В Москва, 2005 С 10-11 (соавт Богачева М А )

4 Влияние кислородно-аргоновой среды на цитогенетические показатели и формулу крови лабораторных животных // Материалы IV молодежной конференции, посвященной Дню

космонавтики и 10-летию со дня окончания сверхдлительного космического полета врача-космонавта-исследователя Полякова В В Москва, 2005 С 22-23 (соавт Богачева MA)

5 Физиологические эффекты газовых смесей и сред, содержащих ксенон и криптон // Сборник докладов научно-практической конференции «Ксенон и ксеноносберегающие технологии в медицине - 2005» Москва, 2005 С 20-28 (соавт Павлов Б H, Павлов H Б, Богачева M А, Григорьев А И )

6 Направления исследования свойств газовых смесей и сред, содержащих криптон // Научные труды I Съезда физиологов СНГ Сочи 2005 С 212 (соавт БогачеваМА)

7 Новые лечебные дыхательные смеси // Материалы конференции «Гипербарическая физиология и водолазная медицина» Москва, 2005 С 16-17 (соавт Павлов НБ, Павлов БН, Жданов В H, Потапов В H )

8 Направления исследования свойств газовых смесей и сред, содержащих криптон // Материалы конференции «Гипербарическая физиология и водолазная медицина» Москва, 2005 С 20-21 (соавт Богачева MA)

9 Терапевтические возможности применения лечебных дыхательных газовых смесей на основе гелия и ксенона в целях профилактики здоровья гражданского населения гарнизонов и специалистов ВМФ // Материалы научно-практической конференции «Медицинское обеспечение сил флота в условиях Кольского Заполярья» Видяево, 2006 С 165-167 (соавт Павлов H Б , Павлов Б H , Жданов В H, Потапов В H )

10 Биологические эффекты криптона при повышенном давлении на тигровых планарий Dugesia tignna в водной среде // Материалы V конференции молодых ученых и специалистов, аспирантов и студентов, посвященной дню космонавтики Москва, 2006 С 23

11 Влияние газовой среды, содержащей криптон, на эмбриональное развитие японского перепела // Материалы XIII конференции по космической биологии и авиакосмической медицине Москва, 2006 С 163 (соавт Гурьева Т С , Дадашева О А , Павлов H Б )

12 Main trends of investigation of properties of gas mixtures and atmospheres containing helium, argon, xenon and krypton // Materials of VIII World Congress of ISAM Moscow, 2006 P 86-87 (coauthors Pavlov N В , Tugusheva MP)

13 Цитогенетические последствия в эпителиоцитах роговицы глаза мышей после их пребывания в воздушно-аргоновой среде // Авиакосмическая и экологическая медицина 2006 №5 С 42-44 (соавт Богачева M А , Шкурат Т П , Павлов H Б )

14 Влияние дыхательных сред, содержащих ксенон и криптон, на клинико-биохимические показатели крови животных // Авиакосмическая и экологическая медицина 2007 №2 С 30-32 (соавт Богачева M А , Шкурат Т П , Павлов Б H )

15 Влияние газовой среды, содержащей криптон, на эмбриональное развитие японского перепела // Труды XXXI академических чтений по космонавтике «Актуальные проблемы Российской космонавтики» Москва, 2007 С 483-484 (соавт Гурьева Т С, Дадашева О А, Павлов Б H, Павлов НБ)

16 Определение парциальных давлений криптона, оказывающих наркотический эффект на лабораторных животных и человека // Материалы VI конференции молодых ученых и специалистов, аспирантов и студентов, посвященной дню космонавтики Москва, 2007 С 33 (соавт Павлов H Б )

Благодарности

Автор выражает признательность д б н [Е П Гуськов^ - консультанту данной работы, НИИ Биологии РГУ под руководством д б н Т П Шкурат (за помощь в проведении биохимических и иммуноферментных методов), ООО «Акела-Н» и лично В Н Жданову (за своевременную поставку медицинских газов), научным группам к б н Т С Гурьевой (за совместную работу в экспериментах с японскими перепелами) и к м н А А Антонова (за обучение работе с программно-аппаратным комплексом «Типология»), а также всему коллективу отдела барофизиологии и водолазной медицины (ГНЦ РФ-ИМБП РАН)

Актуальность работы

В настоящее время бесспорной является возможность использования индифферентных газов (инертных газов, а также азота и водорода) в составе газовых смесей и сред при глубоководных водолазных спусках [Орбели, Бресткин, Кравчинский, 1944; Bond, 1963, Смолин и др., 1968; Fructus, Brauer, Dimov, 1968; Беннет, 1971; Генин и др., 1992; Семко и др., 2000; Баранов, Павлов, 2004; Смолин, Соколов, Павлов, 2003,2004,2005]. Так, при внедрении метода длительного пребывания в глубоководных водолазных спусках основным газом-разбавителем кислорода является гелий, с ним достигнута глубина 686 м [Беннет, Элиот, 1988], а с использованием водорода - 701 м. [Gardette et al., 1993]. Эти газы уже широко используются в практике создания искусственной среды обитания и для других замкнутых гермообъектов. Перспективным является создание пожаробезопасной среды в различных гермообъектах, включая космические корабли и станции, с использованием аргона [Pavlov, Buravkova, 1999; Солдатов, 2006; Павлов, 2006].

Помимо этого проводятся работы по внедрению новых методов лечения и реабилитации газовыми смесями, содержащими инертные газы. Являясь химически инертными, они, тем не менее, обладают широким спектром биологического действия. Уже сегодня можно говорить, что инертные газы -это новый класс нетоксичных средств, оказывающих на организм целый ряд биологических эффектов, которые используются в медицине [Лазарев, 1941; Павлов и др., 1995, 2006; Буров, Потапов, Макеев, 2000; Логунов, Павлов, Григорьев и др., 2006].

Так, использование кислородно-гелиевых смесей эффективно при лечении ряда заболеваний органов дыхания и сердечно-сосудистой системы, реабилитации после переохлаждения и физических нагрузок [Barach, 1935; Orr, 1988; Павлов и др., 1995; Куценко, 2000; Воль, 2006]. Применение кислородно-аргоновых гипоксических смесей (с содержанием кислорода 1015%) повышает резистентность организма человека и млекопитающих к гипоксической гипоксии и улучшает сон после психофизических нагрузок [Pavlov, Grigoriev, Smolin et al, 1997; Шулагин, Дьяченко, Павлов, 2001; Павлов Н.Б., 2006]. С помощью ксеноновых смесей возможна терапия бессонницы, неврозов различной этиологии, реактивных и абстинентных состояний, снижения болевой чувствительности. Ксенон на сегодняшний момент, кроме того, является идеальным общим анестетиком, однако его повсеместное использование ограничивается высокой стоимостью [Буачидзе, Смольников, 1962; Буров, Потапов, Макеев, 2000; Наумов и др., 2002].

Наиболее близким к ксенону по физическим свойствам элементом является криптон [Aitkenhead, Smith, 1990], но для его внедрения в медицинскую практику необходимо всестороннее изучение влияния этого газа на организм. При этом анестетическая сила криптона несколько слабее, чем ксенона, что может дать новый, более широкий, чем у ксенона спектр применения в медицине и реабилитации при нормальном давлении и обеспечить достаточную анестезию при повышенном давлении [Павлов, Куссмауль и др., 2005]. Кроме того, в перспективе возможно использование криптона в водолазной практике, космической и экстремальной медицине для создания безопасной дыхательной газовой среды с заданными свойствами в гермозамкнутых объектах и для проведения анестезии под повышенным давлением.

Несмотря на возрастающий интерес к этой области [Abraini, 2003; Preckel, 2004, 2006; Ma, 2007], механизмы действия инертных газов, в частности их наркотического действия до конца не выяснены. Настоящая работа посвящена данной проблеме, в частности поиску подходов к изучению биологических эффектов криптона.

Целью работы было изучение биологического действия криптона на живые организмы различных уровней организации в условиях повышенного давления. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи: 1. Создание экспериментальных установок:

- барокамеры длительного содержания биообъектов и водных животных под давлением в термостате и оптической барокамеры для макрофото- и видеосъемки лабораторных животных (лабораторных планарий, иглистых тритонов, плодовых мушек и др.) под давлением;

- термобоксов и инкубаторов для длительной инкубации яиц японского перепела в дыхательных газовых средах различного состава под различным давлением в отсеке барокомплекса ГВК-250;

- барокамерного дыхательного аппарата с замкнутой схемой дыхания для проведения исследований с участием человека в барокомплексе под давлением по изучению эффектов дыхательных газовых смесей, содержащих криптон и другие инертные газы, и автоматизированного дыхательного аппарата для нормобарических условий.

2. Определение пороговых величин парциального давления криптона, оказывающего наркотический эффект на различных лабораторных животных и человека.

3. Оценка влияния криптона на формирование органов и тканей:

- в процессе регенерации;

- в эмбриогенезе.

4. Исследование влияния воздушно-криптоновых сред и кислородно-криптоновых смесей на клинико-биохимические показатели крови животных и человека.

5. Изучение цитогенетических последствий инкубации лабораторных крыс в воздушно-криптоновой среде.

6. Исследование влияния дыхания кислородно-криптоновыми смесями при нормальном и повышенном давлении на электрическую активность мозга человека.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Биологическая активность химически инертного газа криптона на животных и человека проявляется в различной степени в зависимости от парциального давления и уровня организации живого организма; при этом видимых отрицательных эффектов на организм не отмечено.

2. Криптон в водных и газовых средах и смесях при повышенном давлении проявляет выраженный анестетический эффект на лабораторных животных и человека.

Научная новизна работы

1. Впервые применен эволюционный подход к изучению действия повышенного парциального давления криптона на живые организмы, и выстроен эволюционный ряд из исследованных объектов по степени их чувствительности к криптоновой анестезии.

2. Впервые проведены исследования, в которых полный цикл эмбрионального развития теплокровных животных (японского перепела) происходит в атмосфере общего анестетика (криптона и закиси азота).

3. Впервые осуществлено исследование влияния криптона, обладающего анестетическими свойствами, на образование органов и тканей как в процессе регенерации, так и в процессе эмбриогенеза.

4. Впервые проведены исследования с участием человека по изучению влияния дыхания газовыми смесями, содержащими криптон, при нормальном и повышенном давлении на электрическую активность мозга и клинико-биохимические показатели крови.

Теоретический вклад

Результаты данной работы могут расширить границы существующего понимания механизмов действия криптона и инертных газов в общем, а также наметить пути дальнейших исследований в этой области.

Практическая значимость

В лекционные курсы для аспирантов ГНЦ РФ-ИМБП РАН, студентов МГУ, РГМУ, ГКА им.Маймонида, курсантов ИПК ФМБА России включены данные о физиологическом действии криптона на человека и животных при нормальном и повышенном давлении, полученные в рамках данной работы. Результаты работы легли в основу обоснования НИОКР МО России по созданию подвижного гипербарического госпиталя с барооперационной, в которой для анестезии предполагается использовать криптон и ксенон.

Внедрение результатов исследования в практику

По результатам работы разработаны технические условия на медицинскую газовую смесь: ТУ 2114-028-39791733-2007 от 15.01.2007. Дыхательная газовая смесь «КрипОксА». Потапов В.Н., Жданов В.Н., Филиппов В.М., Потапов А.В., Волокитин Л.Б., Козин В.Л., Павлов Б.Н., Амиров P.P., Демидион П.Ю., Павлов Н.Б., Куссмауль А.Р., Тугушева М.П., Логунов А.Т. (Акт о внедрении результатов от ООО «Акела-Н» от 15.01.2007). Разработаны действующие макеты барокамерного дыхательного аппарата с замкнутой схемой дыхания под давлением до 10 кгс/см с применением различных ДГС на основе криптона, аргона, ксенона и автоматизированного дыхательного аппарата для нормобарических условий. (Акт о внедрении результатов от ЗАО СКБ ЭО от 19.04.2007). (См. Приложение А)

Апробация работы

Основные результаты и положения диссертации доложены на конференциях молодых ученых ГНЦ РФ-ИМБП РАН, посвященных Дню космонавтики (Москва, 2005, 2006, 2007); конференции «Гипербарическая физиология и водолазная медицина» (Москва, 2005); I Съезде физиологов СНГ (Сочи, 2005); XIII международной конференции по космической биологии и авиакосмической медицине (Москва, 2006); VIII всемирном конгрессе по адаптационной биологии и медицине (Москва, 2006); XXXI академических чтениях по космонавтике «Актуальные проблемы Российской космонавтики» (Москва, 2007). Диссертация апробирована на секции Учёного совета «Гипербарическая физиология и экологическая медицина» ГНЦ РФ-ИМБП РАН (протокол №3 от 13 апреля 2007г.). По материалам диссертации опубликовано 16 печатных работ.

Статьи:

1. Куссмауль А.Р., Богачева М.А., Шкурат Т.П., Павлов Н.Б.

Цитогенетические последствия в эпителиоцитах роговицы глаза мышей после их пребывания в воздушно-аргоновой среде // Авиакосмическая и экологическая медицина. 2006. №5. С.42-44.

2. Куссмауль А.Р., Богачева М.А., Шкурат Т.П., Павлов Б.Н. Влияние дыхательных сред, содержащих ксенон и криптон, на клинико-биохимические показатели крови животных // Авиакосмическая и экологическая медицина. 2007. №2. С.30-32

3. Куссмауль А.Р., Богачева М.А., Павлов Н.Б., Шкурат Т.П., Павлов Б.Н. Цитогенетические эффекты аргона // Сборник научных работ «Актуальные проблемы биологии». Томск, 2004. Т.З. №1. С.30-32.

4. Богачева М.А., Куссмауль А.Р., Павлов Н.Б., Шкурат Т.П., Павлов Б.Н. Влияние гелия на развитие Xenopus laevis Doudin // Сборник научных работ «Актуальные проблемы биологии». Томск, 2004. Т.З. №1. С.162-163.

Доклад

5. Павлов Б.Н., Павлов Н.Б., Куссмауль А.Р., Богачева М.А., Григорьев А.И. Физиологические эффекты газовых смесей и сред, содержащих ксенон и криптон // Научно-практическая конференция «Ксенон и ксеноносберегающие технологии в медицине - 2005» Сборник докладов. Москва, 2005. С.20-28.

Тезисы:

6. Павлов Н.Б., Куссмауль А.Р., Павлов Б.Н., Жданов В.Н., Потапов В.Н. Новые лечебные дыхательные смеси // Материалы конференции «Гипербарическая физиология и водолазная медицина». Москва, 2005. С.16-17.

7. Куссмауль А. Р., Богачева М.А. Направления исследования свойств газовых смесей и сред, содержащих криптон // Материалы конференции «Гипербарическая физиология и водолазная медицина». Москва, 2005. С.20-21.

8. Богачева М.А., Куссмауль А. Р. Влияние кислородно-ксеноновой и кислородно-криптоновой дыхательных сред на формулу крови, биохимические показатели и гормональный статус животных // Материалы IV молодежной конференции, посвященной Дню космонавтики и 10-летию со дня окончания сверхдлительного космического полета врача-космонавта-исследователя Полякова В.В. Москва, 2005. С.10-11.

9. Куссмауль А. Р., Богачева М.А. Влияние кислородно-аргоновой среды на цитогенетические показатели и формулу крови лабораторных животных // Материалы IV молодежной конференции, посвященной Дню космонавтики и 10-летию со дня окончания сверхдлительного космического полета врача-космонавта-исследователя Полякова В.В. Москва, 2005. С.22-23.

10. Куссмауль А. Р., Богачева М.А. Направления исследования свойств газовых смесей и сред, содержащих криптон // Научные труды I Съезда физиологов СНГ. Сочи, 2005. С.212.

11. Павлов Н.Б., Павлов Б.Н., Куссмауль А.Р., Жданов В.Н., Потапов В.Н. Терапевтические возможности применения лечебных дыхательных газовых смесей на основе гелия и ксенона в целях профилактики здоровья гражданского населения гарнизонов и специалистов ВМФ // Материалы научно-практической конференции «Медицинское обеспечение сил флота в условиях Кольского Заполярья». Видяево, 2006. С.165-167.

12. Куссмауль А.Р. Биологические эффекты криптона при повышенном давлении на тигровых планарий Dugesia tigrina в водной среде // Материалы V конференции молодых ученых и специалистов, аспирантов и студентов, посвященной дню космонавтики. Москва, 2006. Стр. 23.

13. Куссмауль А.Р., Гурьева Т.С., Дадашева О.А., Павлов Н.Б. Влияние газовой ' среды, содержащей криптон, на эмбриональное развитие японского перепела //

Материалы XIII конференции по космической биологии и авиакосмической медицине. Москва, 2006.

14. Pavlov N.B., Kussmaul A.R., Tugusheva М.Р. Main trends of investigation of properties of gas mixtures and atmospheres containing helium, argon, xenon and krypton // Materials of VIII World Congress of ISAM. Moscow, 2006. P.86-87.

15. Куссмауль A.P., Гурьева T.C., Дадашева О.А., Павлов Б.Н., Павлов Н.Б. Влияние газовой среды, содержащей криптон, на эмбриональное развитие японского перепела // Труды XXXI академических чтений по космонавтике «Актуальные проблемы Российской космонавтики». Москва, 2007. С.483-484.

16. Куссмауль А.Р., Павлов Н.Б. Определение парциальных давлений криптона, оказывающих наркотический эффект на лабораторных животных и человека // Материалы VI конференции молодых ученых и специалистов, аспирантов и студентов, посвященной дню космонавтики. Москва, 2007. С. 33. г Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, 6 глав собственного исследования, каждая из которых заканчивается обсуждением и выводами по главе, заключения, общих выводов, списка литературы и приложений, содержащих таблицы, фотографии, материалы по внедрению.

выводы

1. Химически инертный газ криптон в условиях повышенного давления (0,330 кгс/см ) обладает выраженным биологическим действием на животных и человека.

2. По величине парциального давления криптона, необходимого для обездвиживания и/или анестезии, объекты исследований можно выстроить в соответствующий эволюционный ряд: тигровые планарии Girardia tigrina (20-30 кгс/см ), плодовые мушки Drosophila melanogaster (18-20 кгс/см ), иглистые тритоны Pleurodeles waltli (14-16 кгс/см ), японские перепела Coturnix coturnix japonica (5-5,5 кгс/см2), человек (3-3,5 кгс/см2).

3. Исследованные концентрации криптона в среде не оказывают выраженного влияния на формирование органов и тканей как в процессе регенерации (лабораторных планарий), так и в процессе эмбрионального развития (японского перепела). При наличии токсического воздействия (гипоксия, аммиак) криптон в среде способен несколько нивелировать отрицательные эффекты этого воздействия.

4. Нормоксические газовые смеси и среды, содержащие криптон, вызывают определенные изменения в крови теплокровных животных и человека: а) при повышенном давлении у теплокровных животных и человека такие смеси и среды как правило вызывают увеличение числа нейтрофилов и снижение числа агранулоцитов (при нормальном давлении реакции менее выражены); б) суточная инкубация крыс в воздушно-криптоновой среде при избыточном давлении 0,3 кгс/см2 вызывает повышение концентрации кортизола и прогестерона и снижение концентрации общего тироксина и тестостерона, а также глюкозы и мочевины в крови.

5. Суточное пребывание крыс в воздушно-криптоновой среде при давлении 0,3 кгс/см2 не вызывает достоверного увеличения хромосомных мутаций и изменения митотического индекса, при этом соотношение фаз митоза изменяется.

6. Дыхание нормоксической кислородно-криптоновой смесью при нормальном и повышенном давлении изменяет электрическую активность головного мозга человека: а) при нормальном давлении у большинства испытуемых происходит снижение мощности а-, А- и 0-волн и увеличение р-волн, при этом в большинстве случаев при закрытии глаз сохраняются изменения электрической активности мозга, аналогичные изменениям при закрытии глаз в фоне. б) при повышенном давлении изменения электрической активности мозга во время дыхания кислородно-криптоновой средой однонаправлены с изменениями, связанными с пребыванием человека в воздушной среде под давлением (снижение a-, Pi-волн, увеличение А и 0-волн), при этом закрытие глаз (при отключении сознания) во время дыхания кислородно-криптоновой смесью не вызывает изменений.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, в рамках данной работы были созданы экспериментальные установки для макрофото- и видеосъемки под давлением лабораторных животных, специальные боксы и инкубаторы для длительной инкубации яиц японского перепела в ДГСр различного состава, барокамерный аппарат для проведения исследований влияния ДГС, содержащих криптон и другие инертные газы, на человека в барокомплексе под давлением. С помощью данных установок были определены пороговые значения парциального давления криптона, оказывающего анестетический эффект на различных лабораторных животных и человека, исследовано влияние криптона на формирование органов и тканей в процессе регенерации и в эмбриогенезе, на клинико-биохимические показатели крови животных и человека, на цитогенетические показатели роговицы глаза крыс, а также на электрическую активность мозга человека.

Результаты проведенных экспериментов показали, что биологическая активность химически инертного криптона в дыхательных газовых смесях и средах и воде на лабораторных животных и человека проявляется в различной степени. Криптон при парциальных давлениях, ниже анестетических, не влияет ни на скорость регенерации плоских червей, ни на эмбриональное развитие теплокровных. При этом следует отметить, что криптон оказывает некий протекторный эффект при формировании тканей и органов, механизмы которого пока не ясны.

В нормоксических газовых средах и смесях при повышенном давлении криптон проявляет выраженный анестетический эффект на лабораторных животных и человека, не вызывая видимых отрицательных эффектов на организм. При этом чувствительность к анестетическому действию криптона возрастает с усложнением организации нервной системы организмов.

Полученные данные часто являются неоднозначными и должны послужить отправной точкой для комплексного изучения свойств криптона и влияния этого газа на организм.