Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Биологическая роль суперантигенов, входящих в состав бактериальных и ретровирусных патогенов

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

На правах рукописи

УДК 616-006-097:612.017.1

ХОДЦЕВ АНДРЕЙ СТАНИСЛАВОВИЧ

БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ СУПЕРАНТИГЕНОВ, ВХОДЯЩИХ В СОСТАВ БАКТЕРИАЛЬНЫХ И РПТРОВНРУСНЫХ ПАТОГЕНОВ

(специальность 14.00.14 - онкология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соиск&ние учёной степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1993

Работа выполнена в лаборатории механизмов регуляции иммунитета (заведующий -профессор Б.Д.Бровдз) Онкологического Научного Центра РАМН (директор -академик РАМН Н.Н.Трапезников).

Научный руковрдитель: доктор медицинских наук, профессор Б.Д.БРОНДЗ

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, чл.-корр. РАН

Г.И.АБЕЛЕВ доктор биологических наук, академик РАЕН л. А. ЯРИЛИН

Ведущее учреждение: НИИ онкологии им.П. А.Герцена Министерства здравоохранения РФ

Защита состоится "J " 1994 года на заседании специализированного

Ученого Совета (К.ooi. 17.01) Онкологического Научного Центра PAMII (115478, Москва, Каширское шоссе, 24)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Онкологического Научного Центра РАМН

Автореферат разослан " 19эУгода

Ученый секретарь специализированного Ученого

Совета, доктор медицинских наук, профессор В.С.ТУРУСОВ

CDJ обпщЛ нгрс-р Т-.тамфощгтоз, иомпопгят Т-рецегггориого комплекса

CD1 мгргер Т-лпмфощгтов гилпгрной группы

COS г::ртер Т-гзагфоцлтсэ киллеров и супресеороз

BSV Kiprc Эпитейка-Барр

iL-a(3,4,3) пптерлепхппы

y-ira у-потгрфгрсп

niv-l гтп>уз гггауподгфяця» чалосгза

Г!ЛЛ сгнсрггтптгп 2íyce;?lasi:a arthritidia

tmC II «олгзула гстстлегез гпгтосоЕмгстимссти II слассз

iUTZV tspjre р^з мзго«то.1 гииги «ища

сл сугермтетеп

ЗЛО ГСП™/ ГСП С7Г?ГГ-ТП!ГгПЗ nrrv'

C2Ä, С~3, ■ С22, Т2ЭТ-1, SSC 1, а, 3 бактериальные суперантагены, гптсрвте^сгпи стг^пгагсогга

СПИД (ДХСЗ) еппдреи пммуяоифодгта чвяогега-вызываемый íiiv-i ?Л reste?, пкпоягягшД прямо г.аггро.тпрогать продукты реп ГСП Т-?гц:птор л:п.:фовдп>э, г:гп:ггп в комплексе с íihc

п24 п?е.1уз7 ггпа gag niv-l

ГСП '27Utni!ií3

V, с«рпгСаангя обягста (а гекц) а-цмга Т-ргцептора Vj сблгсть (п гепы) р-цгяя Т-ргцептора

Jj еезггтгггттг'-л лСлг.гп Д-ц;пл Т-ргцептсра С. езглстгггяшая область Д-цепи Т-рецептора

Введение

Актуальность проблемы. Суперантигены окгогеикых ретро пируссз играют важную роль в жизненном цикле вируса. Шгесто несколько примеров, когда их функция абсолютно необходима для выживания вируса в организме, что в конечном счете приводит к трансформации клеток. Наиболее швгетеи сулер&ктнген с;:руса рака молочной железы (KMTV), который является продуктом вирусного гена ORF5'LTR (по новой номенклатуре - sag-mmtvj и вызывает стимуляцию т-лимфоцитов, от которой зависит репликация и интеграция вируса в геном В-;ишфоцитов. Это создаёт пермиссивные условия для вируса в организме новорожденной мыши, зараженной с молоком и не имеющей развитых тканей молочных желёз, где происходит окончательная фаза интеграции вируса, приводящая к трансформации клеток этих ткачей.

Эта биологическая функция настолько доена, что существует вволюционно закреплённый механизм защиты, от действия суперантигека - такой же суперантиген, но в эндогенной форме, кодируемый геном проаируса, включенного в геном мыши. Такие провирусы дефектны и не производят инфекционных вирусных частиц. Однако функция гена sag сохранена и его продукт, вкспресскруемый с первых дней жизни мыши, приводит к делеции той субпопуляции Т-лимфоцитов, которая реагирует с суперантигеном. В результате не возникает В-кдеточного "резервуара", где вирус переживает до формирования тканей молочной железы и в таких мышах опухоли не развиваются.

Второй онкологический пример действия суперантигена - опухоли rcs в мышах линии sjl. Это в-лимфомы, рост которых зависит от лимфоки^пв (il-4, il-5, y-lFN) продуцируемых Т-лимфошггамн в ответ «а суперантиген, экспрессированный на поверхности В-димфомы. Он также кодируется геном из группы sag-mmtv и его экспрессия необходима для поддержания роста В-лимфомы.

Сейчас известно более двадцати разных суперантигенов из «той группы, как эндогенных, так и экзогенных / но существуют также суперантигены совершенно другого происхождения - бактериальные, такие как антеротокскны стафилококка или суперантнген микоплазмы. Они не гомологичны вирусным, но активируют Т-лимфоциты таким же способом.

Суперантигены представляют собой белки, функции которых в иммунной системе занимают место, промежуточное между неспецифической активацией Т-клеток и нормальным, высокоспециализированным распознаванием антигена. Их частичная специфичность обычно ограничена одним или несколькими Уд элементами (вариабельной части 0-цепи) Т-рецептора, с которыми ош и реагируют.

Суперантиген активирует нее (или большинство) Т-клеток, экспрессирующих

7г, что составляет от 2 до 10$ всех Т-клгток, и это с^гзягзт его спгллилй , епялулирующий эффект. При распознавании гтГ2ц:сс:^г~"п:ого гтгпггг^а слтягпрустся только 1 клетка из юо ооо.

' CjTüjsrmiríKU :::::стпы тгкгя cas Ув-сгл?:ггпг&>!5 элементы, потому что cm ргтхлруют с оггр^дгл'ипым участием v^-цепи иез&вкекмо от остальных гжк-'.:ятоз Т-р;г,лпсра. • CSsscft еггзываппя соответствует петяо cDR4 т-п псследсвзтсльмостямп 67 - 77.

Sto ess дга Cssrt?2'.sjüiaís супсргятпгеяов тал и для ретровирусных.

¡С-гхт'Д с.С\: :::о реггпругт с кескояьтагш разными v^, но сравнение

ях círr*i3nsroKtrí па гэзволгэт юдагэтггь о&цяЛ мотив,

спгцт:;^—п.г"5 ;>"" crnejsnrnrKti. Вопрос о мпяг:.«лы:оЧ структуре,

пгсЗлел^'гЭ дгл«гтт^тггегоеглзмзгкаа сулгрантагспа, представляется гесша кянгта,- nicarrr^ С12 гзачт.кааз атего пгшоггйсгзня нельзя разрабатьюать пептз па фею^згсуигргнтнгеков в организме.

Ojrnt^ari «зътгявггегза «лапе?» пзучг:ал гораздо ху;хе. Существуют г:;"'',':;ггг",Г1:"г-зГ';":-*-;зос: r-ensrrnra пск..*£у'"-»го ендогеиного суперантегепа íi г:с;цг"*;;с:;т;и:го с гирусом Эпштойиа-Барр (оба со

сг«»г:Сгг:ггл.гэ*^з> кс^;г?'ггпггтп».я.ссоцпя?сз.тй;югаси!ру<»мт-!тогнодсфишт Hiv-i (coc^crv^i^r-.gtrriroirVjis). Изгастотакясечтогптеротоксикы :::гут Сать г;.сг::л:о"; t¡rs!?Ai» ги-с.чггп-г.гспл согтсппй а наиболее ярким :™эм отего «yren? 'i' - cyn:?:.:mnr-.?:t гиялгаощгй еппдром токсического в»га (с: s t'£3).

Атг;г~-г.;¡гп/^—зтп 'гго до ciíx пор г.а существует точных

о cv¿¡~ry¿,3 0у.".";г-?.1гпггск-с;'л;!.1-''!с'щгй области Т-рецептора. Без гтзто ss "зтгяя позозкогпю создание вакцин и язпгг.-зЭтому вопросу

, 2з Т-ллмфсцятсз - супрессоров,

r.07x:vj:3 jresnro в мзх&гяма делеюп; Т-клегок, реагирующих с

ст стпсзгешия cnjysca, п|>5Д5т,*тру1са:кх сулсргнтпген. - В трет ей части работы псггг":пэ <тз;глг:-:г-п:5 гул;?^:гп!гс::а, ат?5язлпощего уровень репликации вируса яммуисггфдапа «амЬгзз (iiiv-'i) зТ-лзмфоцктах.

Целя п гглуге Г'аздсгаяа. Нгстаяв*гя работа посвящена исследованию »«хкнимоздгйгпш. cynípsirnirenoa 1:1 р-азккх уровнях: молекулярном, клеточном ü ккыистопг.о;!, сг.ргдгдлг' '.им с;гимодейгт£'ллм'л меязду функционально разными еубяслуляагл! и Т>л::?!£зцчтов. В соответствия с этим были поставлены следующие

вадачи»

1. Определить варианты ?! Т-рецеггтора реагирующегос суперантигеном (МАМ).

2. Определить аминокислотные позиции в структур« Т-рецептора, важные для его

взаимодействия с суперантигеном МАМ.

3. Получить клоны Т-супрессороэ И мучить условия'их взаимодействия с В-клеткамн (стимуляторами) и отвечающими пролиферацией СВ4+ Т-клеткам и.

4. Изучить уровень репликации вирус« иммунодефицита человека (Н1У-1) в Т-клетках вкспрессирующих разные варианты У;. ,

Научная новизна и прастгксхав ценность работ. В данной работе решён вопрос о дополнительном элементе Т-рецеатора, определеяющем его реактивность с суперантигеном. Кроме известного ранее эта реакция зависит от использования определенных элементов в составе Т-рсцептора. Определена аминокислотная позиция позволяющая V, сформировать "реагирующую" конформацию Т-рецептора, специфичную для суперактигена микоплазмы. Показано также существование Т-супрессоров, реагирующих с вндогенным суперантигеном. Иммунорсгуляторная функцнятакма клеток может приводить к делецин отвечающих на суперантиген Тгодмфрцнгов| т.е. участвовать щ защите организма от онкогенных вирусов подобных МИТУ.

Третьим важным результатом этой работы является демонстрация того факта, что репликация вируса иммунодефицита человека (И1У-1) в Т-клетках является V,-селективным процессом, т.е. различна в Т-клетках экслресскрующнираэные варианты V,. Это говорит об участии суперантигена, который активирует Т-димфоциты экспрессирующие уДа, *» способствует интеграции вируса в геном клетки и создав? условия дла репликации вируса в «той изолированной сурпопуляции. Такие клетки служат "резервуаром" вируса в организме и этот суперантиген-опосредованный путь атжааци!« Т-клеток может быть критическим втапом в распространении вируса. .

Апробации работы. Основные материалы работы изложены в 7 публикациях. Диссертация была опробирована на совместной конференции лабораторий иммунохимии, механизмов регуляции иммунитета и противоопухолевого иммунитета, состоявшейся 14 мая 199ЭГ.

Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, результатов и обсуждения собственных исследований и выводов. Работа изложена на 70 страницах, содержит • рисунков. Список литературы включает 132 публикации.

Методы псследояаняя.

Структура Т-рецгптора, реагирующего с суперантяггеном, изучалась с помощыэ полямеразной usraioft реакции (PCR), d которой в качестве праймеров кепояьзогалгсь о.тагопуглзотпды с последовательностью,' уникальной для данного sipnsim Vß Т-рсцептсрз. Продукты рсй изолировались в сектор ТА для опрадолоппя различий мвяду реагирующими и яереагирующимя посЕглкзгеЕьпсстяма У^. Зкспресетя продукта на поверхности клеток Т-клона поягггргс.З-':!» с сзпопй» anra-v^ мопсклспалыгых антител.

. Для - пзлзгташз псяпкпопзлыгах Т-клсточных линий человека,

eccirpytcrr.rr. с^пл гарг-от Vj Сь'л разработка метод селекции Т-клеток с аитн-:zrr.Tz::z:.'.:i' с r.v.cz'r.'.o кзпппгных частиц. Такие клеточные линии тгизлт-гсга.-::"*, ".тл :гргзе:zvs r::p'/cs-: ппмуподгфидагга человека (Hiv-i) и в явявх с пгокпфзрзззЗ з отсзт на B-ssanm больных СПИД.

- Ilrrcrr.r Т-супгггзврсз Снял получены адсорбцией гипериммуинзированных плотоп in лл.тогс!п:ш макрофагах и тестировались на подавление грг.г:ф*?а!д:п! я сСразсззтпи щхтотогсячесигх плеток в смешанной

З'ЛИУРЗ ™!^фОЦ12ТСЗ.

Результата.

:. Т-рз^стгога я cynepsnrcrcna.

3 рс'отз Сил получен и проанализировал набор Т-клонов

гпп'рпегетг плп из pisrnpy^netn с г~етгоргпп.1М супер антигеном микоплазмы Г?усс?1сс=з orthrltidls) - HVI.

, Т atcru тсстарсгзлпя» ¡12 акшоклопалыгость с помощью антител к vf-:r7rc:i7, а кглз ГСП с пепэлмзвзлпгм'^-специфических праймеров. Клеточные :ппп, ГГЛ.'^атс-'г.- мспкпогалтость была подтверждена, тестировались на -.z~r."::c?:*> с S Сетзрпзльпьп.::! супграптпгенамн. Кз них была получена кДШС, .аипфппрС™!! з "СП О прймерамп, соответствующими лпдерной области vß и пгау С£Ь, я п'глтгтглтг capnsirra были клонированы в вектор ТА. кппгепслэтпцэ псспг^зггтсльпосш, соответствующие клонированным v^-dj-сь !сдстамггш на рпг. 1.

Т япелы чглсегг-а, рмтпрумпшз'с МАМ, могут вкспрессировать 5 различных :псз 7г rc::03t y,s.i, v^.2, v^.i-a, v^ia.a n v^.i.

3 соотгзтст::::! о теп, кап emi роагпррот с другими супераотпгенами, их

HAM J,

■37 5.1 CASS LSAORADTQ Y ГС + 3.3

■10 8.3 CASS AISYTQ Y TO + 3.3

■59 8.3 CASS OGGVYEQ Y Гв + 3.7

Н17 17.1 CASS IIXJETQ Y TO + 3.S

■36 13.3 САХ 8AGEETQ Y TQ + 3.5 .

■76 9.1 CASS PGTGGWCEQ Г Гв - 3.1

W5.1 9.1 CASS LNGRMSSYNEQ Г ГО • - 3.1

CL30 8.1 CAS XTGAGVGMEQ F fl - 2.1

83-И 8 CASS SGLACPNEQ F FG

J17 17.1 CASS DDKGSYNEQ Г Гв - 3.1

»89 13.3 CAX HSKT8GPIPSYNEQ f fg - 3.1

ml(17/25) 8 CASS . F8HEQ V ГС 8*L 3.7

1-3,6,« 8 CASS PWEETQ YFO SZL 2.8

3-6,7 8 CASS PASySYEQXrO IIL 3.7

2-1,7,10 17.1 CASS ISECTGENTQ Y FG SEL 3-3

4-9,10, IS, 30 17.1 CASS XFGQNYBQYFQ SJSL 3.7 8-4,7 5 CAS PQAGYEQ Y F6. ffEL 3.7 .

Рис.1. Аминокислотные последовательности Dfi - 3fii l. Т-клонов, реагирующих с МАМ {+), 3. Т-клоиов, не реагирующих с МДМ (-),

3. Доминантных клонов, седектироишних стимулациев МАМ (••!■).

- б -

можно разделять на две группы! Т клетки несущие » 1 и . 1-2 также хорошо реагируют с СЕЗ, но пв с другими тестированными суперантигенами, а вхспрессярующпз чр.2, ^12.2 или У^17.г специфично отвечают на ЭЕС1, 8ЕС2, ЙЗСЗ (ряг.з).

Дм иадого аз перечпсенных вариантов У(, исключая чр.г, был найден из ргггпрутощпй с МАМ слои, тая и пз реагирующий. Предположение о том, что гаргггпругзщпз еязткп гхспрвсепрумт мутгптныЯ или аллельный вариант v, послуяплэ оепоггпягм для сг.глпга их гетпогаслотных последовательностей. Если бы тггоэ прг^пэ.тогггнпз сягзалось вгряым, сравнение различий помогло бы кгртпрсглтп» сз-псг'птпгсп-сгязигакщсго участка на 0-цегш Т рес;пт"з. К созаяггспэ, посяздогательпоста а Области V/ оказались идентичны. Это пслтрггх*тг прсг.гтг-"-"^ о тс:!, что другпе компоненты Т рецептора (кроме Уц), г~гут 7т::стт,огпть го к^глолгйстзпл с'суперантигеном.

Сг-^г.тспггз пегстдсгэтельЕостсй СЪ-иЬ показывает, что только одна еют:сЕ:глэтз, а (V), с-тед/тсщий за глутамнном СО), мо;хет

огргдееть рг^пппу з сзипклка супгралтпгена. Этот тирозин расположен в оепг^сппз пгтпз СГ?Л п, согмззгпо, принимает участие в образовании водородных гспкД, сптегдтисгт гз^годойггтпо с молекулой МНС II класса или

с МНС II гаггется весьма вероятным, потому что гттглл ССЛЭ з р::пс:т::п;г1пл прецгегирозгппого пептпда в комплексе с

МНС II. Прз ргспсспмотт ггепткдпых ¡пгшгснов определённым Т-рецептором, крпаят .(лсгус а МНС, пятользугмкй для презентации весьма важен;

этготсриа ея.и.тг5'сгвясвЗяы прггсгаиггь аиткген.в-форме, необходимой для кгкиздйеткп с -1Т рсцзптером, тогда кал Другие образуют реагирующий гсг-тггтс, что прпго^пт з егпкацпи Т клетки. Этот феномен получил название МНС-ргступзи^!. Дгя тс го тгсЗ:л ггрспсрггь, не сзязано ли отсутствие реггпгпзстп МЛМ-пЗуггтгруюЕЛя егопэз с подобным' эффектом неудачной тргистгют супгрзп'гагспз, . Сиял протсстпровмш 5 линий человеческих В-гакфсм. Во сса еяута!»'риетпкэяъ Т-плопоз с тремя суперантигенами была етя^егой (рпс.З). Нгзгггсггю оттого, икая ксябкула МНС использовалась для тр5;:птагпз» Т-^бпы/пзрсггаруяаатэоМАМ, остались нереагирующими, что тзггслгз? ггптагь дантй вроиссе'ристпкюсгп.плп кереактивности не-МНС-

Дгл того, что С ы поягптп» бояго позяуи пафоркацию о структуре оь-лть ::п:спз, спгтаи^иой дая «азыкатя .суперайтлгспз, была проведена селекция 1Гсг:о.т1™г: погз^коззлшък Т-пязтотпых псппЯ с помощью ряда последовательных гта.'улггцла супзргипггепом МАМ. Апглйз--полученных последовательностей

г 7 т

т- клон 8 ЕЛ 8Е8 БЕЕ Т88Т 8ЕС1 6ЕС2 8ЕСЗ КАК

в27 ++ +++ +++ +++ -И- •И-+ ++ 5.1

В76 + + +++ ++ _ ++ м 9.1

в59 - - +++ + - - V +++ 8.2

В10 - - +++ - Г +++ 8.2

62-М +++ +++ + - ' ♦ . - ' 8.

С130 +++ ++ +++ ++ ++ 8.1

В2б ++ +++ - ' + ♦♦♦ ++♦ 12.2

В89 - - : - + ■ ++ ++ - 12.2

N17 ++ +++ - - ' - +++ 17.1

Л7 ++ - ' - ♦♦♦ 17.1

вЗ +++ ++ + +++ . 7

В19 +++ + - - ■ '• ♦♦♦ 7

81-М +++ + ++ - г - •. 13.1

П45 ++ V ++ - 13.2

В9б ++ - - '. ♦♦ : * - • 13.2

Н2 - +++ ++ - - 2

вюо +++ - . +++ + - .'■ - ' - 18

Рис.2. Про.шфератианый ответ Т-клонов на бактериальные суперантигены.

Количество плюсов соответствует концентрации суперантигена при которой клон

включает н'-тимидин »

"+++" до 10"4 пд/я1

в++и до ю"' пд/п1

»+« до 10"' пд/я1

не реагирует (меньше чем 2 фона)

ЗЗббР

,'лага . - . 51сэ ,28

«Г г« •»

улор Г клал]

5X2

МАМ 1 - -Ъ1С?. Д'Л 5ГЕ 5 -

,.:з12 {

АУШ V41

♦ 5ХС2 ■ 51« I

Л1АА173 '

кЩЗЯ'." уьз }

А1ллг угг-?пз

♦ 51С2

/лм%5

- КСЗ Ч

5И ¡223

. МАЛИ » 5ЕС2 *

Л.-

1РЯ

Ркс.З. Презентация МАИ разними аллелями МНС не изменяет паттерна реактивности Т-хлоноз.

ixо ■ )sbo эЧооа

количество клеток Т-супрессоров на лунку

Рве.4. Подававши генерация цвтотокопесиз клеток клопом Т-супроссоров, la vitro, в смешанной культуре лимфоцитов ВАЬЦ/с anti АЯВ.

# ю'/лунку клеток-мишеней BW5147, меченных »ромом-51 ■ 2Х101 мишеней

показал, что стимуляций приводит к появлению доминан+ных клонов, т.е. некоторые последовательности часто повторяются, что свидетельствует об их селективном преимуществе.

Интересующая нас позиция во всех доминантных клонах была представлена тирозином. Количествопроанализйрованпыхпоследователыюстей (142) позволяет считать эти датшэвесша репрезентативными. Другие закономерности, такие как длила петли скгз пла аминокислотная композиция других ев участков также могут был предметом обсуждения при спализз Db-Jb последовательностей отобранных стамулгцпзасупераотпгеиом. D этом смысла использованный метод (определение поспадоззтглькостеа из нормальных' Т клеток) обладает несомненным преимуществом перед традиционным направленным мутагенезом и трансфекцией Т гпбрндом, посгодькуестестЕггшьхймгхгтпмрекомбингщпшредставляетмножестЕо сгркапти Т-рсцептора, реально существующих а организме. Исследования с поиощкэ мутагенеза часто приводят к неогтдаппым результатам, ео многих случаях Ьзкапеяпз а самых разных участках Т-рецептора влияют на его связывающие СЕо2стпа d отношении шпигепа или суперантигена, по-видимому нарушая его когпсзпепш закрепленную трстачиую структуру, точнее ограниченное множество этих стррггур. Эти данные привели д представлению о "жидкой структуре" Т-рецептора. Найденная в этой работе позиция татке не является частью суперг1гп!ген-связывающег0 участка, но вероятно влияет на его информацию. К согсалепнго, Т-рецептор псЗ ещЗ не был кристаллизован и можно только предполагать, как осуществляется взаимодействие между этими двумя участками. Компьютерная модель, построенная по апалогии с известной структурой иммуноглобулина, показывает близость нашей аминокислотной позиции к суперплтпген-связывающему участку.

Лллогепзшо Т-супрссотры, реагирующие c'Hlo.

Т-супрессоры, индуцированные паюриммунизацией аллореактивными клеткши, адсорбировались па слое ' облучйнных аллогсшгых макрофагов (ггплотапа, использованного для иммунизации) п затем выращивались в качестве нормальных (не трансформированных)' Т-клеточных линий в присутствии шггеряеЛкппа-2. Клспм были получены методом лимитирующих разведений.

Полученные клопы обладали фенотипом: Thyl+CD4-cD8+LFA-i+. Добавление клеток-Т-супрессорного ¡слома в смешанную .культуру лимфоцитов вызывало антагеп-слецифичечкоз.подавление пролиферация. Эффективность этих клеток Сила очень гысокой, в несколько: опытах было-показано, что они

- 1Q -

подавляют пролиферацию при соотношении между супрессорами и отвечающими клетками (респондерами) 1:1000. Супрессорная функция Т-клонов проверялась также в тесте подавления генерации цитотоксических лимфоцитов in vitro. Они успешно подавляли образование аллоантигенных (распознающих МНС) цитотоксическихТлимфоцитов (рис.4). .

Разные варианты отвечающих и стимуляторных клеток использовались для более детальной характеризации Т-супрессоров. Наиболее интересным оказался Т клон, полученный из мышей линии BALB/C после иммунизации их клетками селезенками линии AKR (клон ВА686). Супрессия, вызываемая клетками «того клоне, была антиген-специфичной и МНС-рестриктированной (рис.5). Дополнительные активности этого клона были обнаружены когда в качестве отвечающих клеток использовались клетки мышей линии DBA 2. Они не отличались от balb/c в локусе мнс, это тот же h-2d, важное различие связано с другим локусом-Mls. При добавлений Т-супцессорного клона в смешанные культуры такого типа супрессоры не проявляли обычной специфичности, они подавляли реакцию на H-2v и Н-2Г также как на Н-2к. В состав Т-рецептора этого клона входит продукт V;8.i, который, как известно, реагирует с И1в-1в. Различие между днииями DBA2 и balb/c, по-видимому определяющее наличие или отсутствие специфичности, заключается в том, что первая акспресснрует сК1а-1а, а вторая - И1в-1Ь.

Приведенные данные показывают, чтоТ-супрессоры могут подавлять функции CD4+ клеток, экспресснрующих М1в. Существование Т-супрессоров, реагирующих с эндогенным суперантигеном наводит на мысль, что Такие супрессоры могут быть частью механизма делеции CD4+T клеток. В организме, где все клетки вк(прессируют одинаковые МНС, CD4+T клетки и Т-супрессоры могут реагировать с одной и той же В клеткой на поверхности которой представлен суперантигеи (рис.6). Такой комплекс из трСх клеток может быть достаточным условием для того, чтобы осуществить функциональное взаимодействие между Т-супрессорной клеткой и cd4+T клеткой. Необходимым условием будет экспрессия реагирующего с суперантигеном V, обоими типами Т клеток. В результате должна наступать анергия, а затем делеция CD4+T клеток несущих реагирующий Делеция же является важной частью реакции организма, направленной на защиту от активирующего дейсатия суперантнгена, что чрезвычайно важно при тех патологических состояниях, которые суперантиген вызывает.

Суперантиген, ассоциированный с BIV-1.

Наиболее ясным свойством каждого суперантигена является его V,-

сэ4+ 7кл«тка

:îi

см+ Тметкл-\

CvnPfiCCOP

Инщ

Рис.6. ВозмояниЯ механизм Mit-ассоциированной супрессии в реальном организм».

Thousands

1'ис. 5. Подавление пролиферации б смешанной культуре кшфоцитоо супргссоррi клопа ВА 686. . D без супрессоров ÏÏ ю3 клеток ВА 686 на 1 лунку

а - BAI В/с (îîls-lb) , Ь - DBA 2 (MLS-la) , С - SJL (IILS-lb)

селективность, поэтому дл* проверки "суперантигенной гипотезы" была поставлена задача сравнить эффективность репликации вируса в Т клетках, зкспрессирукнцих разные Vj продукты. Дли того чтобы оценить суперантигенный эффект, связанный С HIV-1, мы разработали метод получения Т клеточных линий, экспрессирующмх только один варкам. v<( отобранный с помощью моноклональных антител (рис.7).

Это истинно поликлональные клеточные линии, в которых случайным образом представлены разные варианты V. н других элементов Т к: точного рецептора, но тольхо один вариант V0. Свойство поликлональности позволяет предположить, что разнородность клеток внутри каждой такой клеточной линии делает ей статистически схожей с другой, зкспрессирующей другой Vj. Таким образом можно считать, что íth два (или более) разнообразия Т клеток отличаются только экспрессией v¿.

Продукция вируса в культурах оценивалась по количеству вирусного белка р24 (продукт гена gag) с помощью имМуноферментного метода. Все протестированные кудьуры содержали р24 и, соответственно, были заражены Hiv-i, но количество р24 существенно отличалось и коррелировало с экспрессией V¿. Наиболее значительные различия были получены при сравнении Т клеток, экспрессарующих V,12 (8511+) vt6.7 (ОТ145+), первые всегда производили больше р24, в некоторых случаях более чем в 100 раз (рис.а). Т клетки, экспрессирующие v(i7 (С1 ♦ > или VjB (Tila*) были способны поддерживать промежуточный уровень репликации вируса, но есв же значительно ниже чем V¿12+. Активация Т клеток на является необходимым условием дм процесса заражения клеток, но способствует интеграции ДНК-вируса в геном клетки и значительно увеличивает уровень его репликации. Наблюдая различия в продукции вируса, можно предполагать, что:

1. Т слетки с фенотипом V¿12+, CD4+- могут быть активированы суперантигеном, продуцируемым или индуцируемым hiv-i.

2. Т клетки с фенотипом Vf6. CD8+ содержат клетки, способные ингибировать продукцию hiv-i в coa* клетках.

Дня того, чтобы проверить какое из двух предположений верно, из исходных линий с помощью магнитных частиц были получены V,12+, CD4 + и V{6.7, CD4 + клеточные линии. Восстановить репликацию вируса удалением CD8+ клеток не удалось, клетки по прежнему продуцировали наименьшее количество р24.

Этот результат показывает, что только CD4+ клетки определяют v^-селективность вирусной репликации. В культурах, куда были добавлены моноклональные антитела к МНС II класса, продукция р24 была подавлена на 80%. Это согласуется с тем, что для презентации суперантигена необходим МНС.

Можно было бы предполагать, что v,6.7+ клетки имеют дефект, не позяоляюшин им поддерживать репликацию вируса, и тогда гипотеза о активации

•rctiutv цоилоюш i йоннвао<Ьияо1Г03-ая шионо^'эвд

О 5 10 15 20 25 30

I 1 I'" -г-

0 5 10 15 20 25 30

днн в культуре

/НС.а. Продукция бели р24 mv-l) в куяьтур« Т-клеток с ридичньиш ^-фемотшшш.

Г клеток суперантигеном оказывается несостоятельной. О том, что aro не так, говорят данные опыта с активацией . Vt6.7+ клеток комбинацией фитогеманшпотинина и форболмиристацетата. В таких Т клетках репликация гаруса восстанавливается до уровня реплшсацил в V#12+ клетках.

СтимуЛяторный эффект суперантигена может быть протестирован на-Vj-селектированных клетках. Проблемой такого - вксперимента будет источник суперантигена, поскольку сам вирус обладает способностью подавлять пролиферацшо Т клеток. Для того, чтобы обойти эту проблему кз Ероиз больных (HIV-1+) были выделены В клетки, облучены и ссаользошш в качество стимуляторов. Такие клетки не содержат значительных Количеств спруса,со ш их поверхности должен присутствовать суперадукген Ь ассоциация с MHCII, поскольгу они являются эффективными антиген-презгатиругаодас: плотшш. ДеСгтситсльпо, стимуляция V^12+ клеток была более эффективной чем клотог (рис.9).

В организме мыши суперантигены 1DITV' пызыслот езлзцпю Т клзтоз, несущих реагирующие V». В культуре они стимулируют те по клгтЕИ, шзыбм кх

'9

пролиферацию. Мы проанализировали v^-репертуар дзсеолшхх hiv-l+шщивидуумов на разных клинических стадиях прогрзсска бояззпи с псмоиио 11 моноклональных антител к продуктам Ve и V¿¡ (что преястшшзт скало 305 схго репертуара) в CD4+ и CD3+ популяциях. Нп одна кз npoanasgsíipoc^niin ve-субиопуляций не была увеличена или делетирошша. Поетспазхаа по пюйрзтаггя гибель CD4+ Т клеток не является у/з-сеясспшьш процзссоьг. Е::олопгчгст!й смысл различия между двумя ретровирусиыми cyn3paarcrc::ün¡ uoxzsr С'^титои, что эти два вируса инфицируют раз низ клугги. peisjsytpou kitv. езллхясз Б клетки, поэтому велсция Т клеток пз протамрвчаг'сграгсгал вируса, пгарсяггкаой на выживание. В случае l-iiv-l делецияТ клеток, в которых пропекал1 пгпСолзз активная репликация вируса, приводила бы к исчезновении ванСолзэ салгапз источника вируса в организме.

Зашпотепиз.

Суперантигены являются белками, биолопгчзскаа 'фушщка которых -и: гииировать Т-лимфоциты окспресирующие опреаглёшшз варианты Vj «»ivirra ■ Т-рецептора. Область связывания cynepairruren была лошшзокка в пзтлз CD?. 4 v^ Т-рецептора, однако некоторые Т-клстки, пзеущиз "рзехпрующпй" Ve ccü se' не могут быть активированы суперантигеном. Эти дашые прльгш; г. прздетгхлгнпю о том, что второй элемент Т-рецептора моя:ет опргдзлять конформацпо vt необходимую для сиязыва^ы суперантигена. В представленной работе етот аламзнг

ОТ145 SSII

D Q3

я

a

Nl(«I CDJ

I «

iaL

XL

HIV» HIV* HIV* HIV» AIOS AIOS AIOS

Рис.191, в клетки из крови НШ-1* индивидуумов лучи» стмнулируот УЬ12*Т клетки Ч«М В&6.7+Т ХЛвГКИ.

<лд) (¡ыл найден и локализована аминокислота (тирозин вместо фенилаланина) которая определяет реактивность Т-рецептора с супераитигеном мнкоплазыы.

Активащш Т клеток суперантигенами приводит к бурному размножению клеток экспрессируюших реагирующие У^, и затем, кпх дзлзщга. Механизм втоЯ делеции не совсем понятен, поскольку ретрошхруспыз супграитегскы из шотдаругат образования цитотокснческих Т лимфоцитов и, вероятно, требуют участия молекулы С04+ для активащш Т клетки. В данной работа пзкян», что идаш Т супрессоров с фенотипом ссз+ могут реагировать пасндогсиплЛ сулгралтагса дах;з в том случае, когда ои представлен на поверхности Т кхстог в псззслэтъ их пролиферативный ответ на аллоантигеи.

Процессы, регулирующие рсшщкацшо в Т сгулах, прг^этм^гют

большой интерес для медицины как ключевые процзсси,. сисш&аам с котср-з можно остановить или предотвраипь инфекций/ ккшгдацу» сргыззт его иммунитета. Репликация вируса с Т клетках обладаетсеойстесм Уе-сз.~;;т;а:;зс,П!, т.е. существует определенный Уе фенотип Т елзт02, с кстери« с;:з ккдагголыго более эффективна. Это указывает иа роль супгралгагсаа,'потери.', по-ездпмсуу участвует в активации этой субпопуляшш Т клзтог. что егтнгатм Т

клеток способствует интеграции вирусного гепома в гепем и угас;?]:;;;т

уровень его репликации. Природа супгргиггкгеш, сссац^лрсзахюто с [Ц\'-1 неизвестна, но можно предполагать, что оп азллзтея п-их^злрезалш&г Сзлгсм Н1У-1, либо продуктом иного широко распространенного ачглгззчзсцсЗпзпуглцгш вируса, например еву.

Вывода.

1. Показано, что существует второй елсмснт Т-рсцзгпсра, опр^гдзллюае;;! реактивность злеыеота V/? с супсралтпгслом. Да супср:ЕТПг«:з м;:::сплаз:-:ы (МАМ) найдена аминокислотная позиция (кодируемая ДЬ), скрс^з.г.г.зхтл Оу^зт пи МАМ активировать Т клетки, насущна Уе12, У£0, Уг5.1. Ьтот £фф:;г "запрета" или "разрешения" реакции с супораптпгсноа пз сгяйзтсг МПС-рсстриктированным.

2. Т-супрессоры с фенотипом сбз+ могут : эдаишъ фуквдгз кзте», экспрессирующих эндогенный супераптаген, если опи (Т-супрзссоры) о Слада; от реагирующим У/3 (например У„8.1 для Н1вга). Этотмсхашзн кагвт бал»часто механизма делеции реагирующих с суиёрантигеноы елолоз, т.е. 'ключззым механизмом сзщтцающи^от онкогенного ротровпруса.

3. Вирус иммунодефицита человека, 1114-1, продуцирует или индуцирует суперантиген, специфичный к VflZ^ Биологическая роль итого суперантигена заключается в том, что си активирует репликацию вируса в Т клетках, несущих У,13, создавая в организме постоянный источник Н1У-1.

Список работ, спубдпговддшд по те»:з дяссе/ш^«

1. Ходцев А.С., Апасов С.Г.

Получение • интерлейыш-записимой аллорсагшькой кпн;:: Т-супрессорсз. Иммунология. 1983, Н2, с.36-30.

2. Chervonsky A.V, Filatov A.V., Su:!ov А.Р., Isskova V.R, Apasov S.&, Hodtsev A.S., Orlova E.A., Tcnsvltsky A.G.

Monoclonal antibodies to rcurlna specific T-$upro$5or»: vwicr.ts, tnterectlwi v/llii T-iub;at, reactivity pattern, Iromunotoxla Fcdsrotlcn Prcoacdir.yS, 1213, v.4S, Ы-i, p.E31.

3. Hcdtsev A.S., Kushnlr N'.V. fv'Is-ssicclstvd suppccsilen. 7 Ir.i. Cor.j-s:» of l;,^-,elegy (Berlin) 1933, p.324.

4. Friedman S.M., Crow M.K., Tttnang J.R., Tu,r.cng te, Xu Y, A.S., Cc!j B.C., Posnott D.N. Characterization of human T cclls rcictlvo with tlia i.:/rcp!as~.a a".lirltldis-derived Supcrantlgsn (MAM): Generation of a monoclone! antibody cj-.i.-.it VfJ7, t!:c: T csll rcccptor geno product Expressed by e I erg: frsctlcn of MAi.rr;;;Siv*a l-L^in 1 cclls. V.Exp.Med. 1991, v.174, p.£91-SOO. '

5. Laurence J, Hodtsov AS, Posnott DN ■

Supersntlgcn Implicated indop;ndsncoof HIV-1 replication In T ceil: en JCRVt схргсяЮа Nature, 1032, vol.358, p.255-259.

6. Posnott DN, КеЬгк S, Hodtsav SA, Goldb-rg EA, Atu"i A.

T-ccll antigen receptor Vp subsets aro not preferentially c':bud in AIDS. AIDS 1993, 7: 625-631.

7. Hodtsov AS, Bhardwaj II, Posnatt DM

T call rcccptor Jt element determines reactivity with tupwsntlg;n. Science 1S33, в пзчати.