Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Бактерии рода Rhodococcus

ГЕ Ой

лГ РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК - & ДСП Ш' УРАЛЬСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ

ИНСТИТУТ ЭКОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ МИКРООРГАНИЗМОВ

На правах рукописи ИВШИНА Ирина Борисовна

БАКТЕРИИ РОДА ¡ШОООСОССШ (иммунодиагностика, детекция, биоразнообразис)

14.00.36 - аллергология и иммунология 03.00.07 - микробиология

ДИССЕРТАЦИЯ в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук

Пермь, 1997

Работа выполнена в Институте экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН, Пермь

Официальные оппоненты:

академик РЭА, доктор медицинских наук, профессор С.Н. Теплова доктор биологических наук А.И. Саралов доктор биологических наук Л.П Терехова

Ведущая организация: Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН

Защита состоится « » декабря 1997 г. в ^ час. на заседании специализированного совета Д-084.04.01 в Челябинской государственной медицинской академии (454092 Челябинск, ул. Воровского, 64)

С диссертацией в виде научного доклада можно ознакомиться в библиотеке Челябинской государственной медицинской академии

Диссертация в виде научного доклада разослана « ^^ » ноября 1997 г.

Ученый секретарь специализированного совета, A.B. Зурочка

д.м.н., профессор

Принятые сокращения

ДАПК Диаминопимелмновая кислота

ИМВ Институт микробиологии и вирусологии АН Украины

ИНМИБ Институт микробиологии АН Белоруссии

ИЭГМ Иист1ггут экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН

МПА мясопептонный агар

МШ< минимальная подавляющая концентрация антибиотиков

МТБЭ метил-трегичнобутиловый эфир

нМФА непрямой метод флуоресцирующих антител

РА реакция микробной агглютинации

РИ реакции иммунодиффузии в агаровом геле

СЖА сахарозо-желатиновый агар

ПЦР полимеразная цепная реакция

MSDN Международная сеть данных о штаммах микроорганизмов и клеточных линиях (Microbial Strain Data Network)

NCIMB Национальные коллекции промышленных и морских бактерий (National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited)

WDCM Всемирный центр данных о микроорганизмах (World Data Centre for Microorganisms)

WFCC Всемирная федерация коллекций культур (World Federation for Culture Collections)

B. Bacillus

D. üietzia

Der. Dermacoccus

G. Gordona

К. KoLnria

M. Micrococcus

Ps. Pseudomonas

R. IViodococcus

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Разрушение биологического разнообразия идет катастрофическими темпами. По данным Лондонского фонда международного законодательства об окружающей среде (Sands, 1994), если непрерывные потери видов будут идти с той же скоростью, с какой они идут сейчас, то в последующие 25 лет будет уничтожено 15 % видов на Земле, при этом к 2040 году будут исчезать ежедневно от 20 до 75 биологических видов. В связи с этим одним из важнейших направлений биологических исследований в настоящее время является изучение биологического разнообразия и поиск путей его сохранения (Convention on Biological Diversity, 1992; Global Biodiversity Strategy, 1992).

Возникшая на пороге XXI столетия угроза потери природных ресурсов Земли ставит на первый план задачу гарантированного сохранения генетического пула микроорганизмов и их многообразия для будущих поколений. По оценкам специалистов, прекращение деятельности микроорганизмов означает гибель всей жизни на нашей планете в 4-х дневный срок (Калакуцкий, 1993). Несмотря на глобальную незаменимую роль микроорганизмов в земных экосистемах, до настоящего времени описана лишь малая часть (менее 5%, в частности для эубактсрий около 1% видов) действительного разнообразия микроорганизмов (Bull, Hardman, 1991; Hawksworth, Colwell, 1992; Amann et al., 1995). Один из наиболее эффективных способов сохранения микроорганизмов, особо важных для экоце-нозов и хозяйственной деятельности человека, - их поддержание в микробных коллекциях, имеющих значимость для фундаментальных научных исследований и развертывания новых биотехнологических производств. Грядущее столетие, обещающее быть веком экологически чистых технологий, непременно потребует вовлечения в сферу практического использования все новых групп микроорганизмов. В связи с этим на рубеже XX и XXI вв. во всех странах мира наблюдается интенсивное формирование децентрализованных банков живых культур, период ренессанса коллекционного дела и становления биоинформатики. В нашей стране работа по выполнению Конвенции о биологическом разнообразии в области коллекционного дела и биоинформатики проводится в рамках ГНТП РФ "Средства обеспечения исследований по физико-химической биологии и биотехнологии" по направлению "Коллекции биологических объектов - культур микроорганизмов, клеток человека, животных и растений" и ГНТП РФ "Новейшие методы биоинженерии" по направлению "Биотехнология защиты окружающей среды". Основная цель проектов -формирование децентрализованных отечественных коллекций, отвечающих потребностям пользователей, создание банков жизнеспособных культур и банков данных об этих культурах, которые будут представлять специализированные узлы общей сети взаимодействующих по единым правилам коллекций в стране и за рубежом.

О несомненном возобновлении интереса к деятельности микробных коллекций свидетельствуют меморандум Международных союзов биологических наук и микробиологических обществ "Микробное разнообразие 21" (Microbial Diversity, 1991) и, как следствие его, разработка приоритетной Международной программы "DIVERSITAS" (Haks-worth, Aguirre-Hudson, 1994), в которых обозначено, что сегодня более интенсивно должно вестись изучение микроорганизмов, связанных с деятельностью человека и участвующих в восстановлении затронутых этой деятельностью экосистем; особое внимание должно быть уделено группам микроорганизмов, имеющих функциональное значение для биосферы и экосистем; инвентаризации известных видов и активной ревизии состояния микроорганизмов в природных микробиоценозах; созданию специализированных региональных центров и информационных сетевых сообщений.

Актуальность проблемы. Одной из таких эколого-трофических групп, ведущих окисление природных н антропогенных углеводородов и таким образом участвующих в биогеохимических процессах биосферы, формировании безуглеводородной атмосферы Земли, являются бактерии рода Rliodococciis, принадлежащие к актиномицетно-нокардиоформной линии эволюции прокариот. Обнаружение среди родококков способности аккумулировать молекулярный азот в присутствии н-алканов дает основание предполагать о древнем происхождении углеводородусваивающих азотфиксаторов и их полезной роли в поддержании азотного и углеродного баланса в природе. Они постоянные и доминирующие компоненты естественного биоценоза нефтяных загрязнений, в связи с чем очевидны целесообразность и необходимость использования определенных видов алканотрофных родококков в системе мониторинга углеводородного загрязнения биосферы и для очистки нефтезагрязненнык территорий

Особое место среди алканотрофных родококков занимают представители, биохимическая уникальность которых - способность ассимилировать в качестве единственных источников углеродного питания газообразные углеводороды (пропан, н-бутан). Синтезируемая ими ферментная система обладает широкой субстратной специфичностью и катализирует реакции биотрансформации практически всех классов органических соединений. В настоящее время реально использование этой группы родококков в качестве бно-катализаторов в тонком органическом синтезе, высокоэффективных биосинтетиков белка на основе углеводородных газов и биологических индикаторов углеводородных залежей. Многие представители родококков имеют важное значение как уникальные источники иммуномодуляторов, биополимеров, витаминов, специфических трансформирующих ферментных систем и агенты химической трансформации (Finnerty, 1992; Warhurst, Fevv-son, 1994). Сегодня алканотрофные родококки - одна из наиболее разрабатываемых групп эубактерий в прокариотологии. Так, если в списках Всемирного патентного индекса (World Patent Index, Derwent Information Ltd., London, UK) число патентов с использованием родококков в производстве акриламида и акриловой кислоты, для получения окиси пропилена и активных форм эпоксидов, представляющих основу для синтетических полимеров, для конверсии гпогенпроизводных углеводородов и фенолов, обладающих канцерогенным свойством, и стероидных соединений в 1990 г. составляло 10, в 1994 -20, то уже в последние три года оно составляет 80. свидетельствует о неуклонном возрастающем интересе к данной группе организмов как объекту промышленного использования и перспективных биотехнологий.

Родококки, обладающие необъятным функциональным разнообразием и характерным комплексом реализуемых стратегических приемов выживания, приобретают все большую экологическую значимость, ибо на фоне современного кризиса состояния окружающей среды увеличивается число местообитаний, в которых организмы находятся в экстремальных условиях. Несмотря на то, что биология алканотрофных родококков в последнее десятилетие находится в центре внимания исследователей, биологическое разнообразие этой практически значимой группы микроорганизмов до сих пор охарактеризовано неполно. Без особого внимания остаются вопросы адаптации родококков к изменяющимся условиям внешней среды, переключения с использования одних источников углерода и энергии на другие.

Среди Rhodococais spp. известиы возбудители инфекционных заболеваний человека, животных и растений. В 1991 г. описано тридцать случаев выявленш R.equi в крови больных СПИД (Emmons et al., 1991; Prescott, 1991). Представители данного вида входят в "Список распределения известных бактерий по степени потенциальной опасности при работе с ними", подготовленный экспертами Европейского экономического общества (Council Directive 93/88/ЕЕС, 1993). В этой связи перспективность родококков для эксплуатации их в условиях открытых систем (почв, вод, очистных сооружений) ставит не-

отложную задачу изучения патогенности R}iodococcus spp. с целью определения уровня риска при интродукции их в природные среды.

Систематика родококков - объект непрерывной оценки. Разрабатываются новые схемы классификации (Головлсв, 1983; Нестеренко и др., 1985), утверждаются новые виды Rhodococcus (Klatte et al., 1994а; Stoecker et al., 1994, Briglia et al, 1996), идет процесс редукции видов в результате перевода видовых названий в категорию синонимов (Klatte et al., 1994; Rayney et al., 1995), а также объединения отдельных видов в новые роды (Collins et al, 1988, Stackebrandt et al, 1988, Rayney el al, 1995a). Выделение новых родов Dietzia, Gordona и Tsukamurella для организмов, ранее считавшихся родококками, делает труднодифференцируемый таксон Rhodococcus более однородным и относительно стабильным. Тем не менее приходится констатировать существенный разрыв между современной таксономией и практической идентификацией данной группы организмов. Общепринятая дифференциация нокардиоформ по совокупности генетических, хемотаксоно-мических и фенотипических признаков длительна, трудоемка, неприемлема в экологических исследованиях и при скрининге практически ценных культур. Число доступных исследователю экспрессных, простых и надежных диагностических тестов невелико. В арсенале исследователя нокардиоформ до настоящего времени не существует достоверного метода, пригодного для массового анализа однородности бактериальных культур в пределах таксонов низкого уровня. Плсоморфизм, чрезвычайная фенотипическая изменчивость нокардиоформ приводит к обилию нечетких формулировок дифференцирующих признаков в приводимых диагнозах таксонов. Поэтому остается актуальным поиск объективных дифференцирующих тестов родококков, хорошо воспроизводимых при практической диагностике и определяемых доступными методами; разработка новых подходов в изучении родства этих культур на уровне вида; новых методов детекции и ускоренной идентификации конкретных штаммов не только в чистых культурах, но и в составе сообществ; накопление дополнительных сведений о свойствах уже известных видов и описание новых с обязательным привлечением не только коллекционных штаммов, но и природных изолятов. Валено изучение биологических особенностей широкого набора "диких" штаммов, ибо это дает возможность не только подтвердить на их примере объективность предложенных ранее и новых дифференцирующих критериев, но и выявить признаки, связанные с экологической специализацией исследуемых микроорганизмов и коррелирующие с их поведением in situ.

Данные, основанные на определении последовательностей 16S рРНК ряда представителей Rhodococcus spp. и подтвержденные комплексом хемотаксономических признаков (содержание ГЦ-оснований в ДНК, состав миколовых кислот и менахинонов, наличие индивидуальных липидов), показали их обособленное положение в родовой структуре сем. Nocardiacea (Stackebrandt et al, 1988; Goodfellow, 1989). Однако немотивированный выбор модельных штаммов не позволяет распространить полученные выводы на все множество описанных видов родококков. Охват в рамках единого метода всего разнообразия видов Rhodococcus, представленных в коллекциях мира, не осуществлен до настоящего времени. В отоге систематика данной группы организмов носит незавершенный характер. Насущной задачей остается поиск универсального подхода в изучении родства бактериальных культур на уровне вида, предварительного выявления внутривидовых группировок и объективного выбора штаммов - представителей конкретных видов (групп) для последующего детального генетического анализа.

Все вышесказанное (недостаточная изученность уникального видового разнообразия и потенциальных возможностей родококков, обеспечивающих их функционирование в специфических биотопах, возможность интродукции родококков в открытые экосистемы и биотехнологические аспекты изучения родококков) свидетельствует об актуальности дальнейшего углубленного изучения биологии и систематики бактерий рода Rhodococcus. Основой для развития подобных исследований должны служить специализиро-

ванные центры живых культур с детально описанными биологическими характеристиками. Коллекционные фонды бактерий рода Rhodococcus весьма ограничены (Sugawara et al, 1993). Полезность родококков как удобных объектов развивающейся биотехнологии обусловливает необходимость расширения коллекций этих ценных культур и совершенствование методов их сохранения.

Состояние вопроса, цель и задачи исследований. К началу наших исследований (1975 г.) биология нокардиоподобных бактерий, объединяемых в комплекс "rhadochrous" и выделенных недавно в самостоятельный род Rhodococcus (Zopf 1891) Goodfellow and Alderson 1977, была изучена слабо, в неудовлетворительном положении находилась систематика данных организмов, идентификация выделенных из природы штаммов была крайне затруднительна, отсутствовали эффективные методы выделения и учета изучаемой грз'ппы организмов in и ex situ. Невыясненными оставались экологические закономерности расселения родококков, характер их взаимодействия со средой обитания и сопутствующей микрофлорой, оценка физиологических функций в природных экосистемах.

В большей степени эти аспекты касались представителей нокардиоформ, усваивающих тяжелые газообразные углеводороды (Сз-СД Впервые установленная Г.АМогилевским нефтегазопоисковая информативность пропан- и бутанокисляющнх бактерий, входящих в состав "бактериального фильтра" на пути миграции газообразных углеводородов от залежи к дневной поверхности, способствовала широкому внедрению в практику разведочных работ геомикробиологического метода поисков нефтяных и газовых месторождений. Для усовершенствования микробиологического прогнозирования подземных залежей нефти и газа необходимо было разработать методы точного и быстрого распознавания индикаторной микрофлоры. Оказалось, что к ней относится множество ранее описанных под другими названиями нокардиоформ, систематическое положение которых требовало тщательной ревизии с привлечением новых нетрадиционных подходов и методов. Изучение биологических особенностей данной группы организмов, ее приуроченности к нефтегазоносным провинциям необходимо было для обоснования теоретических и практических положений нефтегазопоисковой микробиологии. Существенный практический интерес представляло изучение биоразнообразия газоокпсляющих бактерий подземных вод и почв районов нефтяных месторождений Пермского Предуралья, являющегося одним из перспективных нефтегазоносных районов Европейской части Российской Федерации.

Решение обозначенных проблем было возможным только на основе обязательного получения разнообразных чистых лабораторных культур и формирования реферативной коллекции, ибо каждый шгамм несет в себе важную часть генетического пула природных микробных сообществ, а ценность коллекционных культур возрастает по мере накопления все новой информации о их свойствах

Целью настоящей работы являлось комплексное изучение экологии и биологических особенностей, таксономии и деструктивных возможностей родококков, включая: (а) разработку фундаментальной базы данных о биологии алканотрофных родококков природных биоценозов, (б) поиск модельных штаммов, перспективных для биотехнологии; (в) создание профилированной коллекции чистых жизнеспособных культур и автоматизированного банка данных, пригодного для использования в коммуникационных сетях международного, регионального и национального назначения.

Основные задачи исследований:

1. Анализ природного разнообразия Rhodococcus spp. по видовым и экологическим критериям, включающий расшифровку состава сопутствующей газоокисляющим родо-коккам микрофлоры и усовершенствование методов эффективного выделения родокок-

ков из природных субстратов; изучение сезонной динамики представителей отдельных таксономических групп; крупномасштабное выделение культур родококков из различных природных субстратов контрастных околого-географических регионов; определение ан-тагонистичесюгх и патогенных свойств у отдельных представителей рода Ююс1ососсих.

2. Определение основных закономерностей распространения ШкхЬсоссия врр. и их численности в водных и почвенных экосистемах, в том числе газоиспользующих родококков в грунтовых и подпочвенных отложениях нефтеносных и ненефтеносных районов. Микробиологическое обследование природных экотопов для подтверждения применения микробиологического метода прогнозирования нефтяных и газовых месторождений. Оценка эффективности использования пропап-и бутанокисляющих родококков как биоиндикаторов при поисках нефти и газа.

3. Исследование таксономической структуры рода Ююс1оспсс1щ. Поиск новых дифференцирующих критериев и уточнение диагнозов видов. Характеристика родококков по их белковым спектрам. Разработка оптимальной схемы видовой идентификации родококков, пригодной в крупномасштабных таксономических исследованиях и при скрининге практически ценных штаммов.

4. Оценка возможности применения экспрессных иммунохимических методов для объективной диагностики известных видов родококков в чистых, накопительных культурах и смешанных природных популяциях. Разработка способа получения специфических иммунных сывороток против бактерий рода ШюЛососсих, приготовление чувствительных и специфических диагностических препаратов, определение иммуногенности и антигенной специфичности исследуемых штаммов.

5. Изучение структурных и функциональных изменений родококков в условиях индуцированного алканотрофного метаболизма, в частности сравнительное исследование количественного и качественного состава экстрацеллюлярных аминокислот, аотибиоти-кочувсгвительности, жирно-кислотного состава, поверхностных структур, ультратонкого и антигенного строения клеток родококков, культивируемых на разных питательных средах.

6. Изучение биосинтетической, деструктивной и трансформирующей активности выделенных штаммов родококков. Отбор штаммов-активных биодеструкторов различных классов приоритетных органических загрязнителей. Поиск продуцентов экологически безопасных биосурфактантов, перспективных для биотехнологии защиты окружающей среды. Разработка метода эффективного выделен™ поверхностно-активных комплексов родококков и исследование их эмульгирующей активности. Проверка нефтеотмывающих свойств биосурфактантов в условиях полевых экспериментов по биоремедиации нефте-загрязненной почвы.

7. Формирование детально охарактеризованного генофонда алканотрофных родококков и подготовка научной информации на основе новой версии ККС-кода в виде компьютеризированной базы данных о поддерживаемых коллекционных штаммах. Разработка оптимальных методов консервации чистых идентифицированных культур Л/гоа'ососсгм' эрр. с сохранением их уникальных биологических характеристик.

Научная новизна. С позиции системного подхода исследованы биологические особенности бактерий рода ШюЛососсих и своеобразие их взаимотношений с внешней средой, получен ряд уникальных данных, восполняющих познание биологии алканотрофных родококков Работа такого масштаба - с полным набором валидных видов родококков и обширным массивом природных штаммов - проведена впервые. В результате проведенных исследований на защиту выносятся следующие научные положения.

Родококки - экологически гетерогенная группа эубактерий, широко распространенных в природе, занимающих сложную систему экологических ниш - от богатых питательными веществами (организм человека и животных) до олиготрофных мест обитания

(грунтовые воды, снег, воздух и пр.) - и обладающих высоким уровнем адаптации к экстремальным условиям существования. По экологической принадлежности родококки могут быть охарактеризованы как диссипотрофы, использующие рассеянные источники питания и низкие концентрации органического субстрата.

Определенные виды родококков, благодаря их экологически важной способности метаболизировать в качестве единственных источников углеродного питания газообразные н-алканы (пропан, и-бутан), недоступные для друпгх микроорганизмов, характеризуются строго локальным распределением в природе и занимают доминирующее положение в естественном биоценозе "бактериального фильтра" районов углеводородных скоплений, представляющего собой своеобразный природный катаболический экран, предотвращающий загрязнение атмосферы газообразными углеводородами. В результате исследования обширного природного материала (образцы керна, пластовых и поверхностных вод, почв, снежного покрова, воздуха), отобранного из резко контрастных климатических зон, и стационарных исследований закономерностей распределения родококков в природе выявляется приуроченность отдельных видов Rhodococcus-. R.ery1hropolis, R.rhodochrous, R.ruber, R.opacus, R.^longus" к районам углеводородных скоплений. Доминантные виды R.rnber и R.rhodochrous рекомендуются как биоиндикаторы газовых углеводородных "аномалий".

Определению границ предпочтительного расселения конкретных видовых популяций родококков способствуют разработка и использование метода прямого исследования разнообразия Rhodococcus spp. в гетерогенных местообитаниях на основе иммунофлуо-ресцентной микроскопии. С использованием непрямого метода флуоресцирующих антител возможно изучение многообразия алканотрофных родококков in situ без традиционной необходимости выделения их в чистую лабораторную культуру в составе смешанных микробных сообществ на уровне численности популяции 10""-104 клеток/мл(г) в присутствии клеток/мл (г) сопутствующей микрофлоры. Одними из доминирующих бактерий-спутников родококков наряду с исевдомонадами являются представители родов Ко-сипа и Micrococcus.

Дифференциация видов родококков в пределах рода весьма затруднительна. Проведенные исследования указывают на возрастающий разрыв между полифазной таксономией и практической идентификацией изучаемой группы организмов, на отсутствие физиологически обоснованных и информативных, относительно простых по выполнению дифференцирующих тестов и необходимость изучения обширных рабочих коллекций культур. Для различения близкородственных видов родококков эффективным оказываег-ся применение разработанных расширенных диагнозов таксонов Rhodococcus, ключа, диагностической таблицы и оптимальной схемы видовой дифференциации Rhodococcus spp., включающей в качестве надежных диагностических маркеров таксономически значимые антибиотики, свободные жирные кислоты и характеристики спектров суммарных клеточных белков. Методы нумерического и кластерного анализа протеинограмм позволяет успешно дифференцировать и идентифицировать виды родококков.

В таксономическом изучении труднодифференцируемого таксона Rhodococcus имеет смысл применение методов иммунохимического анализа, позволяющих с большой достоверностью проводить экспрессную видовую диагностику родококков на основе их антигенных характеристик. Это открывает принципиальную возможность использования в качестве арбитра видовой идентификации чистых культур Rhodococcus spp. метода им-мунодиффузионного анализа, сочетающего преимущества высокой чувствительности и специфичности с простотой исполнения и доступностью. Для направленного поиска, экспрессной индикации и дифференциации родококков в естественных ассоциатах наиболее результативными и достаточно простыми являются методы иммунофлуоресцентного анализа. Высокоактивные поликлональные иммунные сыворотки, полученные по разработанным рациональным схемам против большинства известных видов Rhodococcus, позво-

ляют впервые провести детальный антигенный аналш штаммов всех валидных видов ро-дококков.

Родококки являются микроорганизмами, высокоадаптированными к использованию предельно восстановленных водонерастворимых субстратов (высших газообразных гомологов метана и жидких 7/-алканов). Полученные ранее неизвестные данные о структурно-функциональных изменениях клеток родококков в присутствии н-ал каков, как то. гиперсинтез мембранного аппарата, клеточной стенки, и новые сведения о жирно-кислотном составе, антибиотикочувствительности и антигенной структуре родококков, культивируемых на разных средах, свидетельствуют о своеобразии струетурной и метаболической организации их клеток. Углеводородный тип питания обусловливает впервые экспериментально доказанное возрастание антибиотикорезистентности родококков, сопровождающееся повышением содержания суммарных клеточных липидов, насыщенных прямоцепочечных жирных кислот (Cis.o, Cis:c, С21.0) и появлением в составе фосфолипи-дов кардиолипина и фосфатидилглицерина. Исследованные механизмы резистентности связаны с увеличением активности неспецифических окислительных ферментных систем родококков, инактивирующих воздействующие антибиотики. В условиях переключения газоокисляющих родококков с углеводного на углеводородное питание выявляются функциональные антигены (впервые обнаруживаемые с помощью реакции двойной им-мунодиффузии в агаровом геле), наличие которых подтверждает адаптивную природу ферментов окисления м-алканов, формирующихся только после появления данного субстрата в среде.

Практическая ценность. Создана наиболее полная в стране и за рубежом коллекция чистых идентифицированных культур Rhodococcus (378 штаммов, принадлежащих к 12, из них 9 валидным видам) и компьютеризированная база данных, используемая в каналах Internet (http:Www.bdt.org br\cgi-bin\msdn\iegm). Авторское собрание штаммов послужило основой для развития первой Региональной профилированной коллекции алка-нотрофных микроорганизмов, зарегистрированной (сентябрь, 1996) во Всемирном центре данных о микроорганизмах (World Data Centre for Microorganisms - WDCM), Всемирной федерации коллекций культур (World Federation for Culture Collections - WFCC) и вошедшей в мировой фонд коллекций.

Впервые создан банк специфических иммунных сывороток против большинства известных видов Rhodococcus. Разработки, связанные с детекцией и видовой идентификацией Rhodococcus spp. с помощью иммунохимического анализа (типовые антисыворотки, приготовленные на их основе тест-системы "антиген-антитело", усовершенствованный способ получения высокодисперсной эмульсии антигенов бактериальных штаммов в адъюванте), могут быть использованы в экспериментальной практике экспресс-диагностирования данной группы микроорганизмов (в том числе оппортунистических патогенов) в аналитических лабораториях, в работе микробных коллекций, экологических исследованиях родококков и для контроля за контаминацией лабораторных и производственных культур.

С помощью предложенных схемы видовой дифференциации родокококков, дополнительных критериев для различения близкородственных видов Rhodococcus, хемо-таксономического и иммунохимического анализа установлена видовая принадлежность пяти ранее неидентифицированных культур Rhodococcus sp. и реклассифицированы три штамма, полученные из Национальных коллекций промышленных и морских бактерий (NCTMB, Абердин, Великобритания), а также пересмотрено систематическое положение восьми штаммов-деструкторов эфиров о-фталевой кислоты, полученных из коллекции микробных культур ИНМИ АН Белоруссии.

Подобраны штаммы-активные продуценты незаменимых аминокислот, новых био-сурфактантов, культуры родококков с высокой активностью оксигеназного комплекса, в

том числе наиболее продуктивные пропан-и бутанокисляющие штаммы; представлены рекомендации по их эксплуатации. У данных штаммов установлено отсутствие патогенных свойств. Для эффективного выделения поверхностно-активных комплексов родокок-ков разработан оригинальный метод, включающий экстрагирование биосурфакгантных комплексов метил-третичнобутиловым эфиром в режиме ультразвукового озвучивания.

Разработанные эффективные питательные среды для преимущественного выделения газоокисляющих родококков из природных субстратов, обеспечивающие высокий селективный индекс (85-98 %), рекомендуются для выделения газоокисляющих родоккок-ков из смешанных природных и промышленных популяций.

Разработанный экспресс-метод диагностики пропан- и бутанокисляющих бактерий (удостоен диплома Ш степени и бронзовой медали ВДНХ СССР) и рекомендованная бактериальная индикаторная система обнаружения углеводородных газов в естественных субстратах используются в производстве нсфтегазопоисковых работ. По результатам комплексных поисково-геохимических и микробиологических исследований (1988-1992 гг.), проводимых на договорных условиях с Геофизической экспедицией по заказу ПО "Белорусгеология", в 1992 г. разбурено шесть структур, на двух из которых вскрыты промышленные залежи нефти, на двух других отмечены хорошие признаки нефтеносности, на остальных - нефтегазоносные отложения заводнены и только поэтому не представляют промышленной ценности.

Приобретен уникальный опыт работы с массовыми культурами алканотрофных микроорганизмов. Результаты работы внедрены в учебный процесс на кафедре микробиологии и иммунологии биологического факультета Пермского госуниверситета: материалы диссертации используются в лекциях спецкурсов "Систематика прокариотных организмов" и "Нефтяная микробиология", культуры - в Практикуме по идентификации бактерий. Для обучения и исследовательских целей чистые культуры предоставлены в Государственную сельскохозяйственную академию, Государственную фармацевтическую академию (Пермь, Россия), Государственный университет (Санкт-Петербург, Россия), Ярославский государственный университет им. П.Г.Демидова, ИМВ АН Украины (Киев, Украина), ИНМИ АЛ Белоруссии (Минск, Белоруссия), Напиер университет (Эдинбург, Великобритания), Варвикский университет (Ковентри, Великобритания), Институт микробиологии (Аахен, Германия); "NC1MB (Абердин, Великобритания).

Связь работы с крупными программами. Работа в течение 1976-1997 гг. проводилась в соответствии с планом ПИР ИЭГМ УрО РАН (номера госрегистрации тем НИР 01.9.00 017993; 01.9.70 005279), а также в 1988-1990 гг. по заданию 5.5.5.1 Комплексной программы НТП СЭВ "Создание информационных банков данных о штаммах микроорганизмов"; в 1991-1993 гг. - в рамках целевого Международного проекта "Микробные ресурсы-биотехнологии" согласно договора о сотрудничестве с Международной информационной сетью данных о штаммах микроорганизмов и клеточных линиях (Microbial Strain Data Network - MSDN, Cambridge, (Ж); в 1992-1997 гг. - ГНПТ РФ "Средства обеспечения исследований по физико-химической биологии и биотехнологии"; в 1993-1995 гг. - ГППТ РФ "Биотехнология защиты окружающей среды"; в 1995-1997 г. - Региональной комплексной научно-технической программы "УРАЛ"; в 1994-1997 гг. - инициативных совместных проектов с Напиер университетом (Эдинбург, Шотландия) при поддержке Королевского научного общества Великобритании (The Royal Society, UK) и Международной программы НАТО "The NATO Sciences Programme and Cooperation Parthers" В 1993 г. исследования были поддержаны грантом РФФИ 93-04-12191, стипендией Джорджа Сороса и Академии естественных наук РФ по проблеме "Бноразнообразие". Реализация методических разработок по изучению "бактериального фильтра" нефтегазоносных районов и усовершенствованию метода микробиологического прогнозирования

подземных залежей нефтяных и газовых месторождений осуществлялась в ПО "Пермнефть", "Удмуртнефть", "Центргеофизика", "Аэрогеология", и "Келорусгеология" путем выполнения опытно-методических исследований на основе хоздоговоров (19791993 гг.) и выдачи практических рекомендаций в отчетах. Проверка информативной ценности применения экспрессных методов иммунодиагностики Rhodococcus spp.n Micrococcus spp. проводилась в рамках Договоров о сотрудничестве с Институтом микробиологии и вирусологии имени акад. Д.К.Заболотного АН Украины (1979-1982; 1982-1986; 19861987) и Института микробиологии АН Белоруссии (1989-1991).

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на YI, YII Съездах Всесоюзного микробиологического общества (Рига, 1980, Алма-Ата, 1985); Региональной конференции "Экология, человек и проблемы окружающей среды" (Свердловск, 1983); Выставке достижений народного хозяйства СССР (Москва, 1984, свидетельство ВДНХ СССР N. 17672 от 11.11.84); YI, YII, IX Международных симпозиумах по биологии актиномицетов (Дебрецен, 1985, Токио, 1988; Москва, 1994); Всесоюзной конференции "Биоиндикация и биотестирование природных вод" (Ростов-на-Дону, 1986); Всесоюзных конференциях "Биосинтез вторичных метаболитов" (Пущино, 1987, Ташкент, 1988), ХШ, X1Y Всесоюзных конференциях по электронной микроскопии (Звенигород, 1988; Черноголовка, 1992); Ш Всесоюзной конференции "Биодинамика почв" (Таллин, 1988); Y Международном симпозиуме по микробной экологии (Киото, 1989); IY, Y Конференциях- Европейской актиномицетной группы (Удине, 1990, Париж, 1993); Всесоюзном симпозиуме "Микробиология охраны биосферы в регионах Урала и Северного Прикаспия" (Оренбург, 1991); 1, Ш Международных симпозиумах "Проблемы токсикологии и прикладной экологии" (Ленинград, 1991; 1995); Рабочем совещании Отделения общей биологии РАН "Биоразнообразие: систематическая изученность таксонов органического мира я формирование компьютеризированных банков данных" (Москва, 1991); Международном симпозиуме по микробиологии подземных экосистем (Бат, 1993); Конференции Российского микробиологического общества "Биосинтез ферментов микроорганизмов" (Москва, 1993); Конференции Европейской Федерации микробиологических обществ "Идентификация бактерий современные направления, перспективы на будущее" (Гранада, 1993); IY Конференции РФ "Новые направления биотехнологии" (Пущино, 1994); YI1 Международном микробиологическом конгрессе (Прага, 1994), Международной конференции памяти акад. А.А.Бабаева (Москва, 1996); Международной конференции "Микробное разнообразие: состояние, сохранение, экологические проблемы" (Пермь, 1996), Международной конференции по биоремедиации (Портсмут, 1996); Y1I Международном конгрессе по коллекциям культур (Вельдховеи, 1996).

Публикации. Полученный экспериментальный материал и литературные сведения по теме диссертации обобщены в 73 печатных работах и частично в виде диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук (1982). Большая часть материалов представлена в двух монографиях (1987, 1988). Проведенная систематическая ревизия собранного генофонда бактериальных культур, сопровождающаяся постановкой большого объема экспериментальных исследований для подтверждения видовой принадлежности и исходной активности штаммов, завершена составлением и изданием (на русском и английском языках) "Каталога штаммов региональной профилированной коллекции ач-канотрофных микроорганизмов", М.: Наука, 1994. В опубликованных в соавторстве работах личный вклад автора заключался в планировании и непосредственном участии при выполнении экспериментов, обработке полученных результатов, их обсуждении и написании текста рукописей. Материалы диссертации вошли в опубликованные Программы специальных курсов для студентов биологического факультета ПТУ "Систематика прока-риотных организмов" и "Нефтяная микробиология" (Пермь, Перм. ун-т, 1997).

Место проведения работы. Материалы диссертации получены автором за время работы в лаборатории геологической микробиологии Института экологии растений и животных УНЦ АН СССР с 1975 по 1987 гг. и в последующий период (с 1988 г. по настоящее время) в лаборатории алканотрофных микроорганизмов ИЭГМ УрО РАН, организатором и руководителем которой является автор работы Научные положения диссертации и выводы, вытекающие из анализа полученного экспериментального материала, базируются на результатах собственных исследований автора, режимных наблюдениях, опытно-методических испытаниях разрабатываемых методик, реализованных как в полевых, так и в лабораторных условиях. Большая часть используемых: в работе природных штаммов выделена и идентифицирована автором.

Исследования были начаты под руководством д.г.-м.н. A.A.Оборина и д.м.н., профессора Р.А.Пшеничнова. Изучение ультратонкого строения родококков проведено совместно с к.б.н. Л.Е.Глазачевой и к.б.н. В.П.Шеховцовым. Раздел работы по получению антисывороток выполнен при использовании вивария Пермской государственной медицинской академии. Проверка способности культур использовать эфиры фталевых кислот - основных загрязнителей сточных вод производства пластификаторов осуществлена совместно с сотрудниками лаборатории экологии микроорганизмов ИНМИ АН Белоруссии (зав. - д.б.н. А.С.Самсонова). При оценке вирулентности культур пользовались квалифицированными консультациями сотрудников кафедры патологической анатомии и биологической химии ПГМА. Генетический анализ родококков с использованием полимераз-иой цепной реакции проведен на базе Напиер университета (Эдинбург, Великобритания) при непосредственном участии д-ра К.Белла и н.с. М.С.Куюкиной. Работа по подготовке автоматизированной базы данных выполнялась на основе программного обеспечения, предложенного ИБФМ РАН (отделы ВКМ, ЦВТ). Ряд специальных задач решался на базе других научных подразделений ИЭГМ УрО РАН: лаборатории биохимии развития микроорганизмов (зав.- к.м.н. В.ПКоробов), лаборатории химического мутагенеза (зав.-к.мн. В.А.Демаков).

Автор выражает искреннюю благодарность названным коллективам и сотрудникам лабораторий геомикробиологии и алканотрофных микроорганизмов, способствующим завершению настоящей работы и чей вклад в определенные разделы исследований отражен в приведенных в списке литературы публикациях. Особую благодарность автор выражает коллективу лаборатории алканотрофных микроорганизмов за сотрудничество на всех этапах данной работы. Автор искренне признателен д.м.н., профессору Н.Н.Кеворкову за предоставленную возможность проведения экспериментов по изучению иммуногенности родококков на базе кафедры биохимии ПГМА, стимулирующие дискуссии, обсуждение разделов работы по серодиагностике родококков, ценные замечания и советы; к.м н. В.П.Коробову - за консультации и помощь при обработке результатов по разделению внеклеточных аминокислот способом ионнообменной хроматографии, постоянное внимание к настоящей работе, полезные советы и сделанные критические замечания; к.м.н. М.Колотову - за первоначальную помощь при лиофилизации культур и бактериальных диагностикумов. Автор благодарит сотрудников Напиер университета Великобритании во главе с профессором Н.Кристофи за плодотворное сотрудничество.

Автор приносит глубокую благодарность и признательность чл.-корр. РАН, д.б.н., зав. отделом ВКМ ИБФМ РАН, профессору Л.В.Калакуцкому за консультационную и практическую помощь, постоянное внимание и моральную поддержку при разработке концепции профиля первой на Урале коллекции микробных ресурсов и в ее практической организации.

Автор считает своим долгом выразить особую благодарность своим учителям и наставникам д.б.н. О А.Нестеренко!, д.м.н., профессору Р.А.Пшеничнову, д.м.н., профессору Н.Н.Кеворкову и д.г.-м.н. А.А.Оборину, оказавшим большое влияние на выбор целей научного поиска и формирование научного мировоззрения автора.

Автор выражает большую и искреннюю благодарность директору ИЭГМ УрО РАН, академику РАН, д.м.н., профессору В.А.Черешневу за помощь в работе в качестве научного консультанта и в его лице всем сотрудникам института, способствующим развитию Региональной профилированной коллекции чистых культур алканотрофных микроорганизмов.

Цитируемая литература

1. Головлев Е.Л. Биолотя сапрофитных ыикобактерии. Автореф. дне. ... докг. биол. паук. Путщшо: 1983, 37 с.

2. Калакуцкий Л.В. // Микробиология. 1993,62,2, 363-366.

3. Нестеренко О А., Квасников E.H., Ногина Т.М. Нокардшгаодобныс и корцнеподобные бактерии. Киев: Наук. думка, 1985. 336 с.

4. Ainann, R.I.. Ludwig, W.. Schleifer. K..-H. // Mierobiol.Rev., 1995. 1. 143-169.

5. Briglia. M., Rainey, F.A.. Stackebrandt, E. ei nl. ii Int. J.Syst. Bacteriol., 1996. 46. 1. 23-30.

6. Bull. A.T.. Hardmaa D.J. /7 Curr. Opm. Biolecbnol.. 1991, 2. 421-428.

7. Collins. M.D., Smida, J., Dorsch. M„ Stackebrandt, E. //Int. J. Syst. Bacteriol, 1988. 88, 385-391.

8. Convention oil Biological Diversity. // Biol.lnt, 1992, 25. 22-39.

9. Council Directive 93/88/EEC on the protection of workers from risks related to exposure to biological agents at work // Official Journal of tile European Communities, No L 268/71 of 29.10.1993.

10. Emmons, W.. Rcichwein, В., Winslow. D.L. //Rev. Infect. Dis.. 1991, 13, 91-96.

11. Fiimerty, W.R. // Ann. Rev. Microbiol., 1992,46, 193-218.

12. Global Biodiversity Strategy. Policy-makers'guide. World Resources Institute, The World Conservation Union; United Nations Environment Programme: with consult. FAO and UNESCO. 1992, 52 pp.

13. Goodfellow, M. /I In: Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. Eds. S.T.Williams et nl., Williams and Wilkins, Baltimore, 1989,2362-2371.

14. Hawksworth, D.L., Aguirre-Hudson. B. // In' The Biodiversity of Microorganisms and the Role of Microbial Resource Centres (B.Kirsop and D.L.Hawksworth cds.). WFCC.UNEP. 1994.65-72.

15. Hawksworth, D L„ Colwell, R.R. // Biol. Int.. 1992, 24,11-15.

16. Hawksworth. D L.. Sastramihardja, I, Kokke, R., Stevenson, R. Guidelines for the Establishment and Operation of Collections of Cultures of Microorganisms. Richmond, Surrcv: Simworth Press. 1990, 16 pp.

17. Klattc, S.. Jahnke, K.-D.. Kroppenstedt, R.M. el at. ,7 hit. I System. Bactcriol.. 1994. 44.4.627-630.

18. Klatte, S., Kroppenstedt. R.M.. Ramey,F. // J. Syst. Appl. Microbiol., 1994a. 17,355-360.

19. Microbial Diversity 21.1UMS/IUBS Action Statement. WFCC Newsletter, 1991. 17. 18-20.

20. Prescott, J. F. // Clin. Microbiol. Rev.. 1991, 4, 20-34.

21. Ramev, F.A.. Burghardt. I., Kroppenstedt. R., Klatte, S.. Stackebnmdt, E. U Int. I. Syst. Bacterid.. 1995.45. 101-103."

22. Raincy, F. A.. Klattc. R.M., Stackebrandt, E. // Int. J. Syst. Bacterid.. 1995a. 45, 1, 32-36.

23. Sands. P. // In: The Biodiversity of Microorganisms and the Role of Microbial Resource Centres (B.Kirsop and D.L Hawksworth cds.). WFCC.UNEP, 1994. 9-27.

24. Stackebrandt. E.. Sinida. J., Collins, M.D.//J. Gen. Appl. Microbiol.. 1988. 34. 4, 341-348.

25. Stoecker, M.A., Russell, P.H.. Stalcy. J.T. // Int. J. Svst Bacteriol.. 1994, 44. 1. 106-110.

26. Sugawara. H.. Ma, J., Miyazaki. S. et at. (eds.). World Directory of Collections of Cultures of Microorganisms. 4th cd. Saitama. WFCC World Data Center on Microorgamisms, RIKEN. Hirosawa, Japan. 1152 pp.

27. Warhurst, AM.. Fewson. C.A. // Crit. Rev. Biotechnology. 1994.1, 29-73.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

L ОБЪЕКТЫ II МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Рабочая коллекция культур, условия iiv выделения и культивирования. В работе использовано 378 чистых культур, выделенных в течение ряда лет из многих тысяч образцов пластовых, грунтовых и поверхностных вод, донных осадков, почв разных типов, вечномерзлых фунтов, кернов из геохимических скважин, снежного покрова, атмосферного воздуха контрастных природно-климатических зон, в том числе районов нефтяных загрязнений и нефтепромыслов России (Пермского Предуралья и Коми края, Таймыра и Западной Сибири, Ульяновского Поволжья и Красноярского края и т.д.) и нефтеразведочных площадей Белоруссии. Типовые штаммы известных видов Rhodococcus, Gordona, Dietzia,Micrococcus и Kocuria получены из Коллекции бактериальных культур отдела физиологии промышленных микроорганизмов ИМВ АН Украины и Национальных коллекций промышленных и морских бактерий (NCIMB), Абердин, Великобритания. Подготовка почвенных образцов включала предварительную обработку ультразвуком [69]. Алканотрофные микроорганизмы выделяли с помощью накопительных культур и культивировали на минеральных средах с углеводородными газами (пропаном, п-бутаном), н-гексадеканом и смесями жидких углеводородов (С15-С17, нефть; вазелиновое масло) в качестве единственных источников углерода и энергии, как описано ранее [9]. В качестве питательной среды для выделения газоокисляющих бактерий использовали также предварительно отстернл изо ванные через мембранные фильтры природные грунтовые воды. В работе использовали пропан (98,63 %) и я-бутан (99,75 %) производства Московского опытного з-да ВНИИгаз, жидкие индивидуальные //-алканы 97-99 % чистоты (Sigma Chemical Co., St Louis, USA). Для обнаружения и количественного учета в культуре накопления представителей рода Pseudomonas использовали элективные среды с апета-мидом (Вуль, Колкер, 1978; Atlas, 1993).

Исследуемые чистые культуры выращивали в течение 3 сут при 28°С на богатых питательных средах, как то; мясомептонный агар - МПА (Oxoid, Unipath Ltd, UK) и органический агар Гаузе N 2 (Поиск продуцентов..., 1990), а также на жидкой и агаризовапной минеральной основе среды К (Малашенко и др, 1973), содержащей 1-2 об.% н-гексадекана в качестве единственного источника углерода и энергии. Пропанокисляющие родококки параллельно культивировали в течение 5-7 сут при 28°С на минеральной среде в газовоздушной атмосфере (пропан, я-бутан - воздух 1:5).

Стационарные наблюдения за динамикой популяции алканотрофных родококков в грунтовых водах проводили во время полевого сезона с мая по октябрь 1980 г. иа участках, расположенных в контуре Мазунинского нефтяного месторождения, за его пределами и в (контрольном) районе Ишимовской разбуренной непродуктивной структуры, в почвенных горизонтах - в период с июня по октябрь 1988 г. в районе Межевского месторождения нефти Пермской области Для определения содержания жизнеспособных клеток в популяциях различных видов родококков использовали метод микрокультурального анализа. Сравнительный анализ подземных вод на присутствие газоокисляющих бактерий и наличие растворенного газа проводили в полевых условиях на базе лаборатории ЛГМА-1 (автомобильной лаборатории геомикробиологии). Дегазацию водных проб и газовый анализ осуществляли по методике ВНИИЯГГ (Инструктивные указания..., 1974). величины pH и Eh определяли непосредственно на водоисточнике с помощью ионометра И-102, количество растворенного кислорода - по методу Винклера, гидрохимические показатели - по общепринятой методике (Резников и др., 1970).

Таксономический анализ, изучение биохимической активности коллекционных и свежевыделенных культур, поиск модельных штаммов, необходимых для селекционных и биоинженерных работ, сопровождался постановкой большого набора тестов в соотвегст-

вии с. используемым в мировой практике RKC-кодом (Rogosa et а!., 1986, McManus, Krichevsky, 1991).

Фснотипические исследования проводили по методам (Gordon, Smith, 1953; Gordon, Mihm, 1957; Sierra, 1957, Tsukamura, 1967, 1969; Komagata et cd., 1969) [58]. Морфологические признаки клеток, отобранных на разных стадиях роста культуры, исследовали методами световой, просвечивающей и сканирующей (с использованием микроскопов JEM-100B и JSM-50A, соответственно) микроскопии [10, 39,]. Морфологию клеток и цикл развития исследовали на живых препаратах 6, 18, 24, 48, 72 и 96-часовых культур, выращенных на скошенной питательной среде, методами световой микроскопии с использованием фазового контраста. Выявление метахроматических гранул и жироподоб-ных веществ, окраску по Граму и определение кислотоустойчивости проводили по общепринятым методам (Методы обшей..., 1984).

Для дегсшии биомодифицирующей и деструктивной способностей штаммов использовали широкий спектр органических загрязнителей: газообразные (Сз-Сд), легколетучие (С5-С10), жидкие (Сц-Сп) я-алканы; ароматические углеводороды (бензол, толуол, ксилол); фенолы; эфиры фгалевых кислот; ароматические амины (анилин), кетоны углеводородов (ацетон), алифатические спирты (одноатомные: метанол, этанол, пропанол, бутанол, пентанол, октанол, двухатомные: полиэтилен гл и кол и, трехатомные: глицерин, щесгиатомные: дульцит, маншгг, сорбит), насыщенные жирные кислоты (моно- и дикар-боновые, циклические моно- и дикарбоновые, ароматические), жиры и масла (твин - 80, смазочно-охлаждающие жидкости); поверхностно-активные вещества (/9-алкамон, алкил-бензолсульфонат, алкилсульфонат, гидразекс-2), антибиотические вещества разного происхождения и спектра действия.

Хемотаксономичесюш анализ природных изолятов проводили с применением методов восходящей бумажной (наличие изомеров диаминопимелиновой кислоты - мезо-ДАПК и ÍX-ДАПК, моносахаридный состав клеток) и тонкослойной (наличие свободных миколовых кислот) хроматографии (Ногина и др., 1987, Becker el al., 1964, Lechevalier, 1968; Mmnikin el al, 1975) [60]. Препараты для изучения аминокислотного состава пепти-догликана готовили по методу (Schleifer, Kandier, 1972). Аминокислоты разделяли на автоматическом анализаторе "Biotronik 5001" на базе ИМВ АН Украины [44]. Тип пеггги-догликана определяли по количественному соотношению аминокислот пептидной части полимера.

Суммарные клеточные липиды, глико- и фосфолипиды экстрагировали по традиционному методу (Кейтс, 1975). Газожидкостной хроматографический анализ метиловых эфиров жирных кислот проводили с помощью хроматографа модели "Chrom-5"c пламенно-ионизационным детектором, руководствуясь известным! методиками и рекомендациями (Goodfellow, Donnell, 1994) |51|. Исследование поверхностно-активных и эмульгирующих свойств родококков проводили при росте их на углеводных и углеводородных субстратах. Поверхностное и межфазное натяжение измеряли с помощью тенсиомеягра, критическую мицеллярную концентрацию биосурфактантов определяли разбавлением препаратов дистиллированной водой до достижения минимального значения поверхностного натяжения. Определение токсичности выделенных из родококков биосурфактант-ных комплексов проводили с помощью анализатора токсичности "Microtox Model М500" на базе Напиер университета по изменению интенсивности свечения биолюминесцентных бактерий Vibrio fischen при 15° С.

Электрофоретический анализ общих клеточных белков проводили в прерывистой по pH системе по методу Лемли (Laemmly, 1970) в аппарате для вертикального гель-электрофореза ("Хийу калур", Таллин). Экспериментально подобранные оптимальные условия постановки электрофореза в полиакриламидном геле предусматривали (1) отбор клеток в начале стационарной фазы роста, (2) разрушение их с помощью ультразвука в растворе додецилсульфата натрия со стеклянным порошком и (3) использование 9%-ного

геля. Белковые спектры сравнивали визуально попарно с подсчетом числа пар идентичных полос и общего числа полос в обоих спектрах. Процент сходства рассчитывали, сравнивая протеинограммы различных штаммов, с использованием коэффициента Чека-новского (Зайцев, 1991). На основании полученных электрофореграмм проводили кластерный анализ спектров суммарных клеточных белков с использованием показателей взвешенного среднего числа пары группы.

Нмяунохнмическнй анализ. Культуры выращивали на МПЛ при 28°С в течение 72-96 ч. При сравнительном изучении антигенного родства клеток газоокисляющих родококков последние параллельно культивировали на минеральной среде с пропаном 117]. Водорастворимые антигенные комплексы получали путем дезинтеграции клеток при помощи низкочастотного диспергатора УЗДН-М (22 кГц, 10 (для микрококков) - 20 (для родококков) мин в условиях охлаждения суспензии). Концентрация белка в гомогенатах, определяемая по методу (Lowry et al., 1951), составляла в среднем 25 мг/мл. Антигенную специфичность свежевыцеленных и коллекционных культур изучали в опытах перекрестной постановки реакций пробирочной агглютинации (РА), двойной иммунодиффузии в агаровом геле по Оухтерлонн (РИ). непрямой иммунофлуоресценции (нМФА), как описано ранее [12, 26, 31, 57]. Иммуногенность родококков исследовали по уровню определяемых у экспериментальных животных агглютининов и преципитинов.

В РА использовали антисыворотки, полученные против гретых вакцин, в РИ - как выше упомянутые, так и сыворотки, полученные против соответствующих гомогенатов бактериальных клеток В РЛ антигенами служили инактивированные прогреванием культуры в S-форме, в РИ - разрушенные ультразвуком. Для приготовления преципнтирую-щих антиродококковых сывороток предлагается усовершенствованный способ получения высокодисперсной эмульсии антигенов бактериальных клеток в адъювапте, предусматривающий дезинтеграцию клеток и создание эмульсии в адъюванте в одной пробе. С этой целью клетки обрабатываются ультразвуком в течение 15 мин, а затем в пробу добавляется адьювапт, и смесь дополнительно озвучивается на протяжении 5 мин. Поли-клональные иммунные сыворотки получали к типовым и типичным штаммам разных видов Rhodococcus и Micrococcus по разработанным способам оптимальной гипериммунизации кроликов [24). Титры антисывороток приведены в табл.1. Готовые антисыворотки хранили в лиофилизированном состоянии, а созданные на их основе референтные системы "антиген-антитело" - в замороженном виде с добавлением мертиолата (1:10 ООО). Контроль состояния банка иммунных сывороток и бактериальных диагностикумов проводили через каждые 6 мес. их хранения путем оценки титра и специфичности сохраняемых аитисывороток В нМФА использовали меченую изотиоцианатом флуоресцеина антикроличью сыворотку в рабочем разведении 1:4 производства ИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН, Приготовленные препараты просматривали под люминесцентным микроскопом "ЛЮМАМ И-2" (не менее 10 полей зрения) с объективом 90 х, применяя в качестве иммерсионной среды химически чистый днметилфталат, контрастирующего красителя -бычий альбумин, помеченный родамином. Для нммунофлуоресцентного исследования искусственных сообществ использовали поливалентные (смесь нескольких типовых аитисывороток) иммунные сыворотки против различных видов Rhodococcus [61]. Искусственные микробные ассоциации включали суспензии чистых культур отдельных представителей Rhodococcus, Micrococcus и Pseudomonas, смешанные в равных концентрациях. Для оценки интенсивности специфической флуоресценции использовали общепринятую четырех крестную шкалу [34]. Положительным результатом иммунофлуоресцентных реакций считали флуоресценцию клеток интенсивностью не менее 3 + Количественный учет родококков проводили по методу (Cochran-Stafira. Starzyk, 1989). Преципитационные спектры исследуемых штаммов регистрировали зарисовками и фотографированием в ко-сопроходяшем свете.

Таблица 1. Титры антител полученных специфических поликлональных иммунных сывороток против типовых и типичных представителей Rhodococcus spp., Micrococcus spp.

Видовая принадлежность Номер штамм Титр антител в log2, выявленных в РА

Dermacoccus (former Micrococcus) ИЭГМ BT 393r 10,8 ± 0,43

nishinomiyaensis (-ССМ 2140)

Dietzia (former Rhodococcus) maris ИЭГМ AC 55т 10,3 ± 0,60

(=АТСС 35013)

Gordona (former Rhodococcus) ИЭГМ АС 95т 9,4 ± 0,53

rubropertinctus (=АТСС14352)

Gordona (former Rhodoroccus) terrae ГОГМАС 143т 9,4 ± 0,40

(=АТСС 25594)

Kocuria (former Micrococcus) kristinae ИЭГМ ВТ 390т 7,5 ± 0,74

(=ССМ 2690)

Kocuria (former Micrococcus) rosea ИЭГМ ВТ 394т 9,2 ± 0,35

(=ССМ 679)

Kocuria (former Micrococcus) varions ИЭГМ ВТ 400т 8,4 ± 0,48

(=ССМ 884)

Micrococcus luteus ИЭГМ ВТ 39 Г 8,6 ± 0,61

(=ССМ 169)

Micrococcus lylae ИЭГМВТ392т 10,8 ± 0,55

(=ССМ 2693)

Rhodococcus "aquosus" ГОГМАС 1 9,8 + 0,63

(=АТСС 14887)

Rhodococcus equi ИЭГМ АС Т 8,9 ± 0,40

(=АТСС 25729)

Rhodococcus erythropolis ИЭГМ АС Т 10,3 ± 0,74

(=АТСС 4277)

Rhodococcus fascians (former R. luteus) ИЭГМ АС 43 10,5 ± 0,48

(=АТСС 35014)

Rhodococcus "longus" ИЭГМ АС 27 9,0 ± 0,50

(=ИМВ Ас-352)

Rhodococcus opacus ИЭГМ АС 56 10,8 + 0,58

(=ИМВ Ас-379)

Rhodococcus rhodochrous ИЭГМ АС 62т 10,8 ± 0,43

(=АТСС 13808)

Rhodococcusruber ИЭГМ АС 70т 9,3 ± 0,65

(=АТСС 27863)

Rhodococcus ruber ИЭГМ АС 319 9,6 ± 0,45

(=М-13)

Rhodococcus ruber ИЭГМ АС 333 11,8 + 0,56

Примечание.т -Типовой иггамм. Здесь и далее в кавычках - невалидное видовое наименование таксона. Антисыворотки получали на 7-й день после завершающего цикла иммунизации. Готовые сыворотки разливали в ампулы по 1 мл и лиофилизировали. После лиофилизации ампулы запаивали под вакуумом с использованием газово-кислородвой горелки и хранили в темноте при температуре 4° С. Влажность конечного продукта, определяемая весовым методом, составляла 3,2±0,6 %. Сухую сыворотку перед употреблением растворяли в дистиллированной водк ди первоначального объема

С использованием иммунохимических критериев проведена диагностика всех выделенных природных штаммов, а также большого набора коллекционных культур, полученных из ИМВ АН Украины (270 штаммов Rhodococcus spp. и 284 .Uicroaiccus spp), ИНМИ АН Белоруссии (11 проюводсткстю-цешшх культур Rhodococcus spp.), МГУ (4 штамма), Варвикского университета (L'niversitv оГ Wanvick. Covcntry. UK, 1 штамм) и Национальных коллекций промышленных и морских бактерий (The National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited, Aberdeen, Scotland, UK, 22 штамма), и сопоставление ее результатов с идентификацией данных штаммов градационными методами бактериальной таксономии

Изучение патогенных свойств природных штаммов. Культуры выращивали на МПА. Белых беспородных мышей (мужских особей) весом 18-25 г инфицировали в дозе 8x10й целых клеток, параллельно отобранных в экспоненциальной и ранней стационарной фазах роста, однократно, внутрибрюшинно по 16 особей на каждый исследуемый штамм. Контрольной группе подопытных животных вводили по 0,5 мл стерильного физиологического раствора. Наблюдение за состоянием инфицированных животных проводили в течение 15 сут, регистрировали вес и коэффициент выживания, тщательно исследовали внутренние органы (забрюшинные лимфатические узлы, печень, селезенку, легкие, миокард, кишечник, почки, надпочечники) и проводили визуальный осмотр наружных покровов, цвета кожи и ее чистоты. Гомогенат селезенки всех павших животных и выборочно оставшихся в живых исследовали методом посева на МПА. Результаты проведенных исследований показали отсутствие патогенности (в экспериментах для здоровых белых мышей) у испытуемых штаммов R.erylhropolis ИЭГМ АС 199, ИЭГМ АС 201, ИЭГМ АС 272, ИЭГМ АС 275, КгиЪег ИЭГМ АС 74, ИЭГМ АС 219. ИЭГМ АС 231. ИЭГМ АС 242, ИЭГМ АС 351, ИЭГМ АС 371.

Антимикробная активность. Антагонистические свойства культур проверяли традиционным диффузионным методом (Поиск продуцентов..., 1990) на МПА и агаризо-ванной среде Гаузе N 2. Использовали тест-культуры Escherichia coli К-13, Comamonas terrigena АТСС 8461, Staphylococcus aureus 209P и мутант стафилококка 209Р/УФ-2, Bacillus myeoides R-537, Ps.aerugenosa АТСС 27853, Ai.luteus АТСС 27853 и Saccharomyces cerevisiae FL200, полученные из Института по изысканию новых антибиотиков РАМН. Из исследуемых на антимикробную активность 77 штаммов Rhodococcus spp. и 6 штаммов Micrococcns spp. лишь единичные культуры R.equi ИЭГМ АС 6, R.erythropolis ИЭГМ АС 272, Rfascians ИЭГМ АС 35 и M.roseus ИЭГМ АС 397 проявляли антагонистические свойства по отношению к Sh.cerevisiae и St.aureus. Настоящие штаммы интересны проявлением антагонистической активности против тест-организма St.aureus 209Р/УФ-2, чаше всего использующегося при первичном отборе новых продуцентов противоопухолевых антибиотиков.

Антибиотикочувствительность штаммов изучали методами стандартных индикаторных дисков и серийных разведений. Использовали бумажные диски, пропитанные стандартными растворами 34 испытуемых антибиотических веществ различного биологического происхождения: образуемые бактериями, актиномицетами и несовершенными грибами, а также широкого спектра действия на бактериальную клетку [40, 68]. Значения минимальной подавляющей концентрации (МПК) антибиотиков рассчитывали с использованием уравнений линейной регрессии, показывающих зависимость между определяемой в пробирках МПК и диаметрами зон задержки роста на плотных средах (Нахаба и др., 1990).

Определение активности окислительных ферментных систем определяли с помощью полярографического метода измерения скорости потребления кислорода клетками и бесклеточными экстрактами родококков в присутствии антибиотиков. Использо-вати полярограф "Polarographic Analyzer РА2" (Laboratorni Pristroje, Prague, Czech Republic). Автоматическое снятие результатов измерения и обработку данных проводили по программе, разработанной инженером лаборатории ачканотрофных микроорганизмов ИЭГМ УрО РАН О Б.Чумаковым. Объем ячейки - 2,5 мл, толщина мембраны - 10-12 мкм. Для подтверждения процесса инактивирования ряда антибиотиков в условиях ин-

дукции монооксигеназного комплекса родококков использовали высокочувствительные к линкомицину, оксациллину, олеандомшшну, хлорамфениколу и эритромицину тест-культуры M.hiknis АТСС 9341. B.subtilis АТСС 6633, B.mycoides R-537, полученные из Института по изысканию новых антибиотиков РАМН. Хроматографическое определение антибиотических веществ, проводили с использованием жидкостного хроматографа (модель 2150, LKB, Bromma, Sweden) с ультрафиолетовым детектором (модель 2158, LKB UVICORD SD).

Генетический анализ с использованием полимеразнои цепной реакции проводили на базе Напиер университета, Эдинбург, Великобритания [63]. Экстрагирование хромосомальной ДНК осуществляли с использованием препарата InstaGene (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) в соответствии с рекомендациями, указанными в Каталоге "InstaGene Purification Matrix Catalog". Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей 16S рРНК гена представителей отдельных видов родококков и некоторых близких родов, опубликованных в GenBank (National Library of Medicine, National Centre for Biotechnology Information, Bethesda, Md , USA), проводили с помощью компьютерной программы Gene Works (InteUigentics Inc., Mountainview, CA, USA); полимеразную цепную реакцию (ПЦР) - с учетом процедур, предусмотренных для минимализации риска загрязнения реакционной смеси посторонней ДНК (Kwok, Higuchi, 1989). Обнаружение продуктов ПЦР осуществляли путем постановки электрофореза в 1,5 % агарозном геле с последующим окрашиванием бромистым этндием. В качестве свидетеля использовали молекулярный маркер ДНК Boehringer Mannheim N. YI. Гели просматривали под ультрафиолетовым светом. Положительный результат регистрировали в виде единичной полосы, соответствующей позиции фрагмента ДНК определенной длины.

Идентификация. При идентификации культур использовали в основном диагностическую таблицу и ключ, предложенные О.А.Нестеренко с соавт. (1985) для видовой дифференциации lUiodococcus, частично Руководство по систематике бактерий Берги (Bergey's manual..., 1994) и новое издание известного справочника "Прокариоты" (The Prokaryotes, 1992), а также данные оригинальных публикаций (Goodfellow, Alderson, 1977, Rowbotham, Cross, 1977; Goodfellow et al, 1982; Stackebrandt, 1982).

Хранение чистых культур и бактериальных диагностикумов. Дегидратацию биологического материала производили в лабораторном лиофилизаторе типа ОЕ-960 (Венгрия) при остаточном давлении 0,7-0,9 мм рт. ст. с предварительным замораживанием в азоте и последующем высушиванием в течение 20 ч. В качестве криопротекторов при лиофилизацин испытывали сахарозо-желатиновый агар Файбича, суспензионную среду с низкой ионной силой, жидкую синтетическую среду К, регидратантов - водопроводную и дистиллированную воду, 0,5 %-ный раствор хлорида натрга и жидкую среду К. Контроль состояния чистых культур и антисывороток проводили через определенные сроки хранения (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 лет) путем оценки жизнеспособности и биохимической активности клеток, а также титра и специфичности сохраняемых лиофилизированных иммунных сывороток. Наличие взаимосвязи между выживаемостью клеток и интенсивностью их эндогенного дыхания изучали с помощью полярографического метода [51].

Исследования по бноремеднации пахотной дерново-подзолистой почвы, загрязненной после аварийного разлива нефти и пластовых вод, проводили во время полевого сезона (июль-ноябрь, 1995; июнь-июль, 1996) на территории Межевского нефтяного месторождения (НГДУ "Полазнанефть", ОАО "ЛУКойл-Пермнсфть") с применением различных рекультивационных приемов [65]. Почвенные образцы анализировали на общее содержание органического вещества, остаточной нефти, гетеро- и алканотрофных бактерий, на влажность, температуру и кислотность почвенной среды, а также структурно-групповой состав остаточных нефтепродуктов (на базе КамНИИКИГС НПО "Недра").

Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета компьютерных программ Statictica (версия 3.4 для Windows) Основной массив экспериметаль-

ных данных, в том числе результаты определения титров агглютининов и преципитинов, которые выражали в величинах log2 последнего разведения антисыворотки и антигена (соответственно), лающего положительную реакцию, обрабатывали статистически с вычислением среднего квадрагического, стандартной ошибки, доверительного интервала. При опенки степени достоверности средних данных использовали f-критерий Стьюдента, степень варьирования данных оценивали с помощью коэффициента вариации. Для решения отдельных задач применяли программы корреляционного, кластерного и дискрими-нантного анализа. В кластерном анализе использовали показатели взвешенного среднего числа пары группы, расстояние между которыми рассчитывали по формуле City-block Manhattan disctance, позволяющей снизить влияние отдельных больших различий между объектами на рассчитываемое расстояние

Цитируемая литератора

1. ВульС.М.. КолхсрИ.И. // Лаб дело. 1978, 6. 326-329.

2. Инструктивные укачания по проведению газобиохимических поисковых работ на на)ггъ и газПод ред Г.А.Мопаевского и Е.В.Стадника. М.: ОНТИ ВНИИЯГГ. 1974, 16 с.

3. Зайцев Г.Н. Математический аиадю биологических данных. М,: Наука, 1991, 184 с.

4. Кейтс М. Техника ягаидологмя М.: Мир. 1975. 322 с.

5. Малашенко Ю.Р., Романовская В А., Богаченко В Н. н др. // Микробиология. 1973. 42. 3, 403-408.

6. Методы общей бак1сриол01 ии/Под ред Ф.Герхардта и др. М.: Мир. 1984, 1, 54-90.

7. Нахаба В.А., Полюдов С.И. // Лаб дело. 1990,3,60-63.

8. Неетеренко О. А , Квасника ЕН.. Ногаяа Т.М. Никардиоподобные и коринсподобкые бактерии. Киев: Наук думка. 1985, 335 с.

9. Ногина Т.М , Стогний И.П., Гвочдяк О.Р. и др. // МикроЬнол. жури.. 1987. 49. 5. 98-100.

10 Поиск продуцентов анжбиогиков среди актнночицегов редких родов Алма-Ата: Гылым. 1990.

120 с.

11. Резников А,А., Мчликовская Е.П.. Соколов И.10. Методы анализа природных вод. М.. Петра 1970. 488 с.

12. Atlas, R.M. Handbook of Microbiological Media. Ed. L C.Parks. CRC Press. 1993,46-47, 1079 pp.

13. Beckcr, В., Leclievalier. M.P., Gordon. R.E.. Leclicvalier. H.A. /I Appl. Microbiol. 1964. 12. 5. 421423.

14. Bergey's Manual of Determinathe Bacteriology 9th ed/Eds. J.GHolt. N.RKrieg. PHA.Sneath, 1 T.Staley. S.T.Williams Baltimore: Williams and WfflJns. 1994, 787 pp

15 Cocliran-Stafira. D.L., Starzyk. J. ¡1 Microbios, 1989, 60. 159-165.

16. Folch. J., Lees. M.. Sloon-Stanley. GH. //1 Biol. Chem., 1957, 226.1, 497-509.

17. Goodfellow, M, Alderson, G. // J. Gen. Microbiol., 1977, 100,1, 99-122.

18 Goodfellow, M., O'Donnell. A.G. (eds ). Chemical methods in prokariotiс svstemalics. John Wilcv and Sons Ltd. Baffms Lane, Chichester. England. 1994. 576 pp.

19, Goodfellow. M„ Weaver. C.R.. Minmkin. D E. // J. Gen Microbiol.. 1982. 128. 731-745

20 Gordon. R.E.. Mihm. J.M. HI Bacterid.. 1957, 73. 15-27.

21. Gordon. R E„ Smith, M M. // J. Bactcrio!. 1953, 66. 41-48

22. Komagata, K.. Yaimda, К. Ogawa. H. //J. Gen Appl. Microbiol.. 1969. 15. 3. 243-259.

23. К wok. S.. Higuchi. R. //Nature, 1989. 389. 237-23S.

24. Laermnly. U.K. // Nature, 1970, 227. 271-310.

25. Lechevalicr, M P. // J. Lab. Clin. Med., 1968, 71. 6. 934-944.

26 Mc.Manus. C.. Krichevsky. M.I. The RKC Code. Coding Microbiological Data for Computers. Draft Version. Springer-Verlag. KTe\v York. 1991. 367 pp.

27. Minnikin. D.E . Alshamaony. L„ Goodfellow, M. Hi. Gen. Microbiol., 1975. 88. 1. 200-204.

28. Rogosa. M., Kjichevsk). ML. Colwcll. R.R. Coding Microbiological Data for Computers. Spnnger-Verlag, New York. 1986. 299 pp.

29. Rowbotham. T.J.. Cross, T. // J. Gen. Microbiol., 1977, 100. 1. 123-138.

30. Schleifer, K.-IL. Kandler, O. //Bacieriol. Revs., 1972. 36. 4. 407-477.

31. Sierra, G.//Antonic van Leemvenhock J. Microbiol, and Serol., 1957. 23. 15-22.

32. Slackebrandt. E. //The Actinomycctes. 1982. 16. 4. 132137.

33. The Prok3ryoles. 2-nd Edition. A Handbook on the Biology of Bacteria: Ecophj siologv, Isolation, identification, Application, Eds. A.Balows, H.G.Triiper, M.Duorkin. W.Hardcr, К-H.Schleifer. Berlin. Heidelberg: Springer-Verlag. New York, 1992. V 1-4

.34. Tsukamura. M. // Tubercle. 1967. 48, .311-338.

35. Tsukamura. M. U I. Gen Microbiol., 1969. 56. 2. 265-287.

П. ПРИНЦИПЫ КЛАССИФИКАЦИИ RHODOCOCCUS. ФЕНОТИПИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА Н ВИДОВАЯ ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ

Признание важной роли родококков, которую они играют в природе, народном хозяйстве и медицине, предполагает совершенствование видовой систематики данной группы организмов, разработку информативных и сравнительно простых по исполнению дифференцирующих тестов, а также экспрессных методов диагностики. Дифференциация видов родококков в пределах рода весьма затруднительна, ибо они обладают высоким уровнем морфо-физиологического сходства. Идентификация родококков по описательным классификационным схемам (Bergey's manual..., 1989, Goodfellow, 1992; Goodfellow et al., 1990), включающим большое число ортодоксальных признаков, с использованием традиционных ключей технически крайне затруднительна и не всегда позволяет однозначно дифференцировать отдельные виды. Для рутинной идентификации Riiodococcus гораздо удобнее пользоваться диагностической таблицей, предложенной О.А.Нестеренко с соавторами (1985). По истечении двенадцати лет, когда накопилась новая информация, нам кажется правомочным внесение изменений, уточнений и дополнений в практическую схему идентификации родококков на основании тщательного исследования таксономической значимости отдельных признаков с целью разработки классификационной системы с ограниченным кругом дифференцирующих единичных и функционально сходных признаков, выявленных методами нумерического анализа.

Ниже приводится фенотипическая характеристика родококков, выделенных нами из различных экосистем, и рассматриваются группы признаков с целью оценки возможности их применения для видовой дифференциации родококков.

Природные изоляты из разнообразных мест их обитания не только сопредельных, но и географически удаленных районов, представляли довольно гомогенную группу организмов и отличались однотипностью фенотипических свойств, включая морфологию колоний и микробных клеток 138]. Все исследуемые штаммы - грамположительные аэробы, неподвижны, пекислотоустойчивы, неспорообразующие Имеют ярко выраженные каталазную активность и окислительный метаболизм. Гидролитические ферменты отсутствуют. Клетки палочковидные, шириной 0,6-0,9 мкм и длиной 2-5 до 7-12, иногда 15-18 мкм, слабо ветвящиеся или с тенденцией к истинному ветвлению. Характерно v-образное и палисадное расположение клеток, наличие плеоморфизма Отличительная черта исследуемых штаммов - трехстадийный морфогенетический цикл развития (кокки - палочковидные, нитевидные или ветвящиеся клетки - кокки) На стандартных лабораторных средах при температуре 28° С, pH 6,8-7,0 образуют колонии мягкой консистенции без воздушного мицелия с розовато-красным, оранжево-красным, палево-телесным или интенсивно желтым недиффундирующим пигментом. Как показал анализ химического состава гидролизатов целых клеток исследуемых штамов [44, 60], все они имеют IV хемотип клеточной стенки (тип дифференцирующих Сахаров А (арабиноза, галактоза) и л/«о-ДАПК) и синтезируют миколовые кислоты (липид LCN-A обнаружен). Характеризуются пепти-догликаном вариации А1у (аланин - глутаминовая кислота -л/еао-ДАПК с молярным соотношением 1,99:1,32:1,0 (2.1:1) и Р И типом фосфолипидов. Приведенная характеристика свежевыделенных штаммов в целом соответствует современному представлению о роде Rhodococcus Zopf 1891, причисленному (Goodfellow, 1992) в сем. Nocardiacaae Castel-laniand Chalmersl919, пор. Actwomycetales Buchanan 1917.

Все родококки, выделенные из различных природных источников, восстанавливают нитраты в нитриты, образуют кислоту из глюкозы, фруктозы, глицерина, и, как правило, маннозы, но не продуцируют ее из сорбозы, рамнозы, целлобиозы, дульцита и рафи-нозы Они усваивают натриевые соли пировиноградной, фумаровой, уксусной, пропионо-вой и масляной, но не усваивают натриевые соли щавелевой и, как правило, винной кислот. Рост и образование кислоты на арабинозе, галактозе, лактозе, мальтозе, сахарозе,

инозите, салищше и а-метнл-Л-глюкозиде, a также усвоение натриевых солен а-кетоглутаровои, у-аминомасляной, лимонной, молочной, фенилуксусной и янтарной кислот, разложение тирозина и наличие урсазы определяются видоспецифическими особенностями Rhodococcus spp. Исследуемые природные штаммы устойчивы к действию факторов внешней среды: способны расти в присутствии 7 % NaCl; при исходном рН 5,7 и 8,0; при температуре от 10 до 42° С; выдерживают осмотическое давление 31,4 атм, нагревание при 60° С в течение 30 мин и при 72" С в течение 15 мин, растут на безазотнстых минеральных средах и толерантны к антимикробным агентам: растут на средах, содержащих 0,003 % основного фуксина, 0,0001 % кристаллического фиолетового и 5 % пропи-ленглнколя.

Детальное изучение морфологии клеток и цикла развития исследуемых культур позволило установить принадлежность их к двум морфологическим группам. К первой морфогруппе отнесены 145 изолятов родококков (R.erythropolis, R.fasaœis, R."longvs", R.rhodochrous), в мазках которых в течение первых 10-12 ч после посева преобладают нитевидные 8,0-12,0 мкм длиной, редко слабоветвяишеся, фрагментирующиеся через 12-14 ч роста, формы. Последующее деление укороченных фрагментов происходит бинарным способом Иногда палочковидные клетки в культуре имеют терминальные и субтерминальные вздутия. Вторую морфогруппу (R.ruber, R.opacus) составили 158 штаммов с четко выраженной фрагментацией первичного мицелия. В начальной стадии роста прорастание и ветвление исходных кохковидных и коротких палочковидных клеток начинается с формирования одной-грех ростовых трубок, диаметр которых меньше такового родона-чальных клеток. В экспоненциальной стадии развития (8-12 ч) выявляются клетки длиной 6,0-12,0 х 0,6-0,9 мкм с обильно ветвящимся мицелием, который фрагментируется на укороченные неравномерные палочковидные и кокковидные элементы. В 28-40-часовых культурах присутствуют ветвящиеся клетки длиной 4,0-5,0 мкм с характерной "пoлocaтocтью,' цитоплазмы и небольшое количество более коротких фрагментов. Цитохимические исследования изолятов. культивируемых на MI LA и на среде с н-гексадеканом, показали их способность к накоплению резервного цитоплазматпческого материала на всех стадиях жизненного цикла В клетках исследуемых родококков обнаруживается значительное количество гранул безазотистых органических запасных веществ (гликогена и поли-Р-оксимасляной кислоты), а также волютина

Сравнительное изучение морфологических, культуральных и физиолого-биочимических характеристик природных изолятов свидетельствует о высокой степени фенотипичсского сходства (90 % одинаковых признаков) исследуемых культур с типовыми штаммами отдельных видов Rhodococcus spp. Данный уровень фенотипичсского сходства позволяет сделать вывод о принадлежности выделенных штаммов к следующим видам: R.erythropolis, R.fascians, R."¡ongtis'\ R.opacu%. Rrhodochrous и R.niher.

Для эффективного различения родококков на уровне вида предлагается использование уточненных (пигментация колоний, морфология вегетативных клеток, способность утилизировать моно- и оллгосахариды и спирты) и дополнительных дифференцирующих признаков, как то: чувствительность к антибиотическим веществам, особенности жирно-кислотного пула клеток (табл. 2).

Л нтиГшоти ко чувствительность как объективный дополнительным критерий видовом идентификации родококков. Чувствительность к антибиотикам сегодня часто включается в описание таксономических взаимоотношений между различными родами и видами эубактерий. Исследования нокардиоформных актиномицетов в данном направлении немногочисленны, фрагментарны и проводились в основном со штаммами, принадлежность которых к определенным, признаваемым в настоящее время видам Rhodococcus, была неясна

Все 146 исследуемых по данном)' признаку штаммов проявляют характерную для рода Rhodococcus (Goodfellow, Orchard, 1974; Boiron, Provost, 1990) высокую чувствнтель-

Таблица 2. Признаки, дифференцирующие виды рода ЯАоЛ>сосси«

Признак Н.соргорЬИи. г (1)* И.еди! т* Я.егуЖгороН? (97)* Я [ахЫапз (26)'

Колонии ораткево-красныс 0- 0- 0- 0-

Колонии розовато-красные 100+ 0- 0- 0-

Колонии интенсивно желтые 0- 0- 0- 100 +

Колонии палево-телесные 0- 100 + 100 + 0-

Слабо ветвящиеся клетки, 0- 100 + 100 + 100 +

палочки нитевидные и кокки

Сильно ветвящиеся клетки с 100 + 0- 0- 0-

развитым первичным мицелием

и кокки

Образование кислоты из:

арабинозы 0- 0- 0- 100 +

галактозы 0- 0 - 0- 100 +

лактозы 0- 100 + 0- 25-

мальтозы 0- 0- 0- 0-

сахарозы 0- 50 + 100 + 100 +

инозита 0- 0 - 100 + 0-

а-метал-О-глюкозида 0- 0- 0- 0-

салицина 0- 0- 90 + 0-

Усвоение Ка-солей кислот:

у-аминомасляной 0- 50 + 95 + 100 +

винной 0 - 0- 0- 0-

а-кетоглутаровой 0 - 0- 59 + 100 +

лимонной 0 - 0- 100 + 100 +

молочной 0 - 100 + 100 + 100 +

фенилуксусной 0- 0- 100 + 33-

янтарной 0- 50 + 100 + 100 +

Разложение тирозина 0- 0- 81 + 12 -

Наличие уреазы 0 - 50 + 100 + 81 +

ацетамидазы 0- 100 + 80-

никотинамидазы 0- 100 + 83 +

Рост на

ЫПНП'1ТЯНПГГЯМИНе 0- 100 + 0- 0-

R.gioberulus or R. "îongus" (9 г Kopacus m* R.rhodnil (1)* R.rhodochrmis (13)* R. ruber (151)*

0- 0- 0- 0- 0- 100 +

0- 0- 0- 0- 100 + 0-

0- 0- 0- 0- 0- 0-

100 + 100 + 100 + 100 + 0- 0 -

100 + 100 + 0- 100 + 100 + 0 -

0- 0- 100 + 0 - 0- 100 +

0 - 0- 0- 0 - 0- 0-

0- 0- 0- 0 - 0 - 0-

100 + 0- 0- 0- 0- 0-

0 - 0- 100 + 0- 0- 0-

0- 80 + 100 + 0- 0- 80 +

0- 0- 100 + 0- 0- 0-

0- 0- 100 + 0- 0- 0-

0- 0- 0- 0- 0- 0-

100 + 95 + 100 + 0- 0- 100 +

0- 0- 80 + 0- 0- 0-

0- 59 + 100 + 0- 100 + 0-

0- 100 + 100 + 0- 75 + 100 +

100 + 100 + 100 + 100 + 100 + 100 +

40- 100 + 0- 0- 0-

0- 100 + 100 + 0- 100 + 100 +

0- 100 + 100 + 0- 100 + 100 +

0- 22- 0- 100 + 0- 0-

100 + 100 + 100 + 0- 100 +

100 + 100 + 0- 100 +

0- 0- 0- 100 +

Продолжение таблицы 2.

Признак R.coprophilus R.equ¡ Reryíhropolís R.fascíans R.globcrulus R. "longus" R.opacus R.rhodnii R rhodochrous R. ruber

(1)* (2)* (26)* (D* (9)* (7)* (1)* (13)* (151)*

Чувствительность к ** (мкг/мл)

ампициллину (10) 28 16-35 23-40 23-34 32 26-37 25-35 30 19-38 33-42

доксициклину (10) 37 34-39 17-31 20-24 34 20-31 16-23 19 20-28 23-30

канамицину (30) 45 45-50 16-25 37-14 29 15-23 33-42 46 24-32 25-34

олсандомицнну (15) 34 28-35 14-29 24-31 14 33-43 18-36 17 13-27 33-41

полимиксину (100 Ед/мл) 6 6-9 6-7 6-7 7 6-7 10-14 9 6-9 6-9

фузидину (10) 50 43-50 15-27 16-20 32 36-50 21-25 29 18-23 43-50

хлора?.1фениколу (30) 27 27-38 19-35 33-42 32 35-43 40-51 20 24-30 25-31

эритромицину (15) 38 38-42 22-40 29-38 34 48-50 43-56 15 23-28 36-50

Состав жирных кислот*** (%)

Cl2 0 0,4-0,7 0,5-1,4 0,1 0,2 1,6-1,8 0,1-0,6

C130 0,1-0,2 0,2-0,3 0,1 0,1 0,1-0,8 0,1-0,2

CuCf 5,2-7,8 4,1-5,6 1,5 2,2-2,8 3,8-6,5 0,8-1,9

Cl5 0 1,1-2,2 2,3-4,2 2,6-3,3 3,1-4,6 2,6-4,6 0,3-1,2

С,60 30,0-32,9 34,4-35,6 23,8-25,5 28,2-29,6 31,2-33,1 27,0-35,0

ЮМсСюо 0,1-1,4 0,1-0,4 0,3-0,4 0,1-1,7 3,4-7,2 -

C1S i 6,2-10,1 10,8-11,1 8,7-8,8 9,4-9,7 11,5-15,0 3,8-8,2

С17 0 1,2-1,8 0,8-1,3 6,4-7,5 3,6-5,2 1,1-2,9 1,0-1,5

С>'С,7 0 2,5-3,9 - - - - -

ЮМе С|7о - 0,1-1,0 0,3 0,1-3,3 - -

С]7 1 0,9-3,1 1,7-1,9 9,5-12,5 5,2-5,7 3,5-4,4 0,3-0,7

Cl8 с 6,1-13,7 5,0-5,9 4,2-5,7 4,1-8,7 7,9-8,3 11,4-20,3

ЮМе Ciso 10,7-17,3 6,7-8,1 2,7-4,2 9,9-13,0 6,3-7,9 0,9-3,4

С]8,1 15,1-21,8 25,3-28,0 32,5-33,4 18,9-27,7 13,6-18,2 37,5-42,5

С]9 1 0,6-3,0 1,0-1,3 1,2-1,3 0,1-1,0 - -

Примечание. Приведено относительное количество штаммов с выраженным признаком в процентах от количества исследуемых; "+","-" - проявление признака у типового штамма. * Число исследованных штаммов; ** величина диаметра зоны отсутствия роста в мм; *** к общему количеству жирных кислот (приведены данные анализа жирно-кислотного состава 70 штаммов родококков, в том числе R.erythropolis - 17, R.fascíans - 8, Я "longus" - 9, Ropacas - 7, R.rhodochrous - 6, R.ruber - 23). Незаполненные места - нет данных.

ность к большинству испытанных антибиотических веществ. Значительная часть культур устойчива к действию гелиомиципа, грамицидина С, метициллина и налидиксовой кислоты [40]. Наиболее сильное антибактериальное воздействие оказывают антибиотики -продукты биосинтеза актиномицетов и их производные. Тетрациклиновые, линкозамид-ные, макролидчые и аминогликозидные антибиотики, синтезируемые стрептомицетами, ристомицин и рифампицин, образуемые нокардиями, подавляют рост большинства исследуемых штаммов (диаметр зон ингибирования роста варьирует в пределах 20-40 мм). Сравнительно меньшее отрицательное воздействие на жизнедеятельность родококков оказывают рубомицин, оливомицин и эремомицин, продуцируемые представителями редких родов актиномицетов (диаметр зон отсутствия роста 8-16 мм). Неодинаково реагируют штаммы на действие антибиотиков, продуцентами которых служат бактерии и несовершенные грибы. Родококки отличаются значительно большей чувствительностью к ампициллину и карбенициллину (диаметр стерильной зоны 45 мм), чем к оксациллину и ме-тициллину (соответствующие диаметры стерильных зон 1 -20 и 0-9 мм). Большинство родококков отноыггельно устойчиво к цефалексину, производному цефалоспорина - продукта жизнедеятельности мицелиального гриба Серктоярогшт асгетоп'шт. Продуцируемый грибом ГнхМшт соссикия фузидин оказывает ингибирующее воздействие на 88 % исследуемых штаммов (диаметр зон подавления роста 20-40 мм).

Сравнительная характеристика антибиотикочувствителышсти десяти видов родококков вошла в расширенные диагнозы таксонов. Выявлены межвидовые различия в степени чувствительности родококков к антибиотическим веществам. Дендрограмма сходства видов ШоЛососсш (здесь не приводится), рассчитанного по усредненным для каждого вида значениям диаметра зоны ингибирования бактериального роста под действием антибиотика, выявляет следующие пары видов, сходные по изучаемому признаку: Л'7он^ги" и Лорасиу, Иг1юс1ос/1гон5 и ИгиЬег, КегучИгориИв и Две послед-

ние пары видов характеризуются высокой степенью филогенетического родства, установленного на основании гомологии генов 16Б рРНК (ВпеНа е1 а!., 1996) В результате проведенного дисперсионного анализа с помощью /-критерия Стьюдента средних значений диаметра зоны подавления роста под действием антибиотиков для каждой пары близкородственных таксонов: Л.гЛос/осЛ/о/« и Л.гиЬег\ и Я.ораси$ стало возможным статистически достоверное разделение двух видов родококков с использованием показателей их чувствительности к ампициллину, олеандомицину, фузидину и эритромицину; доксициклину, канамицину, полимиксину, фузидину и хлорамфениколу, соответственно. Так, представленная на рис. 1 деидрограмма демонстрирует четкое распределение всех исследуемых штаммов Л.'7да£н.*" и Карасий на два кластера, основанное на результатах группового анализа признаков чувствительности организмов к выявленным пяти таксо-номически значимым антибиотикам. В частности, использование показателей чувствительности родококков к доксициклину, канамицину, полимиксину, фузидину и хлорамфениколу в качестве дополнительного критерия дифференциации и Яорасш (наряду с данными фенотип ического, хемотаксономического, иммунохимического и генетического анализа) позволило установить видовую принадлежность штаммов Ююйососсих ер. ИЭГМ АС 717 (=N01МВ 11276), ИЭГМ АС 718 (=КС1МВ 11160), а также реиденти-фицировать штаммы ИЭГМ АС 246 (=ИНМИБ ДСС-7), ИЭГМ АС 247 (-К11М1ТБ ДСС-31), ИЭГМ АС 248 (=ИНМИБ 29Ф), ИЭГМ АС 249 (=ИНМИБ ДСС-29), ИЭГМ АС 261 (=ИНМИБ 7Ф), ИЭГМ АС 262 (=ИНМИБ 14Ф), ИЭГМ АС 263 (=ИНМИБ 70Ф), ИЭГМ АС 264 (-ИНМИБ ДСС-14), ранее идентифицированных как НетИгороИй (рис. 2). Все они реклассифицированы как 1{.ораси.5. Использование в качестве дополнительного критерия дифференциации К.гкайосЬгоиа и КгиЬег показателей чувствительности к ампици-лину, олеандомицину, фузидину и эритромицину позволило пересмотреть видовую принадлежность штаммов, поступивших из Национальных коллекций промышленных и морских бактерий под названием П.г!км!исИгоих ИЭГМ АС 656 (=МС1МВ 11273), ИЭГМ АС

657 (=NCIMB 11277), ИЭГМ AC 759 (=NCIMB 13259) и идентифицировать как R.ruber два штамма Rhodococcus sp. ИЭГМ АС 743 (=NCIMB 9741), ИЭГМ АС 744 (-NCIMB 9784) (рис. 3). Результаты видового определения штаммов по данным антнбиотикотипирования совпадают с данными проведенного иммунохимичсскогю и генетического анализа.

R. "longus" ИЭГМ АС 27 : : !:.'::

R. "longus" ИЭГМ АС 29 Н I; I ' !

R. "longus" ИЭГМ АС 31 _ j i-.

R. "longus" ИЭГМ AC 68 П~| : j ; I ;

R. "longus" ИЭГМ AC 33 _J | ; ~ ; 1 П

R. "longus" ИЭГМ AC 32 j | ; ■ | j

R.opacus ИЭГМ AC 56 _Ц I ! ; ;

R.opacus ИЭГМ AC 59 -:-_J П_l ','']'

R.opacus ИЭГМ AC 61 -i-:-U : ; : : ' !

Ropacus ИЭГМ AC 57 -1-, ; : ;

R.opacus ИЭГМ AC 458 ---' ; ; :

R.opacus ИЭГМ AC 58 -

R. opacus ИЭГМ AC 717 --J |

R. opacus ИЭГМ AC 7161 -i-—-- ,

Ropacus ИЭГМ AC 60 -!-—' ; ;

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

S, %

Рис. 1. Распределение штаммов R. "longus" и R.opacus по кластерам в зависимости от степени их чувствительности к воздействию доксициклина, канамицина, полимиксина, фузидина и хлорамфеникола.

R. "longus" ИЭГМ AC 68 шшшмшшш.....Ill.....Hill.....iiiiiiiiiiiiiiiuiiiiiiiii................................

R "longus" ИЭГМ AC 33 ..........................................................................................................

R "longus" ИЭГМ AC 31 ............................................................................Ilium

R "longus" ИЭГМ AC 29 R. "longus" ИЭГМ AC 32 R "longus" ИЭГМ AC 27 IIIUIIIIIIIIIIIH

!IIIIIIIII!IIIIIIIII!IIIIIIIIIIIIIIIIII!II1IIIIIIIH1III!IIII1

l|i|||[[llllllllllll[llllllllllllllll]IIIHIIIIlll

R.erythropolis ИЭГМ AC 264 Ropacus ИЭГМ AC 458 Rerythropolis ИЭГМ AC 248 Rhodococcus sp. ИЭГМ AC 718 Rerythropolis ИЭГМ AC 246 Ropacus ИЭГМ AC 717 Ropacus ИЭГМ AC 60 Rerythropolis ИЭГМ AC 263 Rerythropolis ИЭГМ AC 249 Rerythropolis ИЭГМ AC 261 Ropacus ИЭГМ AC 61 Ropacus ИЭГМ AC 57 Ropacus ИЭГМ AC 716T Ropacus ИЭГМ AC 58 Rerythropolis ИЭГМ AC 247

V//////////////,

У//ШШ///Ж

шшшшш

Ropacus ИЭГМ AC 56 Ropacus ИЭГМ AC 59 R. erythropolis ИЭГМ AC 262

1ШШ/Ш//У////Ш/Ш//Ш/////ША

-5 4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6

Рис. 2. Значения дискриминаютой функции для представителей R. "longus", R.opacus, R.erythropolis и Rhodococcus sp. ИЭГМ AC 7] 8 по величине диаметра стерильной зоны, образуемой под действием пяти таксономически значимых антибиотиков', доксициклина, канамицина, полимиксина, фузидина и хлорамфеникола.

Таким образом, полученные данные позволяют сделать вывод о том, что, хотя не удается установить индивидуального антибиотического маркера для дифференциации каждого конкретного вида Rhodococcus, совокупный видовой профиль чувствительности к антибиотикам служит полезной характеристикой при исследовании таксономической структуры данного рода. Результаты свидетельствуют о вероятной хромосомной локализации генов, определяющих антибиотикорезистентность родококков. Попытки найти плазмиды, несущие маркеры антибиотикочувствительности, увенчались успехом только для единичных представителей R.equi, RJascians и R.erylhropoIis (Dabbs, Sole, 1988; Deso-mereia/., 1992; Finnerty, 1992).

ÜZ

z

ЕЕ

Rruber ИЭГМ ЛС 70r R.ruber ИЭГМАС351 R.ruber ЮГМАС437 R.ruber ИЭГМ AC 224 R.ruber ИЭГМ AC 228 R. ruber ИЭГМ AC 324 R.ruber ИЭГМ AC 482 R.ruber ИЭГМ AC 340 Rhodococcus sp. ИЭГМ AC 743 R.ruber ИЭГМ AC 226 ¡{.ruber ИЭГМ AC 223 R. ruber ИЭГМ AC 319 R.ruber ИЭГМ ЛС 472 R rhodochrous ИЭГМ AC 656 R.rhodochrous ИЭГМ AC 657 R ruber ИЭГМ AC 87 Rruber ИЭГМ AC 448 R.rhodochrous ИЭГМ AC 759 Rruber ИЭГМ AC 387 Rruber ИЭГМ ЛС 230 Rhodococcus sp. ИЭГМ AC 744 R. ruber ИЭГМ AC 92 Rruber ИЭГМ AC 233 R.ruber ИЭГМ AC 235 R. ruber ЯЭГМ AC 89 Rruber ИЭГМ AC 82 R.ruber ИЭГМ AC 73

Rrhodochrous R.rhodochrous R.rhodochrous Rrhodochrous Rrhodochrous R.rhodochrous R. rhodochrous

ИЭГМ AC 758 ИЭГМ AC 66 ИЭГМ AC 64 ИЭГМ AC 62T ИЭГМ AC 653 ИЭГМ AC 655 ИЭГМ AC 63

1

3

2!

1

шшжтшбШ

-7 -6

-5

9

4

Рис. 3. Значения дискриминантной функции для штаммов R.rhodochrous, КгиЬег и Rhodococcus ер. по величине диаметра стерильной зоны, образуемой под действием четырех таксономически значимых антибиотиков' ампициллина, олеандомицина, фузидина и эритромицина.

Жирно-кислотный состав клеток в качестве химического маркера в классификации родококков. Анализ клеточных жирных кислот 70 коллекционных и свежевы-дсленных штаммов показал (см. табл. 2), что родококки, независимо от их видовой принадлежности, характеризуются повышенным содержанием пальмитиновой (С16.0), паль-митолеиновой (С^л) и олеиновой (СиО кислот, а также неизменным присутствием 10-метилстеариновой (туберкулостеариновой - ЮМеСц.о) кислоты. Преобладающие компоненты жирно-кислотного пула родококков - насыщенные прямоцепочечные (от 43,7 до 68,0 % общего количества обнаруженный жирных кислот) с четным числом углеродных атомов (от 73,9 до 98,1 %) кислоты [51].

Спектр жирных кислот исследуемых штаммов различных видов родококков представляет довольно сложную композицию, тогда как качественный состав их почти идентичен, Существенные различия выявляются прежде всего в количественном соотношении индивидуальных кислот. Так, по соотношению миристиновой (Сио) и пентадекановой (Сил) кислот все исследуемые штаммы родокококков подразделяются на две группы. Для родококков группы I (Иегу11ггороН.ч, КгИЫосЬгоив, КгиЬег) характерно отношение Си.о и Сп.о кислот больше единицы, группы II (/¿'7ои£1и" и /?.о/>асги) - меньше единицы. Для представителей Н.егиИгороИ$ типичным является присутствие (2,5-3,9 %) "маркерной" циклопропановой жирной кислоты С17у. Этот признак отличает их от штаммов всех других видов родококков, у которых данная кислота не обнаруживается. Другая отличительная особенность культур ¡{.егуЛгороНя - повышенное содержание миристиновой (С^о) и туберкулостеариновой кислот. Сопоставление жирно-кислотных профилей трудно дифференцируемых таксонов К.гкосЬсЬгои! и Я.гиЬег выявляет их отличительные особенности. Так, представители КгиЬег успешно различаются по минимальному процентному содержанию (3,4 %) туберкулостеариновой кислоты и ее гомологов (ЮМеС^.о, 10МеС[7:о) по сравнению с таковым у Я.гкос/осИгоих и Кегу^ЬороИя (9,7 и 10,8 %, соответственно). Своеобразие жирно-кислотного спектра представителей 11.орасиь проявляется в сравнительно более высоком показателе (10,1 %) суммарных количеств туберкулостеариновой кислоты и се гомологов по сравнению с таковым у штаммов Л.'7ои^м"(4,9 %). Последние отличаются более высоким показателем нснасышенности, рассчитанным по соотношению суммарных количеств ненасыщенных и насыщенных жирных кислот. По жирно-кислотным профилям не удается однозначно дифференцировать исследуемые изоляты И/скатн. Однако замечено, что они характеризуются самым высоким уровнем пальмитиновой кислоты (до 35,6 %).

Выявленные особенности жирно-кислотного клеточного пула родококков использованы для построения частной таксономической системы, позволяющей дифференцировать Ююс1ососсих на видовом уровне

Ключ для определения видов родококков

1. Отношение концентрации миристиновои кислоты С140 к концентрации пентадекановой кислоты С15.0 больше единицы - К.сгуЖгороНь, И.гкойоскгоич, КгиЬег

A. Циклопропановая жирная кислота С 177 присутствует - ИегуЛгороИэ

Б. Процентное содержание туберкулостеариновой кислоты ЮМеСи.о и ее гомологов 10МеС16о, 10МеС|7-о минимальное, меньше 3 - ЯгиЬег

B. Процентное содержание туберкулостеариновой кислоты ЮМеСщ.и и ее гомологов ЮМеСю.о, 10МсС17:о высокое, больше 9 - ЯНгоЦосЬгоих

2. Отношение концентрации миристиновой кислоты Си.о к концентрации пентадекановой килоты Си о меньше единицы - Корасия

А. Процентное содержание туберкулостеариновой кислоты ЮМеСи-о и ее гомологов ЮМеСю.о, ЮМеС 17.о меньше 4 - К.'Чопких"'

Б. Процентное содержание туберкулостеариновой кислоты 10МеСц.о и ее гомологов ЮМеСшо, IОМеСп:о больше 10 - Яорасш

В целом группирование штаммов по данным жирно-кислотного состава, а также показателям антибиотикочувствительностц согласуется с результатами классификации по геносистематическим исследованиям, проведенным методом видосиецифической амплификации 16Б рРНК гена с использованием 11ЦР. В частности, они подтверждают выводы о видовой принадлежности исследуемых ( в том числе рекласснфицированныч и вновь идентифицированных) культур (табл. 3).

Таблица 3. Результаты генетического анализа Rhodococcus врр., проведенного с использованием ПЦР-технологни

Данные ПЦР, поставленных с праймерами для

Вщ, пггамм R. erythropolis Ropacus | о в; R.ruber

R. erythropolis (35 штаммов, в т.ч. ИЭГМЛС71) + -

ИЭГМ АС 246 (=ИНМИБ ДСС-7) ИЭГМ АС 247 (=ИНМИБ ДСС-31) ИЭГМ АС 248 (=ИНМИБ 29Ф) ИЭГМ АС 249 (-ИИМИБ ДСС-29) ИЭГМ АС 261 (=ИНМИБ 7Ф) ИЭГМ АС 262 (=ИНМИБ 14Ф) ИЭГМ АС 263 (=ИНМИБ 70Ф) ИЭГМ АС 264 (=ИНМИБ ДСС-14) - + + + + + -t-

R.rhodochrous (9 штаммов, в т.ч. ИЭГМ АС 62т) + -

ЮГМ АС 656 (-NCIMB 11273) ИЭГМ АС 657 (-NCIMB 11277) ИЭГМ АС 759 (-NCIMB 13259) - Т "Р

R.ruber (57 штаммов, в т.ч. ИЭГМ AC 701)

Rhodococcus sp. ИЭГМ АС 743 (=NCIMB 9741). ЮГМ АС 744 (-NCIMB 9784) - +

ИЭГМ АС 745 (---NCIMB 13261)

Обобщенные диагностические признаки (в общей сложности 49) представителен различных видов родококков приведены в табл. 2 Как показывает нумерический анализ (рис. 4), при использовании предлагаемого набора дополнительных новых признаков, в

s,% о

20

40

60

80

100

1 4 5 63 36 34 56 53 57 37 61 64 31 23 22 41 27 42 45 43 2 3 62 32 33 51 52 54 35 5 5 65 66 26 21 24 47 25 44 46 48

s, 9-1 0

20

40

60

80

100

1 3 5 22 24 26 31 33 3 5 37 42 44 46 48 52 54 56 61 63 65 2 4 21 23 25 27 32 34 36 41 43 45 47 51 53 55 57 62 64 66

б

Рис. 4. Деидрограмма формирования фенонов алканотрофных родококков при использовании для нумерического анализа традиционных фенотипических признаков (а) и предлагаемого набора признаков (б).

Приведены условные номера исследуемых штаммов (в скобках указан коллекционный номер) : 1 (ГОШ АС 36), 2 (ИЭГМ АС 171), 3 (ИЭГМ АС 34), 4 (ИЭГМ АС 38), 5 (ГОШ АС 43) -R/acsians; 21 (ИЭГМ АС 56), 22 (ИЭГМ АС 58), 23 (ИЭГМ АС 768), 24 (ИЭГМ АС 60), 25 (ГОШ АС 716), 26 (ИЭГМ АС 57), 27 (ИЭГМ АС 717) - Ropacus, 31 (ИЭГМ АС 69), 32 (ИЭГМ АС 28), 33 (ИЭГМ АС 31), 34 (ИЭГМ АС 68), 35 (ГОШ АС 29), 36 (ИЭГМ АС 33), 37 (ИЭГМ АС 27) -R"longus"; 41 (ГОШ АС 214), 42 (ИЭГМ АС 686), 43 (ИЭШ АС 687), 44 (ИЭШ АС 682), 45 (ИЭГМ АС 270), 46 (ГОШ АС 15), 47 (ИЭШ АС 265), 48 (ИЭШ АС 7Т) - Rerythropolis; 51 (ИЭШ АС 572), 52 (ГОШ АС 85), 53 (ИЭШ АС 568), 54 (ИЭШ АС 380), 55 (ИЭШ АС 333), 56 (ИЭШ АС 641), 57 (ИЭШ АС 70т) - Rruber, 61 (ИЭШ АС 653), 62 (ИЭШ АС 63), 63 (ИЭШ АС 62х), 64 (ИЭШ АС 66), 65 (ИЭШ АС 760), 66 (ИЭШ АС 64) -Rrhodochrous.

частности таких, как чувствительность к антибиотикам и жирно-кислотный профиль клеток, наряду с уточненными ранее использованными морфолого-культуральными и фи-зиолого-биохимическими признаками наблюдается четкое распределение исследуемых штаммов по фенонам, характеризующих их на уровне вида (рис. 46). Тогда как при использовании только традиционных морфолого-культуральных и физиологических признаков (в общей сложности 118) получена дендрограмма (рис. 4а), в которой исследуемые виды Rhodococcus. R.erythropolis, R.fascians, R."longus", Ropacus, R. rhudochrous, R.niber образуют смешанные феноны. Представленный в диагностической таблице массив информации отражает современный принцип выделения видов (посредством комбинации фенотипических и хемотаксономических признаков), позволяет оценить степень вариабельности признаков штаммов каждого таксона и способствует определению систематического положения идентифицируемых культур с высоким уровнем достоверности. Предлагаемая схема видовой дифференциации родококков на протяжении ряда лет практического использования зарекомендовала себя как достаточно надежная. Полученные результаты подтверждают правомочность выделения самостоятельного нового вида родококков R^lo/igits".

Основываясь на данных собственных исследований, приводим дополнительное описание отдельных таксономических групп родококков, включающее следующие характеристики.

Rhodococcus erythropolis (Gray and Thornton 1928) Goodfellow and Aldcrson 1979.

Все нзоляты данного вида характеризуются палево-телесной, бледно-розовой или палево-розовой окраской, обильным, часто слизистым ростом на плотных средах. Для них характерна способность образовывать кислоту из большей части широко используемых в тестах моно-, олигосахаридов и сахароспиртов, усваивать подавляющее большинство органических кислот. Как правило, представители R.erythropolis образуют кислоту из салицина, что отличает их от штаммов других таксонов. На практике чаще всего вызывает затруднение дифференциация данной группы организмов по морфолого-кудьтуральным признакам от R."longus" и R.opacus. Изоляты R.erylhropohs различаются от {{."longHs^ способностью образовывать кислот)' из инозита, от R.opacus - уреазу. Представители данных таксонов демонстрируют различную подвижность пятен метилмиколатов на ТСХ липиды LCN-A (свободные миколовые кислоты, экстрагируемые из клеток этанол-эфирной смесью) R/'/ongus" и R.opacus характеризуются более высокими значениями Rr (0,40±0,08 и 0,46±0,01, соответственно), по сравнению с таковым (0,33±0,02) R.eryihropolis. Сравнительное изучение спектра антибиотикочувствительности выявляет свойственную данному виду пониженную чувствительность к действию канамицина, стрептомицина, ристомицина, фузидина (МПК составляет в среднем 0,8-5,6 мкг/мл) и более высокую чувствительность к налидиксовой кислоте (МПК = 5-10 мкг/мл).

Rhodococcus fascians (Tilford 1936) Goodfellow 1984. Данный таксон включает представителей ранее самостоятельного вида R.luteu.i (Sohngen 1913) Nesterenko et al. 1982, таксономический статус которых недавно пересмотрен (Klatte et al., 1994) В настоящее время название R.li/leus рассматривается как поздний субъективный синоним R.fascians. Па МПА исследуемые штаммы образуют колонии лимонно или слабо желтого цвета. Представители R.fascians, так же как и вышеописанная таксономическая группа, характеризуются использованием широкого спек-тра исследуемых соединений. В отличие от других исследуемых родококков, все свежевыделенныс штаммы R.fascians образуют кислоту из арабинозы и галактозы. Обладают выраженной чувствительностью к канами-цину, линкомицину и новобиоцину (средние значения МПК = 0.005, 0,09 и 0,01 мкг/мл, соответственно).

Rhodococcus gloherulus Goodfellow ct al. 1985. Вид в настоящем исследовании представлен типовым штаммом R.globendus ИЭГХ1 АС 59 Г, который по сравнению с другими исследуемыми штаммами родококков значительно пониженной чувствительно-

стыо к действию неомицина и олеандомицина (соответствующие значения МПК составляют 32,0 и 25,6 мкг/мл) и устойчивостью к гентамипину, оксацилину и цефалексину (МПК > 50 мкг/мл). Кроме того, данный штамм характеризуется более высокой степенью чувствительности к доксициклину (МПК~ 0,11 мкг/мл). От R.equi и Rrhodnii, наиболее близких к R.globeridus по морфолого-культуральным свойствам, последний дифференцируется способностью потреблять натриевые соли у-аминомасляной кислоты. Набор усваиваемых соединений весьма ограничен

Rhoclococcus rhodnii Goodfellovv and Alderson 1979. Данный вид в настоящем исследовании представлен типовым штаммом Rrhodnii ИЭГМ AC 5551, характеризуется чрезвычайно высокой чувствительностью к действию большинства пенициллиновых и аминогликозидных антибиотиков, ристомицина и рнфампицина (МПК варьирует от 0,0003 до 0,02 мкг/мл). От других исследуемых родококков отличается нескольно сниженной чувствительностью к цефалоспориновому антибиотику - цефокситину (МПК = 4,27 мкг/мл) и устойчивостью к действию эритромицина (МПК = 18,9 мкг/мл). Следует отметить, что для Rrhodnii характерен чрезвычайно узкий спектр используемых субстратов (типовой штамм данного вида не растет на многих сахарах и органических кислотах).

Rhodococcus coprophilus Rowbotham and Cross 1979. Вид в настоящем исследовании представлен типовым штаммом R.coprophilus ИЭГМ АС 600т, который характеризуется чрезвычайно высокой чувствительностью к действию канамицина, тетрациклина, рифампицина и фузидина (величины МПК составляют 0,0002-0,02 мкг/мл). Меньшую степень чувствительности проявляет к пенициллинам, аминогликозидам, макролидам, ристомицину, ванкомицину и цефокситину (МПК< 1,0 мкг/мл). От других родокококков данный таксон отличается более выраженной чувствительностью к доксициклину и цефалексину (соответствующие значения МПК = 0,05 и 8,27 мкгмл). Фенотипическая иде1гти-фикация R.coprophilus затруднена ограниченностью их метаболических возможностей. По морфолого-культуральным свойствам наиболее близок к R.ruber и Rrhodochrous. В отличие от последних, образует астероидные колонии с выпуклым центром.

Rhodococcus cqiii (Magnussen 1923) Goodfellow and Alderson 1979. Различная окраска колоний исследуемых штаммов на богатых питательных средах (палевая и телесно-красная) сближает их с таковыми групп 1 и II, соответственно, объединяющими штаммы устойчивые и чувствительные к ß-лактамным антибиотикам (Goodfellow et ed., 1993). Характеризуются крайне узким диапазоном усвояемых углеродных соединений. Образуют кислоту из лактозы. Проявляют высокую чувствительность к мономицшгу, стрептомицину и эритромицину (МПК< 1 мкг/мл) и устойчивость к брунеомицину, гслиомицину, грамицидину С, цефалексину и налидиксовой кислоте.

Rhodococcus ruher (Kruse 1896) Goodfellow and Alderson 1977. Все 151 штамм, отнесенные к морфогруппе II, по ряду фенотипических свойств (по способности к разложению тирозина, образованию кислоты из углеводов) близки к типовому штамму R rhodochrous ИЭГМ АС 62'. Признаками, дифференцирующими представителей таксонов Rruber и Rrhodochrous, являются отношение их к у-аминомасляной, а-кетоглугаровой кислот, а также наличие или отсутствие ацетамидазы и никотинамидазы. Исследуемые изоляты усваивают -у-аминомасляную, но не а-кетоглутаровую кислоты, образовывают ацетамидазу и никотинамидазу (на 21-е сут роста), как правило, кислоту из сахарозы, что указывает на их принадлежность к R.ruber. Неспособность свежевыделен-ных родококков к усвоению солей винной кислоты сближает их с таковыми фенона 1D (Goodfellow, Alderson, 1977) и группы Б (Нестеренко и др., 1985). объединяющими штаммы Rruber subsp. ruber. К R.ruber группы Б (R.ruber subsp. ruber) относится и типовой штамм вида R.ruber ИЭГМ АС 70т. В отличие от типового штамма, биологической особенностью исследуемых культур является способность их метаболизировать наряду с жидкими я-алканамн высшие газообразные гомологи метана. Способность к утилизации

С;-С4 не утрачивается при поддержании в коллекции на обычных питательных средах в течение более десяти лет. Обнаружено высокое сходство спектров антибиотнкочувстви-тельности данного вида и представителей R.rhodochrous. Практически все штаммы, принадлежащие к данным таксонам, одинаково реагируют на действие более 80 % испытуемых антибиотических веществ. Выявленные количественные различия в степени их чувствительности в действию конкретных антибиотиков (ампициллину, олеандо.мицину, фу-зидину и эритромицину) позволяют успешно дифференцировать R.ruber и R.rhodochrous по данному признаку.

R.rhodochrous (Zopf 1891) Tsukamura 1974 emend. Rainey et al. 1995. На богатых питательных средах формируют розовато-красные со слабым желтоватым оттенком, выпуклые, с влажным блеском, гладкие, маслянистые, с ровным краем колонии диаметром до 3,0 мм Со временем некоторые колонии на этой среде приобретают бледно-оранжеватый оттенок. Отдельные штаммы на минеральной среде в атмосфере пропана образуют колонии пастообразной или крошащейся консистенции, ярко-розовые или красно-оранжевые, имеющие по краям древовидные сухие отростки. По культуралъным признакам трудно дифференцируются от R.ruher. Замечено, что после удаления колоний с агаровой пластинки и последующего просмотра места их расположения в стереоскопическом микроскопе обнаруживается врастание клеток R.ruber в агар. В отличие от R.ruber не образуют кислоту из сахарозы, не синтезируют ацетамидазу и никотинамидазу, не растут па среде с моноэтаноламином, усваивают натриевые соли а-кетоглутаровой кислоты, но не у-аминомасляной. Все исследуемые штаммы, включая типовой штамм R.rhodochrous ИЭГМ АС 62т, обладают высокой чувствительностью к гентамицину, мо-номицину, новобиоцину, ристомицину, рифампицину, тетрациклину, цефокситину и хло-рамфениколу (МПК < 1,0 мкг/мл) и устойчивостью к налидиксовой кислоте. Следует отметить, что среди наших изолятов родококков имеются культуры, одновременно обладающие рядом физиологических признаков, присущих обоим вилам R.rhodochrous и R.ruber. Это так называемые аберрантные, промежуточные между R.rhodochrous и R.ruber штаммы Rhodococcus sp.

Rhodococcus "longus" Nesterenko 1982. Невалидный (не вошедший в Одобренные списки названий бактерий и не являющийся действительно опубликованным в Int. J. System. Bacteriol.) вид в настоящем исследовании представлен штаммами, полученными от О.А Несгеренко (ИМВ АН Украина) и впервые описанными О.А.Нестеренко с соавт. в фундаментальном труде по систематике нокардио- и кори неподобных бактерий (1985) в качестве нового вида RJongus sp. nov., и новыми изолятами, выделенными нами из районов нефтепромыслов Пермской области. Данные штаммы по фенотипическим признакам наиболее близки к виду R.opacus (см. рис. 4). В отличие от R.opacus все они не усваивают натриевые соли винной кислоты и не образуют кислоту из инозита, мальтозы и а-метил-£>-глюкозида. Обладают выраженной чувствительностью к действию аминоглико-зидов (за исключением канамицина), макролидов, тетрациклина, фузидина и хлорамфе-ннкола (М1Ж< 1,0 мкг/мл) и устойчивостью к метицилину, полимиксину и налидиксовой кислоте. Отличительная особенность R."longus"- более высокая степень чувствительности по отношению к брунеомицину и более низкая - к воздействию канамицина и карбе-нишилина. Результаты наших исследований (см. рис. 4) подтверждают правомочность выделения самостоятельного вида/?."/ongiis".

Rhodococcus opticus Klatte et al. 1995. Все культуры используют неограниченный набор источников углерода, в том числе отдельные штаммы наряду с жидкими (Cn-Cjs) ассимилируют газообразные (Cj-C4) я-алканы и способны к автотрофному росту за счет окисления водорода. Нумерический анализ выявил диагностические признаки штаммов этой группы. Таковыми являются свойства, присущие 80-100 % исследуемых культур, как-то: редко встречающаяся у родококков способность усваивать виннокислый натрий, а

также образование кислоты из мальтозы, инозита и а-метил-/3-глюкозида. От наиболее близкого по фенопитическим признакам R."longus" представители Ropacus распознаются по степени чувствительности к доксициклину, канамицину, полпмиксину, фузидину и хлорамфениколу. Результаты проведенных нами фенотипических и хемотаксономических исследований, последующие иммунохимический анализ и изучение белковых спектров, а также данные секвенирования олигопуклеотидов (Klatte et al., 1994) свидетельствуют об обособленном положении данной группы организмов и о целесообразности недавнего присвоения (Validation of the publication..., 1995) ей статуса самостоятельного таксона Ropacus.

В лабораторной практике при определении систематического положения культур большое значение имеет разработка более ускоренных способов изучения характеризующих их свойств. В последние годы широкое распространение в таксономических исследованиях грамположительных бактерий находит электрофоретический анализ спектров клеточных белков, имеющий сходный уровень разрешения с методом ДНК/ДНК-гибридизации и являющийся при этом более быстрым, менее сложным и сравнительно дешевым (Pot et al., 1994; Kersters et al., 1994). В настоящей работе с целью повышения надежности экспресс-диагностики труднодифференцируемых таксонов родококков и выявления степени родства представителей различных видов Rhodococctts spp. успешно применен метод нумерического анализа протеинограмм.

Сравнительный электрофоретический анализ суммарных клеточных белков как средство ускоренной видовой дифференциации родококков. Методом электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия исследованы белковые спектры 87 штаммов. Предварительные эксперименты показали стабильность белковых спектров родококков независимо от условий их роста (температуры от 15 до 36° С и срока культивирования от 2 до 14 сут). Выявленный уровень сходства между видами родококков не превышает 65%. Четко разделяются фенотипически сходные таксоны R.rhodochrous и Rruber, R."longus" и R.opacus, что подтверждает правомочность самостоятельного существования двух последних видов. С помошыо данного метода удается диагностировать культуры Rhodococcus sp., промежуточные по фенотипическим характеристикам между R.ruber и R.rhodochrous, а также подтвердить видовую принадлежность к Ropacus восьми реклассифицированных нами (см. выше) штаммов-деструкторов о- и те-рефталевых кислот, полученных из ИНМИ Белоруссии. Для изучения внутривидового разнообразия спектров были выбраны штаммы, принадлежащие к конкретному виду, но различающиеся по ферментативной активности, географии и источникам выделения. Однако, все они имели сходный набор белков. Так, виды R.erythropolis и R.ruber оказались достаточно однородными (коэффициенты сходства между штаммами внутри данных видов не ниже 90%), внутри видов R.fascians, R.rhodochrous и Ropacus присутствовали крайние варианты со средней связью с другими штаммами выборки меньше 80% Видос-пецифичные белковые полосы характеризовались молекулярными массами 19-57 кДа (маркерный участок белковых спектров представителей Rerythropolis располагается в области молекулярных масс 19-27 кДа, Rfascians - 57 кДа, R.ruber - 30-50 кДа ). Внутри каждого изученного вида отобраны наиболее типичные по данному признаку эталонные штаммы: R.erythropolis ИЭГМ АС 193, Rruber ИЭГМ АС 70', Rfascians ИЭГМ АС 170, Ropacus ИЭГМ АС 58, R.rhodochrous ИЭГМ АС 63, белковые спектры которых демонстрируют максимальную среднюю связь (как правило, 90%) со всеми остальными изученными штаммами вида. В дальнейшем с использованием набора эталонных образцов с типичными белковыми спектрами проводили сопоставление протеинограмм исследуемых культур и устанавливали их видовую принадлежность. Отмечена корреляция между полученными протеинограммами и кластерированием культур по фенотипическим характеристикам

s,%

ioo -

1

90 -

j

80 -

i

£

Щ

AC 20 AC 689 AC 7T AC 641 AC 577 AC 70T

70

60

Рис. 5. Электрофоретические спектры суммарных клеточных белков Rhodococcus spp. и дендрограмма, отражающая таксономическую близость исследуемых штаммов: R.erythropolis ИЭГМ АС Т. ИЭГМ АС 20, ИЭГМ АС 689; R.ruber ИЭГМ АС 70т, ИЭГМ АС 577. ИЭГМ АС 641.

Результаты электрофоретических исследований дают возможность с определенной степенью достоверности выстроить цепочку родственных отношений тестируемых видов родококков. Наиболее близки по изучаемому признаку Rruber и Rrhodoclirous; R.erythropolis и Rfascicuis, R."longus" и R.opacns (соответствующие коэффициенты гомологии составляют 61, 56 и 60 %), что совпадает с данными по реассоцпации ДНК (Chun, Goodfellow, 1995; Rainey et al., 1995, Briglia et al., 1996) и отражает филогенетическое родство данных видов. На рис. 5 частично представлены результаты проведенных исследований, свидетельствующие о возможности с использованием белковых электрофореграмм судить о степени однородности таксонов, дифференцировать Rhodococcus spp., в том числе фенотипически подобные виды родококков и определять их межвидовые и внутривидовые взаимоотношения.

Применение метода сопоставления спектров общих клеточных белков родококков, дающего четкую и доступную таксономическую информацию, бесспорно, имеет существенное практическое значение и является полезным для коллекционной работы, в классификации и идентификации Rhodococcus spp. Однако, несмотря на его такие ценные качества, как относительная простота интерпретации результатов, возможность одновременного исследования большой выборки штаммов и достаточность малых объемов биомассы, тем не менее необходимо отметить, что данный метод довольно трудоемок в повседневной рутинной работе, а идентификация этим методом может быть осуществлена только в чистых культурах. В ряде случаев он также неприемлем, когда чрезвычайно важна экспрессная (в течение нескольких часов) эффективная диагностика родококков. В цикле работ [12, 17, 24, 26, 34] по иммунодиагностике бактерий рода Rhodococcus экспериментально доказана возможность применения иммуиохимического анализа для экспрессной индикации и дифференциации родококков в чистых культурах и природных сообществах.

Цитируемая литерату ра

1. Нестеренко О А, Квасников Е.И.. Ногина Т.М. Нокардиоподобные и хорииеподобные бактерии. Киев: Наук, думка. 1985. 336 с.

2. Bcrgey's Manual of Systematics Bacteriology. Eds. S.T.Williams, M.E.Sharpe, J.G.Holt. Williams and Wilkins. 1989. V.4. 2362-2371.

3. Boiron, P.. Provost. F. // Zbl. Bakt.. 1990. 274, 203-213.

4 Briglia, M„ Raincv. F. A.. Stackebrand. E. et al // Int. J.Syst. Bacteriol.. 1996,46, 1, 23-30.

5. Chun, J., Goodfellow, M. // Tnt J. System. Bacteriol.. 1995.45,2. 240-245.

6. Dabbs. E.R.. Sole, G.J. //Mol. Gen. Genet. 1988, 211. 148-154.

7. Desomer, J. et al. II Mol. Microbiol.. 1992, 6. 16, 2377-2385

8. Finncrty. W. // Ann. Rev. Microbiol., 1992, 46. 193-218.

9. Goodfellow. M. // The Prokaryotes. 2-nd Edition. A Handbook on the Biology of Bacteria: Ecophysiol-ogy, Isolation, Identification, Application. Ed. A.Balows. H.G.Triipcr. M.Dworkin. W.Hardcr. K.-H.Schleifcr. Berlin. Heidelberg,: Spnngcr-Verhg, New York. 1992,1188-1213.

10 Goodfellow. M . Alderson. G. // J. Gen. Microbiol.. 1977. 100. 1. 99-122.

11. Goodfellow. M, Orchard, V. // J. Gen Microbiol., 1974.83, 2, 375-387.

12. Goodfellow, M„ Schaal, K.P., Zlotruk. H. etal. /'Res. Microbiol., 1993, 144. 647-651.

13. Goodfellow. M, Thomas. E.G.. Ward AC.. James, A.L. //Zbl. Bakt. 1990.274, 3. 299-315.

14. Kerstcrs. K.. Pot, В., Dewettinck. D„ Torek, U. el al // In: Bactcrial Diversity and Systematics. Ed. F.G.Priest, A.Rames-Cormen/ana, B.J.Tindall. Plenum Press. New York and London. 1994, 51-66.

15. Klatte, S. Kroppenstcdt, R.M., Raincy, F. // J. Syst. Appl. Microbiol., 1994. 17. 355-360

16. Pot, В., Vandamme, P., Kersters. K. // In: Chemical Methods in Prokaryodc Systematics. Ed. M.Goodfellow and A.G.O'DonnelI John Wiley and Sons Ltd.. Baffins Lane. Chichester, England 1994. 493-521.

17. Raincv, F A , Klatte, S.. Kroppcnstcdt, R.M.. Stackcbrandt. E. II Int. J. Syst. Bacteriol., 1995. 45, 1. 3236.

18. Validation of the publication of new names and new combinations prc\ iouslv effectively published outside the IJSB. List No 52 // Int. J. Syst Bacteriol.. 1995. 45. 197-198.

ТП. ИММУНОДИАГНОСТИКА БАКТЕРИЙ РОДА RHODOCOCCUS

Основное преимущество иммунохимических методов исследования - их высокая чувствительность и специфичность. В этом отношении они превосходят, пожалуй, современные ферментативные методы анализа. Так. выявляемое в реакции иммунодиффу-зии минимальное количество антител в пересчете на белковый азот составляет 3-9 мкг/мл, в реакции иммунофлуоресценцин - 0,05-0,1 мкг/мл (Фримель, ред.. 1979). Серологические методы играют определяющую роль прежде всего в медицинской микробиологии и их применение за рамками меднко-биологических исследований долгое время носило ограниченный характер Лишь только в последние годы они начали широко применяться при решении спорных вопросов систематики труднодифференцируемых таксонов и в экологических исследованиях непатогенных бактерий. Быстрой реализации возможностей иммунохимического анализа препятствует недостаточное знание антигенных особенностей этой группы микроорганизмов. Исследования в данном направлении представителей рода Rhodococcus немногочисленны (Ridell, 1977). Имеющиеся в литературе сведения относятся к концу 60-х - началу 70-х годов и касаются в основном изучения общих межродовых антигенных комплексов h'ocardia, Mycobacterium, Corynebaclerium и Rhodococcus (Cummins, 1965; Norlin el a!., 1969, Kwapinski, 1970; Ridell, Norlin, 1973, Ridell, 1977, 1981). Для видовой диагностики Rhodococcus spp. иммуиохимические методы ранее не использовались.

Изучение нммуногенности родококков. Получение поликл опальных специфических иммунных сывороток. Приготовление высокотнтрованных антисывороток -один из наиболее трудных вопросов серодиагностики родококков. При подборе оптимальных условий для получения иммунных сывороток против отдельных видов родококков учитывались следующие факторы, определяющие эффективность иммунизации, физико-химическая природа вводимого антигена (корпускулярный или водорастворимый), способ его введения; кратность и интервалы между иммунизациями Кроме того, эффективность иммунизации существенно зависит от нммуногенности каждого штамма, обусловленной специфическим антигенным составом клетки, активностью лизосомальных ферментов фагоцитов макроорганизма. При иммунизации кроликов различными вакцинами Rhodococcus spp. отмечено, что наиболее интенсивно индуцируют антителообразо-вание в организме подопытных животных водорастворимые антигены, эмульгированные в неполном адъюванте Фрейнда, тогда как интактные клетки вызывали слабый иммунный ответ. Это, по-видимому, связано с затрудненной переработкой антигенной информации в макрофагальном звене клеточных реакций иммунитета, обусловленной биологическими особенностями родококков, а именно наличием в их стенках большого количества (до 14%) липидов. Результаты опытов по сопоставлению динамики накопления антител в крови животных при разных способах введения вакцины R.rubcr ИЭГМ АС 70т показали (рис. 6), что максимальное накопление антител в крови животных имеет место при внутривенной аппликации вакцины. Повышению иммунологической активности кроликов способствовала комбинация внутривенной и внутримышечной аппликаций гомогенатов дезинтегрированных клеток с адъювантом. В ряде случаев схема получения активных антисывороток включала увеличение интервала между иммунизациями и отдаленную ревакцинацию. В ходе построения рациональных схем иммунизации [24] установлено, что степень нммуногенности исследуемых культур выражена неодинаково (рис 7) и не может существовать единого метода получения высокоактивных сывороток против всех изученных штаммов Rhodococcus spp. В табл. 4 представлены эффективные схемы иммунизации подопытных животных комплексными антигенами, которые дали возможность получить диагностические антисыворотки против типовых и типичных представителей видов Rhodococcus с достаточно высокими титрами антител (см. табл. 1). Несмотря на то, что данные схемы являются довольно длительными, относительно высокие титры антител п спе-

1 о

9 - Ol

D II

S 8 - И III

7 14 2 1

Дни после первой вакцинации

Рис. 6. Сравнительная эффективность различных способов иммунизации кроликов на примере гретой вакцины R.ruber ИЭГМ АС 70": 1 - иммунизация в дозах 0,6-1,3 мл подкожно трехкратно с интервалом 7 дней; II - иммунизация в дозах 0,6-1,3 мл внутрибрюшинно трехкратно с интервалом 7 дней; III - иммунизация в дозах 0,6-1,3 мл внутривенно трехкратно с интервалом 7 дней.

с.

t« •3

□ I QII

□ III

□ IV

Ft

-»ч

V?* У v *

Щ

14 31

Дни после первой вакцинации

Рис. 7. Изучение относительной иммуногенности Rhodococcus spp. Динамика синтеза антител, выявляемых в РА, при иммунизации кроликов корпускулярными антигенами родококков: 1 - Rrhodochrous ИЭГМ АС 62т; II - R.ruber ИЭГМ АС 70т; Ш - Rrhodochrous ИЭГМ АС 3; IV - R.ruber ИЭГМ АС 73

Таблица 4 . Способы получения гипериммунных сывороток против типовых и типичных представителен Rhodococcus spp. и Micrococcus spp.

Водорастворимый белковый гомогенат штамма Схема иммунизации

D. (former R.) maris ИЭГМ АС 55т, С. (former Л.) rubropertmctusllSTM AC 951, R."aquosus" ИЭГМ АС 1, Rerythropolis ИЭГМ АС Т, Rriongus" ИЭГМ АС 27, Rruber ИЭГМ AC 70т, R.ruber ИЭГМ АС 333 G. (former Л.) геггаеИЭГМ АС 143т, R.eqid ИЭГМ AC 1\ R. fasaans ИЭГМ АС 43, R.rhodochrous ИЭГМ АС 62', R.opacus ИЭГМ АС 56 Der. (former M) nishinomiyaensis ИЭГМ ВТ 393т, К (former M) krisiitiae ИЭГМ ВТ 390т, К. (former M) rosea ИЭГМ ВТ 394т, A', (former M) varions ИЭ1М ВТ 400', M. luteus ИЭГМ ВТ 391т, M.lylae ИЭГМ ВТ 392т 0,5-1,5 мл с неполным адъювантом Фрейнда (1.1), ежедневно в течение 3-х дней, интервал 14 дней, внутримышечно; 1,0 мл без адьюванта, один день, подкожно; интервал 30 дней; 0,25-1,0 мл без адьюванта, ежедневно в течение 3-х дней, в!гутривенно 0,5-1,5 мл в смеси с неполным адъювантом Фрейнда (11), ежедневно в течение 4-х дней, интервал 7 дней, внутримышечно; 0,25- 0,50 мл без адьюванта, ежедневно в течение 3-х дней, втгутривецно 0,5-1,0 мл, 2 дня, подкожно, интервал 7 дней; 0,5-1,5 мл, ежедневно в течение. 3-х дней, внутримышечно, интервал 7 дней; 0,25-0,5 мл, ежедневно в течение 3-х дней, внутривенно

цнфичность иммунных сывороток, а также сравнительно легкая переносимость их кроликами-продуцентами. позволили выбрать их в качестве основных схем иммунизации

Антигенная специфичность Rltodococcus spp. Идентификация ролококков методом н.чмунодиффузии. Приведенные в табл 5 и 6 результаты свидетельствуют о высокой видовой и родовой специфичности полученных антисывороток Как вично из табл 5 и рис 8. только в гомологичных тест-системах с соответствующими бактериальными антигенами обнаруживаются реакции полной идентичности Полученные данные указывают на значшельное антигенное сходство типовых штаммов Rcoprophilu■>, R.rhot/ochmiis и Rniber. R.er\thropohs и Rglohendus: менее выраженное - Ci.(R )lerrae и (i (R.)rubropernníiii.\. на наличие частично идентичных антигенов у большинства исследованных культур ролококков У типового штамма R.fasciain выявляются слабые двусторонние антигенные связи с R.eryihropolis. На серологическую обособленность родов (ioi-doiia и Dietzia указывают обнаруживаемые лишь в единичных случаях с представителями ролококков частично идентичные антигенные детерминанты Выявленные закономерности подтверждаются и в опытах перекрестной постановки нМФА Дендрограмма. построенная с использованием метода (Chaparas с! а!.. 1978) по данным иммунохимического анализа типовых штаммов всех валидных видов ролококков и бывших представителей рода Rhodococcus, объединенных недавно в новые роды L>iet:ia (Rainey el al. 1995) и Сип-

Таблица 5. Результаты перекрестных РИ антисывороток и гомогенатов клеток родококков в гомологичных и гетерологичных системах антиген-антитело

п/п Гомогенаты клеток штаммов Антисыворотка к штамму:

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

1 Ле<тн/ИЭГМ АС 21 + + + ш - ш 111 ш - ш - ш

2 ЯегуМгороИя ИЭГМ АС 7Т - + + + ш ш III ш ш ш - -

3 Я/скаат ИЭГМ АС 43 - ш + + + - - - ш - - -

4 Л"1оп&иГ ИЭГМ АС 27 - - - + + + ш ш ш - - -

5 Яорасиу ИЭГМ АС 56 - - - ш + + + ш ш - - -

6 ЛгЪос1осЪгот ИЭГМ АС 62т ш ш - ш ш + + + + + - - ш

7 Лп^ег ИЭГМ АС 70т - 111 - ш ш + + + + + - - ш

8 С. (Л )гпЬгорег1п1с1из ИЭГМ АС 95т - - - - - - ш + + + ш -

9 0.(Я)1епае ИЭГМ АС 1437 - - - - - ш - + + + + -

10 В.(Я)тап.я ИЭГМ АС 55г - ш - ш - ш - - ш + + +

11 Я соргоркИш ИЭГМ АС 600т - ш - ш ш + + + ш ш -

12 ЛфЬет/и* ИЭГМ АС 59 Г ш + + - - - - ш ш ш -

13 Лора«« ИЭГМ АС 71 б1 - - - ш +++ ш ш - - -

14 ЯгНоЖт ИЭГМ АС 555'' ш ш - ш ш ш ш ш ш ш

Примечание Число плюсов означает число полос преципитации (реакция полной идентичности); "-" - отсутствие общих антигенов (реакция нсидентнчности); Ш - образование истинной шпоры (реакция частичной идентичности).

Таблица 6 Распределение представителен рода Шии/ососеи.х в соответствии с числом выявленных в гомологичных системах ангиген-анштело общих полог пргцпшпапнп

Кати-

Вид чагшо

иггам-

.'.tr.ii

1{.егу[Иго[ю!1х 96

И.еп1Ьп>ри//л в

ИИМИБ

25

Я "1ог,£нх" 8

11'' 7

Я гкспЬсЬ-пи^ 23

Я.гЬоЛосЬгоих 8

ИС1МВ

МС1МВ 1127л 1

^1МВ 11277 1

ЫС1МВ 13259 1

Я.гипсг 150

Я еда: 2

ЯЬос1ососсул Бр 5

КС1МВ

ХС1МВ 9741 1

К'С1МВ 9784 1

КС1МВ 11160 1

КС1МВ 11276 1

КС1МВ 13261 1

Ант н сыворотка

штамму

Н.сп!Ьгоро1и-ИЭГМ АС 7'(3)"

О и! I

7

9 16 6 2 5 2 12 11

8

1 1 1 150 1

2 2

1 1

1 1

9 84

Я./азаапь ИЭГМ АС43"(3)"

О Ш 1

Я. "1оП£И,Ч "

ИЭГМ АС 27(3)"

3-' О Ш 1

79 17 8

8

7

23

8

1

1 1

124 26 2 5

84 12 8

7

9 14 3 5

1 1 1 150 2 2

1 1

Я. орасих ИЭГМ АС 56 (3)"

О Ш Г 2° 3

84 12

11 12 8

1 1 1 150 2 3

1 1

2 6

И гНос1осИгои$ ИЭГМ АС 62' (З)1

О Ш I

96 8

14 11

8

23

5

1 1 1

84 66 1

2

1 1

Я.гцЬег ИЭГМ АС 70г(3)'

О Ш 1

96 3 5

14 9 1 4

1 1 1 150

Я.едш ИЭГМ АС2*(ЗГ

О 111 1

2'1 3 е'

84 12 8

25 8

7

14 9

8

1 1 1

112 38

Примечание. О - отсутствие общих антигенов (реакция нсидстичности); Ш - образование истинной шпоры (реакция частичной идентичности);а>6 -преципитации, формирующихся в гомологичной системе антиген-антитело.

число полос

к

2

3

25

В

6 2

7

7

1

3

2

1

1

Рис. 8. Идентификация с г.сжевыде ленных культур с помощью реакции двойной иммунодиффузии в агаровом геле.

а: I - антисыворотка к К.гиЬег ИЭГМ АС 70т; 1 и 4 - гомогенат клеток того же штамма; 2 и 5 -гомогенат клеток Я.гиЬег ИЭГМ АС 235; 3 и 6 - гомогенат клеток К.гиЬег ИЭГМ АС 330; б: II -антисыворотка к К./аэаапя ИЭГМ АС 43; 1 и 4 - гомогенат клеток того лее штамма; 2 и 5 -гомогенат клеток К.гиЬег ИЭГМ АС 235; 3 и 6 - гомогенат клеток Ш.гЪодосЪгот ИЭГМ АС 330.

Jona (Stackebrandt et al1988), демонстрирует общие взаимосвязи всех исследуемых видов родококков (рис. 9). Большинство видов Rhodococcus объединены в три основные серологические группы, имеющие внутригрупповой показатель сходства не ниже 60%. Одну из групп составляют типовые штаммы Rfascians, R.erythropolis и R.globerulus, последние два из которой характеризуются высокой степенью сходства около 80%; другую - R. "longtis" и Ropacus; наиболее удаленную третью - Rcoprophilits, R.rhodochrous и R. ruber Близкие по данному признаку R.ruber и R.rhodochrous обнаруживают наибольший уровень сходства, достигающий 85%. Самостоятельную ветвь на дендрограмме образует типовой штамм R.rhodnii, не являющийся типичным представителем истинной почвенной микрофлоры и основное местообитание которого - кишечный тракт почвенных беспозвоночных (Goodfellow, Alderson, 1977) Следует отметить, что патогенный для человека и животных вид Requi занимает изолированное положение от свободно живушнх форм и наиболее удален от других видов родококков, показатель сходства с которыми составляет 20 %. Полученные результаты подтверждают правомочность выделения само-

Rfascians ИЭГМ АС 431 _;- .

Rerythropolis ИЭГМЛС7Т __ ;

R.globerulus ИЭГМ ЛС 591 т _J ; -

Rrhodnii ИЭГМ АС 555т -.-Ü

R "longus" ИЭГМ АС 27т -;- \

R. opacus ИЭГМ АС 716Т -:-Г ; -

Rcoprophilus ИЭГМ АС 600 т -;- .

R.rhodochrous ИЭГМ AC 62 т -. --1

Rruber ИЭГМ AC 70 т -Г I

Requi ИЭГМ АС 2 т -;-;-i- j "j

D.maris ИЭГМ АС 55 т ................................................|

G.rubropertinctus ИЭГМ АС 95 т------- j J

G. terrae ИЭГМ AC 143т___.___J~

100 80 60 40 20 0

S, %

Рис. 9. Дендрограмма, построенная на основании данных иммунохимичсского анализа взаимоотношений между отдельными видами рода Rhodococcus.

стоятельных родов Gordona и Dietzia из состава рода Rhodococcus (уровень сходства между ними составляет всего 10-15 %). В целом группирование по данным антигенной специфичности исследуемой группы штаммов согласуется с филогенетической схемой, построенной для родококков на основании секвенирования 16S рРНК (Chun, Goodfellow, 1995; Briglia el al., 1996), в частности в обоих случаях кластерируются одинаковые группы организмов.

Каждая из полученых видоспецифических антисывороток была проверена в РИ со штаммами всей рабочей коллекции. Результаты применения РИ для диагностики родококков, частично представленные в табл. 6 и на рис. 10, свидетельствуют о том, что метод иммунодиффузионного анализа является быстрым и надежным для диагностирования известных видов родококков. Наиболее успешно с помощью РИ диагностируются Rrhodochrous, R.ruber. R.fascians, R.opacus, R'Hongus". Так, например, все из 150 взятых в исследование изолятов, идентифицированных по фенотипическим свойствам как R.ruber, дают реакцию полной антигенной идентичности с антисывороткой против типового штамма R.ruber ИЭГМ АС 70т. С помощью иммунной сыворотки к R.erylhropolis ИЭГМ АС 7Т удается идешифицировать подавляющее большинство природных изолятов этого вида, но не многие коллекционные штаммы, по фенотипическим признакам соответствующие Rerythropolis [25]. Показано, что 8 штаммов, полученных из коллекции ИНМИБ под наименованием R. erythropolis, выявляют полное антигенное тождество с типичным штаммом R.opacus ИЭГМ АС 56. У большинства из них обнаруживаются единичные частично идентичные преципитиногены с типовыми штаммами Rerythropolis, R/'longus", R.rhodochrous и R.ruber. Из 8 анализируемых штаммов Rrhodochrous из коллекции NCIMB гомогенаты лишь пяти дают реакцию полной идентичности с поликлональными антителами Rrhodochrous ИЭГМ АС 62' ; три штамма наиболее близки по антигенному составу типовому R.ruber ИЭГМ AC 701, обнаруживая с ним три общих полностью идентичных преципитиногена. Из 5 штаммов Rhodococcus sp. из коллекции NCIMB для двух (NCIMB 11276, NCIMB 11160) установлено полное антигенное тождество с эталонным штаммом Ropacus ИЭГМ АС 56, двух других (NCIMB 9741, NCIMB 9784) - с типовым штаммом R.ruber ИЭГМ АС 70' и одного (NCIMB 13261) - с таковым Rerythropolis ИЭГМ АС Т. Полученные данные подтверждают сделанный нами ранее вывод о систематической принадлежности культур из коллекций ИНМИБ и NCIMB (см. табл. 3). Интересно отметить, что отдельные изоляты, имеющие феиотипические свойства и Rrhodochrous и Rruber, проявляют большее антигенное родство с Rrhodochrous, чем с Rruber. Данные штаммы имеют с Rrhodochrous ИЭГМ АС 62* три общих преципитиногена и один общий преципитиноген с R.ruber ИЭГМ АС 70'. Особое внимание в нашей работе уделено оценке возможности использования иммунохимического анализа в таксономическом исследовании наиболее часто встречающихся в природе и имеющих экологическую и биотехнологическую значимость видов родококков. Дендрограмма на рис. 10 иллюстрирует результаты кластерирования большого набора (52 изолята) свежевыделен-ных культур данных видов по изучаемому признаку. Как видно из дендрограммы, все штаммы четко группируются в кластеры, совпадающие с обозначенными видами Rhodococcus, что указывает на таксономическую и филогенетическую обособленность последних. Подтверждается вывод о серологическом родстве R.rhodochrous и R.ruber, R."longus" и R.opacus, сделанный ранее на основании изучения антигенной специфичности типовых штаммов данных видов родококков (см. табл. 5). Аналогичное группирование штаммов было выявлено и при дифференциации родококков методом нумерического анализа белковых электрофореграмм и фенотипических признаков.

Таким образом, метод иммунодиффузионного анализа позволяет не только дифференцировать отдельные виды и даже штаммы, но и проследить антигенные взаимоотношения между отдельными таксонами родококков Данный метод, достоинство которого заключается не только в его специфичности, удовлетворительной воспроизводимости

>

Г иэгм ас иэгм ас иэгм ас иэгм ас иэгм ас иэгм ас иэгм ас иэгм ас иэгм ас иэгм ас иэгм ас иэгм ас

иэш ас иэш ас

иэгм ас иэш ас иэгм ас иэгм ас иэгм ас иэгм ас иэгм ас иэгм ас иэш ас иэгм ас иэгм ас иэш ас иэш ас иэш ас иэш ас иэш ас иэш ас иэш ас иэш ас иэш ас иэш ас иэш ас иэш ас v иэш ас г иэш ас иэш ас иэш ас иэш ас иэш ас иэш ас иэш ас иэш ас иэш ас иэш ас иэш ас иэш ас иэш ас иэш ас иэш ас иэш ас иэш ас иэш ас иэш ас иэш ас

7* 16 8

15 212 214 216 270 273 265 250 275

27

30

33

31

28 29 508 716' 60

58 57 56

59 717 61

7 68 4 3т

34 802 277

38 289 171 36

35

39 62т 449 448 64 654 121 760 63 653 582 7 0Т 74 380 333 572

74 347 85 568

75

Н !"' " ¡.:

____Г

-Г ____1

г...:

г

' 1—1

100

80

60

40

20

Рис. 10. Таксономическая дендрограмма. иллюстрирующая результаты изучения антигенных взаимосвязей природных изолятов Ююдососси* Брр. с помощью иммунодиффузионного анализа. А -К.егу1ИгороИ.ч, Б - В - К.орасия, Г - К./ачаап.ч, Д -

К.гИос1осИгои$. Е - КгиЬег.

результатов, возможности получения быстрого лабораторного ответа и сравнения сложных антигенных комплексов, но и возможности использовать малые объемы антисывороток, что не менее важно при значительных масштабах таксономических исследований, рекомендуется для широкой практики в экспресс-диагностике видов родококков.

С целью выяснения серологических связей между родококками и представителями сопутствующих микроорганизмов в задачу исследований входило определение антигенной структуры другого труднодиффе-рекцируеыого таксона актиномицетной линии эволюции прокариотов - рода Micrococcus Cohn 1872 [57]. Опыты перекрестной постановки РИ и нМФА свидетельствуют о серологическом различии представителей родов Rhodococcus и Micrococcus и возможности четкого ах распознавания и разграничения с помощью методов иммунохимического анализа.

Экспресс-индикация и дифференциация Rhodococcus spp. методом иммуиоф-луоресцирующих антител. Иммунофлуоресцентный анализ видового разнообразия родококков. Серией опытов с использованием моновалентных и поливалентных гипериммунных сывороток показана эффективность непрямого метода флуоресцирующих антител не только для идентификации чистых культур различных видов родококков, но и ускоренной детекции и дифференциации Rhodococcus spp. в накопительных культурах, составе смешанных искусственных и естественных сообществ |34, 37, 56, 61J. С этой целью были исследованы накопительные культуры пропанокисляющих бактерий, выделенных из разнообразных природных источников. Характерное яркое желто-зеленое свечение палочковидных клеток родококков позволяет выявлять их во всех исследуемых накопительных культурах. Несмотря на то, что для выделения пропанокисляющих бактерий применяли природные материалы различного происхождения, первичные накопительные культуры характеризовачись крайним однообразием морфологических форм и видового состава. Так, из семи проверенных с помощью диагностических типовых иммунных сывороток видов в накопительных газоокисляющих культурах обнаруживались лишь представители R.ruber и R.rhodochrous, редко - R.opacus. Достаточно четко дифференцируются родококки с помощью поливалентных антисывороток и в искусственных ассоциатах. Однако, в сложных микробных смесях интенсивность специфической иммунофлуоресцен-ции нескольно ниже (2+ ми 3+), чем в чистых культурах родококков. Благодаря строгой видовой специфичности использованных иммунных сывороток во всех исследуемых ассоциатах четко обнаруживалось наличие или отсутствие представителей Rhodococcus spp., что позволяет сократить время анализа видового состава популяции родококков. Исследование обширного природного материала, обогащенного углеводородами, позволило выявить приуроченность отдельных видов Rhodococcus к районам углеводородных скоплений. Так, доминирующие компоненты естественного биоценоза нефтяных загрязнений пресноводных и почвенных экосистем представлены видами родококков - R.erythropolis, Ropacus, R."longus" (табл. 7), выявляемыми с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии на уровне численности ]03-104 клеток/мл (г) в присутствии 1О6-108 клеток/мл (г) сопутствующей микрофлоры. При выявлении и количественном учете отдельных видов родококков в естественных субстратах иммунофлуоресцентное окрашивание проводили непосредственно на мембранных фильтрах. В ряде с.чучаев для увеличения чувствительности анализа применяли кратковременное (6-9 ч) подращивание бактерий, помещая мембранные фильтры на питательные среды, при температуре 28° С. При постановке нМФА в качестве контроля иммунологической специфичности изучали препараты гете-рологических микроорганизмов - K.rosea, M.luteus и Pseudomvnas spp., выделенных и идентифицированных в качестве доминирующих компонентов сопутствующей апкано-трофным родококкам микрофлоры. В контрольных мазках, содержащих тест-культуры гетерологичного вида, специфическое свечение, как правило, отсутствовало. Использование высоких разведений анггиродококковых сывороток, не проявляющих неспецифического свечения, позволяло в работе избежать трудоемкой процедуры многократного их истощения гетерологичными бактериальными антигенами.

Полученные результаты дают основание утверждать, что применение метода им-мунофлуоресцентного анализа в изучении R/iodococcus spp целесообразно. Достаточная чувствительность нМФА, относительная простота проведения и малое количество време-

Таблица 7. Детекция и количественное определение видового состава Rhodococcus в природных субстратах методом непрямой иммунофлуоресцскщш, клеток/мл (г)

Антисыворотка к штамму:

Характеристика и география образца R.erythropolis ИЭГМ АС 7 Г R.ruber ИЭГМ АС 70т R.rhodochrous ИЭГМ АС 62т R."!ongus" ИЭГМ АС 27 R.opacus ИЭГМ АС 56

Вода, контурная зона нефтяного месторождения, Пермская обл. — 2,28х103 - -

Почва, загрязненная нефтью, р-н нефтепромысла, Пермская обл. 6,82х106 8,53х103 3,10х103

Песчаная порода с глубины 6,0 м, Гомельская обл. - 5,69х104 1,10х103 - -

Снег, контурная зона нефтяного месторождения, Пермская обл. 1,62х103

Донные отложения, оз. Байкал, Иркутская обл. — 2,50х103 — — —

Озерная вода, Таймыр, Красноярский край б,42х104

ни для ее выполнения (продолжительность реакции - 1,0-1,5 ч) позволяют за короткий промежуток времени исследовать большое количество природных образцов. Данный метод экономичен, позволяет избежать промежуток времени между забором образца и исследованием его в лаборатории и незаменим в полевых условиях. Быстрое выявление из естественных сообществ родококков, являющихся устойчивым компонентом биоценоза "бактериального фильтра" районов углеводородных скоплений, и экспресс-диагностика данной группы организмов сделали возможным разработку нового подхода к практическому использованию иммунофлуоресцентного анализа для усовершенствования метода микробиологического прогнозирования подземных залежей нефти и газа [37, 42], а также микробиологического контроля углеводородного загрязнения окружающей среды [56].

Перечисленные выше методы иммунохимического анализа на протяжении ряда лет успешно применяются в лаборатории алкшотрофных микроорганизмов ИЭГМ УрО РАН и Региональной профилировашюй коллекции алканотрофных микроорпшазмов ИЭГМ в таксономических и экологических исследованиях Rhodococcus Брр. В рамках проблем нефтегазопоисковой микробиологии разработан экспресс-метод индикации и идентификации индикаторных на нефть и газ пропан- и буганокисляющнх родококков на основе непрямой иммунофлуорееценции [18. .37. 42]. Способ прошел многолетние опьгпю-мстодичсские испытания в Пермской и Ульяновской областях РФ. различных регионах Белоруссии при производстве водной, снсжиой и грунтовой биогеохимических съемок, а также при поисковой оценке структур, подготовлешшх к разведочному бурению.

Цитируемая литература

1. Иммунологические методы/Под ред. Х.МФримсля. М. : Мир, 1979, 518 с.

2. Chaparas, S.D, Brown. Т.М., Hyman, I.S. // Int. J. Syst. Bactcriol., 1978,28, 547-560.

3. Cummins, C.S. // Amer. Rev. Resp. Dis., 1965, 92. 63-72.

4. Goodfellovv,M., Alderson. G. //J. Gen. Microbiol.. 1977, 100,1, 99-122.

5. Kwapinski, J.B. // In: The Actinomycetales. H.Prauser (ed.). Gustav Fischer Verlag. Jena, 1970,

345-369.

6. Norlin. M., Lind, A., Öuchterlony, О. HZ. Immun. Forsch. Exp. Thcr., 1969, 137, 2, 241-248.

7. Raynev, F.A.. Klaue. S., Kroppenstedt, R.M., Stackebrandi, E. // Int. J. Syst. Bactcriol., 1995, 45, 1,

32-36.

8. Ridell, M. Serological relationships of Nocardia. Mycobacterium. Corynehaclenum, and the rhodo-chous taxon with special reference to taxonomy. Göteborg, 1977,52 pp.

9. Ridell, M. // In: Actinomyces. Stuttgart, New York: Fischer, 1981. 235-241.

10. Ridell, M.. Norlin, M. // J. Baclenol.. 1973. 1 1.3. 1. 1-7.

11. Stackebrandl. E, Smida. J.. Collins, M D. // J. Gen. Appl. Microbiol., 1988, 34. 4, 341-348.

IV. ОСОБЕННОСТИ БИОЛОГИИ РОДОКОККОВ В УСЛОВИЯХ ИНДУКЦИИ ФЕРМЕНТНОГО ОКСИГЕНАЗНОГО КОМПЛЕКСА

Описанные [9, 28-29, 31, 58] фенотипические особенности родококков - присутствие в клетках полифосфатов, гликогена, поли-Р-оксибутирата как дополнительных энергетических субстратов; диауксотрофныс свойства; ацидо-, алкало-, гало-, ксеро-, термо- и осмотолерантность; способность к олиго- и психротрофии, утилизации трудноусваивае-мых органических веществ - обеспечивают их чрезвычайно широкое распространение в природе. Перечисленные свойства обусловливают приуроченность родококков и к специфическим местообитаниям, к таким как биотопы районов нефтяных загрязнений и нефтепромыслов, биотопы с повышенным содержанием минеральных солей и пр. С экологической точки зрения особый интерес представляет способность родококков синтезировать все компоненты клеток за счет тяжелых газообразных и жидких н-алканов. Только одно уже это свойство делает их наименее зависимыми от внешней среды и позволяет существовать в условиях, неблагоприятных для других микроорганизмов. В этой связи

более пристального внимания и отдельного изучения заслуживает вопрос о своеобразии структурной и метаболической организации родококков, появлении их качественно новых клеточных струстур и физиологических свойств в условиях переключения с углеводного на углеводородное питание Следует еще раз подчеркнуть неравномерность изученности Rhodococcus spp.: при наличии довольно большого числа работ но экологии родококков (Квасников, Клюшникова, 1981, Гусев и др., 1985; Коронелли и др., 1987;Паников и др , 1989; Goodfellow, Minnikin, 1981; Finnerty, 1992), до сих пор слабо изучены их морфологические, ультраструктурные, физиолого-биохимические особенности, составляющие основу биоразнообразия любой группы микроорганизмов. В настоящей главе изложены результаты исследований биологических особенностей родококков при росте их на разных питательных средах: в присутствии н-алканов и без них. Выявленные характерные особенности Rhodococcus spp. значительно расширяют адаптивные возможности родококков и могут рассматриваться как одно из свидетельств исключительной пластичности исследуемой группы организмов, обеспечивающей выживание их в естественных биотопах, характеризующихся экстремальными значениями внешних условий

Морфогенез, поверхностные структуры, своеобразие ультраструктурной организации и клеточные приспособления алканотрофных родококков. Изучение морфологического разнообразия природных изолятов позволяет распределить их по возрастающей сложности дифференциации клеток в жизненном цикле в ряд: R.etylhropohs -RJascians - R.rhodochrous - R."/o?igus" - R.opacas - Rruber. Следует отметить, что все представители R.ruber с наиболее выраженным жизненным циклом и мицелиальной стадией развития клеток (в морфоцикле R.ruber обнаруживается четыре формы клеток' прорастающая, ветвистая, палочковидная и переживающая) характеризуются способностью ассимилировать, наряду с жидкими, тяжелые газообразные л-алканы Не исключено предположение (Калакуцкий, Агре, 1977), что фрагментация мицелия увеличивает отношение клеточной поверхности к объему и тем самым повышает способность родококков в поглощению трудноусвояемого субстрата. У всех исследованных штаммов преобладает раскалывающийся способ обособления делящихся клеток (рис. lia, в). В результате этого образуются так называемые (Иванов, Угодчиков, 1984) клампы плоской формы с характерным v-сочетанием клеток. На полюсах многих клеток обнаружены кольцевидные выступы, соответствующие стеночным "шрамам", разделяющим активно растущую молодую часть клетки с тонким слоем пептидогликана и старую часть с утолщенным ригидным слоем (рис. 116, в). Дополнительная информация о морфологических особенностях родококков получена с помощью сканирующей электронной микроскопии при изучении архитектоники формируемых ими колоний. Наиболее сложной архитектурой отличаются колонии Rruber, дифференцированные на субстратную и надсубстратную зоны роста. Способы кооперации клеток в колониальной популяции разнообразны на уровне видов и штаммов Rhodococcus spp - от слипания пептидогликановых слоев клеточных стенок до формирования одиночных пилевидных поверхностных тяжей и множественных шишковидных выростов на наружной поверхности клеточной стенки (рис. 11а). Очевидно, образование морфо-функцнональных межклеточных контактов в колониях, способствующих возникновению коммуникаций между контактирующими клетками и эффективной генерации ответа "кооперативной клеточной системы" на возможные экологические ситуации, - характерный приспособительный признак родококков, обеспечивающий их сохранение в природных средах. Можно предполагать, что в естественных условиях закрепление Rhodococcus spp. на субстрате вдет либо за счет адгезии клеток на его поверхности, либо (подобно колонизации мицелиальных актиномицетных организмов) за счет врастания клеток в субстрат, образования в нем ветвистых особей и формирования мицелиопо-добньгх структур [10, 32|.

В результате электронно-микроекопнчеекого изучения природных штаммов родококков получены данные, в том числе ранее неизвестные, о реальных изменениях в струк-

Рис. 11. Клетки Л.гиЬег ИЭГМ АС 333, выращенные на мясопептонном агаре (б, в, г) и в присутствии пропана (а), в сканирующем микроскопе.

а, в - х 36 ООО; б - х 40 ООО; г - х 22 ООО. Стрелкой показаны кольцевидные выступы, разделяющие клетку на "новую" (н) и "старую" (с) зоны роста; двойной стрелкой -шишковидные выросты на поверхности клетки.

турно-функциональных комплексах углеводородокисляющих клеток, которые находятся в четкой зависимости от длины углеродной цепи утилизируемого ростового субстрата (10. 39,46). Наиболее типичными реакциями родококков на присутствие газообразных и жидких и-алканов являются наличие фибриллярных, реже гомогенных капсул полисахарид-нон природы, обнаруживающих родство к рутениевому красному (рис. 12а; 13д), вакуо-леподобных образований, нередко расположенных во всей цитоплазме и обладающих ультраструктурными характеристиками, свойственными гранулам поли-[3-оксибутирата (рис 126), повышение содержания осмиофнльных включений, соответствующих по цитохимическим реакциям гранулам полифосфатов (рис 13а) и увеличение их размеров (до 100 нм). Отличительная особенность клеток, выращенных на пропане или н-бутане. -фрагментация цитоплазмы (рис. 126); большое число жировых включений (рис. 13а), формирование оксисомоподобных структур (рис. 12а). см. Когтепс1у, \Vayman. 1974. представляющих собой специализированные участки локализации окисляющих ферментов, которые необходимы для трансформации углеводородного субстрата; образование развитой внутриклеточной мембранной системы, представленной различными конфигурациями и расположенной по периферии цитоплазмы (рис 13е). Преимущественная локализация выявленных сложных внутриклеточных мембранных образований около клеточной стенки свидетельствует о их вероятной роли в увеличении поверхности цитоплазма-тической мембраны и метаболизме газоокисляющих родококков Особый интерес представляет выраженная лабильность клеточной стенки родококков. культивируемых в присутствии пропана или н-бутана (рис 13в). В пропанокисляюших клетках обнаруживается активный синтез новых участков клеточной стенки, степень разрастания которой усиливается при росте родококков на/(-бутане Около разрастаний клеточной стенки обычно

Рис. 12. Ультратонкие срезы клеток Ип/Ьег. выращенных на минеральной среде в присутствии пропана (а, б) п мясопелтонном агаре (в. г) а - штамм ИЭГМ АС 333. » 80 ООО, 5 - штамм ИЭГМ АС 565, > 70 ООО. в -штамм ИЭГМ АС 580. ' 80 ООО. г - штамм ИЭГМ АС 333. у 60 000 КС - клеточная стенка; Н - нуклеомд: Г1 - поперечная перегородка. ВМС -внутрицитоплазматическая мембранная система. В - волютин: Ж - жировые включения. ФЦ - фрагментация цитоплазмы, ПОБ - поли-/^-оксиб\тират; ОС -оксисомоподобные структуры. МК - микрокапсула

Рис 13. Ультратонкие срезы клеток H.nibct, выращенных на минеральной среде в присутствии м-алканов. пропана (а, в, е). я-пентана (б), //-октана (г) и н-гексадекана (д).

а - штамм ИЭГМ АС, 73, * 100 ООО. б - штамм ИЭГМ АС 79. у 85 ООО, в -штамм ИЭГМ АС 342, * 50 ООО, г - штамм ИЭГМ АС 87, .< 80 ООО. д - штамм ИЭГМ АС 333, > 85 ООО; е - штамм ИЭГМ АС 342, * 100 000. МК -микрокапсула, В - волютин, Ж - жировые включения, ВМС — внутрицитоплазматическая мембранная система, РКС - разрастание клеточной стенки.

выявляются мезосомы, имеющие контакт с пограничной цитоплазматической мембраной, и электронно-плотные включения (оксисомы). Биологический смысл этих новообразований остается неясным. Очевидно, избыточный рост клеточной стенки, увеличивающий ее поверхность, связан с созданием своеобразного депо, обеспечивающего фиксацию поступающего гидрофобного ростового субстрата. Особенность улыраструктуры родококков, метабол изирующих жидкие н-алканы (С5, С^. С]$), — аккумуляция углеводородов на поверхности клеточной стенки и цитоплазматической мембраны, появление в цитоплазме обширных участков вакуолизации (рис. 13д) - мест депонирования и-алканов в клетке и присутствие около них кольцевидных внутрицитоплазматических мембранных структур. Изучение топографии окислительных ферментов и каталазной активности в субклеточных структурах родококков с помощью цитохимических реакций показало, что продукт реакции с окисленным 3,3'-Диаминобензидином дискретно локализуется, как правило, на наружном слое внутрицитоплазматических мембран и, частично, в цитоплазме. Продукт реакции на каталазу чаще всего обнаруживается между цитоплазматической и наружной мембранами клеточной оболочки всех исследуемых штаммов, а также в цитоплазме в виде множественных осмиофильных сферических или продолговатых гранул

Таким образом, электронно-цитохимический анализ алканотрофных родококков делает очевидной коррелятивную связь их поверхностных и мембранных ультраструкгур с деструктивными процессами ;/-алканов. Убедительным доказательством функциональной приспособленности родококков, инкубированных в присутствии я-алканов (Сз, С4, С5, Си, С^), является исчезновение наблюдаемых изменений в ультратонком строении клеток по мере многократных серийных пересевов последних и инкубации их на стандартных органических средах. Выявленные своеобразные клеточные приспособления Шгойососсгя эрр. отражают метаболическое состояние клеток родококков, связанное с потреблением ими гидрофобного ростового субстрата.

Особенности антигенной структуры родококков, культивируемых на разных средах. //-Алканы являются субстратом, индуцирующим ферментные системы его гидро-ксилирования и, стало быть, способствующим количественному и качественному изменению определенных биохимических комплексов бактериальных клеток, отличающихся, возможно, по своей антигенной структуре. Отсюда возникла мысль о их выявлении с помощью иммунохимических реакций. В связи с этим представляется важным факт выявления в клетках пропан- и бутанокисляющих родококков в условиях перехода их на углеводородное питание дополнительных специфических антигенов, указывающих на развитие клеток за счет конкретного ростового субстрата - пропана или я-бутана [17, 36|. Как видно из рис. 14, полный спектр преципитационной системы АС-Аг И отличается от такового системы АС-Аг I по отсутствию одной специфической линии преципиатции А и резкому ослаблению степени интенсивности преципитационной дуги В Истощение антисыворотки к штамму Л.гиЬег ИЭГМ АС 333, культивируемому на среде с пропаном, гомоге-натом клеток того же штамма, выращенного на МПА, подтвердило идентичность полос преципитации С, Б, Е и В для данного организма вне зависимости от условий его культивирования. Направленный синтез больших количеств специфических дополнительных антигенов (лреципигацяонные дуги А и частично В) в клетках родококков, культивируемых в присутствии пропана (а не на МПА), можно, по-видимому, объяснить индукцией субстратом питания синтеза соответствующих антигенспецифических энзимных систем его утилизации. Обнаружение функциональных антигенов подтверждает адаптивную природу ферментов окисления газообразных углеводородов, которые формируются только после появления данного субстрата в среде. Результаты иммувохимического анализа позволяют считать, что, если выявляемые дополнительные антигены принадлежат к числу высокомолекулярных белков, то их содержание находится в пределах чувствительности иммунохимических методов исследования Следует отметить, что антисыворотка, полученная при иммунизации кроликов гретой (корпускулярной) вакциной Я.гиЬег ИЭГМ

АС 333, не выявляла дополнительных полос преципитации с Аг I, характерных для системы АС-Аг I. То, что функциональные антигены выявляются в разрушенных клетках, дает основание предполагать их локализацию в цитоплазме, возможно, мембранных структурах клеток родококков.

Рис. 14. Реакция двойной иммунодиф фузии в агаровом геле системы: антисыворотка АС против штамма Я.гиЬег ИЭГМАС 333, культивируемого в присутствии пропала, - гомогенат этого же штамма, выращенного на пропане Аг I (а); гомогенат этого же штамма, выращенного на мясопептонном агаре Аг II (б).

Таким образом, выращивание родококков в атмосфере пропана определяет наличие у них дополнительных антигенов, не выявляемых у данных организмов при культивировании на МПА и являющихся феноменом, обусловленным особенностями углеродного метаболизма газоокисляющих родококков. Специфические дополнительные антигены не найдены у родококков, не способных усваивать пропан и ;/-бутан в качестве единственного источника углерода. Установленная закономерность подтверждена с помощью метода иммуноэлектрофореза |20] и может быть использована для направленного поиска родококков, обладающих способностью ассимилировать газообразные углеводороды и обитающих в различных экосистемах.

Сверхсинтез внеклеточных аминокислот газонспользуюшими родококками. Установлено, что при переходе родококков с углеводного на углеводородное питание изменяется качественный и количественный состав экстрацеллюлярных аминокислот [23, 30]. Так, если аргинин выделялся в среду с глюкозой только девятью штаммами родококков, то при росте на синтетической среде с пропаном его выделяют в культураль-ную жидкость все 25 исследуемых штаммов. Увеличивается и число штаммов родококков, накапливаемых экстрацеллюлярные валин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, в то время как число штаммов, выделяющих гистидин, глицин, глутаминовую кислоту, изолейцин, тирозин и треонин с серином, нескольно снижается (рис. 15). Все исследуемые штаммы К.гиЬег накапливают при росте на среде с пропаном преимущественно ала-нин, аргинин (до 0,9 тМ/л) и валин (до 1,2 тМ/л). Реже обнаруживаются гистидин (до 1,5 гпМ/л), глутаминовая кислота, фенилаланин (до 0,4 тМ/л) (табл. 8). Состав синтезируемых аминокислот зависит от индивидуальных особенностей исследуемых штаммов Шю-с1ососси.1 Брр. и природы утилизируемого субстрата. Родококки при выращивании их на глюкозо - минеральной среде и на среде в атмосфере пропана способны в процессе роста

а

б

Таблица 8. Накопление экстрацеллюлярных аминокислот штаммами В.гиЬег на различных средах, тМ/л

Аминокислота ИЭГМ АС 333 ИЭГМ АС 340 ИЭГМ АС 341 ИЭГМ АС 370 ИЭГМ АС 639

Алании 0,05/0,02 0,05/0,08 0,74/0,85 0,52/0,49 0,46/0,23

Аргинин 0,07/0,79 Сл./0,55 -/0,21 -/0,28 Сл./0,25

Аспарагиновая кислота Сл./Сл.

Валин 0,22/1,21 -/0,14 0,34/0,57 0,16/0,54 0,33/0,84

Гистидин 0,04/1,37 0,04/0,27 Сл./- 0,06/0,38 0,18/1,47

Глицин Сл./- -/- Сл./-

Глутаминовая кислота 0,06/0,08 -/0,08 -/0,23 0,10/0,37

Изолейцин 0,11/0,28 0,08/- -/- -/Сл. 0,12/-

Лейцин -/Сл. -/- -/0,09 -/0,01

Лизин 0,06/1,09 Сл./0,57 -/Сл. -/0,46 -/0,34

Метионин 0,04/0,19 0,04/- -/- -/-

Тирозин 0,13/- 0,09/Сл. -/- 0,08/0,34

Треонин + серии 0,09/0,19 0,09/- -/- -/- -/Сл.

Фенилаланин 0,03/0,08 0,03/Сл. -/- -/- 0,05/0,24

Сумма аминокислот 0,90/5,30 0,42/1,69 1,08/1,63 0,74/2,47 1,32/4,09

Примечание. Приведены средние значения трех параллельных проб. В числителе - источник углерода в минеральной среде - глюкоза, в знаменателе - пропан.

сер

Рис. 15. Количество штаммов родококков, обра)ующих экстраиеллюлярные аминокислоты на средах с глюкозой и в присутствии пропана. а - накопление экстрацеллюлярных аминокислот на глюкозо-минеральной среде. б - на среде в атмосфере пропана. * Незаменимые аминокислоты.

синтезировать и выделять в среду, как правило, несколько аминокислот - от трех до двенадцати. Свсрхсинтез аминокислот выше у родококков, культивируемых в присутствии пропана. Природные изоляты R.ruber ИЭГМ АС 333, ИЭГМ АС 340, ИЭГМ АС 341. ИЭГМ АС 370, ИЭГМ АС 371 при росте на пропане в качестве единственного источника углерода - активные продуценты аминокислот, что позволяет рекомендовать их в качестве исходного материала для селекции перспективных форм, синтезируемых преимущественно одну аминокислоту в количестве, досточном для производства Помимо практической значимости, которую может иметь способность алканотрофных родококков накапливать внеклеточные аминокислоты, это, возможно, имеет значение и с экологической точки зрения. Известно, что в обмене вешеств между организмами биоценозов важную роль играют свободные аминокислоты, влияющие на развитие комплексов микробных ассоциаций. Не исключено предположение, что экстраиеллюлярные аминокислоты, синтезируемые газоокисляющими родококками в естественных субстратах с минимальным содержанием органических веществ, могут быть использованы в процессе жизнедеятельности другими группами гетеротрофных микроорганизмов ценоза

Синтез поверхностно-активных веществ родококками при росте их на м-ялканах. Изучены поверхностно-активные и эмульгирующие свойства 150 природных изолятов Rhoiiococcm spp при росте их на углеводных и углеводородных субстратах [54, 65-66]. Показано, что родококки только в присутствии л-алканов (Си., Ci:-Cit) способны синтезировать активные сурфактантные комплексы, снижающие поверхностное и межфазное натяжение воды до 26-28 и 2-5 мН/м, соответственно (табл 9) Продуцируемые сурфактанты проявляют высокую эмульгирующую активность (Ем - 53.0-62,5 %), образуя стабильные эмульсин типа "'масло/вода" или "вода/масло" Установлено, что продуцируемые родококками биоэмульгируюшие комплексы при добавке к буровому шламу и нефтезагрязненному песку проявляют активные нефгеотмывающие свойства, демонстрируя через 48 ч 85-90%-ное отделение нефтяной фракции от нефтесодержаших песка и шлама Следует отметить, что выделение биосурфактантов затруднено (I) невозможностью полного отделения клеток родококков от продуцируемого ими экзогенного сурфак-

Таблица 9. Поверхностно-активные и эмульгирующие свойства Rhodococcus $рр. при росте на н-гексадекане

Вид, штамм Поверхностное Межфазное Индекс

натяжение, мП/м натяжение, мН/м эмульгирования, В24, %

R.eryihropotis

ИЭГМ АС 20 26, 6 4,8 53 0

ИЭГМ АС 185 26, 9 3,6 51 5

ИЭГМ АС 188 26, 3 3,5 37 9

R."longus"

ИЭГМ АС 28 27, 0 Нет данных 53 8

ИЭГМ АС 29 27, 8 1,9 60 5

ИЭГМ АС 68 26, 9 1,7 59 ,8

R.opacus

ИЭГМ АС 58 26, 5 Нет данных 54 ,6

ИЭГМ АС 59 27, 3 4,8 56 ,4

ИЭГМ АС 60 25, 8 1,3 60 ,6

R.ruber

ИЭГМ АС 74 27, 7 2,0 57 ,8

ИЭГМ АС 219 27, 8 1,6 62 ,5

ИЭГМ АС 235 27, 0 1,8 60 ,3

ИЭГМ АС 326 28, 3 3,5 53 ,9

ИЭГМ АС 339 26, 9 2,0 56,6

ИЭГМ АС 342 27, 1 2,5 58,7

тантного материала и (2) высокой стоимостью и низкой эффективностью традиционно используемых экстракционных методов Для эффективного выделения поверхностно-активных комплексов родококков разработан оригинальный метод, позволяющий избежать опасности интродукции живых клеток ролококков в природную среду и включающий экстрагирование биосурфактантов метнл-третичнобутиловыи эфиром (МТБЭ) в режиме ультразвукового озвучивания Новый растворитель МТБЭ отличается от традиционно используемых, как то смесь хлороформа с метанолом, дихлорметан (Короиелли и др , 1993. КгИзсЬшсг е/ а1., 1980) низкой токсичностью и высокой биодеградабельностью. МТБЭ относится к общедоступным и относительно дешевим реагентам, поскольку широко используется для повышения октанового числа бензнна. а также в медицине и ветеринарии для растворения желчных конкрементов. Способность к снижению поверхностного натяжения воды сурфактантов. выделенных с помощью МТБЭ. дихлорэтана и хлороформ-метанола, сравнительно одинаковая, наибольшая .межфазная активность характерна для биосурфактантных комплексов, экстрагируемых МТБЭ <3.1 мН/м) Экстрагирование в условиях ультразвукового озвучивания (20 мин при частоте 44 кГц) увеличивает выход сурфактантов в 2.0 раза В дальнейшей работе выделение повер.хносшо-активных комплексов родококков проводили с помощью МТБЭ в сочетании с ультразвуковой обработкой Изучение с помощью хроматографического и спектрометрического методов качественного состава сурфактантных комплексов, синтезируемых наиболее активными биосинтетиками двух видов родококков 1<.ег\111гороН.<, и И.гиЬег, показало, что в состав

поверхностно-активных комплексов входят глпколипиды, свободные жирные кислоты и спирты. В неочищенных экстрактах сурфактантов содержится также значительное количество белка (7,5-16.0 вес%), свободные гексозы и остаточный н-гексадекан. Известно (Cooper, Zajic. 1980), что наибольшей поверхностной активностью обладают гликолипи-ды. Исследование методом высокоэффективной тонкослойной хроматографии препаратов очищенных гликолипидных комплексов выявило, что представители R.rtiber продуцируют наряду с описанными ранее (Коронелли и др., 1993; Wagner et al., 1983> корино-мнколатами трегалозы дополнительный неидентифицированный гликолппид, обладающий более выраженной полярностью по сравнению с гликолипидами исследованных штаммов R.erythropohs Полученный препарат (Rt 0,93) снижает поверхностное и межфазное натяжение воды до 26.8 и 0,9 мН/м, соответственно, (критическая мицеллярная концентрация - 54.0 мг/л). Активность очищенного глпколнпидного комплекса из К. ruber ИЭГМ АС 231 сопоставима с таковой коммерческого препарата из Bacillus subtilis и значительно превышает активность тотатьно используемых синтетических сурфактантов. Сравнительные данные токсичности глпколнпидного биосурфактанта из [{.ruber и других биогенных (из R.erythropohs, Fs.aerugino.sa). а также синтетических (стеарат сукро-зы DK50. корексит 9597. инипол ЕАР22; финазол OSR-5) сурфактантов свидетельствуют о том. чю полученный препарат в 100 раз менее токсичен, чем синтетические сурфактан-ты, и в 2-10 раз, че.м трегалозо- и рамнолипиды из R.eiythropohs и Ps.aerugmosa.

Таким образом, родококки при росте на н-алканах синтезируют свойственные только им своеобразные поверхностно-активные вещества, способствующие солюбили-зации углеводородных субстратов (Коронелли и др., 1993) и играющих, по-видимому, решающую роль в очистке биотопов от нефтяных загрязнений.

Полученные бносурфактантные комплексы-ЛЛи/нсжсчк успешно используются в качестве эффективных добавок в полевых экспериментах по биоремедиашш с применением экологически беюпасной технологии компостных силе.м с повышенным вентилированием По нашим данным [65). эффективность очистки после 4-х месяцев биоремешашш пахотной дсриово-подюдистой почвы после аварийного разлива нефти и пластовых вод в районе нефтепромысла составляет 60.0

Повышение антибнотнкорсзнстснгностн родококков в условиях их роста на к-алкаиах. В сравнительных исследованиях [40, 68| родококков, культивируемых в присутствии газообразных (С.5-С4) и жидких (Cie) и-алканов и на средах без них (МГ1А. МПБ), обнаружена различная степень чувствительности к антибиотикам в условиях переключения клеток на углеводородное питание (табл. 10) Отличительная особенность родококков, выращенных на минеральной среде в атмосфере пропана. - их высокая "феногипическая'' резистентность к действию олеандомицина, линкомицина, оксацилли-на, цефалексина (средний диаметр зоны отсутствия роста 9-10 мм), а также неомицина. эритромицина, клнндамицина и хлорамфеникола (средний диаметр стерильной зоны 1415 мм) Выявленные закономерности повышения устойчивости исследуемых культур к широкому спектру антибиотических веществ (аминогликозидам, линкозамидам, макролидам. а -лактамным и ароматическим соединениям) при росте родококков на газообразных н-алканах обнаруживаются и при культивировании их с жидкими углеводородами. Однако, в данном случае снижение степенн чувствительности к большинству испыту емых антибиотиков носит менее выраженный характер (см. табл. 10) Следует заметить, что наибольшее количество резистентных форм алканотрофных родококков выявлено в отношении антибиотических веществ, образуемых актиномицетами Так, при смене источника углерода происходит изменение чувствительности родококков к почти 80% используемых aimtôtiOTiiKOB актиноминетного происхождения н только к двум препаратам (ок-сациллину и иефалексину) - полусинтетическим производным соединений, продуцируемых несовершенными грибами Полученные данные свидетельствуют о том. что выявленные различия в антибиотикорезистентности Rliotlococcus spp определяются своеобразной метаболической организацией данной группы организмов и являются непосрсдст-

Таблица 10 Влияние условий культивирования родококков на их чувствительность к антибиотикам (диаметр зоны отсутствия роста, мм)

Мясопептонный Минеральная среда п присутствии

Антибиотик агар пропана //-гексадекана

Аминогликозиды

Тентами цин 36, 2 ± 4, 8 17, 4 ± 2,4 29,1 ± 4,2

Канамицин 32, 7 ± 5, 4 22, 4 ± 5,2 30,2 ± 7,2

Мономицин 33, 6 ± 4, 0 17, 5 ± 3,6 Нет данных

Неомицин 29, з ± 6, 2 15 4 ±5,6 25,7 ± 4,0

Стрептомицин 33, 1 ± 2, 8 25, 0 ± 3,8 Нет данных

Макролидн

Олеандомнцин 33, 2 ± В, 8 9, 2 + 5,4 16,3 + 7,2

Эритромицин 40 1 ± 6,8 14 1 ± 7,7 29,5 ± 4,8

Липкозамиды

Линкомицин 25 1 ± 8 0 9 4 ± 5,6 11,3 ± 3,4

Клиндамицин 21 2 ± 8 4 15 2 ± 7,2 12,6 ± 6,8

Пепициллипы

Ампициллин 36 6 ± 6 0 33,3 ± 6,2 39,7 ± 8,8

Бензилпенициллин 38 1 ± 4 4 35 5 ± 3,4 33,4 ± 8,4

Карбенициллин 44 2 ± 6 4 32 3 ± 3,6 51,8 ± 5,8

Метицнллин 8 2 ± 4 4 6 0 ± 0,8 6,0 ± 1,4

Оксациллин 20 2 ± 4 2 9 3 ± 6,2 12,3 + 5,7

Тетрацитины

Доксициклин 25 ,1 ± 6 ,4 37 5 ± 5,0 35,6 ± 9,4

Тетрациклин 31 ,2 ± 6 ,0 33 3 ± 5,2 41,7 ± 8,0

Налндиксовая к-та 6 3 ± 1 ,0 6 1 ± 0,8 6,0 ± 1,0

Полимикснн 9 ,1 ± 4 ,2 6 о + 1,6 9,2 ± 3,2

Ристомицин 26 ,2 ± 7 ,2 27 7 ± 8,0 34,2 ± 6,8

Рифампицин 41 ,0 ± 8 ,0 23, 6 ±10,4 45,0 ± 14,7

Фузидин 50 ,1 ± 3 ,4 46 , 2 + 8,4 54,3 ± 4,0

Хлорамфеникол 30 ,1 ± 5 ,4 15 ,0 ±7,6 13,3 ± 6,9

Цефалексин 14 ,5 ± 6 ,3 9 ,0 + 6,7 14,4 ± 5,8

Примечание. Приведены средние показатели антибиотикочувствительноети 17 штаммов

limber.

венным следствием их жизнедеятельности на среде, содержащей н-алканы в качестве единственного источника углеродного питания.

Исследование возможных механизмов антибиотикорезистентности родококков в условиях углеводородного питания показало значительное увеличение количества суммарных липидов (до 28 %) в антибиотикоусггойчивых клетках по сравнению с клетками антибиотикочувствительных штаммов. Так, в клетках КгиЬег ИЭГМ АС 333, выращенных в атмосфере пропана (количество общих липидов 11,8 ± 2,5 % от сухого веса клеток), наблюдается повышение суммарных липидов при внесении в среду культивирования хло-рамфеникола (на 6,1 % по сравнению с контролем) и менее значительное возрастание ли-пидного содержания (на 2,4 %) при добавлении линкомицина. Данная культура, выращенная на н-гсксадекане (количество общих липидов 22,3 ± 8,2 %) в присутствии линкомицина и эритромицина, характеризуется достоверным увеличением суммарных клеточных липидов на 5,3 и 3,8 %, соответственно. При культивировании ЯгиЬег ИЭГМ АС 333 в МПБ (количество общего липида 14,6 + 4,2 %) адаптивного повышения липидного состава при добавлении антибиотиков не наблюдается. В регуляции поступления антибиотиков в клетку существенную роль играют фосфолипиды. Так, в клетках родококков, культивируемых на и-алканах, обнаруживается большее качественное разнообразие фос-фолипидов по сравнению с таковыми при росте в МПБ. Отличительная особенность родококков на углеводородных средах - присутствие в клетках нейтрального фосфолипида кардиолипина и его предшественника фосфатидилглицерина. Данные компоненты клеточной мембраны, по-видимому, способствуют снижению проницаемости клеточной оболочки для молекул антибиотиков и тем самым развитию антибиотикорезистентности. Так, известно (Смирнов и др., 1987), что кардиолипин вызывает повышение ригидности клеточной оболочки стафилококков, снижая чувствительность данных организмов к действию бацитрацина и энрамицина. Потребление я-алканов родококками сопровождается изменением состава клеточных жирных кислот. Как видно из табл. 11, в клетках, выра-

Таблица 11. Жирно-кислотный состав клеточных липидов КгиЬег ИЭГМ АС 333, выращенного на разных средах в присутствии антибиотических веществ

Жирные кислоты, % к общему количеству

Антибиотики Предельные Непредельные и разветвленные Сщ-Си С16-С21

Контроль (среда без антибиотика) 47,8/67,5 52,7/32,4 18,8/6,3 81,7/93,6

Гентамицин 48,1/52,6 52,1/46,3 9,6/11,5 90,6/87,4

Канамицин 50,2/65,1 49,8/34,9 16,4/11,3 83,6/88,7

Оксациллин 52,2/64,4 46,1/35,2 22,5/10,7 75,8/88,9

Хлорамфеникол 43,7/67,8 56,8/31,4 10,3/21,8 90,2/77,4

Эритромицин 47,3/68,3 52,6/31,8 7,3/4,4 92,6/95,7

Примечание. В числителе - МПА, в знаменателе - минеральная среда с к-гексадеканом.

Таблица 12. Интенсивность дыхания клеточной суспензии ИгиЪег ПЭГМ АС 333, предварительно выращенного в атмосфере пропана (при внесении в полярографическую ячейку антибиотических веществ)

Вносимый в Используемая Скорость поглощения Вносимый в Используемая Скорость поглощения

полярографическую концентрация С>2 (нмоль/ч-мг сухих полярографическую концентрация 02 (нмоль/ч-мг сухих

ячейку антибиотик (мкг/мл, Ед/мл) клеток) ячейку антибиотик (мкг/мл, Ед/мл) клеток)

Бензилпенициллин 0 4 7 X ю2 Олеандомицин 0 5 2 X ю2

4 3 7 X ю2 5 5 6 X ю2

10 4 1 X ю2 10 6 3 X 102

40 4 4 X Ю2 20 6 8 X 102

80 2 8 X Ю2 40 6 7 X ю2

Оксациллин 0 4 5 X 102 Эритромицин 0 5 1 X 102

200 5, 1 X 102 2 5 6 X 102

400 5, 2 X 102 4 5 8 X 102

1000 4, 5 X 102 20 5 0 X 102

Канамицин 0 5, 1 X 102 Полимиксин 0 4 8 X 102

10 5, 8 X 102 100 6 0 X 102

40 6, 7 X 102 1000 6 8 X ю2

80 8, 0 X 102 4000 7 9 X ю2

160 8, 4 X 102 16000 3 4 X ю2

Линкомицин 0 4, 9 X 102 Хлорамфеникол 0 5 3 X ю2

100 б, 0 X 102 20 5 8 X ю2

240 6, 9 X 102 40 5 6 X ю2

480 5, 8 X ю2 120 5 3 X ю2

560 5 3 X ю2

щенных на жидких н-алканах, преобладают предельные неразветвленные жирные кислоты (Ci6 o, С ил, С21 о), тогда как в аотибиотикочувствительных клетках (культивируемых в МПБ) отмечается сравнительно меньшее количество указанных, компонентов за счет повышения содержания непредельных и разветвленных жирных кислот, "разрыхляющих", по образному выражению В.В.Смирнова с соавт. (1987), структуру клеточной оболочки и способствующих повышению ее проницаемости для молекул антибиотиков. Естественно, адаптивная резистентность родококков к антибиотикам - результат синергического действия нескольких разных механизмов, работающих па внутриклеточном уровне. Поскольку бактериальные липиды действуют как модуляторы ферментативных реакций, то, несомненно, в процесс возрастания антибиотикорезистентносги алканотрофных родококков вносят вклад не только особенности липидного состава, но и связанная с ним ферментативная активность. Как видно из табл. 12, устойчивость углеводородокисляющих родококков к антибиотикам результат неспецифическои атаки окислительных ферментных систем, приводящей либо к полной деградации (в случае линкомицина) или частичной трансформации (в случае олсандомицина) антибиотических веществ

Таким образом, приведенные сведения еще раз и с новой стороны подчеркивают многообразие метаболических возможностей алканотрофных родококков. Особый интерес представляют экологические аспекты этой проблемы. Очевидно, пониженная чувствительность к антибиотикам (продуцируемым в основном актиномицетами) в условиях переключения Rhodococcus spp. на углеводородное питание - свидетельство важного для жизнедеятельности данной группы организмов эволюционно выработанного (наряду со способностью ассимилировать индивидуальные углеводороды) преимущества, обеспечивающего их высокую конкурентоспособность, а отсюда - выживание и сохранение максимального числа особей в занимаемых экологических нишах

Изучение антибиотикочувствителыюсти исследуемых бактерий имеет не только теоретическое значение, но и практические перспективы. Так, выявленная закономерность повышения антибиотикорезистентности родококков в условиях индукции пропа-ноксигеназной активности (табл. 13) учитывалась при изучении возможности использования отдельных антибиотических веществ для подавления развития сопутствующих микроорганизмов при изоляции газоокисляющих родококков из природных сред. С целью разработки метода селективной изоляции газоокисляющих родококков расшифрован видовой состав фоновой микрофлоры (табл. 14), исследована антибиотикочувстви-телышсть естественных спутников - представителей родов Kocuria, Micrococcus и Pseudomonas (табл 15) и подобраны оптимальные концентрации антибиотиков - ингибиторов роста сопутствующих микроорганизмов, апробированные далее в опытах по выделению газоокисляющих Rhodococcus spp. из водных и почвенных образцов |68-69]. Обнаруженная разница в антибиотикочувствительности газоокисляющих родококков и бактерий-спутников позволила отобрать шесть антибиотических веществ, различных по спектру антимикробного действия, в качестве селективных агентов для предотвращения развития нежелательных микроорганизмов при выделении Rhodococcus spp. Так, для подавления роста грамположительных бактерий (косурий и микрококков) более успешным является использование линкомицина в концентрации 90 мкг/мл, оксациллина - 50-75 мкг/мл и эритромицина - 1,0-2,5 мкг/мл; для ингибирования развития грамотрицательных микроорганизмов (псевдомонад) - 75-100 Ед/мл полимиксина и 20 мкг/мл налидиксовой кислоты. Хлорамфеникол в концентрации 20 мкг/мл проявлял комплексное воздействие, угнетая рост обеих групп организмов. Оптимальные концентрации антибиотических агентов не оказывают отрицательного влияния на жизнедеятельность газоокисляющих родококков. В ходе экспериментов с учетом принципа синергизма (Егоров, 1986) подобрано три возможных варианта селективных добавок: N1 - хлорамфеникол; N2 - линкомицин и по-лимиксин, N3 - эритромицин и налидиксовая кислота. Результаты проверки эффективно-

Таблица 13. Минимальная подавляющая концентрация антибиотиков для

пропанокисляюших родококков, культивируемых на разных средах

(мкг/мл; Ед/мл)

Антибиотик Мясопептонный агар Минеральная среда в присутствии пропана

Гентамицин 0,004 - 0,1 10,0 - 20,0

Липкомицин 0,2 - 3,5 50,0 - 100,0

Метициллин 20,0 - 100,0 50,0 - 75,0

Налидиксовая к-та 20,0 - 50,0 50,0 - 100,0

Неомицин 0,03 - 0,65 10,0 - 50,0

Оксациллин 0,5 - 20,0 50,0 - 100,0

Олеандомицин 0,003 - 0,15 50,0 - 100,0

Полимиксин 50,0 - 100,0 50,0 - 100,0

Хлорамфеникол 0,08 - 1,8 30,0 - 50,0

Цефалексин 10,0 - 50,0 50,0 - 75,0

Эритромицин 0,001 - 0,7 25,0 - 50,0

Примечание. Приведены минимальные и максимальные значения МПК для 19 штаммов Я ruber.

сти использования минеральной среды с внесенными антибиотиками и без них для выделения пропанокисляюших родококков из природных образцов предст авлены на рис. 16 и 17. Предлагаемые варианты питательной среды характеризуются высоким селективным индексом (85-98 %) по сравнению с таковым (38 %) контрольной среды без антибиотиков, позволяют выявлять максимально полное количество культур пропанокисляюших родококков, содержащихся в исследуемом образце, и рекомендуются для использования в экологических исследованиях пропанокисляюших родококков и при культивировании их смешанных культур в нестерильных производственных условиях.

Разработанный способ селективной изоляции пропанокисляюших родококков (69] на протяжении ряда лет зарекомендовал себя как достаточно эффективный. В экологических исследованиях родококков целесообразно использование селективной среды с хло-рамфениколом в концентрации 20 мкг/мл; в коллекционной работе для получения чистых культур - селективной среды с добавлением комбинации антибиотиков, как то: линкоми-цина (90 мкг/мл) и полимиксина (100 Ед/мл) или эритромицина (2,5 мкг/мл) и налидиксо-иой кислоты (20 мкг/мл).

Таблица 14. Состав культур накопления пропанокисляющих бактерий, полученных из образцов воды и грунта нефтепромысловых районов Пермской области

Характеристика образца Общая численность микроорганизмов, учитываемых на разбавленном МПА (1:1) Количество бактерий, учитываемых непрямым методом флуоресцирующих антител Количество Pseudomonas sp., учитываемых на элективной среде с ацетамидом

R. ruber K.rosea M.luteus

Песчаник с глубины 2,0 м, Межевское нефтяное месторождение (5,8±2, 72)х103 (з,е±1,90)хю3 <1,9±0,89)хЮг (4,4±1,15)х101 (5,0±0,96)хЮг

Глина с глубины 0,5 м, Мазунинское нефтяное месторождение (1, 1±0 , 53) х105 (6, 4±2 ,25) х104 0,0 0,0 (7,3±3,58)х104

Глина с глубины 1,0 м, Полазненское нефтяное месторождение (3,5±1,70)х105 {1 ,г±г,20)хх0* (7,1±2,83)х104 (8,9±3,75)х103 (2 , 5±0 ,13) х105

Грунтовая вода, Полазненское нефтяное месторождение (6,0±3,82)х10г (1,5±0,45)х102 (2,8±1,62)х10г 0,0 (2,1±0,37)х10г

Озерная вода на территории Чашкинского нефтяного месторождения (6, 8±2 , 90) х103 (3,8±1,65)х102 (8 , 2±4 , 65) х101 (3,7±1,32)х101 (7, 9±3, 51) хЮ2

Примечание. Приведены средние значения численности микроорганизмов (в клеток/мл), полученные в результате трех параллельных экспериментов. Знак " - " означает отсутствие микроорганизмов.

Таблица 15. Антнбиотикочувствителыюсть фоновых микроорганизмов

Антибиотик Mimais (4) К. rosea (9) Micrococcus sp (3) 1 Pseua'omonas• sp. (7) j

Гентамиишг 0,002-0,5 0,01-0,25 0,09-0,9 1 0,05-1,0 ! 1

линкомицин 0,002-8,0 0,003-0,4 0,02-2,6 Кет данных i

Метишшлин 0,5-21,2 0,1-50,0 0,03-20,0 50,0-100,0 j

Налидиксовая к-та Нет данных 5,0-20,0 Нет данных 5,0-10,0 j

Неомииин 0,01-0,35 0,07-1,8 0,25-4,6 1 0,09-10,0 i i

Оксациллин 0,007-0,07 0,002-2,6 0,006-0,5 30,0-100,0 j

Олеандочицин 0,003-0,01 0,001-0,06 0,001-20,0 50,0-100,0 1

Полимиксин 30,0-50,0 15,0-50,0 40,0-50,0 2,2-9,5 i

Хлорамфеникол 0,004-0,03 0,003-1,0 0,15-0,6 3,8-6,0

Цефалексин 0,003-0,3 0,002-0,05 1,5-33,5 50,0-100,0 i |

Эритромицин 0,001-0,005 0,001-0,01 0,001-2,2 He I1 данных

Примечание. Приведены минимальные и максимальные значения МПК (мкг/мл, Ед/мл). В скобках - число исследуемых штаммов. Полученные результаты согласуются с данными других авторов (Смирнов, Киприановз, 1990; 81аскеЬгап& е/ а!, 1905).

Результаты данных исследований обобщены в еще Заявки на приобретение патента. 10.07.1997 получено положительное решение В1ШИГПЭ Российского агенства по патентам и товарным злакам о выдаче патента РФ на изобретение 'Способ селективной изоляции пропанокисляющих родококков '

Цитируемая литература

1. Гуссв М.В., Коронслли Т.В . Сенцова О Ю. // Экологические последствия загрязнения океана. Л.: Гидрометсоиздат, 1985. 113-127.

2. Егоров Н.С Основы учения об антибиотиках. М.. Высшая школа. 1986.402 с.

3. Иванов 13 Н.. Угодчнков Г А Клеточный цикл микроорганизмов и гетерогенность их популяций. Киев: Наук, думка. 1984. 280 с.

4. "Калакуцкий Л.В., Aipe U.C. Развитие актиномицетов. М.: Наука. 1977, 2X5 с.

5. Квасников Е.И., Юпошникова T.M. Микроорганизмы - деструкторы нефти в водных бассейнах Киев: Наук, думка. 1981.132 с.

6 Коронслли ТВ.. Комарова Т.И. Каюрова СТ. и др. // Микробиология. 1993. 62. 2. 231-236

7. Коронелли Т В., Ильинский В В . Янушка В.А., Красникова T И // Микробиология, 1987. 56, 3. 472-477.

8. Малашенко Ю Р . Романовская В А.. Богаченко В Н. и др // Микробиология. 1973. 42. 3. 403-408.

9. Паников H С . Добровольская Т.Г. Лысак Л В. Н Успехи микробиологии. 1989. 23. 51-91

К он т роль

N1

N2

N3

Рис. 16. Селективные свойства минеральной среды с антибиотическими добавками и без них.

Здесь и на рис. 17:

Контроль - известная питательная среда (без антибиотиков); N1-0 хлорамфениколом (20 мкг/мл); N2-0 линкомицином (90 мкг/мл) и полимиксином (100 Ед/мл); N3-0 эритромицином (2,5 мкг/мл) и налидиксовой кислотой (20 мкг/мл).

Использована минеральная основа известной питательной среды К (Милашенко и др., 1973), в которую вносят пропан в качестве единственного источника углерода и антибиотические вещества или их комбинации в качестве селективного агента.

I 00

1.е+05

-с -т-

4

1,Е+04 А

+

±

13+оз ^

1.Е+02

1,Е+01

Контроль

N1

£

N2

N3

□ а 06

Рис. 17. Сравнительная эффективность среды с селективными добавками (№-N3) и без них, используемой для выделения пропанокисляющих родококков из почвенных (а) и водных (б) образцов.

10. Смирнов В В.. Васюренко З.П.. Ч\ркина Л.Н. // Антибиотики и медицински бпотехноогая. 1У87. 32, 5. 365-371.

11. Смирнов В.В.. Киприянова Е.А. Бактерии рода P.-eudomonas. Киев: Наук. думка. 1990. 2G4 с.

12. Cooper, D G„ Zajic. J.E. // Appl. Microbiol. 1980, 26.229-252.

13. Finnerty, W.R. // Aunu. Rev. Microbiol, 1092. 46, 193-218.

14. Goodfellow. M.. Minnikin. D. // In: The Prokaryotcs. A Handbook on Habitats. Isolation, and Identification of Bacteria. Ed. M.P.Starr el al. Springer-Verlag. Berlin. Heidelberg. New York. 1981. 2. 2016-2027.

15. Kormend). A C.. Wavman. M. // Can. J. Microbiol.. 1974, 20. 2. 225-230

16. Kretschmer, A., Bock. H., Wagner, F. // Appl. Emir Microbiol., 1982, 44, S64-870.

17. Siackebrandt, E„ Koch. C., Gvozdiak, О. Schumann, P. // Int. J. Syst. Bacterid.. 1995. +5. 4. 682-692.

18. Wagner. F.. Behrendt, U., Bock. H. et al. H In: Microbial Enhanced Oil Recovery. Eds. J.E.Zajic et al.. Pub. RennwcllPublishing Company, Tulsa, 1983, 55-60.

V. РОДОКОККГГ КАК КОМПОНЕНТЫ БИОГЕОЦЕНОЗА: РАСПРОСТРАНЕНИЕ И ПРИГОДЕ, ВИДОВОЕ II ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ РАЗНООБРАЗИЕ, ДОМИНИРУЮЩИЕ ФОРМЫ

Спектр возможных сред обитания Rhodococcus spp необычайно широк и разнообразен - от богатых питательных веществами (организм человека и животных, растения) до оллготрофных (грунтовые воды, снег, воздух) мест обитания. Широкие экологические возможности родококков - результат универсальных адаптивных механизмов (от образования капсулоподобных структур для защиты от неблагоприятных факторов среды, использования адгезии и колонизации поверхностей, способности к алканотрофному образу жизни до эпидемических вариантов в почве (воде) и патогенизашш свободножнвущих форм), обеспечивающих любые способы их существования в природе.

Родококки имеют широкий диапазон толерантности к таким абиотическим факторам среды, как температура, влажность, рН. По нашим данным [9, 29, 35], среди абиотических факторов, определяющих существование и динамику популяции алканотрофных родококков в природных резервуарах, ведущая роль принадлежит органическому составу субстрата. В цикле работ [1, 3-5, 19, 31] по изучению закономерности распространения пропан- и бутанокисляющих микроорганизмов в грунтовых водах и почвах нефтеносных и ненефтеносных районов Пермского Предуралья, перспективных и неперспективных на нефтеносность районов Удмуртии, Ульяновского Поволжья и Белоруссии подтверждена приуроченность данной группы организмов к контуру нефтеносных структур и их нефте-газопоисковая информативность. При исследовании видового состава индикаторных микроорганизмов, населяющих подземные воды разведочных и нефтеносных площадей, показано численное преобладание в них определенного вида пропан- и бутанокисляющих родококков, а именно R.rhodochrous, рекомендованного [11] в качестве индикаторного на нефть при пефтегазопоисковой съемке по водоисточникам. В отличие от подземных вод нефтеносных структур в подпочвенных отложениях обнаруживается высокий процент двух видов-доминантов - R.rhodochrous и R.ruber. Полученные данные согласуются с мнением М.Уильямсова (1975) о том, что в бедных трофических нишах конкуренция приводит к вытеснению одного или другого вида, тогда как в экологических условиях с большим обилием и разнообразием пищевых ресурсов конкурирующие виды, имеющие выраженное экологическое сходство, могут встречаться совместно и не являются в почве сильными конкурентами. Возможно, этим объясняется сосуществование нескольких видов газоокисляющих родококков в почве нефтеносных районов и обнаружение, как правило, одного вида в подземных водах над нефтяным месторождением, где основным источником углерода являются углеводородные газы, выступающие как лимитирующий субстрат. Данные виды Rhodococcus служат специфическими биопоказателями углеводородных залежей (Наибольшее видовое разнообразие алканотрофных родококков обнаруживается в естественных субстратах разной степени загрязнения нефтью и нефтепро-

дуктами. На минеральных средах с жидкими н-алканами и с использованием видоспсци-фических поликлональных иммунных сывороток выявляется количественное преобладание отдельных видовых популяций родококков - ЯлгуЛгороЬ^, Е..ораси$, Я."1оп§ш'", которые могут рассматриваться как индикаторы источника органических веществ). В контуре нефтеносности пробы с газоассимилирующими бактериями составляют 63,8-81,3 % от числа исследованных почвенных и водных образцов, соответственно, а средний уровень численности пропан- и бутанокисляющих родококков достигает 103 -10" клеток/г в почвенных образцах и Ю* -104 клеток/мл в подземных водах над нефтяной залежью (табл. 16, 17). Максимальное общее количество газоокисляющих бактерий установлено на глубине от 1,0 до 1,5 м (см. табл 17). При стационарных исследованиях динамики содержания водных и почвенных микроорганизмов получены данные по влиянию сезонов года и, в частности температуры и влажности на численность изучаемой группы организмов (табл. 18, 19). Как видно из рис. 18 и табл. 19, динамика общей численности бактерий в

I

60

§ 5

I §

с е.

20

600

I &

5

400

-- 200 2 ^

VI

VII VIII IX Месяцы

XI

Рис. 18. Сезонное распределение микроорганизмов в грунтовых водах режимных источников.

1 - общая численность микроорганизмов, определенная методом прямого счета на мембранных фильтрах; 2 - количество гетеротрофных бактерий, определенное высевом на мясопептошшй агар, разведенный в 10 раз. Сплошная линия - контур нефтеносности; штриховая - законтурная зона.

грунтовых водах над нефтяным месторождением имеет выраженный сезонный характер, тогда как сезоны года практически не оказывают существенного влияния на общее количество микроорганизмов в почве (Р>0,05). По-видимому, сезоны сами по себе не имеют значения самостоятельного фактора. Можно согласиться с мнением П Х.Рахно (1972) о том, что влияние сезонов полностью зависит от совпадения влияния конкретных факторов среды - температуры, влажности, содержания в почве питательных веществ и пр. - с сезонами года. Обычно основное значение придают температуре, которая в наших климатических условиях имеет наиболее тесную связь с сезонами года и которую считают ведущим фактором, влияющим на развитие микроорганизмов Результаты проведенных исследований отрицают первостепенное значение температуры на размножение почвенных микроорганизмов (см. табл 19). Анализ почвенных проб при низкой температуре и высо-

Таблица 16. Численность бактерий в грунтовых водах Пермского Предуралья (клеток/мл)

Место Количество Средний процент Общая численность микроорганизмов, учитываемых на Количество бактерий

выделения определений живых клеток мембранных фильтрах МП А/10 пропанокисляющих бутанокисляющих

Контур 32 99 (5 , 24±1, 27) хЮ® (1,03+0,67) хЮ2 (2, 3±0 , 27хЮ3 (4 , 7±0,32) хЮ3

нефтеносности (137,4) (64,3) (66,2) (39,2)

Законтурная 53 97 (7 , 81±1,12) хЮ4 (4 ,01±0 , 74) 102 (1,4+0,09) ХЮ2 (1, 2±0 , 20) хЮ2

зона (104,4) (89,5) (50,9) (124,2)

Непродуктивная структура 28 98 (13 , 80±3, 33) хЮ* (127,5) (6, 92±1,82) хЮ2 (146,5) - -

Примечание. "-" Здесь и табл. 17, не обнаружено или единичные пробы давали положительный результат. В скобках указаны коэффициент вариации в процентах.

Таблица 17. Распространение и численность бактерий в дерново-подзолистой почве в районе Межевского нефтяного месторождения Пермского Предуралья, клеток/г

Место выделения Глубина отбора, м Общая численность микроорганизмов, учитываемых Количество пропан- и бутан-окисляющих бактерий

прямым счетом высевом на МПА

Контур нефтеносности 0,1-0,2 (1,58+0,52)х1011 (1,47±0,91)х109 (67,80+7,17)х105

0,5-0,7 (0,2710,08) хЮ11 (0,4810,27)х109 (21,00±7,61)х105

1,0-1,5 (8,30+2,70) хЮ10 (0,06±0,03)х10® (10, 74±1, 02) хЮ6

3,0-5,0 (0,90±0,0Э)хЮ7 (2,4310,02)х10е (28,2015,35) хЮ5

Законтурная зона 0,1-0,2 (8 , 4±2 , 30) хЮ11 (0 ,12±0 , 05) х 109 -

0,5-0,7 (2 , б±1, 02) х 1011 (0 ,12+0 , 02) х 109 -

1,0-1,5 (4 , 5±1, 62) хЮ10 (0,03+0,002)х109 -

3,0-5,0 (3,311,70)х108 (4 ,11:1:1,32) X Ю-7

Примечание. Приведены средние данные анализа 74 почвенных образцов.

Таблица 18. Содержание органического вещества, тяжелых газообразных н-алканов и пропан- и бутанокнсляющих бактерий в грунтовых водах режимных водоисточников в разные сезоны года

Местонахождение водоисточников Сроки отбора Содержание органического вещества, мг/л Суммарная концентрация этана, пропана, бутана в водо- растворенном газе, Ю-4 об. % Количество бактерий, пхЮ3 клеток/мл

пронан-окисляющих бутанокнсляющих

Контур Июнь 0,3±0,06 6,8±2, 3 2 ,5+0 23 2 3+0,25

нефтеносности Июль 0,3+0,04 4,3+1, 3 2 ,0±0 08 3,5+0,47

Август О,3±0,07 1,9±0, 5 1 ,6+0 67 2 5+0, 38

Сентябрь 0,6±0,10 4,8±2, 7 2 ,3+0 38 2 8+0,48

Октябрь 0,5+0,03 6,0+2 6 2 ,2+0 57 3 2+0,33

Законтурная Июнь 0,3+0,06 0,5+0, 1 0,1±0 02 0 5±0,03

зона Июль 0,2+0,03 1,2+0 5 0 5+0 02 1 2+0,07

Август 0,3±0,0б 1, 5±0 6 0 6±0 02 0 5+0,04

Сентябрь 0,7±0,12 1,0+0, 3 0 4±0 02 0 7±0,04

Октябрь 0,5+0,09 1,8+0, 8 0 ,4+0 02 1 ,0+0,05

Примечание. Приведены средние данные по результатам стационарного наблюдения за изменением химического состава грунтовых вод и динамикой численности бактерий, проведенного на девяти опорных водопунктах в районе Мазунинского нефтяного месторождения Пермской области [31].

Таблица 19. Содержание почвенных микроорганизмов в контурной зоне Межсвского нефтяного месторождения Пермской области в различные сезоны года

Сроки отбора Кол-во определений Температура, Т°С Влажность, % Общее кол-во микроорганизмов, учитываемое прямым счетом Среднее кол-во пропан-и бутанокнсляющих бактерий

Июнь 16 16,2 19,1 (18,2+5,30) хЮ' (2, 61+0, 28) хЮ5

Июль 4 20,6 24 ,2 (2,0+0,74) хЮ10 (5,83±2,12) хЮ3

Август 12 19,2 24,9 (5, 4±1, 52) хЮ11 (3, 40±1, 72) хЮ5

Сентябрь 9 16,6 28, 6 (0,7+0,15) хЮ11 (1, 2б±0 ,89) хЮ5

Октябрь 16 8,7 35,8 (6,3+2,03) хЮ12 (12,8+0,97) хЮ5

Примечание. Приведены средние данные анализа 57 почвенных образцов, отобранных в разное время на глубине 0,5 м [41].

кой влажности почвы обнаруживает наибольшее среднее содержание газоокисляющпх родококков (12,8±0,97)х103 клеток/г. Общая численность почвенных микроорганизмов также достоверно увеличивается при сравнительно низких температурах почвы и, как видно из табл. 19, в большей степени зависит от влажности, чем от температуры почвы. Хотя и прослеживается прямая связь между влажностью почвы и количеством содержащихся в ней микроорганизмов, численность газоокисляющпх родококков не подвержена резким сезонным колебаниям (статистический анализ не выявил ни одного максимума в развитии указанной группы бактерий на протяжении всего периода наблюдения), а основным фактором, регулирующим объем популяции газоокисляющих бактерий в изученных экологических нишах, является интенсивность потока углеводородных газов. Систематическое обнаружение газоокисляющих бактерий в течение всего срока наблюдения свидетельствует о непрерывности процесса ассимиляции газообразных углеводородов микроорганизмами. На широкое распространение газоокисляющих /Уюс/ошса« Брр указывает обнаружение их в воздушной атмосфере газоперерабатывающих предприятий и снежном покрове над залежью нефтн и газа Так, показано [56], что пропан- и бутанокис-ляющие родококки составляют в среднем 5% общей численности микроорганизмов атмосферного воздуха, отобранного на территории Пермского газоперерабатывающего з-да, и их число варьирует в пределах 10-30 клеток в 1 м* объема воздушного пространства. На площадях в пределах контура нефтяных месторождений Пермского Предуралья и Удмуртии в пробах снега выявлено высокое содержание тяжелых углеводородных газов и бактерий, окисляющих их. Обнаружение газоокисляющих родококков в зимние периоды, очевидно, объясняется возможностью механического перемещения бактерий в зимние месяцы из нижних горизонтов почвы в верхние под воздействием восходящего газового потока во время замерзания почвы. Снежный покров - хороший сорбционный субстрат для концентрации бактерий (Рахно и др., 1971; Клевенская, 1974) и газообразных углеводородов Однако, логичнее всего, очевидно, другое объяснение присутствия значительных количеств газоокисляющих родококков в мерзлых почвах, свидетельствующего о высокой степени приспособления щучаемой группы организмов к внешним воздействиям и связанного с выраженным полиморфизмом родококков в естественных условиях. Сегодня уже не вызывает сомнения тот факт, что природным популяциям организмов присуще значительное разнообразие фенотипов (морф), специализированных по отношению к той или иной пространственной или временной субниши и приуроченной к тем или иным условиям среды (Алеев, 1980; Лекявичюс, 1986). Отсюда, обнаружение газоокисляющих родококков зимой можно объяснить сменой бактериальных морф, а конкретнее увеличением частоты соответствующей морфы в популяции за счет избирательной репродукции особей. В теплые сезоны в почве преобладают "летние" формы бактерий, подавляющие развитие "зимних", то есть более психроактивных форм. При низких температурах получают возможность беспрепятственного развития специализированные "зимние" бактериальные формы с измененным в сторону большей экономичности энергетическим обменом. Такое переключение с одного фенотипа па другой, по-видимому, -ответная реакция организма на сезонные изменения в среде. В этой связи приспособительное значение полиморфизма состоит в том, что он снижает вероятность гибели популяций, а также "сглаживает" колебание численности особей и увеличивает эффективность использования пищевых ресурсов.

Алканотрофные родококки, являясь аэробными гетеротрофами и не располагая набором гидролитических ферментов, не принимают участия в процессах разложения органического вещества на начальных этапах и могут быть отнесены к трофической группировке диссипотрофов, эффективно использующей рассеяный поток мономерных соединений (Заварзин, 1970; Васильева, Заварзин, 1995). Для диссипотрофов в микробном сообществе характерны высокое сродство к субстрату, способность использовать его в низкой концентрации; относительно высокие скорости роста в этой области концентра-

ций, чтобы конкурировать с "банальными" копиотрофами, прм этом низкие удельные максимальные скорости роста, адаптация к длительному переживанию неблагоприятных условий. В этой связи понятие ''диссипотрофы" тесно связано с понятием "олиготрофной микрофлоры" (Уапа§ка е! а/, 1978). Родококки, обладающие способностью активно осваивать разнообразные экологические ниши - от богатых органическими веществами до олиготрофных местообитаний - и адаптированные к использованию низких концентраций источников энергии, могут быть отнесены к факультативной форме олиготрофов (Никитин, 1985). Изучение таксономического состава И'поЖкоссиь зрр., выделенных из разнообразных природных образцов, динамики их численности и экологических характеристик дает представление о родококках как об уникальной эколого-трофической группе, проявляющей характерный комплекс стратегических приемов выживания. Первая попытка отнесения конкретных популяций ЮюЖюосст эрр. к тому или иному стратегическому типу сделана Е.Л.Головлевым (1983). Согласно его представлениям, отдельные представители родококков реализуют различные варианты экологической тактики и их сочетания: К- и Ь-такгики; элементы г- на фоне К-тактики. Поскольку г-, К- н Ь-отборы (Уитте-кер, 1980) взаимосвязаны, в природе практически не обнаруживается четкого разделения организмов на ярко выраженные г-. К-типы или Ь-виды. По нашим данным, популяции Мюс1ососат «рр чаще всего обладают более выраженными Ь-свойствами К-стратегов, для которых свойственны циклический характер развития и наличие морфогенет ическнх переходов; доминирование на поздних стадиях сукцессии; отсутствие выраженной экзо-гидролазной и антибиотической активностей; склонность к ассоциации с гидролитиками и способность функционировать в роли диссипотрофов; устойчивость к голоданию, высушиванию, экстремальным значениям конентраций водородных ионов, солей, механическому и ультразвуковому разрушению, токсическим агентам и антисептикам.

Таким образом, алкано- и олиготрофный образ жизни, широкая норма реакции в сочетании с толерантностью к экстремальным абиотическим факторам, высокая сопротивляемость конкурентам, способность к синтезу и аккумуляции большого количества эндогенных резервных веществ в качестве запасного источника энергии, разнообразный "репертуар" поведения в зависимости от параметров занимаемых ими экологических ниш и флуктуаций окружающей среды - все это обеспечивает повсеместное (убиквитарное) распространение родококков, способных формировать устойчивые локальные популяции относительно высокой плотности.

Цитируемая литература

1. Алеев Ю.Г. // Успехи соврем, биол.. 1980, 9». 3 Í6). 462-477.

2. Васильева Л.В.. Заварзин Г А. // Микробиология. 1995. 64. 2. 239-244.

3. Головлсв Е.Л. Биология сапрофитных микобактерий. Автореф дис. ... докт. биол. наутс, Птшино ИБФМРАН. 1983. 37 с.

4. Заварзин Г.А. // Жури, общ биологии. 1970. 31. 4, 386-39.3.

5. Клсвенская И.Л. Олиготрофные микроорганизмы почв Западной Сибири. Новосибирск: Наука. 1974.220 с.

6. Лекявичюс Э. Элементы обшей теории адаптации. Вильнюс: Мокслас, 19S6, 273 с.

7. Никитин Д.И. Биология олигогрофных бактерии: Автореф дис. .. докт. биол. наук. М.: ИНМИ РАН, 1985, 35 с.

8. Ра.хно П.Х. //Вопросы численности, биомассы и продуктивности почвенных микроорганизмов. Л.: Наука. 1972. 79-87.

9. Рахно П X . Аксель М. Сипр Л.. Piule X. Динамика численности почвенных мтткроорганизмов и соединений азота в почве. Таллин: Валгус. 1971. 207 с.

10. Улльячеон М. Анализ биологических популяций. М. Мир. 1975, 271 с.

11. Уиггсьер Р. Сообщества и экосистемы. М.: Прогресс. 19S0, 13-120.

12. Yanagita. Т.. Ichikama. Т.. Tsuji. Т. et al. // J. Gen. Mjcrobiol.. 197S. 24. 59-88.

VI. СОХРАНЕНИЕ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ И СТАБИЛИЗАЦИЯ ОСНОВНЫХ

СВОЙСТВ RHODOCOCCUS SPP. ФОРМИРОВАНИЕ КОЛЛЕКЦИИ И ИНФОРМАЦИОННОГО БАНКА ДАННЫХ О ШТАММАХ АЛКАНОТРОФПЫХ РОДОКОККОВ

Собранная на основании многолетних исследований коллекция чистых идентифицированных детально охарактеризованных культур RhoJococcus spp ставит проблему гарантированного сохранения их жизнеспособности и первоначальных свойств. Существующая практика консервации микробных культур выработала разнообразные экспериментальные подходы к погружению клеток в состояние обратимого торможения обмена. В литературе описаны различные способы консервации большого разнообразия физиологических групп микроорганизмов, предлагается много новых и эффективных методов длительного сохранения микробных культур (Сидякина Т.М., 1990; Henry, Kirsop, 1989, Malik, 1990, 1990а), однако ни один из них не является универсальным. Для хранения больших ресурсных коллекций наиболее оправдано, по-видимому, применение метода глубокого замораживания и высушивания - лиофилизации. Для успешной сублимации, регидратации и восстановления высушенных культур после хранения помимо оптимального режима самого процесса лиофилизации необходим ряд иных дополнительных условий: наличие криопротектора, оптимальная концентрация исходной суспензии, соответствующий регидратант и благоприятная среда восстановления. Следует учшывать и то обстоятельство, что разные виды и даже штаммы обладают специфическими реакциями на высушивание-регидратацию. Все сказанное выше свидетельствует о том, что задача коллекционной практики по поддержанию жизнеспособных, желательно "интактных" (по всем возможным генетическим и фенотипическим показателям) микроорганизмов состоит в необходимости индивидуального (Бекер и др., 1987) подбора наиболее эффективных условий лабораторного хранения для каждой конкретной систематической группы организмов. В связи с этим цель настоящего исследования - разработка оптимальных методов хранения генофонда алканотрофных родококков с учетом изученных структурных и фнзиолого-биохимических особенностей их клеток [51].

Консервация и гарантированное сохранение культур Rltodococcus spp. В работе использовали 43 штамма, достигших стационарной фазы роста, принадлежащих к шести экологически значимым видам Rliodococcus и обладаюицгх потенциально ценными биотехнологическими свойствами, как то: способность деструктировать эфиры фталевых кислот - диметилфталат (R.fascians ИЭГМ АС 170, Rruber ИЭГМ АС 71, ИЭГМ АС 84), дибутилфталат и ди(2-этилгексил)-фталат (R.ruber ИЭГМ АС 71, ИЭГМ АС 76, ИЭГМ АС 79), синтезировать биосурфактанты при росте на н-алканах (Rerythropolis ИЭГМ АС 201, ИЭГМ АС 203, ИЭГМ АС 204, R-'longus'1 ИЭГМ АС 69, Rfascians ИЭГМ АС 170; R.ruber ИЭГМ АС 83, ИЭГМ АС 89, ИЭГМ АС 92, ИЭГМ АС 223, ИЭГМ АС 231, ИЭГМ АС 238, ИЭГМ АС 243, ИЭГМ АС 333; Ropacus ИЭГМ АС 56, ИЭГМ АС 60), ассимилировать в качестве единственных источников углерода пропан, н-бутан (все используемые в работе представители R.rhodochrous и R.ruber, за исключением типовых штаммов). Наиболее приемлемыми среди испытанных традиционных методов непродолжительного хранения оказались способы хранения живых культур родококков на "голодном" агаре, в дистиллированной воде и 0,5 %-ном растворе хлорида натрия. Эти способы привлекают внимание как наиболее удобные и простые в исполнении, дающие высокий процент выживаемости (30-74 %) и способствующие в течение 1,5-2,0 лет сохранению биологической активности родококков. Основываясь на способности Rhodococcus spp. к адгезии, формированию в олиготрофных условиях переживающих форм (цистоподобных клеток) и потенциальной их устойчивости к естественному высыханию, в качестве найденного |53] полезного приема сохранения родококков без изменения их фенотипических свойств рекомендуется испытанный метод поддержания RJtodococcus spp. на миллипоровых фильтрах

(мембраны капроновые микропористые 1VK "Хийу Калур"), наложенных на поверхность питательной среды (МПЛ, синтетическая среда К) с последующим снятием мембран с выросшими клетками и хранением в закрытых флаконах при температуре 4° С. Длительность сохранения жизнеспособности иммобилизованными неразмпожаюшимися вегетативными клетками родококков может быть большой (2-3 года)

Среди методов длительного хранения наиболее эффективно высушивание клеток в вакууме из замороженного состояния. Проведенные исследования показали, что все культуры выдерживают лиофилизацию, но не все одинаково успешно - в зависимости от условий опыта и особенностей штамма (табл. 20, 21). Выявленный процент гибели клеток родококков довольно высок по сравнению с таковым других таксономических групп са-протрофных форм. Нельзя говорить о высокой чувствительности к процессу лиофилиза-оии конкретного вида Rhodococcus, так как в пределах одного таксона культуры демонстрируют различный уровень жизнеспособности. Так, у Rruber ИЭГМ АС 333 отмечается наиболее высокая выживаемость клеток в некоторых вариантах опыта (табл. 20) в 100150 раз превосходящая уровень жизнеспособности наименее устойчивых к лиофилизации штаммов R.n/ber ИЭГМ АС 71, ИЭГМ АС 74. Как видно из табл. 20, в которой на примере 19 культур приведены результаты подбора условий успешной лнофилизации-регидратации коллекционных штаммов родококков, максимальная вылсиваемость алка-нотрофных родококков наблюдается при смешивании клеточных суспензий с типичной защитной средой СЖА и регидраташш 0,5 %-ным раствором хлорида натрия. Испытанные в качестве криопротекторов суспензионная среда с низкой ионной силой (Баросс, Морита, 1981) и минеральная среда К не обеспечивали хорошей выживаемости Rhodococcus spp. и в дальнейшей работе не использовались. Казалось бы, увеличение первоначальной плотности клеточной популяции должно приводить к увеличению процента клеток, переживших лиофилизацию. По утверждению некоторых авторов (Ileckly, 197S; Malik. 1990), данный эффект достигается теп.!, что в процессе лизиса отдельных клеток высвобождаются "холодозащитные" вещества, играющие роль эндогенных криопротекторов. В связи с этим испытывались исходные взвеси различной плотности, вплоть до максимально высокой - 10" клеток/мл. Однако отмечено, что при концентрации бактериальной взвеси более Ю10 клеток/мл наблюдается массовая гибель клеток родококков во время сушки. Процент жизнеспособных клеток при этом сразу после лиофилизации чаще всего составлял ничтожные доли от исходного их количества (до 0,00001 %). Использование начальной концентрации порядка 10s-10 9 клеток/мл позволяет сохранить в жизнеспособном состоянии достаточно большое число клеток Rhodococcus spp. Применение более высоких исходных титров не целесообразно. Определив щадящие условия лиофилизашш-регидратации исследуемых культур, на длительное хранение был заложен весь имеющийся коллекционный фонд родококков.

Анализ жизнеспособности родококков в течение первого года хранения (табл. 21) показывает, что высокий процент гибели клеток в процессе сублимации не влечет за собой последующего быстрого выро/кдення бактериальной суспензии. Скорость гибели клеток при последующем хранении значительно замедляется по сравнению с таковой за время лиофилизации. Наиболее интенсивное отмирание клеток происходит в течение первого месяца хранения культур. Наблюдается обозначенный нами "эффект последействия лиофилизации", при котором процент выживаемости уменьшается в среднем в 10,8 раза. Полугодовое хранение приводит к последующему постепенному достоверному падению титра, однако к исходу первого года в консервированных суспензиях остается еще до 44,8 % живых клеток. Длительный период эксперимента позволил оценить эффективность долгосрочного хранения культур родококков в лиофилизированном виде (табл. 22). Число оставшихся после 4-летнего хранения живых клеток еще довольно велико и при этом можно рассчитывать на более длительный срок их сохранения. Так, для штаммов R.niber константа скорости отмирания лиофилизнрованных клеток равняется п среднем

Таблица 20. Выживаемость Шнм1ососсш врр. в зависимости ог условий лиофилизацни и рсгидратации бактериальных клеток (% от исходного количества)

Вид, штамм Криопро- Регидратант

тектор дистиллированная вода водопроводная вода 0,5 %-ный раствор №С1 минеральная среда К

оп^ь"

ЮГМ АС 27 СЖА 0,6 0,7 1,2 -

ГОШ АС 68 СЖА 1,1 3,1 3,2 -

ИЭГМ АС 69 СЖА 0,9 1,5 2,0 -

Я/асяа>и

ИЭГМ АС 34 СЖА 0,0 30,0 32,2 -

ИЭГМ АС 170 СЖА 7,0 11,1 18,5 -

Карает

ИЭГМ АС 56 СЖА 1,9 2,2 0,9 -

ИЭШ АС 57 СЖА 1,4 2,9 3,0 -

ИЭГМ АС 58 СЖА 0,3 0,9 1,9 -

ЮИсхЗосИгош

ИЭШ АС 62т СЖА 39,1 18,8 39,1 -

ИЭШ АС 63 СЖА 1,8 21,4 22, 6 -

ИЭШ АС 64 СЖА 18,5 15,4 25,0 -

КгиЬег

ИЭШ АС 70т СЖА 10,0 25,3 27,3 -

ИЭШ АС 71 СЖА 0,4 0,4 2,4 0,5

К - 19, 6 20,0 6,8

ИЭШ АС 74 СЖА 2,1 - 0,9 0,7

К 0,3 - 2,1 -

ИЭШ АС 76 СЖА 10, 7 - 13,3 6,3

К 0,9 0,4 1,3 0,6

ИЭГМ АС 84 СЖА 2,3 2,4 4,6 3,1

К 0,2 1,8 1,0 1,3

ИЭШ АС 86 СЖА 6,5 11,8 28,8 4,1

К 5,9 11,2 24,1 2,9

ИЭШ АС 87 СЖА 8,3 8,5 8,6 3,9

К 2,5 4,2 1, 7 0,6

ИЭШ АС 333 СЖА 14, 6 34,1 39,0 13,4

К 45,1 29,3 39,0 13,4

Примечание. СЖА - сахарозо-желатиновый агар Файбича, г/л (сахароза - 100,0; желатин -15,0, агар - 10,0; вода дистиллированная - 1000,0 мл).

Таблица 21. Жизнеспособность лиофшшзированных культур Ююиососсчх врр. при хранении в течение одного года

Вид, штамм числа живых клеток (показатель выживаемости, %)

сразу после лиофилизацин через 1 мес хранения через 6 мес хранения через 12 мес хранения

КегуЛгороПз ШГМ АС Т 11,72 (0,6) 8,43 (0,05) 8,00 (0,02) Нет данных

» ИЭГМ АС 200 8,60 (0,00003) 7,14 (3,5) 6,92 (2,0) Пет данных

ИЭГМ АС 27 8,04 (1,2) 6,81 (5,9) 6,34 (2,0) 6,04 (1,0)

ИЭГМ АС 68 9,48 (0,04) 8,54(11,7) 8,28 (6,3) Нет данных

ИЭГМ АС 69 6,15 (0,0002) 6,04 (78,6) 5,86(51,4) 4,85 (5,1)

К/а$аап$ ИЭГМ АС 34 6,74 (0,0004) 6,51 (58,2) 6,46 (52,7) 5,59(7,1)

ИЭГМ АС 170 11,08 (0,2) 10,67 (39,2) 9,59 (3,0) Нет данных

Л.ораси$ ИЭГМ АС 56 6,81 (0,9) 6,57 (56,9) 6,20 (24,6) 6,04 (16,9)

К.гЬо(1оскгоин ИЭГМ АС 62т 8,32 (0,009) 8,43 (123,6)* 8,11 (61,9) 7,97 (44,8)

КтиЪег ИЭГМ АС 70т 8,95 (0,01) 8,61 (45,6) 8,28 (21,1) 8,15 (15,6)

ИЭГМ АС 74 9,65 (0,0002) 8,15 (3,1) 9,20 (35,6)* 8,20 (4,2)

»1 ИЭГМ АС 83 8,84 (0,004) 7,54 (5,4) 8,62 (60,7)* 7,76 (8,4)

ИЭГМ АС 84 8,71 (0,004) 7,96 (17,8) 8,30 (39,2)* 7,88 (15,1)

ИЭГМ АС 87 8,76 (0,001) 7,88 (13,3) 8,08 (21,1)* 7,63 (7,5)

ИЭГМ АС 333 9,79 (0,07) 9,20 (27,4) 8,76 (9,4) 8,54 (5,6)

Примечание. * Здесь и в табл. 22 - неизбежное отклонение экспериментальных данных от теоретически рассчитанной кривой гибели клеток при увеличении сроков хранения. Многие авторы (Куплетская, 1987; Ротмистров и др., 1990; \lilata, Ваппо, 1989) также отмечают увеличение числа жизнеспособных клеток при долгосрочном хранении. Причины этого явления обычно не обсуждаются. Они могут быть разными: от механических при отсутствии автоматической системы ралива бактериальной взвеси по аппулам до чисто технологических. Мы полагаем, что решить этот вопрос, хотя бы частично, необходимо методически: при проверке жизнеспособности клеток обязательно вскрывать из каждой серии одновременно закладываемых ампул не менее трех, готовить усредненную пробу и в ней через ряд последующих разведений с высевом на агарнзованную питательную среду определять титр клеток, переживших лиофилизацию.

0,41, а рациональная длительность их хранения определяется в границах от 9,7 до 32,8 лет. Лишь отдельные штаммы к концу срока наблюдения имели уровень жизнеспособности, близкий критическому, что вызывало необходимость их срочного пересева на свежие среды с последующей повторной лиофилизаиией. В целом характер динамики жизнеспособности родококков - это устойчивое достоверное снижение числа живых клеток в течение всего срока консервации Показатель максимальной выживаемости лиофнлизиро-ванных культур Шюс/ососст врр. к концу 4-го года хранения составляет 15,8%. Контрольное определение ключевых признаков исследуемых штаммов выявляет сохранение

основных морфологических характеристик, всех особенностей окисления субстратов и деструктивных способностей, присущих интактным клеткам родококков.

Как видно из табл 22, между содержанием каротиноидных пигментов и резистентностью клеток родококков к лиофилизации существует прямая зависимость Так, наиболее успешно длительное консервирование в лиофильно высушенном виде выдерживают штаммы - активные продуценты биосурфактантов, имеющие красно-оранжевый недиффундирующий пигмент (R.rhodochrous, R.ruber) и сохраняющие к концу срока наблюдения значительное число (106-107 клсток/мл) живых особей. Недавно (Nakatani, 1990; Takaichi et al., 1990) приведены новые данные о роли каротиноидов в укреплении липнд-ного бислоя бактерий. Показано, что степень включения каротиноидов в липидные гранулы повышается при соответствии длин молекул каротиноида и липидного бислоя, в результате чего увеличивается ригидность бислоя. Высокий уровень выживаемости (19,431,6%) алканотрофных родококков получен в вариантах опыта по длительному хранению лиофилизированных культур, когда предварительное культивирование родококков проводили в присутствии л-алканов. Результаты измерения эндогенного дыхания 14 интакт-ных и сублимированных культур Rruber, предварительно выращенных на разных средах, свидетельствуют (табл. 23) о том, что организмы с углеводородным обменом более устойчивы к условиям лиофилизации и последующего долгосрочного хранения, поддерживая клеточное дыхание на уровне, в два раза превышающем таковой R.ruber, выращенных на МПА. Высокий уровень выживаемости алканотрофных родококкоз в процессе длительного хранения в лнофилизированном состоянии является прежде всего отражением выявленной структурно-физиологической перестройки клеток в условиях алкапотрофно-го обмена. Как было показано выше (см. раздел IV), характерной чертой родококков, выращенных в присутствии н-алканов, является накопление в вегетативных клетках резервных питательных веществ и отложение их в виде водонерастворимых гранул, а также изменение жирнокислотного пула клеток (табл. 24), что коррелирует с увеличением устойчивости таких клеток к замораживанию-высушиванию. По сложившимся представлениям (Шкорбатов, 1982; Волков и др., 1992), накопление в клетках гранул поли-ß-оксибутирата способствует своеобразной иммобилизации на их поверхности молекул клеточных биополимеров, взаимодействующих с компонентами защитных сред путем образования устойчивых водородных связей, стабилизирующих клеточные структуры, в том числе липидного бислоя и белковых доменов. Резервные вещества активно используются на стадии регидратации-рсактивации для репарации повреждений и тем самым увеличивают выживаемость клеток после стрессовых воздействий. Как видно из табл 24, устойчивость клеток к замораживанию-высушиванию увеличивает и присутствие значительных количеств жирных кислот с нечетным числом углеродных атомов (по сравнению с составом жирных кислот у клеток, выращенных на МПА, сумма нечетных кислот в клетках, выращенных на пропане и н-гексадекане, увеличилась в 2-3 раза, соответственно). Следует заметить, что для обеспечения высокой выживаемости и хорошей сохраняемости родококков целесообразно предварительное выращивание их на жидких, а не газообразных, и-алканах. Известно (Russell, 1984; Benschoter, Ingam, 1986), что одним из факторов устойчивости бактериальных клеток к низкотемпературным воздействиям может быть увеличение ненасыщенности жирнокислотных цепей клеточных липидных компонентов, обеспечивающее более жидкое состояние мембранных липидов и оптимальную степень эластичности клеточной стенки. Тем не менее наличие ненасыщенных жирных кислот, входящих в состав большинства штаммов пропанокисляющих родококков, существенно ограничивает использование предварительного выращивания клеток на пропане. Ибо при высушивании ненасыщенные жирные кислоты легко подвергаются окислению, что резко ухудшает выживаемость клеток после их регидратации (Волков, 1994). Несомненно, важную защитную роль в формировании метаболической сопротивляемости клеток к повреждающим факторам при лиофильной сушке могут играть и синтезируемые родококками

Таблица 22. Жизнеспособность лнофилизированных культур Икойососсиъ эрр. при хранении их в течение 4 лет

Вид, штамм ¡В числа живых клеток (показатель выживаемости, %) К, мес РДХ, годы

1 год 2 года 3 года 4 года

Л егу/ИгороИя

ИЭГМ АС Г 3,58 (0 ,0000007) 2,04 4,4

ИЭГМ АС 201 5,53 (13,6) 0,86 4,3

ИЭГМ АС 202 В,32 (0,2) 1,34 6,2

К.'Чоп&м"

ИЭГМ АС 27 6,04 (1,0) 4,56 (0,03) 4, 00 (0,009) 1,01 5,3

Л/алмсшл-

ИЭГМ АС 34 5,59 (7,1) 3, 08 (0,02) 0,92 4,4

ИЭГМ АС 170 3,70 (0,000004) 3,69 2,3

Я. орасих

ИЭГМ АС 56 6,04 (16,9) 4,30 (0,3) 3, 64 (0,06) 0,79 5,2

И-гИоЛосИгоиз

ИЭГМ АС 62г 7, 97 (44,8) 8,54 (166,7)* 8,30 (95,2) 7 ,23 (4,8) 0,27 20,8

Я.гиЬсг

ИЭГМ АС 70т 8,15 (15,6) 7,98 (10,6) 7 ,56 (4,0) 0,35 17, 9

ИЭГМ АС 83 7,76 (8,4) 8,08 (3,2)* 0,38 16,2

ИЭГМ АС 89 8,71 (8,2) 8 ,23 (2,7) 0,39 18,2

ИЭГМ АС 92 9,08 (9,2) 8 ,15 (1,0) 0,49 15,1

ИЭГМ АС 333 8,56 (5,6) 8,34 (3,5) 0,73 9,7

Примечание. Константы скорости отмирания К лиофильно высушенных ку льтур и рациональную длительность хранения (РДХ) их в лиофилизированном состоянии рассчитывали по известным формулам (1 Тестеров и др., 1986; Л^каГа, Ваппо, 1989): К = Х„ - Х1) / где Х0 -исходный титр жизнеспособных клеток, клеток /мл; X, - титр жизнеспособных клеток в момент времени 1, клеток/мл; I - время наблюдения, суг; РДХ = Х„ - ^ 5х 102) / К. где величина 5х 102 клеток/мл - экспериментально установленное надежное и минимальное количество жтнсспособных клеток в суспензии, достаточное для восстановления высушенной культуры

Таблица 23. Результаты сравнительного исследования активности дыхания клеток 1{.гиЬег, предварительно выращенных на разных средах, перенесших лиофилизацию и последующее хранение в течение трех лет

Эндогенное дыхание интакгных и сублимированных клеток

Штамм выращенных на МПА выращенных в присутствии пропана

до лиофилизации после 3 лет храиеиия до лиофилизации после 3 лет хранения

ИЭГМ АС 71 7,0 2,0 7,4 5,4

ИЭГМАС85 7,2 3,1 6,9 5,6

ИЭГМ АС 86 4,6 Нет данных 5,0 2,7

ИЭГМ АС 87 7,3 1,4 7,0 3,8

ИЭГМ АС 89 4,9 0,5 4,8 2,0

ИЭГМ АС 90 5,0 Нет данных 5,3 3,5

ИЭГМ АС 91 5, 8 1,4 6,3 5,6

ИЭГМ АС 93 6,3 1,0 4,8 2,5

ИЭГМ АС 94 6,9 3,0 6,7 5,7

ИЭГМ АС 323 5,0 1,3 4,6 1,7

ИЭГМ АС 324 5,0 1,5 5,8 2,6

ИЭГМ АС 351 5,3 1,0 6,0 3,0

ИЭГМ АС 352 6,9 0,5 6,9 3,7

ИЭГМ АС 370 7,3 Нет данных 9,4 4,6

Примечание. Скорость поглощения кислорода выражена в мкл Оз / (чхмг веса сухих клеток).

на н-алканах биосурфактанты, выступающие в качестве внутриклеточных протективных веществ. Известно защитное влияние аминокислот с короткими (аланин, глицин, аспара-гин) и длинными углеродными цепями на повышение барьерных функций клеточных мембран. Однако эти вопросы требуют дальнейшего специального изучения, которое приблизит к более полному пониманию механизмов формирования устойчивости клеточных структур Шкх1ососсих врр. к замораживанию и обезвоживанию-регидратацин.

Таким образом, в результате проведенных исследований отобраны рациональные методы лабораторной консервации алканотрофных родококков, обеспечивающие длительное поддержание их жизнеспособности и сохранение биологических особенностей. В биотехнологии сухих препаратов наиболее перспективным и надежным средством долгосрочного хранения является лиофилизация родококков с алканотрофным обменом. Полученные данные свидетельствуют о том, что отмирание клеточной популяции родококков, переживших лиофилизацию, происходит в два этапа' 1-й этап, включающий быструю гибель не приспособленных к замораживанию-высушиванию клеток, и И-й этап - медленное отмирание адаптированных (переживающих) клеток. Ориентировочная длительность сохранения жизнеспособности штаммами к!пх1ососси.<> врр. в лиофилизированном состоянии составляет 5,0-32,8 лет.

Таблица 24. Жирно-кислотный состав клеток ЯгиЬег, выращенных на разных питательных средах (% к общему количеству жирных кислот)

Жирные кислоты Среда культивирования Жирные кислоты Среда культивирования

МПА "К" в присутствии МПА "К" в присутствии

пропана л-гтен-тана н-гекса-декана пропана н-пен-тана н-гекса-декана

Сэо 0,06 0,06 0,04 0,00 С17.0 0,54 0,88 7,07 0,23

Cl0:0 0,12 0,16 0,00 0,40 Cl7:l 2,32 4,64 4,23 1,10

Cll-0 0.34 0,18 0,13 0,57 С 18.0 0,24 1,00 3,27 0,23

Cl 1:1 0,00 0,04 0,07 0,00 Cl8:l 26,18 26,06 17,40 5,70

С 12:0 0,34 0,30 0,13 1,20 Cl8:2 0,08 1,92 4,50 1,10

Cl2:l 0,10 0,04 0,13 0,13 pCw-o 0,14 0,00 0,10 0,00

Cl3:0 0,14 0,24 0,30 0,13 С19 0 0,00 2,58 6,53 0,27

Cl3:l 0,16 0,84 0,07 0,33 Cl9:l 0,00 0,32 3,07 0,53

pCl4:0 0,00 0,00 0,00 0,13 С20Л 0,00 0,82 10,07 0,00

Cl4:0 2,42 2,84 0,67 6,10 C20 1 0,00 0,18 1,37 0,07

С 14:1 0,18 0,46 0,20 0,20 C210 0,00 0,00 0,97 14,80

pCl5:0 0,40 0,00 0,27 0,00 C21.I 0,00 0,00 0,07 0,00

Cis 0 2,62 2,60 9,20 0,37 C22O 0,00 0,00 1,40 0,00

Cis.l 0,24 0,22 0,10 0,57

pCi6o О.ОО 0,00 0,00 0,90 Сумма

Cis 0 50,48 37,34 25,17 49,27 насыщенных 57,58 48,94 65,68 74,60

С i61 9,60 10,80 3,27 10,47 ненасыщенных 38,86 45,52 34,48 20,20

Примечание. Сро - число атомов углерода и двойных связей. Приведены средние данные для 3-х исследуемых штаммов И.гиЬег ИЭГМ АС 333, ИЭГМ АС 336, ИЭГМ АС 371.

Создание специализированной коллекции микробных культур и ее информационное обеспечение. Полезность сохранения н значительная материальная ценность сохраняемых микробиологических ресурсов очевидны [47]. В преддверии грядущего био-технологнческого столетия все больший удельный вес приобретают коллекции живых культур, так как они "... представляют механизм, гарантирующий сохранение микробного разнообразия ex siiu и делающий микроорганизмы, доступными для использования и изучения человеком" (Microbial Diversity, 1991). Собрание большого числа природных изоля-тов из разнообразных субстратов различных эколого-географических регионов (рис, 19) послужило основой для развития первой на Урале коллекции микробных ресурсов, специализирующейся на поддержании и изучении практически ценных культур, основная биологическая функция которых - ассимиляция природных и антропогенных газообразных (Сз-С4), жидких »-алканов, ароматических углеводородов [45, 67, 70|. Как видно из рис. 20, большую долю коллекции составляют бактерии рода Rhodococcus. На вошедшие в коллекцию штаммы составлен поисковый каталог (на русском и английском языках) в виде компьютеризированной базы данных (БД). На основе детальной выборки известного RKC-кода в рамках международных форматов Всемирной федерации коллекций культур с использованием программного обеспечения, предложенного выступающей в роли клирингового информационного центра Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ

о Воздух

* Снег

• Почва Д Вода

& Доннцеос адки О Грунт

Рис 19. География и источники выделения бактериальных культур.

□ Юю^сосси?

□ Оогслопа В 0!еШа

□ ЫосагсЬа

П М1сгососси$ ОКосипа Ш Всгтасоссих ТхикатигсНа

Рис 20. Биорачнообрачис сохраняемых бактериальных культур

ИБФМ РАН), подготовлен массив биологической информации, включающий кроме традиционных сведений, как то: научные наименования родов и видов в соответствии с требованиями официальной бактериологической номенклатуры, номера и описание истории штаммов, субстратов их выделения, потенциально важных для биотехнологии специфических свойств, рекомендации по методам выделения и культивирования, рецепты питательных сред, режимы консервации, перечень метаболизируемых поллютантов, а также библиографический справочник (по таксономии, морфологии, физиологии, практическому знанию штаммов, современным методам их изучения), свидетельствующий о степени изученности того или иного сохраняемого штамма. Так, сформированная БД "Характеристика штаммов" содержит информацию типа "Номер коллекции ИЭГМ -ЛКС-код признака - Выраженность признака (+/-)". На настоящий момент число штаммов, охарактеризованных таким образом, - 378, число использованных признаков - 352. Выявлены более 50 признаков, несущих таксономическую нагрузку, а также связанных с

экологической специализацией исследуемых культур. Применение специализированной системы хранения научной информации и обработки данных о сохраняемых штаммах на основе пакета программы СУБД Paradox, версии 4.5 (доступ к программе осуществляется в диалоговом режиме) позволяет в значительной степени ускорить процесс поиска нужной культуры, распечатывать по запросам пользователей отдельные разделы БД, а также обеспечивает оперативный обмен данными в мировой информационной сети. Первоначальная информация о сохраняемом микробном генофонде издана в сводном Указателе культур микроорганизмов (List of Microbial Species..., 1990). В результате проведенной трудоемкой и тщательной систематической ревизии поддерживаемых культур на основе фенотипических, хемотаксономических, иммунохимических и генетических методов анализа составлен и издан на русском и английском языках Каталог штаммов [531, предназначенный для отечественных и зарубежных пользователей. Массив каталожной информации (английская версия) установлен в Международной сети данных о штаммах микроорганизмов и клеточных линиях (MSDN. Sheffield, England, UK), Всемирном центре данных о микроорганизмах (WFCC \VDCM, RIKEN, Hirosawa, Japan) и используется в каналах Всемирной сети Internet.

Образец "сжатой" каталожной информации:

Rhodococcus ruber ' (Kruse 1896) Goodfellow and Alderson 1979"

иэгм'' ac4 333s <- Ившина И б. ИЭ1 m. оэгм 27-п'. ¿г. грунтовая вода', контурная зона нефтяного месторождения, Пермская обл., Россия8. (Среда 5, 28" С, Л-3, С-4)9 [17, 24, 31, 34, 39-40, 51, 60110

Примечание. 1 — действительное (валидное) наименование рода, вида бактерий; 2 - авторы, описавшие и переописавшие вид, год валидации согласно Спискам одобренных наименований; 3 - акроним коллекции;4 - обозначение группы микроорганизмов е коллекции ИЭГМ. АС -актиномицеты; 5 - номер штамма в коллекции. 6 - лицо и организация, откуда получен штамм, под каким номером передавался; 7 - субстрат выделения; * - географическое местоположение выделения штамма; 9 - питательная среда и температура культивирования; методы хранения и консервации: 10 - библиографическая ссылка на авторские работы, в которых использован данный штамм.

В последнее время коллекции чистых микробных культур становятся одними из важных канатов обмена информацией (Калакуцкий, Мазанов, 1996; Kalakoutskii, Mazanov, 1997). Таким образом, недавнее представление о коллекциях как только лишь о месте складирования различных штаммов существенно устарело, ибо сегодня коллекции предоставляют не только культуры, но и значительные объемы информации о них. Собранный фонд непатогенных культур родококков с высокой активностью оксигеназного комплекса - удобный объект изыскания новых продуцентов ценных веществ, деструкторов и трансформаторов ксенобиотиков, а также для конструирования новых форм и создания новых биологических технологий. Принцип отбора штаммов по таксономическим и функциональным критериям - их потенциальная перспективность для работ по биотехнологии и защите окружающей среды. Использование биохимического потенциала коллекции реачьно в решении таких проблем, как производство корма на нетрадиционных источниках сырья (пропане, я-бутане), энзиматическая транформация углеродных соединений, производство нефтегазоразведочных работ, интенсификация вторичной добычи нефти, контроль и очистка углеводородного загрязнения воздушной и водной сред, био-ремедиация нефтезагрязненных почв. Ценность коллекции в том, что значительная часть ее культур выделена из природы и детально изучена с применением современных методов характеристики и идентификации "классические" признаки, клеточная стенка и

структура, жнрные кислоты, хеиотаксономические маркеры, видоспецифическая ПЦР, электрофорез белков, и.ммунохимические методы - используемые в работе методы идентификации приведены в соответствии с ориентировочными границами таксономического разрешения (Калакуцкий и др., 1996; Уапс1атте е! а!., 1996). Среди коллекционных культур наряду с типовыми штаммами всех валидных видов ЮюЛососсая широко представлены экстремальные формы, имеющие значительный потенциал для промышленной эксплуатации: психроактивные штаммы с широким температурным диапазоном, гало-, термо-, баро-, осмо-, ксеро-, ацидо-, алкалотолеранты; штаммы-деструкторы различных классов органических загрязнителей, как то: анилин, фенолы, нафталин, моно- и дикар-боновые кислоты, оксикислоты, сырая нефть и нефтепродукты; штаммы-продуценты незаменимых аминокислот и биосурфактантов. Программа последовательных действий по изучению и сохранению микробного генофонда может быть представлена в виде схемы (рис. 21), включающей различные направления работы - от адекватного отбора природ-

Рис. 21. Последовательность основных направлений работы по изучению и сохранению микробного генофонда

ного материала и систематического сбора штаммов алканотрофов, их последующего исследования, классификации и таксономического описания, оценки биотехнологической

пригодности и разработки новых и совершенствования существующих методов долгосрочного хранения практически ценных культур до обеспечения непрерывности в передаче пользователям наборов штаммов и полезной научной информации, что собственно и составляет смысл устойчивого существования ресурсных центров. Ибо имеющиеся микробные генетические ресурсы уникальны и, в случае утраты, восстановление их посредством повторного выделения из природных популяций сопряжено с большими трудностями или вовсе невозможно.

Цитируемая литерату ра

1. Баросс Д, Моритз Р // Жизнь микробов в экстремальных условиях/Под ред. Д.Каишсра. М: Мир. 1981. 19-88.

2. Бекер М.Е.. Рапопорт А.И.. Калакуцкий Л.В и др. // Торможение жизнедеятельности клеток. Рига: Зиизтне, 1987.240 с.

3. Волков В.Я. // Микробиология, 1994. 63, 1, 5-16

4. Волков В.Я., Сахаров Б.В . Щепкин В Д и др. //Микробиология. 1992. 61. 2. 214-222.

5. Калакуцкий Л В., Мазанов А Л. // Микробное разнообразие систояние. стратегия, экологические проблемы. Пермь, 1996. 41

6. Калакуцкий Л.В., СЬерская С.М., Евт\ шенко Л И, Мазанов А.Л. // Прикл. биохимия и микробиология.. 1996, 32, 1, 144-154

7. Куплетская М Б. // Микробиология. 1987. 56, 3, 488-491.

8. Нестеров А И., Кошелев А В.. Гальченко В.Ф., Иванов М.В. // Микробиология. 1986, 55, 2. 271277.

9. Ротмистров М.Н.. Ставская С С.. Таранова Л А идр //Микробиология, 1990,59. 1, 271-277.

10. Сидякииа Т.М. Консервация микрооргатгаюв в коллекциях культу р. Сер. Консервация генетических ресу рсов. Пущино: ОПТИ НЦБИ АН СССР, 1990,81-159 .

11. Шкорбатов Г.Л. //Жури. общ. биологии, 1982,43, 6. 775-787.

12. Benschoter. A.S.. Ingram. L О. // Appl. Environ. Microbiol. 1986. 5 L 6. 1278-1282.

13. HecklvR J.// Adv. Appl Microbiol.. 1978, 24,1-53.

14. Henry J., Kirsop B. // UNESCO/ WFCC Technical Information Sheet ('TIS), 1989, 3. 1-3.

15. Kalakoulskii. I.V.. Mazanov, A.L. /7 Proceedings of the First East-European Symposium on Advanced m Databases and Information Systems. St.-Petersburg, 1977. 85-87.

16. List of Microbial Species Maintained in Collections of Bulgana. Vietnam. DDR, Mongolia. USSR and

Czechoslovakia. Yellow Pages in Biotechnology (Bulgaria). 1990, 2-4, 28pp.

17. Malik K.A.// UNESCO/ WFCC Tcehnicallnformation Sheet (T1S). 1990. 7, 1-4.

18. Malik K.A. // UNESCO/ WFCC Technical Information Sheet (T1S), 1990a. 8. 1 -4.

19. Microbial Diversity 21. IUMS/IUBS Action Statement. WFCC Newsletter. 1991, 17. 18-20.

20. Mikata. K., Banno, I. // IFO Res. Communs, 19S9, 14, 80-103.

21. Rusell. N.J. // Trends Biochem Sci, 19S4, 9. 3. 108-112.

22. Takaichi. S.. Ishidsu. J.,Seki Т.. Fukada. S. // Agric. Biol. Chem.. 1990. 54, 8, 1931-1937.

23. Vandamme, P.. Pot. В , Gillis. M. el til. // Microbiol. Rev.. 1996, 60,1, 407-438.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, итогом многолетних исследований, основные результаты которых представлены в настоящей работе, явилось дальнейшее развитие фундаментальной базы данных о биологии бактерий рода Rhodococcus природных биогеоценозов, оригинальных методологических подходов к дифференциации Rhodococcus spp. и создание стабильно работающей Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов, ответственной за поддержание, комплексное изучение и сохранение биоразнообразия специализированных микробных форм ех,т situ и способствующей их практическому использованию в различных областях биотехнологии, в значительной степени ориентированных на поиски новых видов сырья, целевые энзиматические процессы, создание высокопродуктивных штаммов и новых технологий.

После проведенной экспертизы состояния коллекции, ее научной и экономической значимости Региональная профилированная коллекция алканотрофных микроорганизмов зарегистрирована (сентябрь, 1996) в WCDM WFCC

ВЫВОДЫ

Выделенные на протяжении ряда лет из разнообразных природных субстратов контрастных эколого-географических регионов нокардиоподобные бактерии (более 300 чистых культур) на основании полифазных таксономических исследований отнесены к роду Rhodococcus (Zopf 1891) Goodfellow and Alderson 1977. Выраженная биологическая пластичность природных изолятов Rhodococcus spp., в основе которой обнаружен характерный комплекс стратегических приемов выживания: алкано- и олиготрофный образ жизни, широкая норма реакции в сочетании с толерантностью к повреждающим клетку воздействиям, высокая сопротивляемость конкурентам, способность к синтезу и аккумуляции больших количеств эндогенных резервных веществ в качестве дополнительных энергетических субстратов, диауксотрофные свойства, реализация элементов различных экологических тактик, - делает их наименее зависимыми от внешней среды и обеспечивает их широкое распространение в природе, сохранение относительно стабильной численности особей в занимаемой экологической нише н приуроченность к специфическим местообитаниям.

1. Для эффективного выделения алканотрофных родококков из природных образцов разработаны селективные питательные среды с добавлением одного или комбинаций антибиотиков: хлорамфеникола - 20 мкг/мл; линкомицина - 90 мкг/мл и полимиксина -100 Ед/мл; эритромицина - 2,5 мкг/мл и налидиксовой кислоты - 20 мкг/мл, подавляющих рост фоновых микроорганизмов (представителей родов I'seudomonas, Kocuria и Micrococcus). Данные среды характеризуются высокими значениями селективного индекса (85-98 %) и рекомендуются к использованию в экологических исследованиях газоокис-ляющих родококков и при культивировании их в нестерильных производственных условиях.

2. Средний уровень численности алканотрофных родококков достигает 105-10" клеток/мл в нефтезагрязненных почвенных образцах и 10М04 клеток/мл в подземных и поверхностных водах. С использованием иммунофлуоресцентной микроскопии выявлена приуроченность отдельных видов родококков: R.crythropolis, R.ruber, Rrhodochrous,

R."opaats'\ ¡VIongiis" к районам углеводородных скоплений. Доминантные виды R.ruber и Rrhodochrous рекомендованы как биоиндикаторы углеводородных залежей.

3. Разработана оптимальная схема видовой дифференциации Rhodococcus spp., основанная на использовании ограниченного числа выявленных нумерическим анализом признаков и включающая в качестве диагностических маркеров таксономически значимые антибиотики, свободные жирные кислоты, а также характеристики суммарных клеточных белков.

- Совокупный видовой профиль антибиотикочувствительности служит полезной характеристикой при исследовании таксономической структуры Rhodococcus spp. Информативная значимость данных антибиотикотипирования подтверждена результатами генетического анализа родококков с использованием видоспецифической полиме-разной цепной реакции. Для различения близкородственных видов: R.rhodochrons и Rruber предложен тест на чувствительность к ампициллину, олеандомицнну, фузиди-ну, эритромицину; R.'longuи R.opacus - на чувствительность к докспциклину, кана-мицину, полимиксину, фузиднну и хлорамфениколу.

- Выявленные особенности жирно-кислотного клеточного пула Rhodococcus spp. таксономически значимы. Частная таксономическая система, построенная на данных жирно-кислотного состава родококков, позволяет дифференцировать их на видовом уровне.

- Сопоставление спектров общих клеточных белков позволяет судить о степени однородности таксонов родококков, дифференцировать фенотипически сходные виды R.rhodochrons и R.ruber, R"longus" и R.opacus, и определять межвидовые и внутривидовые взаимоотношения. Для практики диагностирования Rhodococcus spp. с использованием протеинограмм рекомендован набор эталонных штаммов (R.eryíhropolis ИЭГМ АС 193. Rruber ИЭГМ АС 70т, R.fascians ИЭГМ АС 170, R.opacus ИЭГМ АС 58; Rrhodochrous ИЭГМ АС 63) с типичными белковыми спектрами.

- Проведенные исследования свидетельствуют об обособленном положении родококков R.'longus" и возможности присвоения им статуса нового самостоятельного таксона.

4. Методы иммунохимнческого анализа позволяют с большой достоверностью проводить экспрессную видовую диагностику родококков на основе их антигенных характеристик и определять антигенные взаимоотношения между отдельными таксонами Rhodococcus.

- Впервые в рамках единого (иммунодиффузионного) метода с использованием набора полиююнальных специфических иммунных сывороток против типовых штаммов известных видов Rhodococcus проведен таксономический анализ большого массива коллекционных и свежевыделенных штаммов родококков, охарактеризованы их иммуногенность и антигенная специфичность, установлено значительное антигенное сходство видов R.coprophilns, Rrhodochrous и R.niber; R.'4origus" и R.opacus; R.erylhropohs и R.globerulus.

- С помощью иммунохлмических методов наиболее успешно диагностируются R.rhodochrons, R.rirfier, R.fascians, а также R.opacus и R."/ongus". В качестве apompa видовой экспресс-диагностики чистых культур родококков рекомендован метод иммунодиффузионного анализа для ускоренной детекции и идентификации Rhodococcv.s spp. в смешанных популяциях - непрямой метод иммунофлуоресцерующих антител.

- Впервые с использованием разработанных эффективных схем гипериммунизации животных комплексными антигенами родококков создан банк видоспецифических аитиродококковых сывороток с достаточно высокими титрами антител: средние величины logiтитров агглютининов составляют 9,0+0,50 -12,3±0,74.

- С помощью иммунодиффузионного и иммунофлуоресценгного анализа выявлено серологическое различие таксонов Rhodococcus и Micrococcus (основных представителей спутниковой микрофлоры) и показана возможность их четкого распознаваши и разграничения ex/in situ.

- Экспресс-метод обнаружения и идентификации индикаторных на нефть и газ пропан- и бутанокисляющих родококков на основе непрямой иммунофлуореспенции реализован в производстве нефтегазопоисковых работ.

5. Экспериментально доказано, что спектр органических субстратов, используемых родококками, существенно различается у представителен различных видов, в частности R.erylhropolis, R.fascians, R.ruber, R.rhodochrous, R."¡ongits" и R.opacus проявляют более широкую ферментативную активность по сравнению с таковой R.globerulus, R.rhodnii, Rcoprophilus и llequi. Родококки - уникальная физиологическая группа организмов, высокоадаптированных к ассимиляции тяжелых газообразных и жидких и-алканов. Использование газообразных (С;,-С4) и жидких низкомолекулярных (С?-С8) w-алканов в качестве единственного источника углерода и энергии свойственно лишь отдельным видам Rhodococcus -R.ruber, Rrhodochrous, R.opacus.

6. В условиях индуцированного алканотрофного метаболизма получены новые данные о своеобразии структурной и мегаболической организации Rhodococcus spp. Выявленные клеточные приспособления родококков значительно расширяют их адаптивные возможности и свидетельствуют об исключительной пластичности Rhodococcus spp.

- Методом сканирующей электронной микроскопии продемонстрированы разнообразные способы кооперации клеток Rhodococcus spp. в колониальной популяции, слипание пептидогликановых слоев клеточной стенки, формирование одиночных пи-левидных поверхностных тяжей и множественных шишковидных выростов на наружной поверхности клеточной стенки, обеспечивающие закрепление родококков и сохранение их в гетерофазных природных средах.

- Детально изучена ультратопкая организация клеток родококков, культивируемых на средах с н-алканами и без них. Выявлены наиболее типичные реакции родококков на присутствие пропана, «-бутана, н-пентана, //-октана и н-гексадекана: наличие фибриллярных капсул полисахаридной природы, повышение содержания и размеров гранул полифосфатов и поли-р-оксибутирата; фрагментация цитоплазмы; формирование окснсомоподобных структур, а также гиперсинтез мембранного аппарата и преимущественная локализация сложных мембранных структур около клеточной стенки; активный синтез новых участков клеточной стенки.

- При переходе на углеводородное питание выявлены высокая резистентность родококков к олеандомицину, линкомицину, оксациллину и резкое снижение чувствительности к гентамицину, неомицину, эритромицину и хлорамфениколу, сопровождающиеся повышением содержания (до 14-28 %) суммарных клеточных липидов, насыщенных прямоцепочечных жирных кислот (Ci6o, Ciso, C2i о), присутствием в составе фосфолипидов кардиолипина и фосфатидилглицерина, а также 3-5-кратным увеличением окислительной активности неспецифических ферментных систем.

- В сравнительных исследованиях спектров жирных кислот природных штаммов Rhodococcus spp. показана уникальность жирно-кислотного пула клеток родококков в условиях перехода их на газовое питание - к использованию пропана и «-бутана. Специфическая черта газоокисляющих родококков - сравнительно высокое содержание (до ¿0 % от суммы) мононенасыщенных жирных кислот.

- С помощью иммунохимических реакций (иммуноднффузии и иммуноэлектрофо-реза) установлен факт появления в клетках пропанокисляющнх Rruber в условиях перехода их на углеводородное питание специфических дополнительных антигенов, не выявляемых у данных организмов при культивировании их на полноценной питательной среде и являющихся феноменом, обусловленным особенностями углеродного метаболизма газоокисляющих родококков.

- Установлено, что в условиях переключения родококков с углеводного на углеводородное питание изменяется качественный и количественный состав зкстрацеллю-лярных аминокислот. В присутствии пропана изоляты Rruber синтезируют более широкий спектр (аргинин, валин, аланин, гистидин, глутаминовая кислота, фенилаланин) и большее количество (до 1,5 пзМ/л) внеклеточных аминокислот, чем при выращивании их на минеральной среде с глюкозой

7. Изучены поверхностно-активные и эмульгирующие свойства Rhodococcus spp. при росте их па жидких и-алканах (С16 или смеси С12-С17). Выделены и описаны наиболее активные продуценты экологически безопасных биосурфактантов с высокой эмульгирующей активностью (Е24 - 62,5 %). Для эффективного выделения поверхностно-активных комплексов разработан оригинальный метод, включающий экстрагирование биосурфактантных комплексов метил-третичнобутиловым эфиром в режиме ультразвукового озвучивания. Применение биосурфактантных коыппексов-Rhodococcus в технологии очистки нефтезагрязненных почв способствует ускорению разложения нефти природной микрофлорой. Эффективность очистки после 4-х месяцев биоремедиации почвы в районе нефтепромысла составляет 60,0 %

8. Подобраны оптимальные методы хранения чистых культур родококков. Наиболее перспективным и надежным средством долгосрочного хранения Rhodococcus spp. является лиофилизация клеток с алканотрофным обменом. Прогнозируемая длительность сохранения жизнеспособности штаммами родококков в лиофилизированном состоянии -от 5,0 до 32,8 лет.

9. Создана реально действующая наиболее полная в стране и за рубежом коллекция чистых идентифицированных культур R}iodococcus spp , располагающая современными методами полифазной таксономии, и компьютеризированная база данных, используемая в каналах Internet.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Оборин А.А., Ившина И.Б. Влияние гидрохимических факторов на рост и размножение бактериофлоры грунтовых вод в районе Уфимского плато/Механизмы регуляции развития бактериальных популяций: Труды/УрО РАН. Ин-т экологии растений и животных. - Свердловск: УНЦ АН СССР, 1977. - С. 96-99.

2. Поносов В.Л., Ившина И.Б , Кеворков НН., Спекггор Г.И. Иммуногенность и антигенная специфичность сапрофитных штаммов бактерий, ассимилирующих углеводо-роды//Микробиол. журн. - 1977. - Т. 39. N. 6. - С. 753-755.

3. Оборин А.А., Владимирцев Г.И, Гусев В.А., Ившина И.Б. Результаты грунтовой газобиохимической съемки в районе Кырыкмасского месторождения нефти Удмуртской АССР//Микробиол. промышленность. М.: ОНТИТЭИмикробиопром, 1977. - Вып. 3(145). -С. 26-28.

4. Ившина И.Б., Владимирцев Г.И Сравнительная характеристика углеводородо-кисляющей микрофлоры грунтовых вод Пермского Предуралья и Ставропо-лья//Геомнкробиология поиска н разработки нефтяных месторождений: Труды/ УрО РАН. Ин-т экологии растений и животных. - Свердловск: УНЦ АН СССР. 1979,- С.51-53.

5. Оборин А.А., Ившина И.Б., Бердичевская М.В. О природных экологических факторах, влияющих на жизнедеятельность углеводородокисляющей микрофлоры//Там же. - С. 30-38.

6. Могидевский Г.А., Оборин А.А., Королев В.К.. Ившина И.Б., Бердичевская MB. Микробное воздействие на нефтяной пласт. - М.: ВНИИОЭНГ, 1979. - 44 с

7. Ившина И.Б. Сравнительное изучение антигенной специфичности различных видов газоиспользующих бактерий//Геохимичсские поиски нефти и газа на Русской платформе: Межвуз. науч. сб. - Изд-во Саратовского ун-та, 1980. - С. 41 -43.

8. Ившина И.Б., Кеворков Н.Н., Оборин А.А. Серологическая идентификация уг-леводородокисляющих бактерий//Прогресс в познании микробного мира. - VT Съезд Все-союз. микробиол. общества: Тез.докл,-Рига, 1980. - Т. 1. - С. 60.

9. Ившина И.Б., Оборин А.А., Нестсренко О.А., Касумова С.А. Бактерии рода Rhodococcus грунтовых вод района нефтяных месторождений Пермского Предура-лья//\1икробиология - 1981. -Т. 50. Вып. 4. - С. 709-717.

10. Ившина И.Б., Нестеренко О.А., Глазачева Л.Е., Шеховцов В.П. Электронно-микроскопическое изучение газоиспользующих Rhodococcus rhodochrous Н Микробиология. - 1982. - T. 51. Вып. 3. - С. 477-481.

11. Ившина И.Б. Биология бактерий рода Rhodococcus, усваивающих пропан и н-бутан: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. -Киев, 1982. - 23 с.

12. Ившина И.Б., Кеворков Н.Н., Коблова ИВ., Нестеренко О А., Квасников Е.И. Идентификация бактерий рода Rhodococcus методом иммунодиффузии//Микробиология. - 1982.-Т. 51.Вып 4.-С. 636-641.

13. Ившина И.Б., Кеворков Н.Н. Использование ультразвука для выделения антигенных комплексов бактерий рода Rhodococcus/fHoBbie методы в теории и практике медицины. - Пермь: ПГМИ, 1983. - С. 69-72.

14. Ившина И.Б. Экспрессные методы диагностики углеводородокисляющих родо-кокков//Экология, человек и проблемы окружающей среды: Тез. докл. Регион, конф -Свердловск, 1983 -С. 44

15. Бердичевская М.В., Ившина И.Б., Нестеренко О.А., Шеховцов В.П. Свойства и видовой состав родококков пластовых вод Пермского Предуралья//Микробиология. -1984. - Т. 53. Вып. 4.-С. 681-685.

16. Ivshina, I.B., Pshenichnov, R.A., Kevorkov, N.N., Oborin, А.А. Properties of the antigenic structure of bacteria belonging to the genus Rhodococcus, cultivated on différent

mcdia76th Inter. Symposium on Actinomycetes Biology Abstr. - Debrecen, Hungary, 1985. - P. 689.

17. ИвшинаИ.Б., Пшеничное P.A., Кеворков H.H. Особенности антигенной структуры родококков, культивируемых на разных средах//Микробиология. - 1985. - Т. 54. Вып. 2. - С. 290-292.

18. Ившина И.Б., Пшеничнов Р.А , Оборин A.A. Экспрессный метод диагностики индикаторных на нефть и газ микроорганизмов/УДостижения микробиологии - практике.

- \П Съезд Всесоюз. микробиол общества: Тез. докл. - Алма-Ата, 1985. - Т. 6. - С. 70.

19. Ившина И.Б. Газоокисляющие родококки как компонент естественного биоценоза "бактериального фильтра" и нефтегазопоисковый индикатор// Бактериальный фильтр Земли и значение углеводородокнсляюших биоценозов для нефтегазопоисковой биогеохимии, рекультивации нефтезагрязненных земель и контроля загрязнения природной среды. - Пермь, 1985. - С. 6-7.

20. Ившина И.Б., Коблова И.В., Кеворков H.H. Сравнительный анализ антигенной структуры родококков, выращиваемых на разных летательных средах, методом иммуно-элетрофореза//Там же. - С 22-23.

21. Ившина И.Б., Кеворков H.H. Перспективы серодиагностики в изучении экологии родококков//Биохимическая экология. - Свердловск- УНЦ АН СССР, 1985 - С. 62-66.

22. Ившина И.Б. Способ дифференциации отдельных видов родококков /7 Естественные науки на службе здравоохранения1 Тез. докл. Регион конф. - Пермь, 1985. - С. 29-30.

23 Ившина И.Б., Коробов В.П., Безматерных Г.И. Определение свободных аминокислот в культуральной жидкости родококков методом ионообменной хроматогра-фии//Там же. - С, 30-31.

24. Ившина И.Б. Способы получения специфических иммунных сывороток против бактерий рода Л/7(7£?осот«//Микробиол. журн. - 1986. - Т. 48. N. 2. - С. 8-13

25. ИвшинаИ.Б. Иммунофлуоресцентный анализ как перспективный метод оценки экологического загрязнения//Биоиндикация и биотестирование природных вод: Тез. докл. Всесоюз. конф. - Ростов-на-Дону, 1986. - С. 98.

26. Ившина И.Б., Коблова И.В., Безматерных Г.И., Нестеренко O.A., Квасников Е.И., Шкаруба В В. Идентификация новых видов бактерий рода Rhodococcus методом иммунодиффузин//Мик-робиол. журн. - 1986. - Т. 48. N. 2. - С. 3-8.

27. Степанова P.A., Ившина И.Б., Шкаруба В В., Милько Е.С., Егоров Н С О систематическом положении Mycobacterium lacticolum, штамм 104//Вестник Моск. ун-та. Серия 16. Биология. - 1986. -N. 2. - С. 63-67.

28. Ившина И.Б. Ассимиляция углеводородов бактериями рода RJiodococcus // Экология и популяционная генетика микроорганизмов: Труды/УрО РАН. Ин-т экологии и генетики микроорганизмов. - Свердловск. УНЦ АН СССР, 1987. - С. 41-46.

29. Ившина И.Б, Оборин A.A.. Рубинштейн JIM., Гусев В.А. Распространение бактерий, усваивающих пропан и н-бутан, в подземных водах Пермского Предуралья//Там же.-С. 27-31.

30. Ившина И.Б., Безматерных Г.И Биосинтез свободных аминокислот родокок-камиУ/Биоеинтез вторичных метаболитов Тез. докл. Всесоюз. конф. - Пушино, 1987. - С. 33-34.

31. Ившина И.Б., Пшеничнов P.A., Оборин A.A. Пропанокисляющие родококки. -Свердловск: УНЦ АН СССР, 1987. - 125 С.

32. Ившина И.Б, Шеховцов В.П. Морфогенез и функция поверхностных структур родококков//ХШ Всесоюз.конф. по электронной микроскопии: Тез. докл. - Москва, 1988,

- С. 82.

33. Ivshina, I.B., Oborin, A.A. The biology of propane-, and и-butane-assimilating bacteria of the genus Rhodococcus/Hih Inter. Symposium on Biology of Actinomycetes. -ISBA'88: Abstr. - Tokyo, Japan, 1988. - P. 570.

34. Барбан П.С., Пшеничное Р.А., Пантюхина А.Н., Ившина И.Б. Иммунофлуо-ресцентный анализ. - Свердловск: УрО АН СССР, 1988. - 175 С.

35. Ившина И.Б., Оборин А.А., Каменских Т.Н., Рубинштейн JI.M., Шишкин A.M. Динамические исследования пропан- и бутанокисляющих бактерий в почве нефтегазоносных структур/ТБиодинамика почв. - III Всесоюз. симпозиум: Тез. докл. - Таллин, 1988. -С. 34.

36. Ившина И.Б. Иммунохимическое выявление ферментов окисления газообразных и-алканов пропан- и бутанокисляющих родококков//Биосинтез ферментов микроорганизмами: Тез. докл. Конф. Всесоюз. микробиол. общества. - Ташкент, 1988. - С. 64.

37. Ившина И.Б., Оборин А.А. Иммунофлуоресцентный анализ в практике нефте-газопоисковых работ//'Основные направления научно-технического прогресса в развитии нефтяной промышленности Пермского Прикамья. - Пермь: ПермНИПИнефть, 1989. - С. 39-41.

38. Ivshina, l.B. Bacteria of the genus Rhodococcus in the oil-bearing structures// 5th Inter. Symposium on Microbial Ecology: Abstr. - Kyoto, Japan, 1989. - P. 221.

39. Глазачева Л.Е., Ившина И.Б., Оборин A.A. Клеточные приспособления Rhodococcus rhodochrous и Rltodococcus ruber, усваивающих пропан и и-бутан// Микробиология. - 1990. - Т. 59. Вып. 2. - С. 301-306.

40. Ившина И.Б., Каменских Т.Н., Козырева Г.И. Антибиотикочувствительность родококков, культивируемых на разных средахУ/Факторы и механизмы регуляции развития бактериальных популяций: Труды/УрО РАН. Ин-т экологии и генетики микроорганизмов. - Свердловск УНЦ АН СССР, 1990. - С. 92-98

41. Оборин А.А., Ившина И.Б., Рубинштейн Л.М., Гусев А.В Пропан- и бутано-кисляющие родококки, выделенные из почв над месторождениями нефти//Там же. - С. 49-54.

42. Ившина И.Б., Оборин А.А. Усовершенствование мегода микробиологического прогнозирования углеводородных залежей на основе непрямой иммунофлуоресценции // Особенности технологии геохимических методов поисков месторождений нефти и газа. -Алма-Ата: КазИМС. 1990. - С. 58-60.

43. Ivshina, l.B. Serological identification of the genus Rhodococcus bacteria// European Actinomyces Group Meeting. - Fourth Conference: Abstr. - Udine, Italy, 1990. - P. 89.

44. Козырева Г.И., Ившина И.Б., Ногина T.M., Куберская С.Л. Хемотаксономиче-ская характеристика алканотрофных родококков//Физиология и биохимия микроорганизмов: Труды/УрО РАН. Ин-т экологии и генетики микроорганизмов. - Екатеринбург: УрО РАН, 1992.-С. 45-53.

45. Ившина И.Б. Создание сети взаимодействующих коллекций микробных культур и компьютеризированных банков данных как основы изучения и сохранения разнообразия микробиологических ресурсов//Экология. - 1992. -М. 6. - С. 12-17.

46. Ившина И.Б., Глазачева Л.Е. Ультраструктурная организация алканотрофных родококков//Х1У Конф. по электронной микроскопии: Тез. докл. - Москва, 1992. - С. 53.

47. Ившина И.Б. Коллекции культур микроорганизмов, находящиеся под угрозой исчезновения/Микробиология. - 1993. - Т. 62. Вып. 6. - С. 1148-1152.

48. Ivshina l.B. The immunochemical analysis of the alkanotrophic rhodococci // European Actinomycetes Group Meeting. - 5th Conference: Abstr. - Paris, Institut Pasteur, 1993.-P. 66.

49. Ivshina, l.B. Nocardioform bacteria of the genus Rhodococcus as the subject for immunofluorescent study//FEMS Meeting. Identification of Bacteria. Present Trends-Future Prospects: Abstr. - Granada, Span, 1993. - P. 95.

50. Ivshina, I.В. Alkanotrophic rhodococci and their role in natural ecosystems // Inter. Symposium on Subsurface Microbiology. - TSSM'93: Abstr. Bath, UK, 1993. - B-l 2.

51. Ившина И.Б., Каменских Т.Н., Куюкина М.С., Рычкова М.И., Шадрин О.А., Рыбалка Л.В., Зверева Л.В., Чумаков О Б. Методы консервации культур Rhodococcvs spp. и их применение в практике поддержания специализированного фонда алканотрофных родококков//Микробиология. - 1994. - Т. 63. Вып. 1. - С. 118-128.

52. Ivshina, l.B. Ex'in situ study and preservation of species and functional diversity of RhodococcnsbzzXcnaJUlb Inter. Congress of Bacteriology and Applied Microbiology Division. -IUMS Congress'94: Abstr. - Prague, Czech Republic, 1994. - P. 519.

53. Каталог штаммов региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов. Составители: Ившина И.Б., Каменских Т.Н., Ляпунов Я.Э./Под ред. И.Б.Ившиной. Ин-т экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН. - М.: Наука, 1994. -163 С.

54. Ившина И.Б., Куюкина М.С., Рычкова М.И. Новые продуценты сурфактантов, перспективных для биотехнологии и защиты окружающей среды/ЯТовые направления биотехнологии. - VI Конф. Российской Федерации: Тез докл. - Пущино, 1994. - С. 26.

55. Ivshina, I B. Alkanotrophic rhodococci and their biotechnological potential // 9th Inter. Symposium on the Actinomycetes. - ISBA'94: Abstr. - Moscow, Russia, 1994. - P.266.

56. Ivshina, l.B. Alkanotrophic rhodococci application in the system of monitoring of air enviroment hydrocarbon poilution'/Л): Indoor Air International. - St.-Peterburgh, Russia, 1995. -P. 138-139. (247 P.).

57. Ившина И.Б., Гвоздяк O.P., Богомягкова О.А., Шкаруба В.В. Использование метода иммунодиффузионного анализа в видовой дифференциации микрококков// Микробиология. - 1995. - Т. 64. N. 1 - С 78-82.

58. Ившина И.Б., Бердичевская М В., Зверева Л.В., Рыбалка Л.В., Еловикова Е.А. Фенотипическая характеристика алканотрофных родококков из различных экосистем // Микробиология - 1995. -Т 64. N. 4. - С. 507-513

59 Ившина И.Б. "Микробное разнообразие 21" и формирование Регионального специализированного центра микробных ресурсов на Урале // Наука Урала.- 1995 - N. 16. - С. 4-6.

60. Рычкова М.И., Ившина И Б. Изучение химического состава клеточной стенки бактерий рода Rhodococcus/1Ф\т\ояотя, генетика и экология микроорганизмов' Тру-ды/УрО РАН. Ин-т экологии и генетики микроорганизмов. - Екатеринбург- УрО РАН, 1996. - С. 35-44.

61. Еловикова Е.А., Ившина И.Б. Иммунофлуоресцентное исследование алканотрофных родококкоп//Там же. - С. 20-27

62. Ivshina, 1 В. Alkanotrophic rhodococci: diversity, detection, and identification // Microbial Diversity: current situation, conservation strategy, and ecological aspects. - Inter. Confer. -ICOMID'96: Abstr. - Perm, Russia, 1996. - P. 172-173.

63 Bell, K.S., Kuyukina, M.S., Christofi, N., Ivshina, I B., Philp, J.C., Aw, D.VV. J Identification of bacteria of the genus Rhodococcvs by specific DNA amplification//Ibid.- P. 151 -152.

64. Kuyukina, M.S., Ivshina, I.B., Lyapunov, Y.E., Bell, K.S., Philp, J.C., Christofi, N. Antibiotic susceptibility tests - a reliable complementary method in Rhodococcvs species differ-entiation//Ibid. - P. 189-190.

65. Christofi, N., Ivshina, I.B., Kuyukina, M S., Philp, J.C. Biological treatment of crude oil contaminated soil///«:Contaminated Land and Groundwater: Future Directions. D.N.Lerner. N.R.G.Walton (eds). Portsmouth, UK. 1996. P. 259-268. (449 P.).

66. Ivshina, IB., Philp, J.C, Kuyukina, M.S., Christofi, N Novel and ecologically safe biosurfactants from RhodococcusifBayev Memorial Conf. Abstr.- Moscow, Russia, 1996 - P. 350.

67. Ivshina, I B. Now Russian specialised collection of microbial resources///«: Culture Collections to Improve the Quality of Live. R.A. Samson, J.A. Stalpers, D.van der Nei, AH.

• Stouthamer (eds). UK. 1996. P. 435-436. (504 P.).

68. Ившина И.Б., Куюкина M.C. Селективное выделение пропанокисляющих родококков с использованием антибиотических веществ//Микробиология.- 1997 - Т.66. N. 4. - С. 494-500.

69. Ившина И Б., Куюкина М.С. Способ селективной изоляции пропанокисляющих родококков. Положительное решение ВНИИГПЭ от 10.07 1997 о выдаче патента РФ на изобретение (МПК 6 С 12N1/00, 1/20, 1/26)

70. Ivshina, I.B. Regional specialized collection as a source for preservation of alkanotro-phic microorganisms diversity///«: Environmental Pollution: Assessment and Treatment Ed. P.Read and J.Kinross. 1997. Edinburgh, UK. P 77-84. ( 113 P.).

71. Kamenskikh, T.N., Ivshina, I.B. Conservation and safe storage of propane-oxidising rhodococci//lbid. - P. 85-91. (113 P.).

72. Систематика прокариотных организмов: программа спецкурса для студентов биологического факультета/Перм. ун-т. Сост. к.б.н., с.н с. И.Б.Ившина,- Пермь,1997.-9 С.

73. Нефтяная микробиология: программа спецкурса для студентов биологического факультета/Перм ун-т. Сост. к.б.н., с.н.с. И.Б.Ившина. - Пермь, 1997. - 9 С.

ОГЛАВЛЕНИЕ

Принятые сокращения 3

Общая характеристика работы 4

Актуальность проблемы 5

Состояние вопроса, цель и задачи исследований 7

Цель настоящей работы 7

Основные задачи исследований 7

Научная новизна 8

Практическая ценность 10

Связь работы с крупными программами 11

Апробация работы 12

Публикации 12

Место проведения работы 13

Цитируемая литература 14

I. Объекты и методы исследований 15

Рабочая коллекция культур, условия их выделения и культивирования 15

Фенотипические исследования 16

Хемотаксономический анализ 16

Элекгрофоретический анализ клеточных белков 16

Иммунохимический анализ 17

Изучение патогенных свойств природных штаммов 19

Антимикробная активность 19

Антибиотикочувствительность штаммов 19

Определение активности окислительных ферментных систем 19

Генетический анализ с использованием полимеразной цепной реакции 20

Идентификация 20

Хранение чистых культур и бактериальных диагностикумов 20

Исследования по биоремедиации пахотной дерново-подзолистой почвы 20

Статистическая обработка результатов 20

Цитируемая литература 21 П. Принципы классификации КЬойососсщ. Дополнение диагнозов таксонов. Фе- 22 иотнпическая характеристика и видовая дифференциация

Фенотип ическая характеристика родококков 22 Антибиотикочувствительность как объективный дополнительный критерий видовой

идентификации родококков 23 Жирно - кислотный состав клеток в качестве химического маркера в классификации 30 родококков

Дополнительное описание таксономических групп 33 Сравнительный электрофоретический анализ суммарных клеточных белков как средство ускоренной видовой дифференциации родококков 36 Цитируемая литература 38 ПТ. Иммунодиагностика бактерий рода Шюйососсии 39

Изучение иммуногенностн родококков. Получение поликлональных специфических 39 иммунных сывороток

Антигенная специфичность Юю/Зососсих Брр. Идентификация родококков методом 41 иммунодиффузни

Экспресс-индикация и дифференциация Шю&усоссш эрр методом иммунофлуоресци-рующик антител. Иммунофлуоресцентный анализ видового разнообразия родококков 48 Цитируемая литература 50

IV. Особенности биологии родококков в условиях индукции ферментного оксиге- 50 назного комплекса

Морфогенез, поверхностные структуры, своеобразие ультраструктурной организации и

клеточные приспособления алканотрофных родококков 51

Особенности антигенной структуры родококков, культивируемых па разных средах 55

Сверхсинтез внеклеточных аминокислот газоиспользующими родококками 56

Синтез поверхностно-активных веществ родококками при росте их на м-алканах 58

Повышение антибиотикорезистентности родококков в условиях их роста на и-алканах 60

Разработка метода селективной изоляции газоокисляющих родококков 64

Цитируемая литература 67

V. Родококки как компоненты биогеоценоза: распространение в природе, видовое и функциональное разнообразие, доминирующие формы 59

Цитируемая литература 75

VI. Сохранение жизнеспособности и стабилизация основных свойств Ыюйососсив Брр. Формирование коллекции и информационного банка данных о штаммах алканотрофных родококков .у^

Консервация и гарантированное сохранение культур Шюс/ососси$ Брр. 76

Создание специализированной коллекции микробных культур и ее информационное 84 обеспечение

Цитируемая литература 87

Заключение 88

Выводы 88

Список работ, опубликованных по теме диссертации 92

Подписано в печать 17.11.97. Формат 60x84'/,6. Усл. печ. л. 4. Тираж 100 экз.

Техническая редакция "Пермского медицинского журнала" 614000, Пермь, ул. Большевистская, 85