Автореферат и диссертация по медицине (14.01.17) на тему:Аутодермопластика глубоких термических ожогов с использованием препарата "Вин-фар", содержащего фактор роста фибробластов (экспериментальное исследование)

На правах рукописи

005053182

НИКИТЕНКО Иван Евгеньевич

Аутодермопластика глубоких термических ожогов с использованием препарата «Винфар», содержащего фактор роста фибробластов (экспериментальное исследование).

14.01.17 Хирургия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

11 ОКТ 2012

Оренбург - 2012

005053182

Диссертация выполнена в Государственном-бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Оренбургская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный руководитель

доктор медицинских наук, профессор Научный консультант доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой хирургии ФППС ГБОУ ВПО ОрГМА Минздравсоцразвития России Третьяков Анатолий Андреевич

доктор медицинских наук, профессор, руководитель ожогового центра ФГБУ института хирургии им. A.B. Вишневского

Минздравсоцразвития России Алексеев Андрей Анатольевич

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Павловичев Сергей Алексеевич Полякова Валентина Сергеевна

Защита диссертации состоится « 'Р. '» /"¿3 2012 г. в « /£> » часов на заседании диссертационного совета Д 208.066.02 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Оренбургская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (Россия. 460000, г. Оренбург, ул. Советская, 6).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО «Оренбургская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России.

Автореферат разослан « ? (г> _2012 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета

доктор медицинских наук, профессор ^^^ Р.И. Сайфутдинов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы

Одним из наиболее распространенных и имеющих явную тенденцию к нарастанию видов повреждений остаются термические ожоги. Реальное влияние на рост числа ожогов у населения оказывают издержки научно-технического прогресса, увеличение количества потенциальных источников термических поражений (C.B. Попов, 2000). Ежегодно в Российской Федерации регистрируется более 400000 пострадавших с термическими поражениями различной тяжести, их частота доходит до 300-350 случаев на 100000 населения (Митряшов К.В. и др. 2011).

Хирургическое лечение больных с глубокими ожогами представляет собой серьезную медико-социальную проблему, значение которой с каждым годом неуклонно возрастает. Непосредственные и отдаленные результаты их лечения существенной положительной динамики за последние десятилетия не претерпели. При выполнении аутодермопластики расщепленными кожными лоскутами очень часто наблюдается лизис пересаженных трансплантатов. По данным Рудовского В. с сотр. (1980) приживление трансплантатов происходит менее, чем в 50 % случаев. А Усов В.В. с сотр. (2011) установили, что полное приживление пересаженных трансплантатов достигается лишь у 65,7% больных. Использование новых технологий закрытия ожоговых ран посредством применения культивированных клеток (кератиноциты и фибробласты) хотя и способствует заживлению, однако приводит к излишнему рубцеванию ран, что ведет к неудовлетворительным эстетическим и функциональным результатам (Shevchenko V.R. et al., 2010). Одной из задач современной хирургии, и, в частности, комбустиологии, является дальнейшее изучение репаративной регенерации кожного покрова и поиск препаратов способных её стимулировать.

Перспективным направлением оказалось исследование группы белков, которые получили-'общее название «факторы роста». Это полипептиды с молекулярной массой 5-50 кДа, объединенные в группу трофических

. регуляторных субстанций. Подобно гормонам, эти факторы обладают широким спектром биологического действия - стимулируют или ингибируют митогенез, хемотаксис, дифференцировку определённого типа клеток (Y.-H. Ching et al. 2011). Одним из наиболее изученных ростовых факторов является семейство факторов роста фибробластов (ФРФ), которые активно участвуют в эмбриональном развитии, процессах ангиогенеза и в заживлении ран (Ornitz D.M. et al., 2001).

В результате многолетних исследований феномена транслокации бактерий из желудочно-кишечного тракта проф. В.И. Никитенко (2011) впервые обнаружен природный штамм бактерий Bacillus subtilis 804, продуцирующий бактериальный фактор роста фибробластов. Наличие нового фактора роста фибробластов в метаболитах штамма подтверждено исследованиями и актом Научно-производственного центра медицинской биотехнологии (г. Москва) в 1989 году. Оказалось, что обнаруженный фактор роста фибробластов - это комплекс термостабильных (до 128 °С) четырех белков, молекулярной массой от 11 до 14 kD. В биотехнологическом эксперименте с культурой фибробластов этот фактор роста, по сравнению с контролем, на 30 — 45% увеличивает число вырастающих клеток. Вышеописанные обстоятельства побудили нас изучить влияние ранее неизвестного и впервые полученного в г. Оренбурге фактора роста фибробластов на заживление ожоговых ран. Был создан препарат с метаболитами штамма бактерий Bacillus subtilis 804, который получил название «Винфар» (свидетельство на товарный знак №433087 от 23 марта 2011 г.). Технология его получения проста, легко воспроизводима, не требует больших материальных вложений, что может быть чрезвычайно существенным при последующем внедрении препарата «Винфар» в широкую клиническую практику лечения тяжелообожженных.

Цель и задачи исследования

Цель работы — улучшение качества лечения глубоких термических ожогов путем экспериментальной разработки новой технологии

аутодермопластики при лечении ожоговых ран с использованием

лекарственного препарата «Винфар», содержащего " новый фактор роста фибробластов.

Для достижения этой цели поставлены следующие задачи:

1. Выполнить клиническое и патоморфологическое исследования приживления свободных кожных лоскутов при пластике гранулирующих ран у животных с глубокими термическими ожогами при местном использовании препарата «Винфар», содержащего новый фактор роста фибробластов.

2. Провести клинические и гистоморфологические наблюдения за приживлением свободных кожных трансплантатов на глубокие ожоговые раны после выполнения первичной тангенциальной некрэктомии при местном применении препарата «Винфар».

3. Изучить динамику заживления «донорских» ран у экспериментальных животных после забора кожи для аутодермопластики с местным применением препарата «Винфар».

Научная новизна

Впервые экспериментально на основе клинических данных, светооптического анализа гистологического материала и иммуногистохимических исследований доказана возможность применения препарата «Винфар», содержащего фактор роста фибробластов, для лечения ожоговых и донорских ран.

Установлено, что местное использование препарата «Винфар» во время аутодермопластики за счет сокращения сроков фиксации и улучшения его питания приводит к скорому и полному приживлению кожных трансплантатов на гранулирующие ожоговые раны. Данная методика при ограниченных глубоких ожогах предохраняет кожные лоскуты от некроза после первичной тангенциальной некрэктомии и способствует их приживлению (патент РФ № 2431203, 10.10.2011).

Однократное нанесение на раны препарата «Винфар» нормализует течение раневого процесса, способствует синтезу зрелого коллагена и снижает активность склеротического процесса. В результате этого не происходит

5

формирование грубых рубцов. Доказано, что применение препарата «Винфар», содержащего новый фактор роста фибробластов, приводит к сокращению времени заживления «донорских» ран.

Научно-практнческая значимость работы.

Полученные новые результаты исследований являются необходимым этапом разработки оригинального лекарственного препарата, содержащего бактериальный фактор роста фибробластов. Внедрение в клиническую практику этого средства в перспективе позволит улучшить результаты лечения тяжелообожженных.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Разработанная новая технология выполнения аутодермопластики с местным применением препарата «Винфар», содержащим фактор роста фибробластов, позволяет существенно улучшить приживление свободных кожных трансплантатов на ожоговые раны.

2. Использование препарата «Винфар» в эксперименте улучшает качество лечения глубоких ожогов и «донорских» ран за счет оптимизации фаз раневого процесса, при этом обеспечивая формирование органотипического регенерата.

Апробация работы и публикации

Основные результаты исследований представлены на заседании проблемной комиссии по хирургии ГБОУ ВПО «Оренбургская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития Российской Федерации, клинических конференциях травматологов-ортопедов ММУЗ ГКБ №4 (г. Оренбург, 2010, 2011), ежегодных региональных конференциях молодых ученых и специалистов (г. Оренбург, 2010, 2011), десятой международной научно-практической конференции «Исследование, разработка и применение высоких технологий в промышленности» (г. Санкт-Петербург, 2010), EPS Global 1-st International Complementary and Alternative Medicine Conference (r. Нанкин, Китай, 2010), национальном конгрессе «Пластическая хирургия» (г. Москва, 2011).

Fio материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, 5 из которых - в ведущих российских рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК. Получен патент Российской Федерации на изобретение № 2431203 от 10.11.2011г.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 128 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, глав с изложением результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и указателя литературы, включающего 245 источников, в том числе 37 работ отечественных и 208 работ зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 62 рисунками и 6 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы

Для выполнения экспериментов использовался лекарственный препарат «Винфар», изготовленный на предприятии «Бакорен». «Винфар» - это стерильная прозрачная жидкость, содержащая 5% метаболитов с новым фактором роста фибробластов и воду. Содержание белка в нем - менее 0,1%, а количество фактора роста - не менее 10 нанограмм в мл. РН препарата - 7,1 + 0,2.

Совместными исследованиями с лабораторией механизмов гибели опухолевых клеток (зав. лабораторией - д.м.н. А.А.Штиль) НИИ канцерогенеза ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН (г. Москва) было изучено влияние препарата «Винфар» на миграцию фибробластов.

Клетки (фибробласты) рассеивались в лунки 24-луночного планшета и оставлялись на сутки для распластывания и образования монослоя. Затем пипеткой наносили повреждение монослоя (раневая полоса). После этого вносилось 12 и 25 мкл препарата «Винфар» на 1 мл среды, контроль оставлялся без препарата. Далее ежедневно морфологически контролировалось состояние культуры. Опыт проводился трижды.

На следующем этапе исследования экспериментальным путем изучено местное воздействие препарата «Винфар» на течение и исходы лечения термических ожогов. Эксперименты на животных выполнялись в ГБОУ ВПО «Оренбургская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития Российской Федерации в соответствии с требованиями «Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей» (Страсбург, 1985). Исследования выполнены на 102 лабораторных белых крысах-самцах линии «Wistar» массой 185 - 215 г (табл. 1). Все животные были получены из питомников лабораторных животных «Столбовая» и «Рапполово».

Шестидесяти двум крысам наносились глубокие контактные ожоги в области спины. Модель ожоговой раны получали по методике В.В. Болтовской (2004). В межлопаточной области у крыс под тиопенталовым наркозом тщательно выбривалась кожа. Для наркоза 1% раствор тиопентала натрия вводился крысам внутрибрюшинно в дозе 40 мг на 1 кг массы животного. Операционное поле обрабатывалось 70 %-м этиловым спиртом. Тонкостенную стеклянную колбу с диаметром дна 1,2 см, наполненную водой с температурой 100 °С, прикладывали к выбритому участку кожи на 35 секунд. После формирования некротического струпа на 6 - 8 сутки выполнялась некрэктомия, а когда происходило созревание грануляционной ткани, на 12 сутки под тиопенталовым наркозом производилась аутодермопластика. При этом донорские места на спине в поясничной области тщательно выбривали, обрабатывали 70 %-м этиловым спиртом, лезвием выкраивали свободные кожные лоскуты.

У животных первой группы (35 крыс) трансплантация кожи выполнялась с использованием препарата «Винфар», который наносился на ожоговую гранулирующую рану в дозе 0,05 мл перед укладкой свободных кожных лоскутов (опыт 1). «Донорские» раны так же орошались препаратом «Винфар» в той же дозировке.

Второй группе крыс (27 -животных) вместо препарата «Винфар» на ожоговые гранулирующие раны перед укладкой свободных кожных лоскутов капали 0,05 мл 0,9% стерильного раствора натрия хлорида (контроль 1). «Донорские» раны в этой группе животных также орошались 0,05 мл 0,9 % раствором натрия хлорида.

Ежедневно у животных этих двух групп с экспериментальными ожогами оценивалось клиническое состояние ожоговых и «донорских» ран, степень приживления трансплантата, а также регистрировались потребление корма и воды, особенности поведения, масса тела животных. Затем на седьмые, десятые и двадцать первые сутки по 5 животных из каждой группы были выведены с помощью летальной дозы 1 % раствора тиопентала натрия (100 мг на 1 кг массы животного). За остальными животными обеих групп наблюдение продолжалось до 30 суток, затем они были выведены из опыта. Ткань области ожоговых и «донорских» ран забиралась для морфологических и иммуногистохимических исследований.

На следующем этапе экспериментального исследования сорока крысам по описанной выше методике под тиопенталовым наркозом наносились глубокие контактные ожоги в области спины. При этом диаметр дна пробирки равнялся 1,5 см. Через 10 мин. после получения ожога скальпелем выполнялась первичная тангенциальная некрэктомия до мелкоточечного кровотечения. Забор кожных трансплантатов выполнялся лезвием на предварительно выбритой поясничной области спины. Перед укладкой кожных лоскутов на ожоговые раны, они были рассечены и уложены марочным способом.

У двадцати животных перед укладкой свободных кожных лоскутов раны орошались препаратом «Винфар» в дозе 0,05 мл (опыт 2). На «донорские» раны у этих животных также наносили «Винфар» в той же дозе. У других двадцати крыс перед укладкой кожных лоскутов ожоговые и «донорские» раны орошались 0,05 мл стерильного 0,9 % раствора натрия хлорида каждая (контроль 2).

Таблица 1.

Данные о характере экспериментов н количестве животных.

Наименование серии опытов

Количество животных

Сроки выведения и? опыта

Аутодермопластика ожоговой раны после формирования некротического струпа и его удаления с применением 0,05 мл препарата «Винфар» (опыт 1)._

35

На 7 сутки после аутодермопластики -5 крыс, на 11 сутки - 5 крыс, на 21 сутки - 5 крыс, на 30 сутки - 20 крыс.

Аутодермопластика ожоговой раны после формирования струпа и его удаления с применением физиологического раствора натрия хлорида 0,9 % дозой 0,05 мл (контроль 1).

27

На 7 сутки после аутодермопластики -5 крыс, на 11 сутки - 5 крыс, на 21 сутки - 5 крыс, на 30 сутки - 12 крыс.

Аутодермоплстика ожоговой раны после тангенциальной некрэктомии с применением 0,05 мл препарата «Винфар»(огтыт 2).

20

На 7 сутки после аутодермопластики -5 крыс, на 11 сутки - 5 крыс, на 21 сутки — 5 крыс, на 30 сутки — 5 крыс

Аутодермопластика после тангенциальной некрэктомии с применением физиологического раствора натрия хлорида 0,9 % дозой 0,05 мл (контроль 2).

20

На 7 сутки после аутодермопластики -5 крыс, на 11 сутки - 5 крыс, на 21 сутки - 5 крыс, на 30 сутки - 5 крыс.

Всего животных

102

Ежедневно у этик животных проводилась оценка клинического состояния ожоговых и «донорских» ран, степень приживления трансплантата, а также регистрировались потребление корма и воды, особенности поведения, масса тела животных. Затем на седьмые, десятые и двадцать первые сутки по 5 животных из каждой группы были выведены с помощью летальной дозы 1 % раствора тиопентала натрия (100 мг на 1 кг массы животного). За остальными животными обеих групп наблюдение продолжалось до 30 суток, затем они были выведены из опыта. Выполнялся забор тканей области ожоговых и «донорских» ран для гистологических и иммуногистохимических исследований.

Для гистологического и гистохимического исследования проводился под тиопенталовым наркозом (100 мг/кг) после декапитации забор материала от экспериментальных животных. Для световой микроскопии участки кожи области ожоговой раны с трансплантатом и «донорского» дефекта помещали в 10% нейтральный формалин и фиксировали при комнатной температуре в течение суток, после обезвоживания в спиртах с возрастающей концентрацией заливали в парафин. Приготовление серийных срезов толщиной 5-6 мкм осуществляли на ротационном микротоме МПС-2. Парафиновые срезы подвергали окраске гематоксилином Майера и эозином. Для выявления

ю

коллагеновых эластических волокон использовали окраску по Маллори, Ван-Гизон (Пирс Э., 1962; Меркулов Г.А., 1969). Часть материала фиксировали сразу в абсолютном спирте. Гистологические срезы из материала, зафиксированного в абсолютном спирте, окрашивали 0,1% раствором тодуидинового синего для выявления тучных клеток (Саркисов Д.С., Перова М.П., 1991). В окрашенных гистологических срезах с помощью окулярной сетки определена относительная объемная плотность сосудов, количество тучных клеток и фибробластов на условной единице площади формирующейся соединительной ткани.

На парафиновых срезах, помещенных на стекла Super frost plus, выявляли пролиферативную активность клеток эпидермиса и дермы с использованием набора реактивов для иммуногистохимии (фирма «BioGenex», США) и моноклональных антител Ki-67. Производили подсчет клеток экспрессирующих Ki-67 и выражали в %о. На стеклах препаратов от каждого экспериментального животного производили подсчет не менее 5 тыс. клеток эпидермиса. Кроме того, иммуногистохимически идентифицировали коллаген 1 и 3 типов с помощью набора моноклональных антител (anti-Collagen 1, antiCollagen 3) с использованием той же системы визуализации (фирма «BioGenex», США). Исследования проводили согласно протокола фирмы производителя.

В ходе проведенного морфологического исследования было проанализировано 1278 стекол.

Статистическая обработка производилась на персональном компьютере с помощью лицензированного пакета прикладных программ «Biostat». При обработке полученных результатов использовались методы описательной статистики и сравнения средних. Достоверность результатов оценивалась с помощью критерия Стьюдента и X2. При этом достоверными считались различия, где уровень значимости (р) был меньше 0,05 (Платонов А.Е., 2000).

и

Результаты исследования и их-обсуждение

Исследования in vitro по изучению действия препарата «Винфар» на клеточную миграцию фибробластов показали, что препарат «Винфар» в дозе 12 мкл привел к стопроцентному заживлению раневой полосы на третьи сутки, при дозе 25 мкл - 90,1 ±1,2 %. В контроле заживление раневой полосы составило 50,2 ± 0,9 %. (р< 0,05). Препарат «Винфар» значительно стимулирует миграцию фибробластов. Это согласуется с исследованиями Sasaki Т. (1992), который установил, что рекомбинантные факторы роста усиливают миграционную активность этих клеток.

На следующем этапе были выполнены клинические наблюдения за заживлением ожогов у крыс после аутодермопластики. После нанесения животным термических ожогов у них на коже сначала появлялась гиперемия, затем образовывались эпидермальные пузыри. Через двадцать четыре часа все крысы стали вялыми, адинамичными. Животные плохо питались. Потребление корма и воды было низким. Наметилась тенденция к снижению массы тела у всех животных. Вес животных в опытной группе составила 195,29+1,63 г, а в контрольной 193,15 ±1,79 г (табл. 4, р>0,05). Пальпация области ожоговой раны вызывала резкую негативную реакцию, что, очевидно было связано со значительным болевым раздражением. Ожоговые раны в опытной группе были размером 1,27 ± 0,04 см2, а в контроле 1,28 ± 0,05 см2 (р> 0,5). Раны были покрыты некротическим струпом коричневого цвета у всех животных.

Через девяносто шесть часов после нанесения ожоговых ран состояние крыс несколько улучшилось. Они стали активнее вести себя, потребление корма и воды увеличилось. Вокруг ран сохранялись гиперемия и отек. Твердый некротический струп коричневого цвета был плотно спаян с окружающими тканями. Отделяемое из ран отсутствовало.

С пятых суток состояние животных вновь ухудшилось. Животные стали вялыми. Реакция на внешние раздражители была не выражена. Потребление корма и воды снизилось. Гиперемия и отек увеличились, развился нагноительный процесс. Некротический струп серо-коричневого цвета начал

12

отторгаться от тканей раны по краям. Из под струпа выделялся серозно-гнойный экссудат. Масса животных обеих групп продолжала снижаться по сравнению с весом животных до травмы (р<0,05), и в опытной группе составила 189,68 ±1,48 г, а в контрольной 187,19 ±1,70 г (табл. 4).

После полного отграничения некротического струпа от жизнеспособных тканей, которое у разных животных происходило на б - 8 сутки, нами выполнялась вторичная хирургическая некрэктомия. Под некротическим струпом имелась грануляционная ткань красного цвета с гнойным отделяемым. Выявлялась слабая краевая эпителизация.

На двенадцатые сутки после ожога была выполнена аутодермопластика гранулирующих ран с применением и без применения препарата «Винфар». Масса животных на момент кожной пластики в опытной группе равнялась 190,02 ±1,57 г, а в контрольной - 187,03 ±1,75 г (табл. 4, р>0,05). Размеры ожоговых ран у животных опытной группы составили: 0,82 +0,04 см2, а контрольной: 0,81+0,05 см2 (р>0,5, табл. 2).

При проведении пластического закрытия гранулирующих ожоговых ран свободными кожными лоскутами нами было отмечено, что пересаживаемый трансплантат быстрее приклеивался к гранулирующей ожоговой ране в группе животных, у которых применялся исследуемый препарат «Винфар». Время адгезии кожного трансплантата в опытной группе составило 2,60 + 0,39 мин., тогда, как в контрольной группе без применения препарата «Винфар» кожные лоскуты фиксировались на ране дольше, в среднем за 12,82 + 0,77 (табл. 2, р< 0,001) мин. В доступной нам литературе мы не нашли сведений о лекарственных препаратах, позволяющих уменьшать сроки адгезии кожного трансплантата к грануляционной ткани. Между тем, это очень важно для осуществления успешного лечения глубоких ожогов. Быстрое «приклеивание» обеспечивает более раннее питание трансплантата и способствует полному приживлению пересаженной кожи.

Таблица-2.

Размеры ожоговых ран, кожных лоскутов и время адгезии трансплантатов в опытной и _контрольной группах (после выполнения вторичной некрэкгомии)._

Опыт 1 Контроль 1 Р

Размер ожоговых ран перед аутодермопластикой (см") 0,82 + 0,04 см2 (и =35) 0,81+0,05 CMj (п=27) р >0,5

Размер донорских ран (см2) 0,84 +0,03 CMJ(n=35) 0,83 + 0,03 см" (п=27) р> 0,5

Время адгезии кожного лоскута (мин.) 2,60+ 0,08 (п=35) 12,82+ 0,19 (п=27) р< 0,01

Через сорок восемь часов после трансплантации кожи у всех животных опытной группы трансплантаты были розового цвета, отделяемого из ран не отмечено. Отек и гиперемия вокруг ожоговой раны значительно уменьшились, но при пальпации области раны по-прежнему возникала негативная реакция. Лоскуты были плотно приклеены к ране.

В контрольной группе на вторые сутки после аутодермопластики у трех животных кожные лоскуты приобрели темно-коричневый цвет. Из ран у этих крыс обильно выделялась серозно-гнойная жидкость. Вокруг раны имелись выраженный отек и гиперемия. У остальных двадцати четырех животных контрольной группы кожные лоскуты были бледно-серого цвета.

При дальнейшем проведении эксперимента еще у восьми животных контрольной группы наблюдалась гибель кожных трансплантатов (на третьи, четвертые, тринадцатые, четырнадцатые и пятнадцатые сутки). У остальных 16 животных группы контроля аутотрансплантаты прижились. При наблюдении за животными опытной группы гибели трансплантатов не наблюдалось ни у одного из тридцати пяти животных. Раны у всех животных опытной группы эпителизировались на 10 сутки после проведения аутодермопластики.

При использовании препарата «Винфар» во время аутодермопластики на гранулирующие ожоговые раны клинически установлено, что полное приживление кожных трансплантатов наступило в 100% случаев. У животных, у которых вместо препарата «Винфар» рана орошалась 0,9% стерильным раствором натрия хлорида, кожные трансплантаты приживались существенно хуже. У одиннадцати из двадцати семи животных (40,74 %) произошел некроз кожных трансплантатов (р< 0,005). Гибель кожных лоскутов у этих животных происходила в различные сроки, начиная со вторых суток, и продолжалась до

пятнадцатых суток. Это согласуется с данными Smith P:D. et al. (2000) и Akita S. et al. (2010), которые установили, что рекомбинантные факторы роста фибробластов способствуют приживлению и ускоряют закрытие ячеек в перфорированных кожных лоскутах.

Благодаря ускоренному приживлению трансплантатов при применении препарата «Винфар», клинические проявления ожоговой интоксикации быстро купировались, животные раньше активизировались. Прибавка массы после аутодермопластики у животных опытной группы отмечена уже на третьи сутки после операции, тогда, как животные контрольной группы начинали прибавлять вес только с десятых суток после операции (табл. 4).

Наши клинические наблюдения в полной мере были подтверждены гистологическими исследованиями. Уже на седьмые сутки после трансплантации кожи у животных опытной группы наблюдалось полноценное приживление трансплантата к подлежащему раневому ложу, из которого произошла его адекватная реваскуляризация. Была восстановлена функциональная активность трансплантируемого участка кожи. Воспалительный процесс на границе трансплантата и раневой поверхности почти отсутствовал, оставался только слабо выраженный полиморфно-клеточный инфильтрат. Пересаженный участок кожи на всём протяжении был хорошо прикреплён к подлежащему ложу.

В группе животных без применения исследуемого препарата на седьмые сутки после аутодермопластики в трансплантате наблюдались выраженные дистрофические изменения эпидермиса, клеток фибробластического дифферона и межуточного вещества дермы. В эпителии отмечена гидропическая дистрофия, в дерме - отёк и выраженная лейкоцитарная инфильтрация. Трансплантат с подлежащим ложем был связан рыхлой прослойкой отёчной грануляционной ткани.

Уже на одиннадцатые сутки после трансплантации кожи в группе животных, у которой применялся препарат «Винфар», оказалось, что гистологически строение трансплантата напоминало строение интактной кожи

краёв раны. Эпидермис был многослойный, полноценный, приобретал толщину, близкую к нормальной с разделением на все функциональные слои и с признаками поверхностной кератинизации. Волокнистый матрикс преобладал над аморфным, волокна были расположены с заметным выравниванием параллельно фибробластам и базальной мембране эпидермиса. В связи с завершением формирования эпителиального пласта, дифференцировавшегося на все функциональные слои, показатель митотической активности краевых участков трансплантата был снижен по сравнению с контролем в 1,4 раза (р< 0,05), и оставался одинаковым по всей площади пересаженного участка кожи.

В группе животных без применения препарата «Винфар» на одиннадцатые сутки после пересадки кожи выявлено, что в толще трансплантата сохранялась слабо выраженная, но диффузная лимфо-гистиоцитарная инфильтрация с примесью эозинофилов. В краевых участках трансплантата митотическая активность клеток базального и шиповатого слоев возрастала до 45,8±0,5 %о по сравнению с участками, удаленными от этой зоны (18,3±0,4%о, р< 0,05). В почти редуцированной грануляционной ткани под трансплантатом, иногда встречались очаги расширенных полнокровных сосудов, питающих пересаженный участок кожи с многочисленными сидерофагами, что свидетельствовало о замедленной редукции сосудов грануляционной ткани ложа трансплантата с длительным эритродиапедезом и экстракапиллярным лизисом эритроцитов. Среди многочисленных фибробластов появлялись лишь единичные фиброциты.

Таким образом, установлено, что однократное орошение ожоговой гранулирующей раны препаратом «Винфар», содержащим фактор роста фибробластов, во время операции уже на седьмые сутки после аутодермопластики значительно снижает уровень воспалительной реакции в ране. При этом отмечены стимуляция пролиферации эпителиальных клеток, усиление ангиогенеза и реваскуляризации трансплантата. Это в полной мере подтверждается данными других исследований. М^игакч Н. е1 а1. (2012) при применении рекомбинантных факторов роста фибробластов отметили

16

снижение уровня воспаления- в ранах. Ряд авторов установили, что эти факторы роста усиливают пролиферацию эндотелиальных клеток, а также повышают уровень ангиогенеза в ранах (Huang S. et al., 2006; Komori M. et al., 2005; Su S.С. et al., 2008). Это подтверждает высокую биологическую активность оригинального препарата «Винфар», содержащего новый фактор роста фибробластов.

При гистологическом исследовании области ожоговых ран у животных контрольной группы без применения препарата «Винфар» на двадцать первые сутки имелся выраженный склеротический процесс, как в трансплантате, так и в окружающих его тканях. В результате этого у животных контрольной группы, несмотря на успешное приживление аутодермотрансплантата, не была достигнута органотипичность пересаженного участка кожи. Из-за асинхронного течения стадий репарации в окружающих трансплантат тканях процесс восстановления шел по типу субституции с формированием грубой рубцовой ткани. Это подтверждает мнение ряда исследований, что факторы роста фибробластов являются антагонистами фиброза и вызывают свободное от рубцов заживление раневых дефектов (Dang С.M. et al., 2003; Kong W. et al., 2008; Abe M. et al., 2012).

С помощью иммуногистохимических исследований установлено, что препарат «Винфар», содержащий фактор роста фибробластов, к одиннадцатым суткам стимулирует выраженный синтез зрелого коллагена I типа (рис. 1). В это время в группе контроля 1 оставался выраженным фибриллогенез тонких волокон незрелого коллагена III типа, которые были беспорядочно расположены в толще фибриллярного матрикса (рис. 2). Наши наблюдения в полной мере совпадают сданными других авторов (Dantas Filho A.M. et al., 2007; Bakhshayesh M. et al., 2012), которые установили стимулирующее влияние рекомбинантных факторов роста фибробластов на синтез зрелого коллагена I типа. Следовательно, исследуемый препарат «Винфар» по своей биологической активности сходен с известными рекомбинантными факторами роста фибробластов.

.........» » "" ,« :

Рис. 1. Окружающая аутодермотрансплантат грануляционная ткань. Опытная группа. 11 сутки после пересадки на гранулирующую раневую поверхность. Иммуногистохимическая реакция на выявление коллагена I типа.

Рис. 2. Окружающая аутодермотрансплантат грануляционная ткань. Контрольная группа. 11 сутки после пересадки на гранулирующую раневую поверхность. Иммуногистохимическая реакция на выявление коллагена Ш типа.

Следующим этапом работы было изучение влияния препарата «Винфар» на приживление кожных трансплантатов к ожоговым ранам после первичной тангенциальной некрэктомии. Сорока крысам были нанесены термические ожоги. Площадь ожоговых ран в опытной группе составила 2,09 ± 0,08 см2, а в контроле 2,22 ± 0,06 см2 (табл. 3, р> 0,05). Масса животных в опытной группе равнялась 196,74 ± 1,31 г, а в контроле 196,82 ±1,43 г (табл. 5, р> 0,5). Тотчас после выполнения тангенциальной некрэктомии производилась аутодермопластика. У двадцати животных ожоговые раны перед укладкой трансплантатов орошались препаратом «Винфар» в дозе 0,05 мл (опыт 2). «Донорские» раны в этой группе так же обрабатывались исследуемым препаратом в той же дозировке. У двадцати животных перед укладкой кожных

лоскутов ожоговые раны орошались стерильным 0,9 % раствором натрия

18

хлорида в дозе 0,05 мл (контроль 2). «Донорские» раны в* этой группе обрабатывались стерильным 0,9 % раствором натрия хлорида. Время адгезии лоскутов составило в опыте 2,60+ 0,11 мин, а в контроле - 13,43 + 0,17 мин (табл. 3, р< 0,001).

Таблица 3.

Размер ожоговых, «донорских» ран и время адгезии трансплантатов в опытной и контрольной группах (при выполнении аутодермопластики _после первичной некрэктомни).__

Опыт 2 Контроль 2 Р

Размер ожоговых ран (см2) 2,09 + 0,08 (п=20) 2,22 + 0,06 (п=20) р> 0,05

Размер «донорских» ран (см") 2,12 ±0,06 (п=20) 2,24 +0,07 (п=20) р> 0,05

Время адгезии трансплантатов (мин.) 2,60+0,11 (п=20) 13,43+0,17 (п=20) р< 0,001

В последующие дни проведения эксперимента у восьми животных опытной группы произошел некроз трансплантатов (40%): у двух крыс - на десятые сутки, у одного животного - на пятнадцатые сутки, у трех - на шестнадцатые, семнадцатые и восемнадцатые сутки. Еще у двух животных гибель кожных лоскутов наступила к двадцатым суткам после выполнения аутодермопластики. У остальных двенадцати крыс кожные трансплантаты прижились.

В контрольной группе на вторые сутки после аутодермопластики у одного животного произошла гибель трансплантата. Животное было резко заторможено. Из раны имелось обильное серозно-гнойное отделяемое. Вокруг раны имелся выраженный отек и гиперемия. При последующем наблюдении животных контрольной группы гибель кожных лоскутов наступила у двух животных на третьи сутки, у шести животных на четвертые сутки, у пяти животных на пятые сутки, у трех животных на шестые сутки, у двух животных на седьмые сутки и у одного животного на десятые сутки эксперимента.

Таким образом, гибель кожных трансплантатов у животных контрольной группы наступила у всех двадцати крыс, или в 100 % случаев. В опытной группе, в которой применялся препарат «Винфар», некроз трансплантатов наступил только у восьми из двадцати животных (40 %, р< 0,005).

" На 7-30 сутки опыта" масса тела животных в опытной группе стала большей, чем у крыс контрольной группы (табл. 5, р < 0,05), что свидетельствовало об уменьшении ожоговой интоксикации и благоприятном течении раневого процесса при использовании лекарственного препарата «Винфар».

При гистологическом исследовании трансплантатов в контрольной группе установлено, что на седьмые сутки после операции в пересаженном кожном лоскуте наблюдалась выраженная диффузная лейкоцитарная инфильтрация на фоне отёка и паранекротических изменений всех тканевых элементов. Сосуды пересаженного участка кожи были или запустевшие, или с лизирующимися эритроцитами. Под трансплантатом шел процесс формирования грануляционной ткани. Между грануляциями и аутодермотрансплантатом определялась прослойка фибринозно-лейкоцитарного экссудата, что подтверждало отсутствие адекватной фиксации и приживления пересаженного фрагмента кожи к подлежащему ложу.

При исследовании трансплантатов у животных с использованием препарата «Винфар», в сравнении с контролем, отмечалось более длительное нахождение ткани трансплантата в состоянии дистрофии (паранекроза). По-видимому, более длительный паранекротический процесс и отсроченный, по сравнению с контролем, некроз в опытной группе, связан с частичной реваскуляризацией трансплантата, что позволило пересаженному фрагменту кожи дольше находиться в переживающем состоянии. Однако, поздняя и частичная реваскуляризация приводила к неадекватной фиксации кожного лоскута и, как следствие, гибели трансплантата, хоть и позже чем в группе контроля. Тем не менее, у 60% опытных животных аутодермотрансплантат прижился к раневой поверхности, при этом морфологическая картина течения репаративного процесса была аналогична контрольной группе, где выполнялось закрытие гранулирующих ожоговых ран.

Таблица 4.

Динамика массы тела крыс в различные сроки проведения эксперимента (дермопластика гранулирующих ожоговых ран) в . _опытной и контрольной группах (в г).____

Сутки болезни Опыт 1 Изменение массы тела в опыте Контроль 1 Изменение массы тела контроль Р

До ожога 198,44+1,72 (п=35) 196,42+1,86 (п=18) р>0,05

1-е сутки после ожога 195,29+1,63 (п=35) -3,50 ±0,27 193,15 +1,79(п=27) -3,32 ±0,27 р> 0,05

3-й сутки после ожога 191,20+1,60 (п=35) -3,82 +0,22 189,42+1,79(п=27) -3,69+0,23 Р >0,5 :

5-е сутки после ожога 189,68+ 1,48 (п=35) -1,71 ±0,18 187,19 ±1,70 (п=27) -2,23 ±0,26 р >0,05

7-е сутки после ожога 189,11 +1,49 (п=35) -0,53 ±0,27 186,53 ±1,69 (п=27) -0,65 ±0,21 р>0,05

12-е сутки после ожога. 190,02 +1,57 (п=35) 0,91±0,29 187,03 ±1,75 (п=27) 0,54 ±0,29 р >0,05

1-е сутки после аутодермопластики 188,50+1,56 (11=35) -1,53 ±0,14 183,92 ±1,69 (п=27) -3,08 ±0,29 р>0,05

3-й сутки после аутодермопластики 187,85 ±1,57 (п=35) -0,62 ±0,21 180,88 ±1,60 (п=27) -3,04 ±0,27 р<0,005

5-е сутки после аутодермопластики 189,26+1,60 (п=35) 1,41 ±0,15 179,85 ±1,55 (п=27) -0,96+0,37 р<0,0005

7-е сутки после аутодермопластики 190,53+1,59 (п=35) 1,18 ±0,20 179,53 ±1,42 (п=27) -0,40 ±0,29 р<0,0005

10-е сутки после аутодермопластики 193,10+1,54 (п=30)* 1,21 ±0,23 180,33 ±1,55 (п=22)* 0,35±0,39 р<0,0005

15-е сутки после аутодермопластики 193,37+1,72 (п=25)» 2,35 +0,32 183,94+1,61 (п=17)* 0,87 +0,66 р<0,0005

20-е сутки после аутодермопластики 196,41 +1,81 (п=25) 3,13 ±0,31 184,81 +1,58 (п=17) 0,8+0,70 р<0,0005

25-е сутки после аутодермопластики 198,32+2,26 (п=20)* 2,53 ±0,23 188,18+1,81 (п=12)* 2,0 ±0,56 р<0,005

30-е сутки после аутодермопластики 200,31 ±2,30 (п=20) 2,06 ±0,32 190,18 ±2,11 (п=12) 2,10+0,60 р<0,005 ;

'- часть животных выведена из опыта для гистологического исследования.

Таблица 5.

Динамика массы тела крыс в различные сроки проведения эксперимента (дермопластика ожоговых ран после первичной

Дни после ожога Опыт 2 Изменение массы опыт 2 Контроль 2 Изменение массы контроль 2 Р

До ожога 196,73 ± 1,31 (п=20) 196,84 ±1,41 (п=20) р >0,5

Первые сутки после ожога 192,74+ 1,21 (п=20) -4,00 ± 0,30 192,84 ± 1,42 (п=20) -4,00 ± 0,36 р >0,5

Третьи сутки после ожога 189,31 ±1,05 (п=20) -3,42 ± 0,23 186,95 ±1,43 (п=20) -6,05 ± 0,40 р >0,05

Пятые сутки после ожога 188,64+ 1,09 (п=20) -1,63 ±0,34 183,07+ 1,88 (п=20) -4,05 + 0,38 р <0,05

Седьмые сутки после ожога 189,35+ 1,06 (п=20) 0,42 ± 0,29 180,64 ± 1,87 (п=20) -2,68 ±0,15 р <0,005 ,

Десятые сутки после ожога 190,21 + 1,48 (п=15)* 1,21 ±0,45 179,07 ±2,31 (п=15)' -1,50 ±0,37 р <0,005

Пятнадцатые сутки после ожога 193,13 + 1,84 (п=10)* 2,50 + 0,78 177,89 +2,72 (п=10)* -0,67 ± 0,50 р <0,005

Двадцатые сутки после ожога 195,1 1 + 1,80(п=10) 2,44 ± 0,44 179,66 ± 2,45 (п=10) 1,78 ± 0,28 р <0,005

Тридцатые сутки после ожога 200,50 ±1,32 (п=5)* 5,25 ±0,85 182,50 ± 2,22 (п=5)* 5,25 ± 1,32 р <0,005

* - часть животных выведена из опыта для гистологического исследования.

Таким образом, установлено, что оригинальный препарат «Винфар». предохраняет трансплантаты от некроза. Это согласуется с данными Bandera B.C. et al. (2010) о способности рекомбинантных факторов роста фибробластов повышать выживаемость кожных лоскутов при пластике.

При клиническом наблюдении за заживлением донорских ран установлено, что орошение этих ран препаратом «Винфар» благоприятно сказывается на их заживлении (табл. 6). При применении исследуемого препарата обращала на себя внимание более быстрая остановка капиллярного кровотечения по сравнению с контролем. У животных после аутодермопластики гранулирующих ран с применением препарата «Винфар» «донорские» раны полностью эпителизировались за 10,60 + 0,63 сут., а при аутодермопластике после первичной некрэктомии - за 13,50 +0,53 сут. Гнойных осложнений не отмечено ни у одного животного. При подобных повреждениях у животных контрольной группы 1 «донорские» раны эпителизировались в среднем за 15,81 + 1,80 сут., (у одного животного имелось нагноение), а в контрольной группе 2 - за 18,38 + 0,52 суток (у одного животного также отмечено нагноение).

При гистологическом изучении «донорских» ран без применения препарата «Винфар» на седьмые сутки после трансплантации в краях и дне донорских скальпированных ран кожи наблюдались умеренный отёк и лимфо-лейкоцитарная инфильтрация с преобладанием эозинофилов. Был выражен процесс новообразования сосудов грануляционной ткани. Наблюдалась интенсивная пролиферация фибробластов и фибриллогенез.

В опытной группе на седьмые сутки после забора кожного трансплантата, в отличии от контроля, отёк и лейкоцитарная инфильтрация в «донорской» ране отсутствовали. Тонкий слой эпителия закрывал большую часть раневого дефекта, наползая с краёв на зрелую грануляционную ткань, в которой уже начинается редукция сосудов. Пролиферация юных фибробластов была слабо выражена, число зрелых фибробластов

приближалось к максимуму, появлялись фиброциты, продолжался процесс увеличения фибриллярного матрикса.

Такая же морфологическая картина репаративного процесса в донорских ранах, как на седьмые сутки после обработки ран препаратом «Винфар», визуализировалась и в условиях контроля, когда «Винфар» не применялся, но только на одиннадцатые сутки эксперимента.

К одиннадцатым суткам после аутодермопластики у опытных животных грануляционная ткань в донорских ранах редуцировалась, частично сохраняясь только в субэпидермальных отделах, что, вероятно, было продиктовано повышенной потребностью ещё молодого и пролиферирующего эпителия в адекватном кровоснабжении. Тонкие коллагеновые волокна исчезали, одновременно образовывались толстые волокна и пучки, направленность которых определялась функциональной нагрузкой на данный участок кожи. Уменьшалось общее число клеток по отношению к фибриллярному матриксу, фиброциты преобладали над фибробластами. Эпидермис приобретал толщину, близкую к нормальной, с признаками поверхностной кератинизации, но ещё без формирования сосочков.

На двадцать первые сутки кожной пластики в опытной группе донорский раневой дефект имел признаки полного заживления и был представлен участком вновь образованной ткани, полностью соответствующей нормальной коже: эпидермис дифференцирован на все функциональные слои с признаками полноценной кератинизации и образованием погружённых в дерму сосочковых инвагинаций. Дерма была дифференцирована на сосочковый и сетчатый слои, сосуды грануляционной ткани полностью редуцированы. Процесс ремоделирования фибриллярного матрикса находился на стадии завершения. При этом тонкие коллагеновые волокна отсутствовали, вновь образованные толстые волокна и их пучки приобретали строго определённую направленность, почти до нормальных

...величин снижалась общая клеточность и был дифференцирован адекватный слой гиподермы.

Таблица 6.

Динамика заживления донорских ран в опытной н контрольной группах (см).

Сутки после забора трансплантатов Опыт 1 размер ран в см2. Контроль 1 размер ран в см2. Р Опыт 2 размер ран в см2. Контроль 2 эазмер ран в Р

Первые сутки после забора 0,79+ 0,020 (п=35) 0,83+0,030 (п=27) р>0,05 2,11 + 0,060 (п=20) 2,26+ 0,070 !п=20) р>0,05

Третьи сутки после забора 0,56+ 0,010 (п=35) 0,76+ 0,020 (п=27) р<0,01 1,64+0,060 (п=20) 2,16+0,060 (п=20) р<0,05

Седьмые сутки после забора 0,13+0,010 (п=35) 0,46 +0,020 (п=27) р<0,01 0,74 + 0,040 (п=20) 1,66 + 0,050 [п=20) р<0,01

Десятые сутки после забора 0,01+0,002 (п=30)* 0,24+ 0,020 (п=22)* р<0,01 0,22+ 0,030 (п=15)> 1,11+ 0,080 (п=15)» р<0,01

Четырнадцатые сутки после забора Все раны эпителизированы (п=25)* 0,03+ 0,008 (п=17)* Все раны эпителизированы (п=10)* 0,25 +0,020 (п=10)*

*- часть животных выведена из опыта для гистологических исследований.

На двадцать первые сутки после нанесения донорских ран без использования препарата «Винфар» морфологическая картина репаративного процесса была схожа с таковой в опытной группе с применением препарата, но на одиннадцатые сутки заживления. В отличие от интактной кожи, эпидермис так же ещё не формировал сосочковых инвагинаций в образующейся дерме, и сохранялась высокая общая клеточность соединительной ткани. Отличия состояли лишь в том, что в контрольной группе на двадцать первые сутки, по сравнению с опытом на одиннадцатые сутки была более выражена редукция сосудов субэпидермального слоя соединительной ткани, несомненно, за счёт большего (на 10 суток) времени заживления.

Таким образом, «донорские» раны после обработки препаратом «Винфар» полностью заживали на пять суток быстрее, по сравнению с животными контрольных групп без использования препарата, что было подтверждено и при гистологическом исследовании. Это согласуется с результатами наблюдений авторов, исследовавших свойства известных препаратов, содержащих рекомбинантные факторы роста фибробластов (Fu, Х.В. etal., 2000; Zhao-Fan, X. etal.,2007).

Результаты экспериментальных наблюдений позволили разработать новую технологию ауто дермопластики глубоких ожогов и лечения донорских ран, основанных на местном применении лекарственного препарата «Винфар», содержащего новый фактор роста фибробластов. Это является важным этапом в создании и регистрации нового лекарственного препарата, который позволит сократить время лечения и улучшить его качество при лечении тяжелой ожоговой травмы. Фактор роста фибробластов в препарате «Винфар» является природным. Высокая активность производственного штамма, в отличие от аналогов, позволяет получать относительно дешевый лекарственный препарат. Важным является наблюдение быстрой остановки капиллярного кровотечения в первой сосудисто-эндотелиальной фазе. Это может явиться предметом дальнейших научных исследований и создания новых гемостатических средств.

Выводы.

1. Разработанная новая технология выполнения аутодермопластики с использованием препарата «Винфар», содержащего фактор роста фибробластов, позволяет существенно улучшить результаты хирургического лечения глубоких ожогов и «донорских» ран.

2. Местное однократное орошение гранулирующей ожоговой раны препаратом «Винфар» при аутодермопластике способствует быстрой адгезии трансплантата, обеспечивает скорое и полное (100 %) приживление кожных лоскутов.

3. Применение препарата «Винфар» во время аутодермопластики после первичной тангенциальной некрэктомии приводит к выраженной реваскуляризации свободных кожных лоскутов и предохраняет их от некроза.

4. В результате местного применения препарата «Винфар» на «донорскую» рану после забора кожных лоскутов для аутодермопластики термических ожогов значительно ускоряется эпителизация «донорского» участка, восстанавливается полноценный кожный покров.

5. При использовании препарата «Винфар».происходит более быстрое

купирование клинических симптомов ожоговой интоксикации, которое проявляется в ранней активизации животных и увеличении их массы.

6. Лекарственный препарат «Винфар» стимулирует реваскуляризацию, клеточную пролиферацию фибробластов и эпителиоцитов кожи и восстанавливает органотипическое строение кожного покрова, при этом происходит усиление синтеза зрелого коллагена I типа и снижается активность склеротических процессов, что приводит к образованию менее выраженных рубцов по сравнению с контролем.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Никитенко И.Е. Применение факторов роста фибробластов для лечения глубоких ожогов. / И.Е. Никитенко // Информационный архив - 2010 - Т. 4, № 3-4 - с. 88 - 90.

2. Никитенко В.И. Феномен транслокации бактерий и его использование в биотехнологии, медицине и ветеринарии. / В.И. Никитенко, В.А. Копылов, И.Е. Никитенко // Высокие технологии и фундаментальные исследования - г. Санкт-Петербург, 2010 - Том 4 - с. 40 - 42.

3. Никитенко В.И. Новые технологии в лечении ожогов и обширных дефектов мягких тканей / В.И. Никитенко, A.M. Гурьянов, С.А. Павловичев, И.Е. Никитенко и др. // Вестник Российской военно-медицинской академии - 2010 -№ 1(29)-с. 84-85.

4. Копылов В.А. Применение фактора роста фибробластов в медицине. / В.А. Копылов, И.Е. Никитенко // Вестник ОГУ - 2010 - № 4 - с. 95.

5. Миханов В.А. Влияние метаболитов культуры Bacillus subtilis 804 на процессы заживления ожоговых ран при проведении аутодермопластики. / В.А. Миханов, B.C. Полякова, В.А. Копылов, И.Е. Никитенко // Морфология - 2011 - Том 140 № 5 - с 100 — 101.

6. Полякова B.C. Экспериментально-гистологическое обоснование применения препарата на основе метаболитов Bacillus subtilis 804 для оптимизации заживления глубоких ран кожи. / B.C. Полякова, В.А. Миханов, В.А. Копылов, И.Е. Никитенко И Морфология-2011-Том 140, №5-с. 107- 108.

7. Никитенко В.И. Факторы роста в травматологии и хирургии. / В.И. Никитенко, С.А. Павловичев, A.A. Сафронов, И.Е. Никитенко // Травматология и ортопедия: материалы международной юбилейной научно-практической конференции травматологов-ортопедов «Достижения и перспективы развития травматологии и ортопедии» посвященной 20-летию Независимости Республики Казахстан - Астана 2011 -с. 357.

8. Копылов В.А. Использование метаболита бактерий Bacillus subtilis 804 при аутодермопластике ожоговых ран. / В.А. Копылов, И.Е. Никитенко, A.M. Гурьянов // Вестник ОГУ -2011 -№ 16 (135)-с. 289-291.

9. Никитенко И.Е. Применение метаболитов бактерий Bacillus subtilis 804, содержащих фактор роста фибробластов, для аутодермопластики при глубоких ожогах. / И.Е. Никитенко, В.А. Копылов // Сборник материалов национального конгресса «Пластическая хирургия» - г. Москва, 2011 - с. 24.

Изобретения по теме диссертации

1. Никитенко, В.И. Способ аутодермопластики в эксперименте. / В.И. Никитенко, В.А. Копылов, И.Е. Никитенко, С.Н. Гнедой - Пат. РФ № 2431203; опубл. 10.10.20011 г. (приоритет от 15.03.2010 г.), Бюл. № 28. -4 с.

26

Подписано в печать 19.09.2012 Формат 60x84/16. Компьютерный набор Гарнитура TimesNewRoman.

Тираж 150 экз.

Издательство ГБОУ ВПО ОрГМА, г. Оренбург, ул. Советская, 6

Одним из наиболее распространенных видов повреждений остаются термические ожоги. Реальное влияние на рост числа ожогов у населения оказывают издержки научно-технического прогресса, увеличение количества потенциальных источников термических поражений (C.B. Попов, 2000). Ежегодно в Российской Федерации регистрируется более 400000 пострадавших с термическими поражениями различной тяжести, их частота доходит до 300-350 случаев на 100000 населения (Митряшов К.В. и др. 2011).

Хирургическое лечение больных с глубокими ожогами представляет собой серьезную медико-социальную проблему, значение которой с каждым годом неуклонно возрастает. Непосредственные и отдаленные результаты их лечения за последние десятилетия существенной положительной динамики не претерпели. Одной из задач современной хирургии, и, в частности, комбустиологии, является дальнейшее изучение репаративной регенерации кожного покрова и поиск препаратов способных её стимулировать.

Перспективным направлением является изучение группы белков, которые получили общее название «факторы роста». Это полипептиды с молекулярной массой 5-50 кДа, объединенные в группу трофических регуляторных субстанций. Подобно гормонам, эти факторы обладают широким спектром биологического действия - стимулируют или ингибируют митогенез, хемотаксис, дифференцировку определённого типа клеток (Y.-H. Ching et al. 2011). К этой группе относятся - инсулиноподобные факторы роста (Herndon D.N. et al., 1996), эпидермальный фактор роста (Alemdaroglu С. et al., 2008), сосудистый эндотелиальный фактор роста (Infanger M. et al., 2004), фактор роста тромбоцитов (Greenhalgh D.G., 2005), трансформирующие факторы роста (Crowe MJ. et al., 2000), колониестимулирующий фактор роста (Ни X. et al., 2011), факторы роста фибробластов (Werner S. et al., 2003).

Одним из наиболее изученных ростовых факторов является семейство факторов роста фибробластов (ФРФ), которые активно участвуют в эмбриональном развитии, процессах ангиогенеза и в заживлении ран (Ornitz D.M. et al., 2001). Имеются многочисленные данные, что факторы роста фибробластов значительно ускоряют заживление ран и ожогов (McGee G.S. et al, 1988; Zheng J. et al, 1994, 1995; Fu X. et al, 1999; Yang Ы.М. et al, 2001; Xing B.R. et al, 2003; Cheng В. et al, 2003, 2004; Gao W.D. et al, 2007; Niu Y.W. et al, 2009), стимулируют ангиогенез во время заживления ран (Miyoshi M. et al, 2005; Komori M. et al, 2005; Wilcke I. et al, 2007; Qiu S.-L. et al, 2008), ускоряют заживление бактериально-загрязненных ран (Hayward P. et al, 1992; Stenberg B.D. et al, 1999; DantasFilho A.M. et al, 2007), улучшают организацию рубцовой ткани (Tan M.L. et al, 1993; Spyrou G.E. et al, 2002; Cheng В. et al, 2002; Akasaka Y. et al, 2007; Xie J.L. et al, 2008; Akita S. et al, 2008; Ishiguro S. et al, 2009), ускоряют заживление ран после забора расщепленных кожных лоскутов (Fu X. et al, 2000; Zhao-Fan X. et al, 2007), способствуют приживлению кожных трансплантатов на раны (Burges A.N, 1989; Sun T. et al, 1997; Liu P.Y. et al, 2005; Bandera B.C. et al, 2010). Все исследователи применяют рекомбинантные (полученные генно-инженерным способом белки-аналоги) факторы роста фибробластов (И. 10. Славченко и др. 2003; М.Э. Гаспарян и др. 2009). К сожалению, в клинической практике препараты, содержащие фактор роста фибробластов до настоящего времени не используются. Только в Китае и Японии проведены ограниченные клинические испытания лекарства с рекомбинантным фактором роста фибробластов при термической травме. Получены обнадеживающие результаты. Широкое клиническое использование уже известных препаратов, содержащих ФРФ, сдерживается сложностью и высокой стоимостью технологии получения фармацевтической субстанции и небольшими, фактически лишь лабораторными, объёмами её производства. Очевидно, что поиск новых, более доступных, источников ФРФ представляется чрезвычайно актуальным.

В результате многолетних исследований феномена транслокации бактерий из желудочно-кишечного тракта проф. В.И. Никитенко (2011) впервые обнаружен природный штамм бактерий Bacillus subtilis 804, продуцирующий бактериальный фактор роста фибробластов. В биотехнологическом эксперименте с культурой фибробластов этот фактор роста, по сравнению с контролем, на 30 - 45% увеличивает число вырастающих клеток. Вышеописанные обстоятельства побудили нас изучить влияние ранее неизвестного и впервые полученного в г. Оренбурге фактора роста фибробластов на заживление ожоговых ран. Был создан препарат с метаболитами штамма Bacillus subtilis 804, который получил название «Винфар» (свидетельство на товарный знак №433087 от 23 марта 2011 г.). Технология его получения проста, легко воспроизводима, не требует больших материальных вложений, что может быть чрезвычайно существенным при последующем внедрении препарата «Винфар» в широкую клиническую практику лечения тяжелообожженных.

Цель и задачи исследования

Цель работы - улучшение качества лечения глубоких термических ожогов путем экспериментальной разработки новой технологии аутодермопластики при лечении ожоговых ран с использованием оригинального лекарственного препарата «Винфар», содержащего новый фактор роста фибробластов.

Для достижения этой цели поставлены следующие задачи:

1. Выполнить клиническое и патоморфологическое исследования приживления свободных кожных лоскутов при пластике гранулирующих ран у животных с глубокими термическими ожогами при местном использовании препарата «Винфар», содержащего новый фактор роста фибробластов.

2. Провести клинические и гистоморфологические наблюдения за приживлением свободных кожных трансплантатов на глубокие ожоговые раны после выполнения первичной тангенциальной некрэктомии при местном применении препарата «Винфар».

3. Изучить динамику заживления «донорских» ран у экспериментальных животных после забора кожи для аутодермопластики с местным применением препарата «Винфар».

Научная новизна

Впервые экспериментально на основе клинических данных, светооптического анализа гистологического материала и иммуногистохимических исследований доказана возможность применения препарата «Винфар», содержащего фактор роста фибробластов, для лечения ожоговых и донорских ран.

Установлено, что местное использование препарата «Винфар» во время аутодермопластики за счет быстрой адгезии кожного лоскута и улучшения его питания приводит к скорому и полному приживлению кожных трансплантатов на гранулирующие ожоговые раны. Данная методика при ограниченных глубоких ожогах предохраняет кожные лоскуты от некроза после первичной тангенциальной некрэктомии и способствует их приживлению (патент РФ № 2431203, 10.10.2011).

Однократное нанесение на раны препарата «Винфар» нормализует течение раневого процесса, способствует синтезу зрелого коллагена и снижает активность склеротического процесса. В результате этого не происходит формирование грубых рубцов. Доказано, что применение препарата «Винфар», содержащего новый фактор роста фибробластов, приводит к сокращению времени заживления «донорских» ран.

Научно-практическая значимость работы.

Полученные новые результаты исследований являются необходимым этапом разработки оригинального лекарственного препарата, содержащего бактериальный фактор роста фибробластов. Внедрение в клиническую практику этого средства в перспективе позволит улучшить результаты лечения тяжелообожженных.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Разработанная новая технология выполнения аутодермопластики с местным применением препарата «Винфар», содержащим фактор роста фибробластов, позволяет существенно улучшить приживление свободных кожных трансплантатов на ожоговые раны.

2. Использование препарата «Винфар» в эксперименте улучшает качество лечения глубоких ожогов и «донорских» ран за счет оптимизации фаз раневого процесса, при этом обеспечивая формирование органотипического регенерата.

Апробация работы и публикации

Основные результаты исследований представлены на заседании проблемной комиссии по хирургии ГБОУ «Оренбургская государственная медицинская академия Минздравсоцразвития РФ», клинических конференциях травматологов-ортопедов ММУЗ ГКБ №4 (г. Оренбург, 2010, 2011), ежегодных региональных конференциях молодых ученых и специалистов (г. Оренбург, 2010, 2011), десятой международной научно-практической конференции «Исследование, разработка и применение высоких технологий в промышленности» (г. Санкт-Петербург, 2010), EPS Global 1-st International Complementary and Alternative Medicine Conference (r. Нанкин, Китай, 2010), национальном конгрессе «Пластическая хирургия» (г. Москва, 2011).

По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, 5 из которых - в ведущих российских рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК. Получен патент Российской Федерации на изобретение № 2431203 от 10.11.2011 г.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 128 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, глав с изложением результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и указателя литературы,

Выводы.

1. Разработанная новая технология выполнения аутодермопластики с использованием препарата «Винфар», содержащего фактор роста фибробластов, позволяет существенно улучшить результаты хирургического лечения глубоких ожогов и «донорских» ран.

2. Местное однократное орошение гранулирующей ожоговой раны препаратом «Винфар» при аутодермопластике способствует быстрой адгезии трансплантата, обеспечивает скорое и полное (100 %) приживление кожных лоскутов.

3. Применение препарата «Винфар» во время аутодермопластики после первичной тангенциальной некрэктомии приводит к выраженной реваскуляризации свободных кожных лоскутов и предохраняет их от некроза.

4. В результате местного применения препарата «Винфар» на «донорскую» рану после забора кожных лоскутов для аутодермопластики термических ожогов значительно ускоряется эпителизация «донорского» участка, восстанавливается полноценный кожный покров.

5. При использовании препарата «Винфар» происходит более быстрое купирование клинических симптомов ожоговой интоксикации, которое проявляется в ранней активизации животных и увеличении их массы.

6. Лекарственный препарат «Винфар» стимулирует реваскуляризацию, клеточную пролиферацию фибробластов и эпителиоцитов кожи и восстанавливает органотипическое строение кожного покрова, при этом происходит усиление синтеза зрелого коллагена I типа и снижается активность склеротических процессов, что приводит к образованию менее выраженных рубцов по сравнению с контролем.