Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Ассоциированность различных аутоиммунных заболеваний с продуктами генов HLA-комплекса в популяции европеоидов Западной Сибири

2 4 МАР 1397

На правах рукописи

ВОРОНОВА ИРИНА АЛЕКСАНДРОВНА

АССОЦИИРОВАННОСТЬ РАЗЛИЧНЫХ АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ С ПРОДУКТАМИ ГЕНОВ Н1А-КОМПЛЕКСА В ПОПУЛЯЦИИ ЕВРОПЕОИДОВ ЗАПАДНОЙ СИБИРИ

14.00.36 — Аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Новосибирск 1997

Работа выполнена в Институте клинической иммунологии Сибирского отделения Российской Академии медицинских наук.

Научный консультант Официальные оппоненты

Ведущее учреждение

— кандидат биологических наук, доцент ИГУ Н. А. Попова

— кандидат биологических наук, с.н.с. ИЦИГ СО РАН Л. П. Осипова

— доктор медицинских наук, с.н.с. ИКИ СО РАМН В. С. Кожевников

— Институт иммунологии МЗ, Москва

Защи'.а диссертации состоится

1997 года

часов на заседании диссертационного совета Д001.01.01.

Института клинической иммунологии СО РАМН по адресу: 630091, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института клинической иммунологии СО РАМН

Автореферат разослан

1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

О. Т. Кудаева

ОЬщая характеристика работы

Актуальность темы: одним нз актуальных разделов мс;цщипы являем-ся проблема аутоиммунных заболевании. До сих пор педоста'очно изучены причины их возникновения и молекулярные механизмы развития, а следовательно не разработаны эффективные способы лечения. В связи с этим изучение генетической пре;фасположеппосп1 к развитию аутоиммунных заболеваний являегся необходимым лапом исследований, позволяющим определить степень риска развития заболеваний, предугада й, характер течения и провесш, при необходимости, дифференциальную днашостику. Возможно, в будущем подобные исследования сделают' возможным коррел ирование наследственной iipoipaMMi.i.

В представляемой работе приводятся результаты исследований спеплсппостп пяти аутоиммунных заболеваний - ревматоцию» о артрита (РА), системной красной волчанки (СКВ), ревматизма (Р), хроническою iломерулонефрита (ХГН), рассеянного склероза (PC) с ал-лслыгымп специфичноешмн HLA, определенными методом серолош-чсского типирования.

Перечисленные заболевания обладают всеми признаками аутоиммунных заболеваний - наличием аугоАТ и соответствующих аутоЛ1", поражением тканей, содержащих аутоАГ, возможиосп>ю переноса заболевании лабораторным животным сывороточными аутоАТ или лимфоиддымн кленами, а также наличием сходных заболеваний у чистолинсйных животных (Драшшк Г.Н.,1989, Забриски Д.Б.,1984, Мсдуницын Н.В., 1987, Насонова В.И.,1989, Рябов С.И., 1989,Чекнсв Б.С., 1994, Чсрнушснко Е.Ф., 1985,Шулутко Б.И.,1994).

Данные заболевания не являются рс;цсими, отличаются неуклонным про1рссс1фованием и практически не поддаются излечению (Насопова В.И., 1989, Чирюш A.A., 1993, Шулутко Б.И.,1994).

При исследовании генетической предрасположснносш к развитию данных заболеваний в первую очередь привлекают внимание гены HLA-комплскса и их продукты, iiipaioiiuie важную роль в развитии иммунного отвега.

К настоящему времени накоплено строчное количество данных об ассошпфованпосш аллелей HLA с различными заболеваниями в раз-пых популяциях. ВЫЯВЛСННЫС при этом П0ПуЛЯЦН0)ПП»1С особенности и невысокие значения относительного риска, полученные для боль

шипства заболеваний, оказались лако обьяснимы в евпе данных о молекулярных механизмах ассоциированности! (Зарецкая Ю.М., 1983, Джирш Д.У., 1982, Hansen J.A., 1990, Ota М„ 1992).

Возможно, слабая степень ассоциированноеш аллсльиых специфичности HLA с заболеваниями может в какой-то мере обьяспя1ься чем, что аллели, тесно сцепленные с развитом патологии, были элиминированы в процессе отбора. Например, при мутации аллеля В13 в аллель В47 развивается вирильнмй сип;(ром с нарушением репродуктивной функции (Р.С. White, 1987).

Исследование аут оиммунных заболеваний может да н. о тег на вопрос, имсегся ли общая 1грс;фасположенносп> к развпшю аутимму-нптста, в часшосш связанная с иосшсльпвом определенных аллелей HLA. .

Цель и задачи исследований. Целью рабоп.1 явилось определение характера ассоцнпровашюсш, а также выявление сгенсни сходства и различий ассоциированносш с аллелями hi LA няш аутоиммунных заболеваний (РА, СКВ, Р, ХГН, PC) в популяции европеоидов Западной Сибири.

В coomeiciBnn с эшм были сформулированы задачи исследования:

1. Изучить харакюр и популяционные особсиносш ассоциированносш РА, СКВ, Р, ХГН, PC с аллелями НLA в исследуемой популяции.

2. Определись наличие или oicyinune шпичных для данных заболеваний ассоциаций, стойко выявляющихся во mhoihx популяциях.

3. Установи п., связаны ли развито клинических форм заболевании и -томи нрофессироваиия процесса с иосшсльпвом определенных аллелей HLA.

4. Проанализирован, cicncni. сходсша и различий в ассоциированносш разных аутоиммунных заболеваний с аллелями HLA.

5. Определи п. степень мммуиогсистичсского сходе ша клинически трудно различимых варнашов заболеваний.

Научная новизна. Впервые для европеоидов Западной Сибири полу чены данные о распределении чип от аллсльных специфичиостей HLA I и II класса у больных ХГН, 1 класса у больных PC, спсцифнч-iiocicü II класса у больных РА, СКВ п Р. Выделены варпашы быстрого и медленного гсмпа развишя эшх заболеваний па основе обще-

прштых кртирисв и исследована их ассоциированности, с про;|ук-Iими ¡снов НLA-комплекса.

Нарячу с преобладающими, выявлены редко встречающиеся у боль-пых, но сравнению со здоровыми, спсцифичпосш HLA.

Усгановлсно, что исследованные в данной работе заболевания, а также их клинически сходные варианты, ассоциированы, в основном, с разными аллельнмми вариантами HLA.

Наряду с популяционпыми особенностями ассоциированности, выявлены шпичнме ;|дя Miionix популяции ассоциации (РА с DR4, СКВ с AI/BS и DR3, PC с В7).

Мпогочисленногп» выявленных положительных п отрицательных связей, наряду со специфическим характером ассоциировапносш, является популяционной особенностью европеоидов Западдой Сибири.

Практическая значимость. Несмотря иа го, что выражсниосп» ассоциаций в большинстве случаев невелика, полученные данные Moiyr использования в практике.

В клинической практике, где ошибки диапсосипси и дифференциальной ;uiarnocniKH Moiyi иривесш к неправильным назначениям, результаты серолошческого нитрования HLA являются вспомогательными данными, облачающими пропюз возможное«! развития заболевания, например в семьях больных, ранней длашостики, которая зачастую бьгеает затруднена, и дифференциальной диашоешки. Также данные Н LA-цитирования Moiyr использования дня прошозн-рования скорости развггшя процесса, развит я заболевания в виде конкрешои клинической формы и, следовательно, опяль-таки выбора правильной тактики лечения.

Тог факт, что далеко не все носители "паголошческих" аллелей заболевают, лето объясняется данными о молекулярных механизмах ассоциированное ш, полносп.ю согласуемся с теорией мулыифакторн-алмгостн развпгия заболеваний п внушает опшмизм, поскольку, согласно упомянугои теории, представляемся возможным моделирован, факторы среды таким образом, чтобы нивелирован» па голошчсское депешие генов.

Полученные данные имеют также большое чеорсшчсское значение, поскольку являются базой дня проведения дальнейших исследовании на молекулярном уровне в данной популяции.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Современное население Западаой Сибири обладает особенностями частичного распределения аллелей HLA у здоровых, при этом характер распределения в основном близок к европеоидному.

2. В популяции Западной Сибири встречаются немногочисленные ассоциации, характерные для mhoiux европеои;щых популяции.

3. Соответственно этому отличается в основном своеобразным характером и ассоциированное!!, исследованных заболеваний со спс1Ц]фпчностями II LA.

4. Развшис клинических форм заболеваний и 1смп их npoipcc-офоваши сцеплены с ностсльством определенных аллелей HLA.

5. При сравнительном анашезе ассоциированности с аллелями HLA пяти аутоиммунных заболеваний показано, что каждое из них ассоциировано с разными аллелями, за фавин ieju.no редкими исключениями.

6. Полученные значеши относительного риска, чувствительности, специфичности, информативности и ;uiaiiiocniuccKoro коэффициента позволяю! использован. данные серолошческого типн-рования при проведении прошоза, в ранней диагностике и ;и1ффсрсшшалыюй диагностике.

Апробация работы и публикации

Материалы диссертации доложены и обсуждены па республиканском елсте молодых медиков (Тбилиси, 1986), на Всесоюзном симпозиуме " Иммуногснсшчсскис аспекты аутоиммунных заболевании и вторичных иммуподефшщтов человека" (Новосибирск, 1989), на расширенном ссминарс ИКИ (1993).

Апробация диссертации состоялась 13 февраля 1995г. на расширенном ссминарс ИКИ СОРАМН.

По теме диссертации опубликовано 19 работ.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена па /З-Z. страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора jurreparypi.i, описания материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, выводов, таблиц. Библиснрафия включает источников, из них /3/С

- отечественных авторов.

Внедрение. Данные HLA-шпнрования в течение ряда лет шттроко используются в практической деятельности I Городского ревмаголо-ШЧССК01 о Hcinpa, а также ревматологического отделения клиники ИКИ СО РАМН.

Материалы и методы исследования.

Обследованные лица.

Всего обследовано 1355 человек. Значительный объем выборки позволяет повысить точность иммуногенегпческих расчетов [G.Thompson and N.R.Rosc, 1983].

Группа сравнения сформирована из 600 здоровых доноров, из них- 312 мужчин и 288 женщин, жшолен Новосибирска, кадровых доноров Областной еташцш пфсливания крови, солда т срочной службы и софудапков ИКИ СО РАМН.

288 больных PA, in них 39 мужчин и 249 жешщш, в возрасте от 18 до 79 лег. У 181 больного па момент обслсдовапия наблюдалась активность процесса I степени, у 95- II ст. ну 12- III ст. Характерные клинические и pcirn енологичсскис признаки полиартрита выявлены у всех больных. У 158 больных в крови стойко дшггельпо выявлялся ревматоидный фактор (РФ). У 96 больных имелись признают суставного РА, у 37- РА с системными проявлениями, у остальпых РА сочетался с деформирующим осгсоартрозом (ДОА). В 39 случаях наблюдалось быстрое про1рсесированис процесса, в 187- медленное, в остальпых случаях на момент обследования, за давностью заболевания, выявить первоначальную скорость про1рссс1троваппя ие представлялось возможным. Y 176 больных выявлена II стадия рагпенолоптчсского процесса, у 96-III, у 16-IV. У 240 больных нарушештя фунюцтональ-пой активности пораженных суставов соответствовали I-II ст., у 48 -II II Ver.

Всем бо.п.ным РА был проведен сгандаршый комплекс обследований для выявления характерных рснпсполошчсских изменешш, РФ,

определение степени активности процесса, лабораторное и инструментальное обследование.

119 больиых СКВ, из иих 10 мужчин и 109 жепщин. Возраст больных колебался от 16 до 65 лет. Отсутствие активпости процесса отмечено у 10 человек: I ст. активности- у 59, 11-у 39, 111- у 21. На момепт обследования 49 больных страдали хронической, 60- подострой формой волчанки. Признаки поражепия почек выявлены у 81 больного, кожи- у 97, серозных оболочек- у 16, оргапов желудочно-кишечного тракта- у 34, нарушений центральной нервной системы- у 16, опорно-даигательного аппарата у 98, гематологических расстройств- у 37, признаков с.Рейно- у 10 человек.

Диагноз выставлялся па основании дашшх стандартного обследования, включающего клинические, лабораторные и инструмаггаль-ные тесты.

155 больных Р, из них 48 мужчин и 107 женщин. Критерием отбора в эту группу больных служило наличие сформированного порока сердца при отсутствии данных о возможной нсревматичсской природе порока. Возраст больных колебался от 16 до 71 года. Все больные предъявляли ревматический анамнез. У 20 больных наблюдалось состояние неактивной фазы, у 98- I ст. активности процесса, у 62 - II, у 5 - III. Острый и подострыи характер течения на момент обследования не наблюдался. У 20 больных порок сердца сформировался латентно, у 80 больных течение процесса было затяжпым, у 55- нс-прерывно-рецндивируюнщм. Недостаточность кровообращения НК0 выявлена у 5 больных, НК1-у 15 больных, НКП - у 102, НКШ - у 33 больных.Все больные имели ревматический анамнез (при латентном течении - указание на тонзиллит). Каждому больному было проведено обследование на ппфшщрованность стрептококком, опрсдслате степени активности процесса, ЭКГ, ФКГ, ЭХО-1 рафия.

74 больных ХГН, 54 мужчины и 20 жешцпп. У 15 больных имелись признаки ХПН 1-Ш степени. 15 больным диагностирована смешанная форма ХГН, 15- латентпая, 14- хроническая нсфротпческая, 7-птертоническая, I- гематурйчсская. С помощью биопсии выявлено, что у 20 больных имел место мезапгиопролиферативный вариант ХГН, у 7 - мезангаокапиллярпый, у 3 - лобулярный, у 4 - мембраноз-ный, у 2 - фмбропластический. Что касается остальных больных, то у них определение варианта течения на момепт обследования было затруднено. У 50 больных определялась акт. процесса I ст., у 22 - II, у

2- III. Больным проводилось лабораторное, инструментальное, ЭХО-локациоппос обследование, чрсскожпая биопсия.

119 больных PC, 39 мужчш! и 80 женщин. Возраст больных колебался от 16 до 47 лет. 115 больных страдали цереброспинальной, 3-мозжечковой, 1- стволовой формой PC. У 48 больных течспис носило ре-миггирующий характер, у 71- прoiредиентный. I ст. активности процесса выявлена у 48 больпых, II- у 60, III- у 11. Всем больным проводилось неврологическое, лабораториос обследование, исследование спинномозговой жидкости, М-ЭХО, ЭЭГ, ЮГ, краниотрафня.

Больные РА, СКВ и Р состояли па учете в Городском ревматологическом диспансере или проходили периодические курсы лечения в специализированном отделении I Городской клинической больницы, небольшая часть этих больных- пациенты Областной клинической больницы. Больные ХГН в течспис ряда лет наблюдались сотрудниками нсфрологического отделения Областной клинической больницы. Обследование больных PC проводилось в сотрудничестве с кафедрой первпых болезней Новосибирского медшршекого нпститута. Диагноз выставлялся в соответствии с действующими критериями и классификациями.

Иммуногенетические методы исследования.

Серологическим методом проводилось определение аллельных вариантов АГ HLA па поверхности лимфоцитов. Всем больным было проведено определение аллельных специфичпостей I класса (локусы А, В, С), больным РА, СКВ, Р и ХГН были определены эротроцитарные АГ системы АВО(Н), согласно общепринятым методикам.

Для проведения пммуногенсшческого обследования кровь из ваш забиралась натощак, в чистые сухие пробирки, и дефибринировалась стеклянной палочкой, в некоторых случаях использовалась гепарини-зированная кровь. Затем мононуклеарные клетки выделялись путем концентрации на градиенте плотности фиколл-верографин, дважды отмывались и раскапывались в планшеты со специфическими сыворотками.

Разделение клеток на Т- и B-лимфоциты осуществлялось на нейлоновом волокне санкт-петербургского производства. Использовались панели типирующнх сывороток санкт-петербургского Института гематологии и переливания крови, а также фирм Bdiring н Biotest

(Германия). Реакцию проводили как стандаршып двухступепча ши микролимфоцитотоксичсский тест по P.Tcrasaki.

Реакции считались положительными при шбели не менее 75% клеток в лунке. Для обозначай» специфичноеiciï использовалась номенклатура 1991г. (The WHO Committee Nomenclature, 1991). Большин-сгво больных в процессе наблюдения были огшпировапм неоднократно.

Определение АГ системы ABO на эритроцитах проводилось с использованием двух наборов сывороток, по стацдар пюи методике.

Методы статистической обработки.

1. Частоту АГ HLA определяли ь % по формуле:

число лиц с исследуемым АГ

Р=- X 10«%

общее число обследованных

2. Частоту гаплотипов определяли по формуле:

Н1АВ= /РА х PB/ + А АВ, где РА и PB - частоты соответствующих генов, а А АВ- величина гамешой ассоциации.

3. Величина относительного риска рассчншвалась по

формуле Woolf, 1955: ad

RR =-----, где a,B,c,d - количество больных и здоровых ин;цш-

Ьс видов, обладающих или не обладающих

данным аллслсм.

Эта формула до настоящего врсмаш являемся наиболее употреби -Moií при расчете вешпипсы относительного риска.

Если частота аллеля у больных снижсна по фавнению с частотой у здоровых, величина относительного риска высчшиваемся с отрицательным знаком.

Если о;пю го значеппи a,B,c,d равно нулю, то используется формула Haldanc:

2а+1 2d+l RR = - х -

2Ь+1 2с+1

4. Доетовернос1т> результатов оцешшалась с помощью метода Фшиера:

/а-t-b/! /с+d/! /а+с/! 1Ъ+Ы!

р=-----------------------------------------

п! а! I»! с! d!

В даппой работе метод "скорректированного" р, при нспот>зова]ши которого значаше р умножается на количество больных в исследуемой группе, не примепялся, чтобы пе была утеряна информация о слабо выражеппых ассоциациях, а также поскол!>ку оп неприменим к расчетам ошосительио гаплотипов и фенотипов [H.Fukuda, 1983].

Поскольку величина RR применима скорее для популяциоппых, чем дня iп 1дпвидуaj 1ыплх заключашй, расчеты были дополнены определением чувствительности (Ч), специфичности (С), информативности (И) и днагностческого коэффициента (ЦК).

Информативность рассчитывалась по способу К.Шешюпа в модификации М.Л.Быховскою:

p(S/A)

1= log 2-------------- , где I - информативность признака S

p(S ) для заболевают А.

p(S /А) - вероятность выявления

этого признака в группе больных, p(S ) - вероятность выявления этого

признака в сравниваемой группе.

Наименьшей величиной информативности, которую можно принимать в расчет, является величина 0,5.

Величиной, позволяющей оценить вклад признака в развитие забо-леваши, является диагностический коэффициент (ДК). Он высчиты-вастся с помощью метода последовательной диашостичсской процедуры на основе секвсшщальпого апшшза А. Бальда в модификации А.А.Гешаша, основаппого на прекращении сбора диа1тюсгачсской информации, в виде перемиожепия вероятностей симптомов болезни, в момент достижения определашого диагностического порога. В общем виде формула принятия решения выглядит так:

р(\1/А1) р(хя/А1)

порог А ---------- ...----порог В

р(х1/А2) р ( хч / А2 )

Порог - это превышение вероятности одной го диапюстическнх шпо-тез, которая соответствует требуемому превытспию частоты правильных днашозов над частотой ошибочных диагнозов.

При постановке диагноза проговоднтся сумшфоваппе ДК разпых признаков. Если сумма достигает величины 9,8, то вероятность правильности диагноза равна 90%, а при сумме ДК 12,8 вероятность правильного диагноза равна 95%.

В данной работе вычислены ДК только для НЬА-пршнаков, что позволяет оценить величину их вклада в теоретически определяемый дпашоз. Наличие у больного НЬА-прпзпаков с высокими значениями ДК или нескольких предрасполагающих к развитию заболеваний НЬА-признаков с невысокими значениями ДК позволяет протезировать возможность развития заболеваш!я в конкретной форме, а также скорость прогрессировать процесса. Таким образом можно с гораздо большей стспепыо уверенности ориснттфоваться в многообразной кшшической карпше клшшчески полиморфных аутоиммунных заболеваний и своевременно выбирать соответствующую тактику лечения.

Результаты исследования и их обсуждение.

Нормативные характеристики распределашя аллелей НЬА в популяции жителей Западной Сибпри европеоидного происхождения.

В настоящее время популяция жителей Западной Сибири состоит не из кореппого населения, а представляет собой смешанную популяцшо, образовавшуюся из пришлого европеоидного населашя с небольшой

долей потомков от сметанных браков с моиголопдами.Таким образом, популяция Западной Спбирп представляет собой промежуточный тип между свропеоидамп п монголоидами, но гораздо ближе к европеоидам. Наиболее распространенными аллелями HLA в данной популяцпп являются Al, А2, A3, А9, В5, В7, В8, В12, В35, В40, Cw3, Cw4, DR2, DR4, DR5. Редко встречаются в даппой популяции А19, А28, B2I, В22, В14, Cwl, Cw7, DR6, DR8. По сравнешао с даппыми Albert E.D., 1984, частота аллеля А9 в Новосибирске значительно превышает частоту этою аллеля у негроидов и европеоидов, но пе достигает чрезвычайно высокой частоты, выявленной для монголоидов.

Частота аллеля А19 в западносибирской популяции значительно ниже, чем в друшх популяциях пегрондов, европеоидов и монголоидов. Частоты аллелей В13 и В27 несколько выше, частота Cw4 значительно вьпис, a Cw7 - значительно ниже, чем у европеоидов, согласно данным Albert E.D., 1984. Кроме тог о, в популяции Западной Сибири редко встречается аллель DR6.

В целом сравшггельный анализ показал, что по частотному составу HLA популяция Западной Сибири находится гораздо ближе к европеоидам, чем к монголоидам (Фефелова В.В., 1994, КотоваЛ.А.,1989).

Учштлвая особенности распределения аллельных специфичностсй HLA у здоровых, следует ожидать выявления популяциош1ых особенностей ассощпфованносш аллелей HLA с заболеваниями,что и подтвердилось при проведении исследований.

Юппппсо-пммуногснетический анализ ревматоидного артрита.

Сравнепие частот аллелей HLA 288 больных ревматопдцьш артритом (РА) и 600 здоровых доноров показало, что прп этом тлеются достоверные различия в частотах 59 аллелей HLA, их гаплотнпов и супратипов, что подтверждает наличие генетической предрасположенности к развптгао РА и участие в форшфОЕашш этой предрасположенности аллелей HLA. Абсолютные зпачеппя величин относительного риска, выявленные для заболеваппя в целом, невелики, что соответствует многочисленным данным, полученным в других популяциях.

По характеру ассоциированности популяция больных РА Западной Снб1фи в значительной сгепешт отличается от других популяций. Тем не менее в регионе Западной Сибири выявлена предрасположенность к развитию РА у носителей аллеля DR4, что является типичным дня большинства исследованных европеондцых популяции и пекото-

11

рых нссвроасоидцых популяции. Также совпадают с данными пеко-торых авторов данные об ассоцшфованпости РА с аллепем БЯЗ.

В популяции жителе)! Западной Сибири выявлсио резкое снижение частоты аллсля ЭЯ52 у больных РА по сравнению со здоровыми, при этом значение риска достигает величины -18,8 (р<0,0001).

Максимальной сцсплспиостыо с РА в популяции Западной Сибири отличаются гаплогапы В 16,40(1^=10.77), CwO,5(RR=16.49), 0113,4(К 18.39).

При попытке выявить связь между развитием клинических форм заболевания и наличием определенных аллелей НЬА оказалось, что такая ассоциированность существует. При этом наиболее типичные формы заболевания обладали ассощшровашюстио, по характеру близкой к ассоциировашюсти 1-руппы РА в целом, а более редкие формы РА отличались другим характером ассоциатор В то же время было выявлено, что различные варианты РА мотуг быть ассоциированы и с о;цпши и теми же аллелями НЬА. Аналогичные результаты были получены и при исследовании других заболеваний.

С точки зрения соврсмешюй иммуногенешки, располагающей данными о многообразии механизмов ассоцшфовашюсш, а также с точки зрения теории мультифакториалыюеш таите данные легко обьясштмы. При этом нужно учтггьша гь и тот факт, что развитие заболевания и его клинических вариантов не зависит лшпь ог постель -ства аллелей НЬА, а определяется также влиянием других многочисленных генов и факторов среды.

Например, наибольший риск развития ссропозитивного РА в популяции Западной Сибири связан с носительством В5,111.59), Сш5(ЯЯ= 13.97), СшО,5(КЯ=24.82), ОЯЗ,4(11Я= 16.59), при этом варианте заболевания особенно понижены частоты В0,7(11к=-12.90), ОЯ52(ЯЯ=-21.47).

На наличие ассоцтафованносш были исследованы также серонсга-тивный РА,суставной РА и РА с системными проявлениями.

По дашнлм разных авторов, чаще всего встречается РА, характеризующийся началом в виде поражения мелких суставов, медленным нрогрсссировшшем процесса и развитием преимуществапIо суставных поражений. При таком "классическом" варианте РА в популяции Западной Сибири оказались значимо повышены частоты аллелей В16, А0/В40, А1/В0, А2/В16, АО,2 и снижена частота аллсля В13. Использование этих данных может оказаться полезным при прогпозтфо-вапии развития такого варианта заболевания.

КjnпniKо-нммvHorciicni4сский анализ системной красной волчанки.

Группа больных СКВ достоверно отличалась от кошрольной частотами 27 алллелей, гаплотипов и супратипов HLA. С этим заболеванием в наибольшей степени ассощпгровапы аллели Cw7(RR=26.11), DR0,3(RR=10.0), DR3,7(RR=15.67) и гаплотипьг аллеля Cw7. В наибольшей степени запцппып эффект ецеплеп с A9/B35(RR=-5.09), CwO,3(RR=-6.70).

В нашем исследовании выявлены типичные для многих популяций accoiqiaipin СКВ с аллелем DR3 и супратипом А1/В8. Значения риска при этом примерно такие же, как и в других популяциях (2.19 и 1.77, соответствашо).

Чрезвычайно высокий риск развития СКВ у лиц с аллелем Cw7 и его гаплотипамп следует считать особенностью популяции Западной Спбирп. Ассощгаровашюсть СКВ с аллелем Cw7 в доступной литературе упомянута лишь в работе Ballou S.P., 1985.

Относительно вариантов клинического течения СКВ получены дапиыс, свидетельствующие о том, что развитие таких вариантов сцеплено с аллелями HLA. Прн этом были исследованы 1руппы больных, страдающих подострой и хронической СКВ, развитие заболевания в детском и более старшем возрасте, множественные и единичные поражения оргапов, наличие и отсутствие поражезшя почек.

В результате проведенных нсследовашш было выявлено, что практически не существует аллелей и аллельных сочетаний, которые были бы связаны одцовремешю со всеми неблагоприятными проявлениями волчанки - ранним началом, множествашымн поражениями, патологией почек - и могли бы служить прогностическими маркерами развития тяжелых форм СКВ. Поэтому в рамках данной работы было проведено определение сцеплеппости аллельных вариантов HLA с развитием тяжелых проявлений волчанки по другому принципу, что описано ниже.

Клшппсо-иммуногенетпческпй анализ течения ревматизма.

Группа больных ревматизмом отличалась от группы здорового котгтроля частотами 27 аллельных специфичностей, гаплотипов и супратипов HLA. Наибольший риск развития Р связан с посительством В8,40 (RR=3.99), A0/B27(RR=4.51), как ввддо, положительная асСо-ципровашюсть при этом заболевании отличается невысокими значе-

пиями ЯК. Но абсолютные значения рисков, выявленные для отрицательных ассоцпагдай, довольно велики н связаны с поаггельством А0/В15(ЯК=-8.23), А11/В35(ЯК=-6.76), А11/В40(КЯ=-8.78), А19/В13 (11К=-7.15).

Пропюз развитая Р завиагг от скорости формирования порока сердца и тяжести порока. Развитие сочеташюго митрального порока в исследованной популяции связано с носительством В16,22(1111=13.16), 0111,3(1111=9.33), наиболее защищены ог форшгро-вания этого вида порока обладатели А9/В27(ЯЯ=-9.65), ОК4(ЯЯ=-5.23).

Развитие сочеганного аортального порока связано с друшмп спе-цифпчпостями НЬА. Мака1мально предрасположены к его форм!гро-вашпо обладатели В 12,27(1111= 10.94), А28/В8(Ш1=46.08), самый высокий протсктпвный эффект выявлен для гаплотппа А1,2 (КЯ=-6.77).

Комбинированшлй митрально-аортальный порок в паиболыней степаш положительно сцеплен с В7,14(1*1^=14.90), В13,17(1*11= 14.24), при этом виде порока особенно редко встречается аллель В15(Ш1=-9.23).

Количество больных с другамн видами пороков оказалось недоста-точио велико для проведения расчетов.

Поскольку в практической деятельности могут в некоторых случаях возшосать затруднешы при проведении дифференциальной диагностики между клшшчески выраженным ревматическим артритом и ревматоидным артритом, протекающим в форме моно-, олш оартри-та, отдельно была исследована ассоцшгрованность аллелей НЬА с ревматическим артршом. По своему характеру выявленные ассоциации полностью отличались от ассоциаций, выявлешц>1х для РА.

Наибольший риск развития ревматического артрита сцеплеп с га-плотинами В16,18(1111=9.05) и 0111,7(1111=7.83).

Как известно, провоцирующим фактором развита Р является ин-фшщровашюсть стрептококком группы А. В соответствии с этим, поскольку нельзя псключшь и вирусную теорию возпикповенпя Р, была выделена особая группа больпых, в анамнезе у которых имелись данные о клинически выражеш!ых проявлсшых тонзиллита, предшествующих атаке Р, сопровождающихся повышением титров АСЛО. Дашиле об ассоциировашюсти аллелей НЬА с такой формой тонзиллита представляют практическую цеппость, так как позволяют обратить особое внимание па больных тонзиллитом с предрасположенностью к развитию Р. Максимально высокая степень риска развития

Р вследствие перенесешгого топзпллита выявлена для А0,28(КЯ= 18.09) и В16,18(КЯ= 11.71).

Клппнко-иммупогепегическин апализ хропического гломерулонефрита.

Для группы больных ХГН было получено 46 достоверных отличий в частотах НЬА-спсцифичностей по сравнешпо со здоровыми. Самый высокий риск наблюдается при налнч1ш АО/В 17(1111=11.12), В 15,21(1^=16.64), 0110,7(]1Я= 12.82), 0113,7(1111= 12.82). В наибольшей степени понижены частоты А2/В13(11Я=-10.48), С\уЗ,4(ЯЯ=-21.61).Для использования дашп>1Х НЬА-птировання в прогнозе развития определенных форм ХГН с контролем сравшгаалпсь группы больных, у которых имелись четкие признаки определашых клинических и морфологических вариантов заболевания, рри услотш достаточной численносш 1руппы. Были выявлены ассоциащш, присущие латентному, хроническому пефротическому, смешанпому варианту ХГН, при этом значения рисков достигали достаточно высоких величия (около 40 в некоторых случаях). Ветппшы отрппательпых значений риска были при этом невелики. Что касается морфологических вариантов ХГН, определашых с помощью биопсии, то достаточно представительной оказалась только группа больных мезапгпопроли-фератпвным ХГН, панболышш риск развития которого связан с В7,1Н(ЯЯ= 13.22).

Юпппгко-пммуногенетпческпй анализ РС.

По техническим причинам больным РС определялись только АГ I класса НЬА. При сравнаппг с группой здорового контроля было выявлено 15 доетоверш,IX ассоциащш, представленных, в основном, сочетаниями аллеля В7.

Ассоншфовашгосп» РС с аллелем В7 характерна для многих попу-ляцпй Европы, несмотря на невысокий относительный риск этой ас-социащт. В популящш Западной Спб1фи риск развитая РС при по-ситсльегве В7 равен 2.85. Максималмплй риск выявлеп для В7,12(1111=8.69) и В7,15(КЯ=8.69).

Для характернстпкп течешм РС выделяют прогредиептиын и ре-М1ггпфую1Щ1Й варианты этого заболевапня, а также указывают локализацию поражения.

Как и при друшх заболсвашмх, разшгше разных форм РС оказалось сцеплено с разными аллелями НЬА. Это относится к прогредн-

15

ептноп и ремиттирующеи форма» РС. Поскольку почти во всех случаях наблюдалась цереброспинальная локализация процесса, выявление ассоциированности с этим показателем не проводилось.

Отдельно рассчитывались показатели риска развития РС для мужчин и женщин. Наиболее подвержены развитию РС среда мужчин обладатели супратипов А1/В7(ЯЯ=5.55), А9/В7(1111=5.55), среда женщин- В7,12(1111=15.82), А2,10(1111= 15.82).

Были также проведены исследования группы родственников, состоящих с больными в I степени родства.

Полученные данные свидетельствуют о том, что у ближайших родственников больных РС имеются, практически, тс же самые особенности частотного распределения НЬА-специфичностсй, что и у больных. Следовательно, родственников можно считать группой риска, в которой, при некоторых соответствующих условиях, мо1уг появиться больные РС.

Иммуногенетические методы прогноза быстро и медленнопрогрессирующих форм заболеваний.

Исследованные в данной работе заболевания отличаются выраженным клиническим полиморфизмом, вероятно, возникающим вследствие разных условий, в том числе и генетических особенностей организма.

Поскольку в данной работе исследовались аутоиммунные заболевания, вполне вероятным представлялось участие в формировании предрасположенности к клиническому полиморфизму и антигенов системы НЬА.

Проведенные исследования позволили выявить наличие нерезко выраженной сцеплеяности между носительством определенных аллелей НЬА и скоростью про!реагирования процесса.

В случае с РА выделение вариантов быстрого и медлешюго прогрессировать заболевания предусмотрено действующей классификацией и полученные данные описаны выше.

Выявление темпа прогрессирования Р представляется затруднительным, поасолысу у многих больных при тщательном расспросе выявля-

ются указания на ревматический процесс в детском возрасте, в то время как форм(фованис порока произошло мнение года спустя, и нелегко решить, какой из этих момсптов можно считан, началом заболевания.

Что касается трех оставшихся заболеваний, то нами были выделены варианты течения согласно общепринятым критериям.

При СКВ признаками неблагоприятного течения признаны поражение почек, развившееся вскоре после появления первых признаков заболевания пли как один из первых признаков, поражение центральной нервной системы и легочной волчаночный васкулит (Насонова, 1989).

Если данные признают ярко выявлялись в первые года от начала СКВ, то в этом случае у больных отмечалось вг.фажсннос повышение частот гаплотипов В18,35(ЯЯ=10.21), С\у2,7(ЯЯ=45.30), Си-6,7(ЯЯ=58.19), ОЯЗ,7(ЯЯ=17.63).

Если же при давности заболевания более 10 лег наблюдались менее тяжелые расстройства органов и систем, то у больных преобладали В0,14(ЯЯ=14.21), В12,18(ЯЯ=14.21), Си-4,7(ЯЯ= 107.04).

При проведении прогноза важно учитывать не только то, каюте органы поражены, по и какое количество органов вовлечено в процесс. Безусловно, множественность поражений является более неблагоприятным признаком. Развитие поражения не менее 5 органов в течешю 5 лет у больных СКВ ассоциировалось, в наибольшей степени, с ОЯЗ,7(ЯЯ= 16.59), С\\7(ЯЯ=37.84), . С\у2,7(ЯЯ=52.38),

С\^3,7(ЯЯ=48.33), Си'6,7(ЯЯ=52.38), развитие поражения не более 4 органов в течение 10 и более лег - с ОЯ0,3(ЯЯ=42.00), С\\-0,5(ЯЯ=49.47), С\\1,5(ЯЯ=49.47), С\\4,7(ЯЯ= 125.26).

При аналошчном исследовании ХГН отдельно была выделена I рунпа больных, имеющих клинические признаки неблагоприятного течения процесса. При этом в одну [руппу 61,тли обьединет.г больные со смешанной и тттсртоттческон формами ХГН,При этом максимальный риск связан с В12,16(ЯЯ=9.90), А0/В16(ЯЯ=11.90), ОЯО,7(ЯЯ=22.26), ОЯЗ,7(ЯЯ= 14.10).

В труппу больных с благоприятным течением ХГН были обт>с;ишс-пы больные, имеющие четкие признаю! латентного, гсматуричсского

или нсфро-шчесхого ХГН, последний сочетался с мембранозпым и ме-зангиопролиферативным гистологическом вариантом.

Риск развития такого, более мягкого течения заболевания, наиболее повышен при выявлении ВО, 16(1111= 11.33), В7,18(ЯЯ=11.33), АО/В 17(1111=23.53), АО/В 18(1111=7.40).

Степень прогрессировали* РС оценивалась следующим образом. Поскольку степап> инвалидности соответствует степени потери футгк-ций, в качестве злокачественного РС рассматривался вариант, при котором в течение 1-3 лет от начала заболевания наступала инвалидность 1-2 группы, а доброкачественного - когда за 4 и более года от начала заболевания степень инвалидности не превышала 3. Максимальный риск развитая первого варианта выявлен для В7,17(1111=25.55), второго варианта - для В7,12(ЯИ= 14.63).

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о накоплении в популяции больных, различающихся характером течения заболеваний, определенных Н ЬА-специфичностси, что может использоваться с целыо прогноза развития вариантов заболеваний.

Таблица 1. Ассоциированность развития быстрого прогресспрования процесса с аллелями НЬА.

Заболевание НЬА

СКВ С\у2,7 С*г6,7 ОЯ 3,7

ХГН В12,16 АО/В 16 БЯЗ,7

РС. В7,12 В7Д7

Сравнительный иммуногенетический анализ исследованных заболеваний.

Исследованные в данной работе заболевания обладают некоторым сходством клинической картины, особенно па ранних стадиях их развития, за исключением РС, который менее всего сходен с другими описанными в данной работе заболеваниями . Теоретически можно было бы предположить, что для данных заболеваний может быть выявлена ассоциированность с одинаковыми аллсльными специфично-стями НЬА, которые обуславливают формирование предрасположенности к развитию аутоиммунитега.

Но, как показывают полученные результаты, все исследованные в данной работе заболевания обладают ассоциированностью с разны-

18

ми аллелями HLA, за исключением нескольких случаев, которые выглядят крайне малочисленными на фоне общего количества ассоциаций.

Таким образом, даппые HLA-типирования могут использоваться в дифференциальной диагностике на ранних стадиях развития этих заболеваний.

Также различаются своей ассоциированностью клинически трудно различимые варианты заболеваний - РА с системными проявлениями и СКВ, СКВ с поражением почек и ХГН, некоторые варианты РА и ревматический артрит.

Общими ассоциациями для РА и СКВ оказались ассоциации с А2,10, DR3, DR3,7, для РА и Р - А10, А2,10, А10/В5, А10/В40, для СКВ и ХГН - А1 О/ВО, DR3, DR3,7, для СКВ и Р - А2,10.

Таким образом, одновремешю с тремя заболеваниями ассоциированы аллель DR3 и гаплотпп DR3,7 (их частоты значимо повышены при СКВ, РА и ХГН), а также гаплотип А2,10 (при СКВ, РА и Р). Следует специально отметить, что неблагоприятное влияние аллеля DR3 на характер иммунологических реакции in vivo 'и in vitro неоднократно отмечено многими авторами (Медуницын Н.Е., 1987, Джу-магазиев A.A., 1993).

В целом нужно отметить, что особенностью популяции Западной Сибири является многочисленная ассоциированность аутоиммунных заболевашш с аллельпыми специфичностямн HLA. Не исключено, что причиной такой несостоятельности многих аллелей и аллельных сочетают являются неблагоприятные климатические условия (Пузырев В.П., 1994).

Табшща 2. Одинаковая ассоцштроваппость разных заболеваний.

HLA Заболевания

А2.10 DR3 DR3,7 РА, СКВ

АЮ A2.I0 А10/В5 А10/В40 РА, Р

Al О/ВО DR3 DR3.7 СКВ, ХТН

А2.10 СКВ, Р

выводы

1. Ассоцшфованность РА, СКВ,Р,ХГН и РС с аллелями НЬА в популяции европеоидов Западной Сибири отличается популя-1цю1шыми особенностями, проявляющимися многочисленностью, специфичностью и силой ассоциации.

2. В нескольких случаях выявлены слабые, но типичные для европеоидных популя1р1Й ассоциации - РА с ОЛ4, СКВ с ЭЯЗ и А1/В8, РС с В7.

3. Развитие определенных клинических форм РА, СКВ, Р, ХГН и РС, а также темп развития этих заболеваний достоверно связаны с носительством аллсльных спсцпфичностсй НЬА.

4. В популяции Запа;цюй Сиб1фи РА, СКВ, Р, ХГН и РС, обладающие признаками аутоиммутшых заболеваний, ассоцшфова-Ш.1 с разными аллелями НЬА, что позволяет использовать полученные данные в практической медицинской деятельности.

5. Различаются своей ассоцшфованностыо и клинически сходные варианты заболеваний - РА с системными проявлениями и СКВ, СКВ с клинически выраженным поражешеем почек и ХГН, Р с клинически выраженным поражением суставов и РА, в последнем случае клиинческос сходство можег наблюдаться на начальных стадиях развития заболеваний и при некоторых начальных формах РА.

6. Выявлено лишь несколько случаев ассоцпировашюсти одних и тех же аллсльных спсцифичностсй НЬА более чем с одним из исследованных в данной работе заболеваний, прп этом выдс-лясгся ассощфовашюсть аллеля ОЯЗ, известного своей сцеп-лспностыо с различными иммунными расстройствами, и его г аплотипа ОЯЗ,7, одновременно с РА, СКВ и ХГН.

7. В ряде случаев получены высокие значепня относительного риска, характеризующие да1шую популяцию, наибольшие - при положительной ассоцшфовашюсти аллсля С\у7 и его гаплопшов с СКВ, а также при отрицательной ассоцшфовашюсти аллеля ОИ.52 и РА.

8. Расчеты величин относительного риска, достоверности, чув-ствитеш.ности, специфичности, информативности и даапюстн-чсского коэффициента показывают-, что данные ссролошческо-го типироваиия НЬА мстуг использоваться, с определенной стсисш.ю достоверности, при проведешш прошоза развития заболевания у индавида, в качестве вспомогатс.]п»ных данных

при диагностике па ранпих стадиях развитая заболеваний и при проведении дифферащиальпой диагностики.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Прокофьев В.Ф., Короткова И.Ю., Наумов Ю.М., Петрова Е.Д., Воронова H.A., Коненков В.И. Иммуногенетические пршпцты даспанссризаппи больпых аутоиммуппыми заболеваниями.

// Тезисы докладов III Всесоюзного съезда ревматологов: Вильнюс, 1985, стр. 65-66.

2. Прокофьев В.Ф., Копепков В.И., Старостина Н.М., Короткова И.Ю., Воропова H.A., Наумов Ю.Н., Донская О.Г. Имму-HOJ спешка диффузных заболеваппй соединительной ткать

// Профилактика, днатоетика н лечение аутоиммунных забо-лсвашн! и вторичных пммунодефпцптов. Тезисы докладов Всесоюзной конферепнпи, Новосибирск, 1985, т. 1, С.65-66.

3.Коненков В.И., Прокофьев В.Ф., Глазычева И.Ю., Кожевников B.C., Наумов Ю.Н., Петрова Е.Д., Воронова И.А., Петрова Е.М., Лозовой В.П. Изменение уровня растворимых HLA - ainureiioB и их легких цепей (р^-мпкроглобулипа) при ревмагои;шом артрите и спстемпой красной волчанке // Тф. архив,-1986.-N7.-C.57-59.

4. Воропова H.A., Прокофьев В.Ф. Иммупогенетический анализ течения ревматизма.//Материалы докладов республиканского слега молодых медиков, Тбилиси, май 1986,стр.348.

5.Конепков В.И., Прокофьев В.Ф., Воропова И.А. Иммуноге-нешческие методы прогноза в клинике ревматических заболеваний. // Оцепка н коррекция состояпня иммунной системы в клинике и эксперименте, Новосибирск, СО АМН СССР, 1987, стр.5-12.

6.Вольский H.H., Прокофьев В.Ф., Кона псов В.И., Козлов В.А., Воронова И.А. Метод этиологических компонент в клшшко-гснетичсском ана;п1зе болезни Бехтфева. // Оценка и коррекция состоя1шя иммунной системы в клгнппсе и экспфпменте, Новоснб1фск, СО АМН СССР, 1987, стр.160-166.

7. Коненков В.И., Прокофьев В.Ф., Воропова И.А., Котова Л.А. Иммуногснетическис методы прогноза эффективности иммунокоррспфующей терапии.// Экспфимснтальпая и клппп-

чсская иммуполошя. Тезисы докладов научной конференции, Красноярк, сентябрь 1988г., т. 1, стр.35.

8. Прокофьев В.Ф., Грибачева И.А., Коненков В.И., Доронин Б.М., Воронова И.А. Иммупогснетичсские маркеры рассеянного склсроза в Западной Сибири.// Журнал невропатолопш и психиатрии им.С.С.Корсакова.- 1988.-N 12.- стр.49-52.

9. Прокофьев В.Ф., Воронова И.А., Котова Л.А., Ш1финекнй В.С, Вольский Н. Иммуногсиешческие методы раннего диашоза и пропюза в клинике аутоиммунных заболеваний.// Клиническая иммунология и иммуногснстика, Новосиб1фск, 1988, стр.126134.

10. Тананко Э.М., Непомнящих В.М., Прокофьев В.Ф., Воронова И.А. Специфическая иммунотфаппя больных поллинозом: эффективность и НЬА фенотп. // Иммуногснстческие аспскп>1 аутонммутплх заболеваний и вторичных пммунодефинптов человека. Тезисы докладов I Всесоюзного симпозиума 30-31 мая, Новосиб1фск, 1989, стр. 68-70.

11.Воронова И.А. Клинико-иммуногенетнчсский анализ ревматоидного артрита. // Иммуногспстическис аспекты аутоиммунных заболеваний и вторичных иммунодефинигов человека. Тезисы докладов 1 Всесоюзного симпозиума 30-31 мая, Новосибирск, 1989, стр. 14-15.

12.Прокофьев В.Ф., Коненков В.И., Грибачева И.А., Воронова И.А., Доронпп Б.М., Ифусалнмский А.П. Клинико - иммунологические параллели при рассеянном склфозс.// Журнал невропатологии и психиатрии им. С.С.Корсакова.- 1989,- сф.31-34.

13.Воронова И.А. Различия в характфе распределения НЬА - ан-тигепов н в степени их ассоциированности с заболеваниями в поиулящш населения Западной Сибири.// Тезисы докладов 1 Всесоюзного иммунолошческого съезда, Сочи, 15-17 ноября 1989г., Москва, т.2, слр.ЗО.

14.Коненков В.И., Прокофьев В.Ф., Воронова И.А. Комплексная оценка генетических факторов риска возшнаювепия ревматизма. II Иммунология.- 1990.- N5,- сгр.71. (Рукопись депонирована во ВНИИМИ 15.05.89 ЛД-17747).

15.Коненков В.И., Прокофьев В.Ф., Гсльфгат ЕЛ., Рогачсва Г.А., Воронова И.А. Иммуногснстика вторичных иммунодефицитов посттравматичсского и эколошчсски обусловленного гепеза.// Экологаческис аспекты иммунопатологических сосгояний. Тезисы докладов пленума Всесоюзной проблемной комиссии

эпидемиолопш иммуиодсфищпов п оценки пммуююго статуса, Москва-Алма-Ата, 1990, стр.58.

16. Воронова H.A., Прокофьев В.Ф., Коненков В.И. Иммуногенс-тичсская reí epoi енпость клинических вариантов СКВ у европеоидов 3ana;pioii Сибири.// Тезисы докладов IV Всесоюзного сьсзда ревматологов, Минск, 1991, 344С.

17. Воронова И.А. Иммупогснешчсское сходство разных вариантов течения аутоиммунных заболевании. II Тезисы докладов I съезда иммунологов России. Новосибирск, 1992.- С. 94.

18. Иванова Г.Г., Воронова И.А., Коненков В.И. Иммупогспеш-чеекпе подходы к отбору рецпппептов для трансплантации почек.// Тезисы докладов I съезда иммунологов России. Новосибирск, 1992,-С. 180.

19. Коненков В.И., Михсснко Т.В., Котова Л.А..Воронова И.А. Иммупогснстика радиационных поражении человека.// Международная научная конференция "Эколошя - радиация-здоровье". Семипалатинск, 1993.- С.59-60.

За к. 10 Тир. 100 Формат 60x84 I/I6. Бумага офссшая. Псч.л. I Типо1рафия СО РАМН., г.Новосибирск, ул. Ак. Тимакова, 9, 1996

Автор выражает глубокую признательность коллективу лаборатории клинической иммунологии ИКИ СО РАМН, на базе которой была проведена практическая часть работы.