Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Ассоциация экспрессии некоторых провирусов семейства HERV-К с возникновением и развитием герминогенных опухолей человека

РГБ ОД

26 ФЕВ 2002

На правах рукописи

Клеймам Анна Михайловна

АССОЦИАЦИЯ ЭКСПРЕССИИ НЕКОТОРЫХ ПРОВИРУСОВ. СЕМЕЙСТВА НЕИУ-К С ВОЗНИКНОВЕНИЕМ И РАЗВИТИЕМ ГЕРМИНОГЕННЫХ ОПУХОЛЕЙ ЧЕЛОВЕКА

14.00.14 - онкология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

МОСКВА - 2001г.

Работа выполнена в Российском Онкологическом научном центре нм.Н.Н.Блохина Российской академии медицинских наук

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор В.Э. Гурцевич

доктор медицинских наук А.И.Карселадзе

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Ф.Л. Киселев

доктор биологических наук А.Ф. Бобков

Ведущая организация:

Научный центр - Институт Иммунологии МЗ РФ

Защита диссертации состоится " 2002 г.

в_часов на заседании Специализнровашгого Совета (К.001.17.01)

Онкологического научного центра РАМН по адресу 11547?,• г.Москва, Каширское шоссе, д.24.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РОЩ им.Н.Н.Блохина РАМН Автореферат разослан " в " фсМ/К^-^-^-- 2002 г.

Ч - ■ ; / /',' / I •

Ученый секретарь ' „ ..." , р -//- / — / N

специализированного совета,

доктор медицинских наук Ю.А.Барсуков

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Герминогенные опухоли (ГО) являются сравнительно редкими и оставляют всего 1-2% от всех опухолевых заболеваний мужчин. Анализ аболеваемости герминогенными опухолями в разных возрастных группах [оказывает, что ГО болеют в основном молодые мужчины в возрасте от [ятнадцати до пятидесяти лет, и пик заболеваемости приходится на 20-25 лет [ 35 лет в зависимости от морфологической формы заболевания. Уровень аболеваемости ГО в последнее время медленно, но неуклонно повышается, собенно в развитых странах, в связи с чем изучение этиологии и патогенеза ерминогенных опулолей, а также поиск маркеров, позволяющих обнаружить пухоль на ранних стадиях заболевания, является важной и актуальной адачей.

В последнее десятилетие появились убедительные данные об ссоциации экспрессии провирусов HERV-K/HTDV (Human Endogenous Letroviruses/Human Teratocarcinoma Derived Viruses) с развитием ерминогенных опухолей человека. В то же время вопрос о значении белков IERV-K/HTDV для возникновения и развития ГО до сих пор остается ткрытым. Изучение экспрессии белков cORF и Env HERV-K/HTDV в ткани грминогенных опухолей и в паренхиме нормального яичка позволит риблизиться к решению этого вопроса.

Интересным с точки зрения изучения механизмов развития грминогенных опухолей является исследование транскрипции гена romyelocytic Leukemia Zink Finger Protein (PLZF) в тканях ГО, так как едавно было показано, что именно PLZF - негативный регулятор ранскрипции клеточных генов, в том числе и циклинов AI и А2, -заимодействует в двух-гнбридной системе с белком cORF HERV-K/HTDV.

Предположение о том, что антитела к белкам провирусов ШШУ-К/НГОУ можно использовать как серологические маркеры ГО неоднократно обсуждалось в литературе. Однако до настоящего времени работы по изучению динамики титров антител у больных герминогенными опухолями, ее корреляции с другими проявлениями болезни и результатами лечения не проводились. Вопрос о том, какие морфологические формы ГО сопровождаются гуморальным иммунным ответом к белкам НЕЯУ-К/НТБУ, также оставался открытым. Таким образом, исследование экспрессии генов ет и сОЯБ провирусов НЕ11У-К/ШТ)У и гена РЬгИ при различных морфологических формах ГО является актуальной Научной задачей и может внести определенный вклад в фундаментальные исследования роли НЕИУб в канцерогенезе. В то же время, изучение антительного ответа на белки провирусов НЕЮ/-К/НТОУ поможет решить практическую задачу поиска новых серологических маркеров ГО. Цели н задачи исследования

Целью настоящей работы было изучение экспрессии провирусов НЕЯУ-К/Н'ГОУ при различных морфологических формах ОСТ и проверка гипотезы о взаимодействии белков сОШ7 и VLZF в клетках герминогенных опухолей. Кроме того, целью работы было изучение гуморального иммунного ответа к белкам НЕЮ/-К/НТОУ при различных морфологических вариантах ГО и возможности использования вирусспецифических антител как серологических маркеров ГО.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1) Изучить экспрессию гена епу НЕЯУ-К/НТБУ при различных морфологических вариантах ГО;

2) Изучить экспрессию сОШ7 Н£Ю/-К/ШТ)У при различных морфологических вариантах ГО;

3) Изучить экспрессию при различных морфологических вариантах ГО;

4) Исследовать гуморальный иммунный ответ к белкам провирусов HERV-K/HTDV при различных морфологических вариантах ГО;

5) Проанализировать возможность использования вирусспецифических антител как серологических маркеров ГО.

Научная новнзпа

1. Высокочувствительным методом RT-PCR было показано, что env HERV-K/HTDV транскрибируется во всех злокачественных морфологических формах ГО яичка, но не транскрибируются в зрелой и незрелой тератомах. Кроме того, показано, что env HERV-K/HTDV транскрибируется в нормальной паренхиме яичка и плаценте.

2. При изучении транскрипции cORF впервые показано, что мРНК полноразмерного cORF обнаруживается только в образцах герминогенных опухолей, но отсутствует в образцах паренхимы здорового яичка. В паренхиме яичка, прилегающей к опухоли, обнаружение мРНК белка cORF коррелирует с присутствием в ткани либо клеток опухоли, либо клеток carcinoma in situ (CIS).

3. Впервые изучена транскрипция гена PLZF при различных морфологических формах герминогенных опухолей и показано, что PLZF не транскрибируется в герминогенных опухолях яичка. Следовательно, в клетках ГО не может происходить взаимодействие между белками cORF и PLZF.

4. При изучении гуморального иммунного ответа к белкам Gag и/или Env HERV-K/HTDV из 310 у 209 (67,4%) больных ГО были обнаружены антитела к Gag и/или Env HERV-K/HTDV. При этом впервые было установлено, что гуморальный иммунный ответ к белкам HERV-K/HTDV у больных ГО развивается при всех морфологических вариантах' первичной опухоли. В случае, когда первичная опухоль представлена только элементами зрелой и/или незрелой тератомы, присутствие антител к вирусным белкам свидетельствует, скорее всего, о том, что в метастазах у этого больного

присутствуют клетки злокачественной формы ГО, которые и продуцируют вирусные антигены.

5. Показано, что наиболее часто антитела к белкам НЕНУ-КЖГОУ встречаются у больных семиномой (77,6%), смешанной опухолью с элементами семиномы 81%) и опухолью желточного мешка (80%). Реже всего антивирусные антитела встречались у больных хориокарциномой (33,3%) и эмбриональным раком (43%).

6. При изучении динамики изменения антительного ответа к белкам НЕЯУ-К/НТОУ и ее корреляции с результатами лечения установлено, что у большинства серопозитивных больных происходит снижение значений титров антивирусных антител в ходе проводимого лечения, что коррелирует с улучшением состояния больного и регрессией опухоли. И наоборот, повышенные титры антител к белкам НЕЯУ-К/Н'ГОУ отражают наличие в организме больного живых клеток ГО, продуцирующих вирусные антигены. Практическая ценность

Впервые на большом клиническом материале было показано, что повышенные титры антител к белкам провирусов НЕЯУ-КЛТШУ после окончания химнотерапевтического лечения статистически достоверно коррелируют с обнаружением живых опухолевых клеток ГО, прогрессированием заболевания и возникновением рецидивов. На основании этих данных сделано заключение, что антитела к белкам НЕ11У-К/НТОУ отражают наличие в организме больного живых опухолевых клеток. Таким образом, антитела к белкам НЕ11У-КЛТГОУ могут быть использованы в клинической практике как серологические маркеры для диагностики ГО. раннего обнаруженния рецидивов, а также для мониторинга больных ГО. Апробация диссертации

Диссертация апробирована на объединенной научной конференции лабораторий иммунологии онкогенных вирусов, вирусного канцерогенеза иммунохимии, молекулярной биологии вирусов, регуляции клеточных V вирусных онкогенов НИИ Канцерогенеза РОНЦ РАМН 4 июля 2001 года

Основные положения диссертации докладывались на VI, VII и VIII Международных конференциях "AIDS, cancer and related problems" 1998, 1999, 2000 (Санкт-Петербург, Россия); Международном семинаре "Endogenous retroviruses and evolution of genome" 2000 (Москва, Россия); 35-ой и 37-ой конференциях Американского общества клинических онкологов (ASCO) 1999 2001 (США); Международном конгрессе Germ Cell Tumours V 2001 (Англия). Публикации

По материалам диссертации опубликовано 3 научные статьи и 11 тезисов докладов.

Структура и объем диссертации

Материал диссертации изложен на 123 страницах машинописного текста. Диссертация состоит из 4-х глав: Введение, Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты собственных исследований, обсуждение и выводы. Работа содержит 21 рисунок, 16 таблиц и два приложения. Библиографический указатель содержит 159 ссылок на литературные источники, из них на 7 отечественных и 152 зарубежных.

II. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы Сыворотка. В работе были использованы 2236 образцов сывороток крови, в том числе, от: 435 больных различными морфологическими формами ГО яичка, находящихся на разных стадиях лечения заболевания (1920 сывороток); 15 больных различными морфологическими формами ГО яичника (27 сывороток); 12 больных негерминогенными опухолями яичка (рабдомиосаркома, лейдигома, сертолиома, липосаркома, лейомиосаркома) (53 сыворотки); 3-х больных неопухолевыми заболеваниями яичка (гидроцеле, 'неспецнфическнй пернорхпэпндемит) (3 сыворотки); 68-ми больных различными опухолевыми заболеваниями (рак простаты, рак мочевого пузыря, рак почек, рак молочной железы, рак желудка, рак толстого кишечника) (68 сывороток); 51-ой беременной женщины (55 сывороток); 17

человек, имеющих высокие титры антител к вирусу Т-клеточного лейкоза человека HTLV-1 и ранее обследованных в нашей лаборатории (17 сывороток); здоровых мужчин доноров (110 сывороток).

Ткани. Собраны образцы 15-ти герминогенных опухолей яичка, 9 образцов паренхимы, прилегающей к герминогенным опухолям яичка и 2 образца негерминогенных опухолей яичка (рабдомиосаркомы и лейдегимы). Все образцы опухолевой ткани были получены во время операции орхофуникулоэктомии. Два образца нормального яичка были собраны во время операции орхоэктомии у больных раком простаты) и 2 образца плаценты.

Клеточные линии. При проведении исследований использовали следующие клеточные линии: Sf 158 — линия клеток жирового тела бабочки Spodoptera frugipedra; Тега 1; Tera2; NT2/D1 - тератокарциномные клеточные линии.

Методы В работе были использованы следующие методы исследования: непрямая иммунофлюоресценция, иммуноблоттинг, гистологическое и иммуногистохимнческое исследование тканей, выделение РНК, электрофорез РНК, постановка RT-PCR, статистическая обработка полученных данных с помощью программы GraphPad Prism.

Результаты исследования 1. Изучение экспрессии гена env HERV-K/HTDV в. опухолевой ткани при различных морфологических формах ГО Наиболее важным направлением в изучении роли провирусов HERV-K/HTDV в этиологии и патогенезе герминогенных опухолей является исследование экспрессии генов env и cORF HERV-K/HTDV. Предполагается, что белок, кодируемый геном env, обладает иммуносупрессивными свойствами, а белок cORF проявляет трансформирующую активность. В нашу задачу входило изучение особенностей экспрессии белков Env и cORF HERV-K/HTDV в опухолевой ткани при различных морфологических

формах ГО. Для изучения транскрипции гена env HERV-K/HTDV был использован высокочувствительный метод RT-PCR. Образцы тканей герминогенных и негерминогенных опухолей яичка, а также нормальных шчек и плаценты, были тестированы на наличие мРНК env HERV-K/HTDV методом RT-PCR с праймерами Env for и Env rev. Схема праймеров 1редставлена на рисунке ]. Последовательности, комплементарные этим траймерам, присутствуют в провирусах HERV-K/HTDV как 1-го, так и 2-го гипа, и таким образом, с помощью праймеров Env for и Env rev можно обнаружить транскрипцию генов env HERV-K/HTDV обоих типов 1ровирусов. Продукт амплификации ожидаемого размера 200 нуклеотидов 5ыл обнаружен во всех образцах герминогенных опухолей, кроме зрелой и гезрелой тератомы (рис.2). мРНК гена env HERV-K/HTDV была обнаружена также в одном из двух исследованных образцов ткани нормального яичка и в обоих образцах плаценты, но отсутствовала в двух негерминогенных опухолях яичка - лейдигоме и рабдомиосаркоме. Полученные результаты ;видетельствуют о том, что ген env HERV-K/HTDV экспрессируется в слетках опухоли при всех морфологических формах ГО, кроме зрелой и ¡езрелой тератомы. Транскрипция гена env HERV-K/HTDV не обнаружена в :канях негерминогенных опухолей яичка. Ген env HERV-K/HTDV "ранскрибируется в плаценте, а также в некоторых случаях в ткани юрмального яичка.

Экспрессия гена env HERV-K/HTDV в клетках ГО чаще всего (в 61,5% шучаев) сопровождается продукцией антител к этому белку. У больных релой и незрелой тератомой повышенные титры антител к белкам фовирусов HERV-K/HTDV, по-видимому, свидетельствуют о присутствии в >рганизме больного опухолевых клеток другой морфологической формы ГО. Отсутствие антительного ответа к Env HERV-K/HTDV при транскрипции фовирусов HERV-K/HTDV в опухолевой ткани может быть обусловлено )азными причинами, в том числе, состоянием иммунной системы пациента ли наличием в последовательности провируса, экспрессирующегося

Рис. 1 Схема продуктов амплификации при использовании праймеров сОШ7 и епу

Провирус I типа

Провирус II типа

Епу Тог Епу геу

Епу 1ог Епу геу

дад ро! епу ПК

ига дад

ро!

епу

ПК

сОЯЯ Л>г сСЖР геу

сСЖгк)Г

сОИЯ геу

Праймеры сОИЯ !ог и сОЯР геу

епу 1800-1900 нп _________ ет 1900-2200 нп

сОЯР 500 нп

сОЯР 300 нп

Праймеры Епу <Ъг и Епу геу 200 нп - 200 нп

в данной опухоли различных мутаций, препятствующих синтезу полноценного белка.

2. Изучение транскрипции cORF при различных морфологических

вариантах ГО

Два типа провнрусов HERV-K/HTDV отличаются по наличию 292-х нуклеотидной делеции (1-ый тип) или ее отсутствию (2-ой тип) на границе генов pol и еп\>. Сплайсинг мРНК env HERV-K/HTDV 2-го типа приводит к образованию матрицы для белка cORF. Следовательно, при использовании праймеров, комплементарных 5'- и 3'- концам гена env HERV-K/HTDV, гомологичных для провирусов 2-х типов, мы получим отличающийся набор PCR-продуктов при транскрипции провирусов 1-го и 2-го типов (Рис.1). Если в ткани транскрибируются только провирусы 1-го типа, то результатом амплификации при использовании этих праймеров должен был быть только один продукт амплификации размером « 1,8 - 1,9 тнп, соответствующий полноразмерному гену env HERV-K/HTDV 1-го типа. Если же в ткани транскрибируются провирусы 2-го типа, и образуется мРНК cORF, то, помимо PCR-продукта, соответствующего полноразмерному гену env, должен быть получен также продукт, размером около 500 нуклеотидов. Таким образом, если в ткани обнаружена мРНК cORF, то можно утверждать, что в ткани транскрибируются провирусы HERV-K/HTDV 2-го типа. В наших исследованиях образцы тканей герминогенных и негерминогенных опухолей яичка, а также нормальной паренхимы яичек и плаценты и паренхимы, прилегающей к опухоли, были тестированы на наличие мРНК cORF методом RT-PCR со специфическими праймерами cORF for и cORF rev (Рис.3). Продукты амплификации размером около 2000 нп соответствуют транскриптам полноразмерного гена env HERV-K/HTDV. Продукты амплификации 500 нп и 300 нп были просеквенированы, и было показано, что последовательность 500-нуклеотидного продукта PCR

Рис.2 Электрофореграмма продуктов амплификации образцов семиног. опухоли эмбрионального рака при использовании праймеров Env for и Env reí

200 нп— фм»

рз 36 зр 33 36 зр 33 36 39 33 36 39 М 33 36

+RT

-RT

семинома

L

+RT -RT геномная

опухоль эмбрионального рака

М ЮОЬр маркер

33,36,39 циклы PCR

Рис.3 Электрофореграмма продуктов амплификации образцов различных тканей при использовании праймеров cORF for и cORF rev

2000 нп-500 нп 300 нп

М 133

J3 LÜ

39j 133 36 391 133

3

плацента опухоль эмбрио- паренхима яичка, паренхима нального рака прилегающая к прилегающ опухоли эмбрио- опухоли нального рака зрелой и не тератомы

М lOOkb маркер

33, 36, 39 циклы PCR

идентична последовательности, кодирующей полноразмерный с(ЖР, тогда как последовательность 300-нуклеотидного продукта амплификации представляет собой последовательность сОИР с делецией в 1-ом экзоне. Результаты исследования транскрипции сОЮ7 в тканях ГО, негерминогенных опухолей яичка, паренхиме нормального яичка и плаценты представлены в таблице 1.

Таблица 1. Обнаружение мРНК генов cORF и env HERV-K/HTDV и антител к _белку Env HERV-K/HTDV__

Ткань мРНКcORF мРНК env HERV- K/HTDV Титры антител к белку Env HERV-K/HTDV

PCR-продукт =500 нп PCR-продукт =300 нп

Семинома№1 + + + HT

Семинома №2 + + + <80

Семинома №3 + + + 160

Семинома №4 + + + 640

Семинома №5 + + + 640

Семинома №6 + + + 1280

Семинома №7 + + + 5120

Эмбриональный рак №1 + + + <80

Эмбриональный рак №2 + + + <80

Эмбриональный рак №3 + + + 160

Смешанная опухоль №1 + + + <80

Смешанная опухоль №2 + + + 160

Смешанная опухоль №3 + + + 320

Зрелая тератома №1 — — — <80

Зрелая тератома №2 — — — <80

Зрелая и незрелая тератома — — — 160

Рабдомиосаркома — — — <80

Лейдигома — — — <80

Паренхима нормального яичка №1 — — — <80

Паренхима нормального яичка №2 — + + <80

Плацента № 1 — — + HT

Плацента №2 — — + HT

Смешанные опухоли: №1- семинома, опухоль желточного мешка, зрелая и незрелая тератома; №2 - эмбриональный рак, тератома; №3 - эмбриональный рак, опухоль желточного мешка, полиэмбриома, незрелая тератома нт - не тестировано ;"+ " - позитивный результат PCR;"—" - негативный результат PCR

Из результатов, представленных в таблице 1 можно заключить, что во всех герминогенных опухолях, кроме тератомы (как зрелой, так и не зрелой), транскрибируются cORF. Из полученных данных следует, что для всех ГО, кроме тератомы, характерна экспрессия провирусов HERV-K/HTDV 2-го типа с неделетированным геном cORF. Кроме того, в клетках ГО также экспрессируются провирусы HERV-K/HTDV 2-го типа с делецированным геном cORF.

В негерминогенных опухолях яичка (рабдомиосаркоме и лейдигоме) транскрипция cORF не была обнаружена, что коррелирует с отсутствием мРНК env HERV-K/HTDV в тканях этих опухолей.

Транскрипция cORF была изучена в 2-х. образцах нормальной паренхимы яичка. В одном образце транскрипция cORF не была обнаружена, и в этом же образце не была обнаружена транскрипция гена env HERV-K/HTDV. В другом образце была обнаружена транскрипция гена env HERV-K/HTDV, а также транскрипция делетированного cORF, о чем свидетельствует 300 нп PCR - продукт реакции амплификации с праймерами cORF For и cORF Rev.

В обоих образцах плаценты 500 нп и 300 нп продукты амплификации не определялись, несмотря на то, что в обоих образцах была обнаружена транскрипция гена env HERV-K/HTDV. На основании полученных данных можно предположить, что в плаценте экспрессируются провирусы 1-го типа.

Результаты исследования транскрипции cORF в паренхиме, прилегающей к опухоли, представлены в таблице 2. Для 5-ти из 9 протестированных нами на наличие мРНК cORF образцов паренхимы, прилегающей к опухоли было проведено гистологическое исследование. Его результаты также представлены в таблице 2.

Таблица 2. Результаты тестирования мРНК сСЖГ и микроскопического исследования прилегающей к опухоли морфологически нормальной ткани яичка

Паренхима яичка, прилегающая к опухолям: РНК в паренхиме яичка, прилегающей к опухоли Наличие опухолевых клеток или клеток CIS в паренхиме яичка, прилегающей к опухоли

PCR-продукт =500 ип PCR-продукт =300 нп

Семинома №2 + + Клетки CIS

Эмбриональный рак №1 + + Мелкие очаги клеток CIS

Эмбриональный рак №2 + + Опухолевые клетки

Эмбриональный рак №3 + + Нет материала

Смешанная опухоль №1 + + Нет материала

Смешанная опухоль №3 + + Нет материала

Зрелая тератома №1 Клетки CIS и опухолевые клетки не обнаружены

Зрелая тератома №2 Клетки CIS и опухолевые клетки не обнаружены

Зрелая и незрелая тератома — + Нет материала

"+ " - позитивный результат PCR "—" - негативный результат PCR

Из результатов, представленных в таблице 2 следует, что в паренхиме, прилегающей к опухоли, уровень транскрипции провирусов ШШУ-КЛТГОУ, кодирующих делецированный cORF выше, чем уровень транскрипции провирусов, кодирующих полноразмерный сОШ7. По расчетам, провирусы, кодирующие полноразмерный с(ЖР транскрибируются лишь в 1-ой из 1001000 клеток паренхимы. Обнаружение транскриптов полноразмерного сОШ7

в паренхиме, прилегающей к опухоли, коррелировало с присутстствием в ткани либо клеток carcinoma in situ либо опухолевых клеток.

3. Транскрипция гена PLZF в опухолевой н нормальной ткани яичка

Для выяснения возможности взаимодействия белков cORF и PLZF in vivo, мы изучали транскрипцию гена PLZF при разных морфологических вариантах ГО, в паренхиме, прилегающей к опухоли и в паренхиме нормального яичка. Во всех образцах паренхимы, прилегающей к опухоли, присутствовал специфический PCR-продукт размером 300 нп. Во всех опухолевых тканях, кроме лейдигомы, не был обнаружен продукт амплификации. Таким образом, транскрипция PLZF не была обнаружена в герминогенных опухолях. По-видимому, в клетках ГО не синтезируется белок PLZF и не происходит взаимодействие между белками cORF и PLZF.

4. Скрининг сывороток на антитела к структурным белкам Gag и Env провнрусов HERV-K/HTDV

Методом непрямой иммунофлюоресценции на бакуловирусной тест-системе был проведен скрининг сывороток больных и здоровых лиц на выявление антител к структурным белкам Gag и Env провирусов HERV- K/HTDV. Вначале исследования использовали сыворотки больных ГО, находящихся на разных этапах лечения: до лечения, в начале и конце химиотерапии, а также в состоянии ремиссии. В контрольную группу с другими формами опухолевых заболеваний также отбирались больные, находящиеся на разных этапах лечения. Результаты исследования представлены в таблице 3.

Из результатов, представленных в таблице 3, можно заключить, что антитела к белкам HERV-K/HTDV при разведении сыворотки 1:80 и выше выявлялись практически только у больных герминогенными опухолями. Среди больных ГО из 449 у 236 (52,6%) были обнаружены антитела либо к одному из двух, либо к обоим структурным белкам HERV-K/HTDV.

Таблица 3. Обнаружение антител к Gag и/или Env HERV-K/HTDV у больных ГО и в различных контрольных группах

Характеристика групп обследуемых лиц Всего обследовано Число лиц, имеющих антитела к Gag и/или Env HERV-K/HTDV (%)

Больные ГО)] 449 236 (52,6%)

Негерминогенные опухоли и неопухолевые заболевания яичка 14 0

Опухолевые заболевания различного происхождения 68 1(1,5%)

Лица с высокими титрами антител к вирусу Т-клеточного лейкоза (НТЬУ-1) 19 0

Беременные женщины 51 0

Доноры (мужчины) 110 1 (0,9%)

В контрольных же группах анти HERV-K/HTDV антитела определялись только в 1,5% случаев (1 из 68 больных) в группе опухолевыми заболеваниями различного происхождения и в 0,9% случаев (1 из 110) в группе доноров крови. Задача следующего этапа исследований состояла в выяснении, при всех ли морфологических вариантах ГО продуцируются антивирусные антитела.

5. Изучение особенностей гуморального иммунного ответа к белкам Gag н Env HERV-K/HTDV при разных морфологических вариантах ГО

Для того чтобы определить особенности экспрессии белка Env и Gag HERV-K/HTDV при различных морфологических формах первичной опухоли яичка из группы больных ГО были отобраны 310 больных, у которых забор крови был осуществлен до начала химиотерапии. Эти больные были разбиты на группы по

морфологическим формам ГО, и в каждой группе были проанализированы результаты тестирования сывороток на наличие антител к структурным белкам

Из данных, представленных в таблице 4 следует, что из 310 у 209 больных ГО (67,4%) до начала химиотерапии выявлялись антитела к Gag и/или Env HERV-K/HTDV в титре 1:80 и больше. Наиболее часто антитела к белкам HERV-K/HTDV встречались у больных семиномой (77,6%), смешанной опухолью с элементами семиномы (81%) и опухолью желточного мешка (80%). Реже всего вирусспецифические антитела встречались у больных хориокарциномой (33,3%) и эмбриональным раком (43%). Однако при всех морфологических вариантах ГО развивался гуморальный иммунный ответ к белкам HERV-K/HTDV.

Таблица 4 Обнаружение антител к белкам HERV-K/HTDV при разных

Морфология Всего Общее число

первичнои опухоли обследовано серопозитивных

больных больных (%)

Семинома 76 59 (77,6%)

Смешанные опухоли с 47 38(81%)

элементами семиномы

Эмбриональный рак 21 9 (43%)

Опухоль желточного 5 4 (80%)

мешка

Хориокарцинома 6 2 (33,3%)

Тератомы зрелая и 18 12 (66,6%)

незрелая

Смешанные опухоли 115 70 (61%)

без элементов

семиномы:*

вариант 1 23 14 (60,9%)

вариант 2 26 13 (50%)

вариант 3 11 6 (54,5%)

вариант 4 55 37 (67,3%)

ГО внегонадной 22 15 (68.2%)

локализации

Всего 310 209 (67,4%)

* - вариант 1 - эмбриональный рак и опухоль желточного мешка; вариант 2 -эмбриональный рак и тератома (зрелая и/или незрелая) или полиэмбриома вариант 3 - опухоль желточного мешка и тератома (зрелая и/или незрелая]

или полиэмбриома; вариант 4 - эмбриональный рак и опухоль желточного мешка и тератома (зрелая и/или незрелая) или полиэмбриома.

6. Использование антител к структурным белкам Gag ii Env HERV-K/HTDV в качестве маркеров гсрмнпогснных опухолей

В течение 3-х лет мы проводили мониторинг больных ГО из отделения клинической фармакологии Института клинической онкологии ОНЦ РАМН на антитела к белкам Gag и Env HERV-K/HTDV. С точки зрения проводимой химиотерапии больные делились на две группы: семиномные и несеминомные. В группу семиномных больных входили больные, у которых первичная опухоль была представлена только клетками семиномы и не повышен уровень АФП. Группа несеминомных больных объединяла всех остальных больных, в том числе и тех, у которых первичная опухоль была представлена смешанной опухолью с элементами семиномы. У всех больных, за которыми мы наблюдали, был распространенный опухолевый процесс. 6.1 Корреляция между уровнем гуморального иммунного ответа к белкам HERV-K/HTDV н рапространенностыо опухолевого процесса

Нами была проанализирована частота встречаемости различных значений титров антител к белкам HERV-K/HTDV перед началом химиотерапии у больных ГО с различными прогнозами по классификации IGCCCG. Титры антител к белкам HERV-K/HTDV, выявляемые в непрямой реакции иммунофлюоресценции, отражали уровень гуморального иммунного ответа к этим антигенам. Для оценки уровней гуморального иммунного ответа нами были использованы следующие критерии: сыворотки с титрами 1:40 и меньше расценивались как негативные; титры антител 1:80 и 1:160 отражали умеренный иммунный ответ; титры антител 1:320 и выше соответствовали высокому уровню гуморального иммунного ответа. Для проведения этого исследования нами проанализированы данные от 264 больных ГО, среди которых были 203 больных несеминомными формами ГО и 61 больной семиномой. Результаты исследования представлены в таблице 5.

Таблица 5. Корреляция между уровнем гуморального иммунного ответа к белкам НЕЮ/-К/НТОУ и клиническим состоянием больных по классификации ЮСССО.

Прогноз по классификации IGCCCG Число больных Титры антител 1:40 Титры антител 1:80 и 1:160 Титры антител 1:320 и больше

Несемииомные формы ГО, всего 203 больных

Хороший 73 25 (34,2%) 20 (27,4%) 28 (38,4%)

Умеренный 63 19 (30,2%) 15(23,8%) 29 (46%)

Плохой 67 27 (40,3%) 11 (16,4%) 29 (43,3%)

Семипомы, всего 61 больной

Хороший 52 14 (26,9%) 10(19,2%) 28 (53,8%)

Умеренный 9 2 (22,2%)- 7 (77,8%)

Из данных, представленных в таблице 5, следует, что наличие и уровень гуморального иммунного ответа к белкам провирусов HERV-K/HTDV у больных ГО перед началом лечения не коррелирует с распространенностью опухолевого процесса, и зависит, вероятно, от того, кодируют ли провирусы HERV-K/HTDV, экспрессирующиеся в данной опухоли, полноценные белки Gag и Env HERV-K/HTDV, а также от состояния иммунной системы больного.

6.2. Динамика аитнтслыюго ответа к структурным белкам HERV-K/HTDV и ее корреляция с результатами лечения больных ГО

Изменение титров анти HERV-K/HTDV антител было прослежено в течение всего периода лечения у 89 больных ГО. У 50 больных титры анти HERV-K/HTDV антител не определялись к концу лечения (группа А), у 29 уменьшились, но оставались повышенными к концу лечения (группа Б). У 9 серопозитивных больных уровень антителыюго ответа к вирусным белкам оставался практически постоянным на протяжении всего лечения (группа В). Типичная динамика изменения титров антивирусных антител в каждой из этих групп больных представлена на левой диаграмме в рисунках 3 А, Б, В,. Мы сравнили результаты лечения больных в этих 3-х группах, выделенных

только по одному признаку - характеру изменения титров анти НЕЯУ-К/КГГОУ антител в процессе лечения. В пределах одной группы больные различались по морфологической форме опухоли и по степени распространенности опухолевого процесса. Однако предполагалось, что наличие гуморального иммунного ответа к белкам 11ЕПУ-КЛТГОУ отражает присутствие в организме больного ГО живых опухолевых клеток, продуцирующих соответствующие антигены, и не зависит от морфологической формы опухоли и характера проводимого лечения. Результаты лечения в этих группах различались. Так, в группе А у 41 из 50 больных (82%) после проведенного лечения произошла регрессия опухоли и только у 7, т.е. в 12% случаев, больных наблюдались неудачи терапии. Под этим термином мы объединили следующие проявления болезни: 1) рецидивы, 2) прогрессирование 3) обнаружение живых клеток злокачественной герминогенной опухоли в удаленных метастатических массах. В группе Б неудача лечения наблюдалась уже в 34,5% случаев (у 10 из 29 больных), а в группе В у всех 9 больных (100%) наблюдались рецидивы и прогрессирование заболевания. Различия между группами А, Б и В статистически достоверны (х2= 29,51; Р < 0,0001).

Аналогичные результаты были получены при исследовании корреляции между наличием живых опухолевых клеток в остаточных опухолевых массах после проведенной химиотерапии и повышенными антителами к белкам НЕ11У-КЛТГОУ. В это исследование были включены результаты наблюдений за 45 больными несеминомными формами ГО, у которых перед началом лечения определялись анти НЕЮ/-К/ШЮУ антитела и которым после химиотерапии была сделана операция по удалению остаточных опухолевых масс. Больные были разделены на 2 группы. I группа состояла из 16 больных, у которых антитела к вирусным белкам после химиотерапии не определялись. Во II группу вошли 29 больных, у которых, несмотря на проведенную химиотерапию перед операцией определялись антитела к белкам НЕЯУ-К/МТОУ.

Рис.3. Изменения титров антивирусных антител (диаграмма слева) и АФП иХГ (диаграмма справа) во время лечения у больного из группы:

А

00М2281

700

2 3 4 5 6

курсы химиотерапии

□антитела к вад НЕ^-К/НТОУ ■ антитела к Епу НЕЯУ-К/НТОУ

0042281

курсы химиотерапии

99Ш91

1400 1200 1000 800 600 400 200 0

1 2 3 4 5 6 курсы химиотерапии

□ антитела к Бад НЕ(*У-К/НТОУ Ш антитела к Епу НЕДУ-К/НТОУ

99\9991

20000

15000

5000

□АФП

■хг

1 2 3 4 5 6 курсы химиотерапии

В

9Э\7357

□ антитела к вад НЕЛУ-К/НТОУ ■ антитела к Епу НЕЯУ-К/НТОУ

курсы химиотерапии

99\7357

8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 О

х-:; ФЪ

■ш&ж

••"Йт!

¿'.-..¡¿'Чч -д.;.'»'..1

- V.!

курсы химиотерапии

□АФП ■ХГ

В первой группе ни у одного больного не было обнаружено живых опухолевых клеток в удаленных опухолевых массах. Во второй группе у 9 больных (31%) в удаленных метастазах были обнаружены живые опухолевые клетки. Между группами I и II по признаку «наличие живых опухолевых клеток в удаленных метастазах» существует достоверное статистическое различие (р=0,0153 по критерию Фишера).

Мы проанализировали также п каждой группе динамику изменения классических маркеров герминогеиных опухолей: а-фетопротенна (ЛФП) и р-хориогонадотропина (ХГ) (правые диаграммы, рис.З Л,Б,В)- В целом, характер изменений вирусспсцнфических антител коррелировал с изменениями значений АФП и ХГ. Однако в подавляющем большинстве случаев классические маркеры ГО нормализовались раньше, чем аигн НЕЯУ-К/ШТ)У антитела (Рис.З, А и Б). В некоторых случаях (Рис.З, 13) динамика антител к белкам НЕЯУ-К/НТОУ более достоверно отражала эффективность химиотерапии, чем изменения АФП и ХГ. Наконец, у 14 из 89 больных значения ЛФП и ХГ не повышались на протяжение всей болезни, и едппс!ценными серологическими маркерами ГО в этих случаях являлись антитела к ПЕ11У-К/НТЕ>У/

Таким образом, можно заключить, что повышенные титры антител отражают присутствие в организме больного ГО живых опухолевых клеток; динамика изменения титров антивирусных антител коррелирует с результатами лечения, и антитела к белкам HERV-K/HTDV могут иметь диагностическое значение и служить маркерами ГО. Выводы

1. Ген env HERV-K/HTDV транскрибируется во всех злокачественных морфологических вариантах ГО яичка, но не транскрибируются в тератомах - доброкачественных формах этих опухолей.

2. Провирусы HERV-K/HTDV, кодирующие полноразмерный белок cORF, транскрибируются только в злокачественных герминогенных опухолях яичка. В паренхиме прилегающей к опухоли, транскрипция провирусов HERV-K/HTDV, кодирующих полноразмерный белок cORF, коррелирует с присутствием клеток carcinoma in situ или опухоли.

3. В герминогенных опухолях яичка ген PLZF не транскрибируется. В клетках ГО не происходит взаимодействие между PLZF и cORF.

4. Гуморальный иммунный ответ к белкам HERV-K/HTDV у больных ГО развивался при всех морфологических вариантах первичной опухоли, включая тератому. У 209 из 310 больных ГО (67,4%) были обнаружены антитела к Gag и/или Env HERV-K/HTDV.

5. Наиболее часто антитела к белкам HERV-K/HTDV встречались у больных семиномон (77,6%), смешанной опухолью с элементами семиномы (81%) и опухолью желточного мешка (80%). Реже всего антивирусные антитела продуцировали больные хориокарциномой (33,3%) эмбриональным раком (43%)

6. Понижение титров вирусспецифических антител коррелировало с успешным лечением ГО; повышенные титры антител к белкам HERV-K/HTDV после, лечения коррелировали с неудачами лечения и

отражали наличие в организме живых клеток ГО, продуцирующих вирусные антигены.

7. Антитела к белкам HERV-K/HTDV могут быть использованы как серологические маркеры герминогенных опухолей для мониторинга больных ГО.

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации

1)Kleiman A., Senyuta N., Sauter М., Tyulandin S., Matveev В., Mueller-Lantzsch N., Guitsevitch V. Detection of HERV-K10 env-specific antibodies and respective virus proteins inpatients with germ cell tumors. J. of Acquired Immune Deficiency Syndromes and Human Retrovirology, 1999, v. 20, №4, P205.

2)Kleiman A., Senyuta N., Tyulandin S., Matveev В., Sauter M., Mueller-Lantzsch N., Garin A., Guitsevitch V. Antibodies to structural proteins of human endogenous retroviruses K10 (HERV-K10) in patients with germ cell tumor Proc. ASCO 18 absrt 251 (poster), 1999

3)Kleiman A., Senyuta N., Sauter M., Trjakin A., Karseladze A., Tjuljandin S., Vinogradova Т., Gurtsevitch V. Expression of human endogenous retrovirus-K (HERV-K) proteins in patients with germ cell tumors (ГО). International Workshop "Endogenous retroviruses and evolution of genome". (Abstracts). 1719 may, 2000, Moscow, Russia, C. 12

4)T. Vinogradova, L. Leppik, S. Akopov, L. Nikolaev, A. Kleiman, N. Senyuta, T. Gorodentseva, E. Sverdlov Probing a role of human endogenous retroviruses in genome transcriptions in cancer and normal human cells Canada, 2000

5)Tatyana V. Vinogradova, Ludmila P. Leppik, Lev G. Nikolaev, Sergey B. Akopov, Anna M. Kleiman, Natalia B. Senyuta and Eugene D. Sverdlov Solitary human endogenous retroviruses-K LTRs retain transcriptional activity in vivo, the mode of which is different in different cell types. Virology (in press).

6) A. Tryakin, A. Kleiman, S. Tjulandin, N. Senyuta, V. Gurtsevitch, A. Karseladze, A.Garin. Antibodies (AB) to structural HERV-K/HTDV proteins as predictors of alive tumour in the postchemotherapy (post-ct) residual masses of nonseminotous germ cell tumor (NSGCT) patients (PTs) Proc. ASCO, v.20, abstract 712 (poster and discussion) 2001

7) Сенюта Н.Б., Клейман A.M. В книге «Канцерогенез» Москва, Издательство «Научный мир», «Эндогенные ретровирусы», стр. 235-245

8) A.M. Клейман, Н.Б. Сешота, А.А. Трякин, Т.В. Виноградова, А.И. Карселадзе, М. Саутер, Н. Мюллер-Ланч, А.С. Тюляндин, В.Э. Гурцевич Экспрессия эндогенных ретровирусов человека семейства HERV-K/HTDV у больных герминогенными опухолями яичка. Вопросы вирусологии, 2001, т.6, стр 17-23

Участок множительной техники POHII им. Н.Н. Блохина РАМН

Заказ 401 Тираж 100 экз.

В геномах всех позвоночных животных присутствуют эндогенные ретровирусы (Endogenous Retroviruses - ERVs). Предполагается, что ERVs являются потомками экзогенных ретровирусов, инфицировавших клетки зародышевого пути предков современных животных миллионы лет назад и с тех пор закрепившихся в геноме. До 8% ДНК человека приходится на долю эндогенных ретровирусов человека (Human Endogenous Retroviruses - HERVs) (2). Большинство провирусов HERVs из-за многочисленных мутаций дефектны и не имеют открытых рамок считывания для вирусных белков (8). В нормальных тканях человека HERVs не транскрибируются или транскрипция осуществляется на низком уровне. В то же время в плаценте многие HERVs интенсивно транскрибируются, происходит синтез белков и сборка вирусных частиц, что дало основания предположить, что белки, кодируемые HERVs необходимы для образования и нормального функционирования плаценты (4,8,10).

О биологическом значении HERVs достоверно известно немного. Предполагается, что помимо участия в эмбриональном развитии и образовании плаценты (4, 10). HERVs играют роль в развитии аутоиммунных и опухолевых процессов (6, 8). Существуют экспериментальные данные, подтверждающие, что HERVs принимают участие в регуляции экспрессии клеточных генов и модулируют иммунный ответ. В настоящее время интенсивно изучается ассоциация между экспрессией HERVs и некоторыми заболеваниями человека.

Провирусы из семейства HERV-K/HTDV (Human Teratocarcinoma Derived Viruses) обладают наибольшей биологической активностью среди HERVs. Они кодируют полноценные структурные вирусные белки и функционально активные ферменты (32, 87, 88, 89, 94,102,105). В геноме присутствует два типа провирусов HERV-K/HTDV, различающихся по наличию (первый тип) или отсутствию (второй тип) 292-х нуклеотидной делеции на границе генов pol-env (80). Геномная мРНК провирусов HERV-K/HTDV 2-го типа сплайсируется, давая несколько субгеномных мРНК (83). В результате сплайсинга env мРНК образуется матрица для небольшого белка cORF (central open reading frame), который является регулятором сплайсинга полноразмерной мРНК провируса и участвует в транспорте несплайсированных мРНК из ядра в цитоплазму (83, 85, 107, 110). мРНК провирусов HERV-K/HTDV 1-го типа из-за делеции и потери акцепторного сайта сплайсинга не может сплайсироваться дважды, и провирусы HERV-K/HTDV 1-го типа не кодируют cORF (83). Недавно было показано, что cORF обладает трансформирующими свойствами и определен один из клеточных белков -мишеней, с которым взаимодействует cORF. Им оказался PLZF - клеточный регулятор транскрипции, участвующий в регуляции развития гонад у плода и контролирующий процесс сперматогенеза. (109,148).

Получены данные о строгой ассоциации экспрессии провирусов семейства HERV-K/HTDV в герминогенных опухолях подростков и взрослых (ГО). Показано, что в опухолевой ткани и в клетках carcinoma in situ (CIS) синтезируется мРНК gag и env HERV-K/HTDV и продуцируется белок Gag HERV-K/HTDV (111, 115, 123, 124). В клеточных линиях, полученных из герминогенных опухолей, синтезируются вирусные белки, и образуются вирусные частицы (5, 84, 103, 104, 117, 118). У больных ГО в значительном проценте случаев (от 62,5% до 70%) образуются антитела к структурным белкам HERV-K/HTDV (44, 98). Все эти данные указывают на возможное участие провирусов HERV-K/HTDV в возникновении и развитии ГО. A.Boese et al. была предложена гипотеза, согласно которой взаимодействие cORF и PLZF играет важную роль в этиопатогенезе герминогенных опухолей (109).

Актуальность проблемы. Среди онкологических заболеваний мужчин герминогенные опухоли являются сравнительно редкими и составляют всего 1-2% от всех опухолевых заболеваний мужчин. Анализ заболеваемости ГО в разных возрастных группах показывает, что герминогенными опухолями болеют в основном молодые мужчины в возрасте от пятнадцати до пятидесяти лет, и пик заболеваемости приходится на 20-25 и 35 лет в зависимости от морфологического варианта заболевания. Уровень заболеваемости ГО в последнее время медленно, но неуклонно повышается, особенно в развитых странах, в связи с чем изучение этиологии и патогенеза герминогенных опулолей, а также поиск маркеров, позволяющих обнаружить опухоль на ранних стадиях заболевания, является важной и актуальной задачей. С другой стороны, изучение экспрессии эндогенных ретровирусов человека семейства HERV-K/HTDV в герминогенных опухолях подростков и взрослых может внести определенный вклад в фундаментальные исследования роли HERVs в канцерогенезе.

К началу наших исследований было известно об активации экспрессии провирусов НЕКУ-КЖГОУ в клетках герминогенных опухолей. Тем не менее, некоторые важные вопросы оставались неизученными. Так, например, не было известно, с каким из двух типов провирусов НЕЯУ-К/НТОУ ассоциировано развитие ГО. Еще одним важным направлением в изучении роли провирусов НЕКУ-К/НТЕ)У в возникновении и развитии ГО является исследование экспрессии генов ет и сОШ7 НЕЯУ-К/НТОУ, так как предполагается, что Епу, обладает иммуносупрессивными свойствами, а белок сОШ7 имеет трансформирующую активность. Однако экспрессия сОШ7 в клетках ГО не была изучена совсем, а транскрипция гена ет НЕКУ-К/НТЮУ изучалась методом гибридизации т ей!, чувствительность которого недостаточна для выявления низкопредставленных транскриптов. Поэтому данные об отсутствии транскрипции ет при определенных морфологических вариантах ГО нуждались в подтверждении более чувствительным методом.

Предположение о том, что антитела к белкам провирусов НЕ11У-К/ШТ)У можно использовать как серологические маркеры ГО, неоднократно обсуждалось в литературе (32, 89, 100, 103). Однако до настоящего времени работы по изучению динамики титров антител у больных ГО, ее корреляции с другими проявлениями болезни и результатами лечения не проводились. Вопрос о том, какие морфологические варианты ГО сопровождаются гуморальным иммунным ответом к белкам НЕКУ-К/НТБУ, также оставался открытым.

Таким образом, исследования экспрессии генов ет и сОКР провирусов НЕЯУ-К/НТОУ при различных морфологических вариантах ГО, а также изучение антительного ответа на белки провирусов НЕИУ-К/НТОУ по-прежнему остаются актуальными.

Целью работы Целью настоящей работы было изучение экспрессии провирусов НЕЛУ-К/НТОУ при различных морфологических вариантах ГО и проверка гипотезы о взаимодействии белков сОЮ7 и в клетках герминогенных опухолей. Кроме того, целью работы было изучение гуморального иммунного ответа к белкам НЕЛУ-К/НТОУ при различных морфологических вариантах ГО и возможности использования вирусспецифических антител как серологических маркеров ГО.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1) Изучить экспрессию гена env HERV-K/HTDV при различных морфологических вариантах ГО;

2) Изучить экспрессию cORF HERV-K/HTDV при различных морфологических вариантах ГО;

3) Изучить экспрессию PLZF при различных морфологических вариантах ГО;

4) Исследовать гуморальный иммунный ответ к белкам провирусов HERV-K/HTDV при различных морфологических вариантах ГО;

5) Проанализировать возможность использования вирусспецифических антител как серологических маркеров ГО.

Научная новизна. Высокочувствительным методом RT-PCR было показано, что env HERV-K/HTDV транскрибируется во всех злокачественных морфологических формах ГО яичка, но не транскрибируются в зрелой и незрелой тератомах. Кроме того, показано, что env HERV-K/HTDV транскрибируется в нормальной паренхиме яичка и плаценте.

При изучении транскрипции cORF впервые показано, что мРНК полноразмерного cORF обнаруживается только в образцах герминогенных опухолей, но отсутствует в образцах паренхимы здорового яичка. В паренхиме яичка, прилегающей к опухоли, обнаружение мРНК белка cORF коррелирует с присутствием в ткани либо клеток опухоли, либо клеток carcinoma in situ (CIS).

Впервые изучена транскрипция гена PLZF при различных морфологических формах герминогенных опухолей и показано, что PLZF не транскрибируется в герминогенных опухолях яичка. Следовательно, в клетках ГО не может происходить взаимодействие между белками cORF и PLZF.

При изучении гуморального иммунного ответа к белкам Gag и/или Env HERV-K/HTDV из 310 у 209 (67,4%) больных ГО были обнаружены антитела к Gag и/или Env HERV-K/HTDV. При этом впервые было установлено, что гуморальный иммунный ответ к белкам HERV-K/HTDV у больных ГО развивается при всех морфологических вариантах первичной опухоли. В случае, когда первичная опухоль представлена только элементами зрелой и/или незрелой тератомы, присутствие антител к вирусным белкам свидетельствует, скорее всего, о том, что в метастазах у этого больного присутствуют клетки злокачественной формы ГО, которые и продуцируют вирусные антигены.

Впервые показано, что наиболее часто антитела к белкам НЕЯУ-К/НТОУ встречаются у больных семиномой (77,6%), смешанной опухолью с элементами семиномы (81%) и опухолью желточного мешка (80%). Реже всего антивирусные антитела встречались у больных хориокарциномой (33,3%) и эмбриональным раком (43%).

При изучении динамики изменения антительного ответа к белкам НЕЯУ-К/НТОУ и ее корреляции с результатами лечения было впервые показано: у большинства серопозитивных больных происходит снижение значений титров антивирусных антител в ходе проводимого лечения, что коррелирует с улучшением состояния больного и регрессией опухоли; повышенные титры антител к белкам НЕЯУ-К/НТОУ отражают присутствие в организме больного клеток ГО, продуцирующих вирусные антигены.

Практическая ценность. Впервые на большом клиническом материале было показано, что повышенные титры антител к белкам провирусов НЕЯУ-К/НТБУ после окончания химиотерапевтического лечения статистически достоверно коррелируют с обнаружением живых опухолевых клеток ГО, прогрессированием заболевания и возникновением рецидивов. Исходя из этих данных, было сделано заключение, что антитела к белкам НЕЛУ-К/НТОУ отражают наличие в организме больного живых опухолевых клеток, и могут быть использованы как серологические маркеры для мониторинга больных ГО подростков и взрослых.

Выводы

1. Ген env HERV-K/HTDV транскрибируется во всех злокачественных морфологических вариантах ГО яичка, но не транскрибируются в тератомах - доброкачественных формах этих опухолей.

2. Провирусы HERV-K/HTDV, кодирующие полноразмерный белок cORF, транскрибируются только в злокачественных герминогенных опухолях яичка. В паренхиме прилегающей к опухоли, транскрипция провирусов HERV-K/HTDV, кодирующих полноразмерный белок cORF, коррелирует с присутствием клеток carcinoma in situ или опухоли.

3. В герминогенных опухолях яичка ген PLZF не транскрибируется. В клетках ГО не происходит взаимодействие между PLZF и cORF.

4. Гуморальный иммунный ответ к белкам HERV-K/HTDV у больных ГО развивался при всех морфологических вариантах первичной опухоли, включая тератому. У 209 из 310 больных ГО (67,4%) были обнаружены антитела к Gag и/или Env HERV-K/HTDV.

5. Наиболее часто антитела к белкам HERV-K/HTDV встречались у больных семиномой (77,6%), смешанной опухолью с элементами семиномы (81%) и опухолью желточного мешка (80%). Реже всего антивирусные антитела продуцировали больные хориокарциномой (33,3%) эмбриональным раком (43%)

6. Понижение титров вирусспецифических антител коррелировало с успешным лечением ГО; повышенные титры антител к белкам НЕЯУ-КЛТГОУ после лечения коррелировали с неудачами лечения и отражали наличие в организме живых клеток ГО, продуцирующих вирусные антигены.

7. Антитела к белкам НЕЯУ-К/НТОУ могут быть использованы как серологические маркеры герминогенных опухолей для мониторинга больных ГО.