Автореферат и диссертация по медицине (14.00.11) на тему:Антипсориатическое действие блокаторов кальциевых каналов в культуре клеток кожи человека

РГб од

На правах рукописи

ПАРФЕНОВА Марина Юрьевна

АНТИПСОРИАТИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ БЛОКАТОРОВ КАЛЬЦИЕВЫХ КАНАЛОВ В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК КОЖИ ЧЕЛОВЕКА

14.00.11 — кожные и венерические болезни

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва — 1997

Работа выполнена в Центральном научнс-исследовательском кожно-венерологическом институте Министерства здравоохранения и медицинской промышленности РФ.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, проф. В. А. Самсонов, кандидат биологических наук А. В. Васильев.

Научный консультант: доктор медицинских наук, проф. Г. М. Цветкова.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, проф. В. Н. Мордовцев, кандидат биологических наук Т. Б. Крохина.

Ведущая организация:

Российский Университет Дружбы Народов.

сертационного совета Д-074.10.01 Центрального научно-исследовательского кожно-венерологического института Министерства здравоохранения и медицинской промышленности РФ. (107076, Москва, ул. Короленко, 3).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

Защита состоится

заседании дис-

цкви МЗМП РФ.

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета! кандидат медицинских наук

Н. К. Иванова

Оошпя лгпрлк~г^ристик*я работы.

Лклуп чьпогль проблемы: В структуре кожной патологии одно га первых мест занимает псориаз. Изучению патогенеза и разработке новых методов терагаш заболевания посвящены работы Ю.К. Скрзппзшаи сооавторов (1971), В.Н. Мордовцева (1987), А.Л. Маш-юпдспсона п соавт. (1979) и др.

Нарушение процесса кератинизацин н дифференцировал клеток эпидермиса в основном определяет структуру и функцию цшоскелеха клеток при псориазе. Эга важная часть патологического процесса является его видимым клиническим проявлением (De Mare S., De Jong Е., Van P F I. et al. !990).

Патологическая реакция эпидермиса обусловлена совокупностью зга крайней мере игсксльтлх фаг-лоров: стимуляцией глепл, срывом регуяятортшх механизмов, контролнрзтощнх пролиферацию п днфферекцнроЕку клеток эпидермиса, а 1зкже воспалительными изменениями в коже.

В соответствии с современной паюшшшческой моделью псориаза, подавление пролифератпг эпнтедтюпптов можно рассматривать гак основное направление терапевтического воздействия (Мордовцев В.Н., Мушет Г .В., Альбанова В.И., 1991). Согласно современным представлениям, процессы клето-ягой пролиферации и дпффе-ретшпровЕИ регулируется в основном большой траттой генов называемых прохооикотенами.

Адекватный анализ механизмов патологических процессов при этом заболевании возможен практически только на клеючно-молекулжрном уровне (Терских В В.. Васильев A.B. 1993). Поэтом}' вполне оправдано изучение механизмов этих нарушений с целью воздействие на эти процессы медикаментозных средств, нормализующих дифферепцнровку и иролиферзцию эгаиелиоцитов.

Культлвпрэвакиг клеток кожи, конструирование в культуре i истолошческой структуры эпидермиса, модели ж im его эквивалента кожи позволяет создать систему поиска н анализа веществ и соединений. влияющих на эш процессы (Скршшш Ю.К. Куоаноеа А А. 199-J.i

Человеческие эгтндермалъные кератинощтш могут расти к культуре, формируя многослойные клеточные пласты (.Rhemwald J D„ Gicen. H. 1975). Кераптецпты в кулыуре остаются не1рапсформиро-вангалмн л сохраняют способность к даффермщиащш и морфогенезу.

В настоящее время обнаружены унш:едсашше исрсДш iiù-jî сигналов от мембраны в цитоплазму. Среди перечисленных факторов особое место занимают ионы катгыгия, кате зтогверезльные медиаторы, регз'тшрз-ющне иноше биошшгчеекке реакции е клетках.

Известно, что содержание кальция в среде оказывает непосред-ствегагое влияние на пролиферацию клеток в культуре. Было показано, что изменения в содержании внугрихлегочяого калыщя ьлкякл на регуляцию мигоитческой активноеш клешт. Кальциевая проводимость мембран клеток обеспечивается важнейштш белковыми системами плазматической мембраны (Cmsaîegui F.H 1993). Spereiakis N. в 1995 год)' приводит примеры нескольких типов клеток которые обладают чувстшельностыо к антагонистам кальциевых каналов. Это мышечные клетки сосудов, сердечной мышцы. скелетных мышц, нейронов, секреторных клеток. По сообщениям Grande S.A., Horion R.H., Manro I.H. в 1996 году такие белковые системы, формирующие, так называемые кальциевые каналы, присутствуют и на керашноци-тах.

В 1990 году De Maie S., De Jong E. отметали значительное увеличение преципитатов кальция, содержащихся внутри кепатиноцитов эпидермиса псориатнческой бляшки, а нарушение кальциевого распределения в клетках может приводить изменению в программе дифференцирован керапшощгхов псориалиеской бляшки.

Кальциевые каналы проявляют сродсгео к антзгогактам кальциевых каналов во время стабилизации клеточной мембраны. Таким образом они могут влиять на содержание внеклеточного кашылтя. В свою очередь появление и внедрение е клиническую практику антагонистов кальция стимулировало изучение калътщеЕого гомеостаза в организме.

История изучения антагонистов кальция началась более 30 лет назад е 1962 года, когда в лаборатории западно-германской фирмы «KNOLL» был создан ьерапашт - новый препарат, ¡шлякшлшея лро-юводным папаверина. Долгое время ею считали сиецифнч,.-» к»; л бе-та-адреноблокатором, и шшь в конце 60-х годов было установлено, •что действие веранаьшла, обладающего сосудорасширяющей :шив-ностью, объясняется именно угнетением трансмембрянного тока кальция. Позднее быта созданы и друпге антагонисты кальция - нн-федигаш, дплгиазеы, форидоп, Bay К.

Сравнительно новой является область лсследсвашш, в которую входит создание препаратов, применяющихся в дерматологи;; для ле-чення гиперпрояиферапшных заболеваний кожи, и в частнос/л, возможного применения их при псориазе. Представкется возможным

использование эшх иреиараюв с целью воздействия на отельные патогенетические механизмы при псориазе. что является одной in нерешенных задач в отношении терапии больных псориазом

Цель работы: Оценить влияние блокаторов кальциевых каналов на пролиферацию и дифферетщировку фпбробластов и кератгаюцн-юп нормальной кожи -человека. Определить возможность прлмспе-ння эгах веществ в качестве антипеориашческих препаратов.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Провести выделение зиидермальных щшинощпов человека. Разработать модель регенерации эпидермиса в культуре клеток.

2. Изз'чить влияние блокаторов и активаторов кальциевых каналов (зерапампла, форндоиа, Bay К) иа пролифератгазиые характеристики эмбриональных фибробяасгов и эиидермаяъых керашноцпюв человека. Выявить дозированный эффект выше указанных препаратов на степень пролиферации клеток в культуре.

3. Предложить и апробировать лекарственную ферму с учетом содержания в ней препарата с выявленной максимальной и минимальной действующей концентрации препарата на лабораторных животных. Определить раздражающие и аллерпшгрующпе, возможно патогенетическое воздействие этой лекарственной формы на стрзктуру кожи морских свинок.

4. ПроЕестн клиническое испытание разработанной лекарственной формы на доброЕольцах-больиых с ограниченными формами псориаза.

5. Провести морфолопртескне исследования кожи (до и после проведенною наружного лечения) у больных псориазом.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

В культуре клеток доказано ишнопрующее елняшк блокаторов кальциевых каналов на пролнферадшо эмбриональных фиоробластов и эпидермальных кератнноцитов человека. Выявлен дозозэекснмъш характер ннгабнрования пролиферации клеток ¿локаторами кальциевых каналов.

В эксперименте на животных показано отсутствие раздражающего и сенсибилизирующего действия в известной концентрации ве-рзпэмнловон мазн, а также агливащш отдельных звеньев метаболических процессов, протекающих в эпидермисе, связанных с процессами кератиннзации н днфференцировки клеток, что делает обоснованным дальнейшее ее изучение на добровольцах, больных с локализованными формами псориаза. Предварительные результаты зпробащш вера-пашловон мази свидетельствуют о целесообразности создания новой лекарственной формы.

Результаты работы Изучено Ешшше блокаторов кальциевых каналов на степень пролиферации клеток кожи в культуре. Предложена к дальнейшему изучению верапамиловая мазь, кзк перспективная лекарстеннал форма.

Апробация работы Основные положения диссертационной работы доложены на научно-практической конференции в ЦКБИ Минздрава России совместно с кафедрой кожных болезней РГМУ 2.02.96. На 7 Российском съезде дершхологов и Еенерологов в Казашт 1996 год.

Оиьсм и структура работы Диссертация изложена да ЮР страницах машинохшского текста, состоит из введения, обзора литературы, собственных псследовагаш, закшоченил, выводов, указателя литературы (33 отечественных и 51 зарубежного источников). В работе приведено б трафиков, 8 рисунков, 3 таблицы.

Содержание работы Материалы и методы исследований Работа по культивированию плеток кожи проводилась в Институте биолопш развития им. Н.К. Кольцова РАН, в лаборатории проблем клеточной пролиферации под руководством доктора биол. наук В В. Терских.

Кулынвироваше эпидермальных кератиноцитов и эмбриональных фибробластов кожи человека проводилось по методу. разработанному в 1975 году Rheinwald J.D.. Green. Н.. Первоначально проводили выделение эмбриональных фибробластов кожи человека. Для получеши: фибробластов использовали аборпшиьш материал.

Биоптаты кожи брали у пациентов в ходе хпрурпгоеспгх операций в стерильных условиях операционной с помощью электродерма-тома. Лоскуты колеи хранили в стеклянных сосудах со стерильным раствором Хегасса, содержащим 500 ед/мл пенициллина и 0,25 ьп/мл стрептоьшщша. Приготовление клеточной суспензии осуществляли но обш.епршшой схеме. Дачес клетчкую суспензию вносили в кулъ-туралыгые флаконы по 3-5 гас. гяеток'ыл и выращивает при темпера-iype 37 тр.С. После шшубащш фрагментов кожи проводили механическое отделение дермы ох эпидерьшеа по линии базатыгой плаепш-

кн. Культивирование клеток кожи проводилось в 24-х луночных плато при 37 гр.С в атмосфере 5% СО*2 и насыщенной влажности. Для выращивания фибробластоЕ использовалась среда игла, для выращивания эгшдермалышх керапшощпоЕ человека использовалась среда ДМЭМФ12 (1:1). Для отделения сулрабазальных эпндермальных слоев использовалась среда 199 без ионов кальция и сыворошг. С целью определения оценки интенсивности включения ЗН-тиындина в структуру ДНК клеток, в лунки на плато вносили ЗН-пьшдшг 1.0 МККн/ыл (36,7 Ки/моль). Оценку инициации пролифератиЕНЫх процессов в 6а-зальных кератинотгтах и эмбриональных фибробластах человека осуществляли по интенсивности включения ЗН-тимидпна в структуру ДНК клеток по системе С.Р.М

В рабоге использовали эмбриональную телячью сыворохку малого предприятия «Биолог», пуиоЕНшую сыворотку человека кооператива «Наследственность и лаборатория». В качестве добавок ис-пользоезлп Эпидермаяьный фактор роста, антибиотики: генкмшппг, стрептомицин и пенициллин отечественного производства.

Для выявления е эксперименте гяперчувсгентельности кожи к ЕераиамилоЕой мази использовались методические рекомендации, составленные Е.А. Иевлевой, C.B. Суворовым и В.И. Чернышовой, которые одобрении Ученым Советом ЦКВИ МЗ СССР (1976).

Изготовление гистологических препаратов для сестовой микроскопии осуществлялись по стандартной методике, с предварительным изготовлением парафиновых блокоБ. Окраска гистологических срезов проводилась гематоксилином и эозином.

Результаты исследовании н их обсуждение

Проведение работы по формированию культур кераттшоцитоЕ и фибробласшоЕ показало, что пролиферация кератнноцнюв ciporo зависит от наличия жесткой подложки Быстрее и лучше пргаорепля-ются к подложке базалыше кератиноциты, не экспрессирующие ш-волюкр1ш. Oiui пргасрепляются и распластываются уже за б часов, тогда как кошпироЕагоше к дифференциация ннЕолюкртгн-положителыше клетки слабо распластываются даже к 8 часам.

В момент прикрепления керапшоциты активно слягезир^тот фибронетагат, который знашпелыто улз'чшает их прикрепление и распластывание. Malcovati М., Tendiini М. (1991) нзучтшт характер распластывания кератпноцитов человека в среде без сыворотки и показали, что с увеличением плотности посева прикрепление кератнноци-ЮЕ не меняется, но фракция распластывающихся клеток увеличивается. АЕЮры полагают, что существует деа типа кераишоцшов: кла-стерогенные, доля которых не меняется, к агтрегирующне, которые способны собираться вокруг кластерогенных клеток и число которых увеличивается при увеличила! плотности посадки. Из общего числа посеянных зпидермоцитоЕ лишь небольшая часть клеток способна прикрепляться к подложке, но еще меньшее их число дает начало колониям кератиноцигов. Bananeton Y., Green Н. (1985) считают, что менее 10% посеянных клеюк способны давать начато колония гл. Если учесть, что е базальноы слое находится около 30% от общего числа клеток эпидермиса то очевидно, что не все базатъные клепси способны инициировав пролиферацию и формировать колонии. Barrandon Y., Green Н. (1985), кроме того, показали, что способностью образовывать колонии обладают те клетки, диаметр которых не превышает

И мкм. Более крупные клен;и уже неоорапшо комшироьаны к дифференциации н продолжают увеличиваться е размерах. Наибольшей клоногенной способностью обладают самые мелше ioiemi, которые, еозможно, представляют собой стволовые кераишоцшы. Важно подчеркнуть. Что к подложке нрнкрепляются преимущественно о u.ut. ные клетки, сохраняющие высокий пролифератнвюлй по гена,кал и дающие затем начало культурам кератиноцитов (Stanley J.R. 1980). ПрнкрепнЕшиеся кератхшощггы начинают активно двигаться, е результате миграции они агрегируют по 4-6 клеток, но образовавшиеся кластеры не яеляюгся результатом образования клонов.

При дальнейшем изучении процесса формирователя колоний Barrandon Y., Green Н. (1987) выделили три ища кераппнщнгов и со-отвегстЕенно три типа колоний, которые дают начало клонам. Первый тип колоний получил название голоклоиое. Клетки таких клонов имеют максимальную способность к пролиферации

Параклоны содержат клетки с низом реплпкатнЕньш потен-щ1алом (не более 15 генераций), после чего они синхронно переходят к дифференциации.

Мероклоны содержат смесь клеток с различным нролнферашв-ньш потенциалом и представляют собой переходный этап между то-локлонами и параклонамн.

Колонии керапшощиов растут за счет увеличения перефертгче-ских зон н миграции краевых клеток. В течении первые 10-12 дней роста культуры обнаруживается очень активная миграция колоний (Васильев A.B. 1993). Со Бременем отдельные колонии сливаются с образованием сплошных пластоЕ. Уже в сравнительно небольших колониях центральные участки оказываются многослойнышт в резуль-

тате ioio. что одновременно с пролиферацией керапшощпов пропс -хоцти процесс их дифференциации и стратификации

Влияние исследуемых препаратов оцехпшачтс в кулызре элп-дерматьных кераттшоцнтов и фибропластов кожи человека. Положительным кошролем служили клетки, растущие в среде, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, а за отрицательный контроль пр1шлм?лл клетки, шткуонровашше в безсывороточной среде. В качестве дейсиптощих вещеста использовали верапамил, форидон. Вау К. Ретулыаш показали, что вераиамил в концеигравин ¡0"'-6|\1оль иракишески не ишлбпрог.ач синтез ДНК в фнброблпстах. Вераиамил г, концентрации 10*-5Моль иктибировач пролиферацию фибробластов на 83,4%. Верапг&шл в концентрации 10*-бМоль не ин-шбировал синтез Д1Ж в кераышощпах, а в концентрации 10*-5Моль интибировал пролиферацию кераптноцитов на 32%.

График 1

Влияние верапамила на синтез ДНК в культуре фибробластов кожи человека

Концентрация вещества

И

График 2

Влияние верапамиш на синтез ДНК базальными кератиноцитами в системе регенерации in vitro

Концентрация вещества

Форндон в концентрации 10*-<>Молъ также не влиял на синтез ДНК фибродастаьш кожи человека Однако в кониентрзцзп! КИ-5Моль форндон штгибировал cranes ДНК в фнброластз;; кожи: человека на 65%.

Форндон в кокцентрацшт 10:1:-6Моль не имитировал пролиферацию эгшдерм'олъных керапшоцтов человека, а в концетрацни 10*-5Моль ннгнбироват синтез Д1Ж в кератшоцшах па 31?о но срап нению с положительным контролем.

График 3.

Влияние форидона на синтез ДНК в культуре фибробластов кожи человека

С рт

Концентрация вещества

График 4.

Влияние форидона на синтез ДНК базальными кератиноцитами в системе регенерации эпидермиса in vitro

Концентрация вещества

Актгшагор кальциевых каналов Bay К также ингибировал синтез ДНК е клетках только в концентрации 10*-5Моль. йгаибнрование досыпало 60% от контрольных значении в культуре эмбриональных фнбробласюв человека и 70% в системе регенерации эпидермиса.

График 5.

Влияние Bay К на синтез ДНК в культуре фибробпастов кожи человека

Концентрация вещества

График б.

Влияние Bay К на синтез ДНК базальными кератиноцитами в системе регенерации эпидермиса in vitro

Концентрация вещества

14

Таким образом, экспериментально доказана способность антагонистов калыгнеЕых каналов дозозависнмо ингибнрОЕагь пролиферацию фибробластов и керапшощпов кожи человека. Показало, что концентрация 10*-5Моль является эффективно угнетающей синтез ДНК в кле'гках кожи.

На базе результатов, полученных в культуре клеток, предложена вералашшоЕая мазь с обоснованной концентрацией активного вещества - верзпамила, как обладающего наиболее выраженной гатгпбп-рутощей способностью.

Активатор кальциевых каналов Bay К также обладает значительной интибирующей активностью, но в настоящее время он не разрежен к применению в практической медицине е Россшг.

Экспериментальное изучение наружной лекарственной формы с целью определения раздражающего, аллергнзирующего и еозыожно патогенетического воздействия было проведено на 5 группах морских свинок (50 особей).

Бо время проведения эксперимента нами использовались методические рекомендации, составленные Е.А. Иевлевой, C.B. Суворовым и В.И. ЧернышоЕой, которые были одобрении Ученым Советом ЦКВИМЗ СССР (1976).

С у^тетом выявленной нами минимальной концентрации Еерапамила (10'г:-5Моль), оказывающей шппбирующее влияние напроли-ферацию клеток, в .эксперименте бьшо изучено воздействие этого вещества на структуру кожи морских свинок в ряде возрастающих концентраций 10*-5Моль, 10*-4Моль, 10*-ЗМоль, 10*-2Моль.

По нашему представлению, необходимость исследования активного вещества е ряде возрасгакшпЕХ концентраций диктуется на-

15

лнчием биологического барьера, который и определяет сама сложная структур а ко жи. Рог овой слой, значительное количество десмосом-ных связен мальпигиева слоя затрудняют проникновение активного вещества е базалытый слой эпидермиса

Для проведения оценки елияния испытуемого лекарственного средства на кожу экспериментальных животных использовался метод ежедневных аппликаций е течении 28 дней. После 14 дней ежедневного нанесения препарата на кожу правого бока морских свинок проЕо-дилась оценка раздражающего действия. Далее присоединяли нанесение мази на кожу левого бока После окончания эксперимента (28 дней) было также проведено изучение состояния кожного покрова в местах нанесения мази. Отсутствие клшшческпх изменений в месте аппликаций после ежедневного нанесения препарата позволяет считать, что последний е изучаемых концентрациях не оказывал на кожу морских свинок раздражающего и аллергизирующего действия, что выражалось в ощгсшт изменения цвета кожи, отсутствии шсл)-ше-ния, образования корок, задержит роста и разряжения волосяного покрова. Для сравнительной характеристики проведена оценка воздействия препарата на состояние морфологических структур кожи экспериментальных животных, а также контрольных животных.

При обработке кожи морских свинок мазью с концентрацией верапамтша 10*-5Моль е мазевой рскоЕе были выявлены следующие морфологические изменения: утолщение малыпштевого слоя за сч?1 увеличения рядности зернистого слоя без особых шмеиешй -в шшю-Еатом слое. Отмечалось незначительное расширение ус1ьен волосяных фоллткулов. Б дерме пролиферация тистиоцнюе и фибробла-стов, выраженная вблизи волосяных фолликулов. Морфологические

1Й

гоменеиия в коже лсеого бока згой серил животных были аналопгч-ными тзтсоеыы в коже правого бока.

В бноптатах кожи морских свинок, после апллкацпй мази с. концентрацией вераизмпла 10*-4Мояь, изменения кожи были сходны с изменениями, описанными выше, хотя местами отмечалось утолиге-ние мзлышпгева слоя, преимущественно вблизи волосяных фолликулов.

Гистологические изменения в бноптатах кожи морских свтпюк после аппликаций мази с концентрацией действующего вещества 10*-ЗМоль характеризовались неравномерным утолщением эпидермиса вблизи еолосяных фолликулов и гиперкератозом. Отмечалось утолщение зертшстого слоя до 3-4 рядов. Что еозможио называет на активацию процессов кератинизации. Местами отмечено увеличение сальных желез в объеме.

В бноптатах кожи морских свинок, которым наносили аплшса-щп1 с концентрацией действующего вещества Е мази 10*-2Моль, наблюдались следующие признаки: утолщение зернистого слоя до 3-4 рядов, пшеркератоз. В дерме слабая пролиферация гистиоцитов и фибробластов.

Таким образом, е эксперименте на морских свинках клинически не было ЕЫЯЕлено раздражающего и аллергизнрующего действия ве-рапамиловой мази, что было подтверждено и при гистологическом исследовании. Однако отмечена акшБация отдельных звеньев метаболических процессов, протекающих в эпидермисе, связанных с нормализацией процессов кератинизации и дифференцироЕки кератино-цитов, что делает обоснованным дальнейшее ее изучение на добровольцах больных с локализованными формами псориаза.

Под наблюдением находились 15 пациентов с ограниченными проявлениям псориаза в области локтеЕых, коленных суставов, единичными бляшками на туловище. Из них 9 мужчзш и б женщин. Возраст падпенюЕ составлял от 21 до 47 лег. У Есех больных консташ-рован вульгарный псориаз в стационарной стадии. В очагах отмечалось отмеренная инфильтрация на поверхности бляшек, шелушение.

Больные е прошлом лечились кате амбз'латорно, таге и е условиях стационара. Получзли разнообразное лечение, б том числе внтаыи-ны, десенсибилизирующие и детоксицнрующие средства, иреформи-рованные физические фат лоры, различную мазевую терапию (серно-сашщиловую, дегсян)то, нафталанов)то и др.).

До проведения изучения эффективности ЕерапамшгоЕОЙ мази у 9 пациенюв с очагов поражения на спине были езяты биоптаты кожи. У Есех больных были выявлены морфологические признаки, патогно-моничные для псориаза.

В качестве наружного средства применялась Еерапамнловая мазь, содержащая е качестве активного начала Еерапамил е концентрации 10*-2Моль, 10*-ЗМоль, что соответствовало концентрации 0,1%.

Болыше были подобраны таким образом, что один очаг поражения смазыЕался ЕерапамилоЕой мазью, другой, аналогичный очаг -чистой мазевой основой. Длительность лечения составляла от 2-х до 4-х недель

/

В результате проведенного лечения получены следующие ре зулыаты:

клиническое выздоровление у 3-х пациентов, значительное улучшение, у <5-тн, улучшегше у 2-х человек, без эффекта от проводи-

1а

ыого лечения остались 4 человека В очагах, обрабатываемых чистой мазевой основой полного регресса псорнатическнх элементов отмечено не было нп в одном случае.

В результате гистологического исследоваштя биоптагоЕ, взятых у пациентов после проведенного лечения, были обнаружены следующие морфологические изменения: сохранялся слабый акантоз, местами с удлинением эплдермалышх выростов, гиперкератоз, зернистый слой на протяжении всего эпидермиса был практически восстановлен, микроабсцессы Мунро отсутствовали. Просветы сосудов были большей частью расширены б верхней части дермы, что возможно связано с патогенетическим воздействием верапамила. Воспалительная инфильтрация почти полностью отсутствовала, местами отмечалась слабая пролиферация фибробластов. В биоптатах с очагов поражения, обрабатываемых в процессе проводимого лечения мазевой основой без добавления действующего фактора, выявлялись морфолопгческие признаки, патогаомоннчные для псориаза.

Таким обркзом, применение новогой лекарственной формы в терапии больных псориазом возможно считать патогенетически обоснованным.

ВЫВОДЫ

1. В результате псследоваштя выделены эпидермалытые кераппгоцпш и эмбриональные фибробласты человека, послужившие базой для изучения характера действия модуляторов кальциевых каналов на пролпфератиЕНые процессы этих клеток, воспроизведена модель регенерации эпидермиса в культуре клеток.

15

2. Б культуре клеток кожи человека доказано шппбирующее влияние вераиашша, фарндона, Bay К на пролиферацию эмбриональных фибрсбластов и эпидермальных кератаноцитов человека Выявлен дозоззеисимый характер их ингабирования. Из 3-х из^таемы;: пре-апаратоЕ Еыделен верапамил, как обладающий наиболее выраженной ингабнрующей активностью.

3. На базе результатов, полученных в культуре клеток, предложена Еерапамнловая мазь с обоснованной концентрацией препарата для дальнейшего ее изучения е эксперименте.

4. В эксперименте на 50 морских свинках клинически не выявлено раздражающего и аллергнзирующего действия ЕерапашшоЕой мази. При гистологическом исследовании кожи жиеогных отмечена акпшация: отдельных звеньев метаболических процессов, протекающих в эпидермисе и связанных с процессами кератинизацин и дефференцировки клеток что делает обоснованным бальнейшее ее изучение на добровольцах-пациентах с локализованными формами псориаза.

5. Предварительные результаты апробации вераламиловой мази, проведенной на ограниченном контингенте больных с локализованными формами псориаза свидетельствует о целесообразности создания верапамилоЕой мази.

Список публикаций у

1. М.Ю. Парфенова, А.В. Васильев, Т.П. Данилова, В .В. 'Терских. Влияние блокаторов кальциевых каналов на пролиферацию клеток кожи в культуре. // Тезисы доклздое 7 Российского сьезда дерма-тологое и Еенерологов. Часть 1 Казань,-1996.-С.187.

2. A.A. Кубанова, В. А. Самсонов, A.B. Резайыша. A.B. Васильев, Л.А. Денисов, М.Ю. Парфенова. Применение культур фпбробла-сгое и эпидермалышх кератиноцитов кожи человека при изучении токспчност лекарственных средств. // Сборшпс научных работ сотрудников ЦКВН, посвященный 75-летию института. Кожные и Еене-

/

ричеасне болезни.-М.-1996.-С.12-18.

3. Г.М. Цветкова, В.А. Самсонов, М.Ю. Парфенова. Морфология изменений кожи морских свинок после обработки верапамтшоЕой мазью. И Вестник дерматологии и еенеролотшг.-1996.-N3.- С. 10-12.

Тип. «Нефтяник» Z&Y.M)