Автореферат и диссертация по медицине (14.00.02) на тему:Анатомические и функциональные особенности звездчатого ганглия белой крысы в постнатальном онтогенезе

На правах рукописи

Корзина Марина Борисовна

АНАТОМИЧЕСКИЕ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ЗВЕЗДЧАТОГО ГАНГЛИЯ БЕЛОЙ КРЫСЫ В ПОСТНАТАЛЬНОМ ОНТОГЕНЕЗЕ

14.00.02 - Анатомия человека 03.00.13-Физиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Ярославль - 2009

003464957

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования "Ярославская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию"

Научный руководитель

доктор медицинских наук, профессор Маслюков Петр Михайлович

Официальные оппоненты:

Ведущая организация - Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН

Защита состоится «2 1 » пп ^ а ^ 2009 года в -Щ на заседании диссертационного совета Д 208.119.02 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Ярославская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», 150000, г. Ярославль, ул. Революционная, д. 5

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ярославской государственной медицинской академии

Автореферат разослан «20.» п 2009 г.

Ученый секретарь

доктор медицинских наук, профессор Левин Вячеслав Наумович доктор биологических наук, профессор Нигматтулина Разина Рамазановна

диссертационного совета

Румянцева Т. А

Актуальность темы. Развитие современных методов исследования, включая иммуногисгохимические, молекулярно-биологические и электрофизиологические, позволило существенно дополнить прежние данные о морфологических и функциональных характеристиках нейронов автономной нервной системы, что нашло свое отражение в ряде монографий (В.Н.Швалев с соавт., 1992; Hendry, Hill, 1992; А.Д.Ноздрачев, А.ВЛнцев, 1995; McLachlan, 1995; А.Д.Ноздрачев, Е.ИЛумасов, 1999; А.Д.Ноздрачев, М.М.Фатеев, 2002; Л.В.Филиппова, А.Д.Ноздрачев, 2007).

Среди паравертебральных ганглиев особое место занимает звездчатый узел (шейно-грудной), который известен как центр иннервации органов грудной полости и шеи (Langley, 1891, 1893; Ю.М.Жаботинский, 1953; М.Г.Удельнов, 1961, 1975; В.И.Скок, 1970; Е.М.Крохина, 1973; АЛ.Хабарова, 1975; А.Д.Ноздрачев, 1978, 1983; В.Н.Швалев с соавт., 1992). Анатомии звездчатого узла и вариантам отхождения его ветвей посвящено много работ, выполненных в основном на собаках и кошках (Phillips et al., 1986; А.Д.Ноздрачев, М.М.Фатеев, 2002). В то же время, имеются очень скудные данные относительно морфологии этого узла у взрослых крыс (А.Д.Ноздрачев, Е.Л.Поляков, 2001).

Нейронная организация симпатических узлов сопровождается возрастной перестройкой, происходящей с увеличением размеров нейронов (Шевелева B.C., 1977), а также перестройкой медиаторного состава (В.Н.Швалев с соавт., 1992), межнейронных связей и контактов с органами-мишенями (П.М.Маслюков, 2000). Тем не менее, очень мало сведений о сроках окончания созревания нейроцитов, динамике изменения их мор-фометрических, иммуногистохимических и электрофизиологических характеристик. Достаточно исследованы иммуноцитохимические свойства нейронов симпатических ганглиев грызунов, в т.ч. белых крыс и мышей (А.Д. Ноздрачев, 1995, 1996, 2002; Klimaschewski et al., 1996). Функциональные характеристики нейронов симпатических узлов также достаточно подробно описаны в литературе (В.И. Скок, АЛ. Иванов, 1989; McLachlan, 2003; Jobling, Gibbins, 1999). В то же время данные о развитии ней-ротрансмитгерного состава звездчатого узла в литературе отсутствуют, а сведения о характере фоновой активности нейронов в онтогенезе являются противоречивыми (В.С.Шевелева, 1977; Haddad, Armour, 1991; Gootman et al., 1992; Sica et al., 1994).

При исследовании синаптической передачи в симпатических узлах взрослых млекопитающих было установлено, что ацетилхолин активирует никотиновые и мускариновые рецепторы, тем самым, вызывая быстрый и медленный возбуждающий постсинаптический потенциал (Eccles, Libet, 1961; Kullmann, Нот, 2006). Также была доказана роль пуринорецепторов в синаптической передаче в симпатических узлах (Burnstock, 1985; Dunn et

al., 2001). Лишь единичные работы посвящены изучению экспрессии мус-кариновых и пуринорецепторов в симпатических узлах в ходе постнаталь-ного развития (Guo-Hua et al., 2000; Rúan et al., 2004). Эти данные не дают полного представления о развитии мускариновой и пуринергической си-наптической передачи в симпатических узлах млекопитающих в онтогенезе.

Цель исследования: выявить анатомические особенности звездчатого ганглия крысы, особенности нейротрансмиттерного и рецепторного состава нейронов, характеристик фоновой активности нейронов узла у крыс в постнатальном онтогенезе.

Задачи исследования:

1. Установить анатомические особенности, варианты отхождения ветвей и морфометрические характеристики нейроцитов звездчатого ганглия у крыс в постнатальном онтогенезе.

2. Выявить гисто- и иммуногисгохимические характеристики нейронов звездчатого ганглия крыс, содержащих различные ней-ротрансмиттеры, в процессе возрастного развития.

3. Определить иммуногисгохимические характеристики нейронов звездчатого ганглия, содержащих мускариновые и пуринорецепто-ры, у крыс разных возрастных групп.

4. Определить характер фоновой электрической активности нейронов звездчатого ганглия у крыс в постнатальном онтогенезе.

Научная новизна работы. Морфологические исследования звездчатого ганглия позволили установить основные типы отхождения ветвей от медиального края узла. У крысят разных возрастов выявлено три варианта отхождения ветвей. Наиболее часто встречается раздельное отхождение каудальной ветви подключичной петли и каудального сердечного нерва. Различий между правым и левым ганглиями не обнаружено. Эти результаты отличаются от данных, полученных на котятах разного возраста (П.М. Маслюков, 1997).

Морфометрический анализ нейроцитов показал, что в ходе онтогенеза возрастают средняя площадь сечения и максимальный диаметр. Доказано, что нет различий по особенностям распределения и морфометрическим характеристикам клеток с правой и левой стороны, между краниальной и каудальной частями звездчатого ганглия крысы в ходе постнатального развития.

Впервые установлено, что у всех исследованных животных подавляющее большинство нейронов (свыше 98%) являются иммунореактивны-ми к М1-холинорецепторам, Р2Х2- и Р2Х6-пуринорецепторам с момента

рождения, и в ходе возрастного развития процент таких нейронов не изменяется. В то же время, процент Р2ХЗ-иммунореактивных нейронов очень мал у животных всех возрастных групп.

Получены новые данные о том, что уже у новорожденных животных в звездчатом ганглии большая часть нейроцитов содержит одновременно тирозингидроксилазу и нейропептид У. В ходе возрастного развития процент таких нейронов увеличивается, в то время как доля соматостатин-иммунопозитивных нейронов резко снижается в первые 10 дней жизни. Доказано отсутствие НАДФН-диафоразопозитивных нейронов в звездчатом ганглии крысят всех возрастов.

Впервые установлено, что импульсная активность нейронов крысят ранних возрастных групп (новорожденных и 10-дневных) характеризуется низкой частотой разрядов и наличием большого процента нейронов с апериодической активностью. В процессе возрастного развития происходит увеличение частоты им пульсации и разнообразие паттерна активности. Характер нейронной фоновой активности формируется в онтогенезе у крыс уже к 20 дню жизни. Окончательное формирование амплитудно-частотных характеристик нейронной активности в звездчатом ганглии у крыс завершается к концу 1 месяца жизни.

Научная и практическая значимость работы. В результате исследования получены новые данные, раскрывающие морфологические особенности как самого звездчатого ганглия, так и его нейронов, содержащих различные нейротрасмиттеры, пуриновые и мускариновые рецепторы в постнатальном онтогенезе. Это представляет интерес для понимания закономерностей иннервации внутренних органов грудной полости и шеи, а также механизмов регуляции эмбрионального и постнатального развития нервной системы, внутренних органов и тканей. Полученные морфологические характеристики ветвей и иммуногистохимические особенности нейронов звездчатого ганглия могут использоваться при проведении морфологического и физиологического эксперимента, в учебном процессе и, с учетом видовых особенностей, экстраполироваться на человека.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Анатомическая структура, рецепторный состав нейронов и набор нейротрансмиттеров в звездчатом ганглии крысы к моменту рождения являются сформированными.

2. Популяции нейронов звездчатого ганглия с различными иммуно-гистохимическими характеристиками развиваются гетерохронно.

3. В процессе возрастного развития параллельно увеличению размеров нейронов происходит изменение характера их фоновой активности.

4. Устойчивое становление функциональных свойств нейронов звездчатого ганглия происходит к концу первого месяца жизни, морфологических характеристик - к концу второго месяца жизни.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на XX съезде физиологического общества имени И.П. Павлова (Москва, 2007); На конференции «Вопросы морфологии и патологии», посвященной 90-летию со дня рождения профессора Н.Е. Ярыгина (Москва, 2007); Всероссийской конференции молодых исследователей (Санкт-Петербург, 2007); IV и V Всероссийских конференциях с международным участием «Механизмы функционирования висцеральных систем» (Санкт-Петербург, 2007, 2008); IV Украинской научной конференции по нейронаукам, посвященной 100-летию со дня рождения академика НАН Украины Ф.М. Сер-кова (Донецк, 2008); IX Всероссийской научно-теоретической конференции «Физиологические механизмы адаптации растущего организма» (Казань, 2008); II съезде физиологов СНГ (Кишинев, Молдова, 2008); Четвертой Всероссийской с международным участием школе-конференции по физиологии кровообращения (Москва, 2008); Конференции с международным участием, посвященной 90-летию со дня рождения академика Т.М. Турпаева (Москва, 2008).

Публикации. По итогам диссертации опубликовано 15 работ, из них 11 - в центральной печати, 3 - в журналах из перечня периодических изданий, рекомендуемых ВАК РФ, 1 - в иностранном журнале.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 151 странице машинописного текста и состоит из введения, материалов и методов исследования, четырех глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, указателя литературы, включающего 278 наименований, в том числе 55 отечественных и 213 иностранных. Диссертация иллюстрирована 8 таблицами и 45 рисунками.

Материал и методы исследования. Работа выполнена на 168 крысах: 28 новорожденных крысятах массой 5-6 г, 28 десятидневных массой 12-14 г, 28 двадцатидневных массой 25-28 г, 28 одномесячных массой 5055 г, 28 двухмесячных массой 90-100 г, 28 шестимесячных крысятах массой 250-300 г. Проведено четыре группы экспериментов с использованием методов: 1) анатомического, 2) гистологического, 3) гистохимического, 4) иммуногистохимического, 5) электрофизиологического.

При исследовании вариантов отхождения ветвей узла эвтаназию животных осуществляли под уретановым наркозом (1 г/кг внутрибрюшинно). Препарирование осуществляли препаровальными иглами под контролем бинокулярной лупы с увеличением 24х.

При проведении морфометрического исследования под глубоким уретановым наркозом (2 г/кг, внутрибрюшинно) после препарирования узлов животных перфузировали транскардиально физиологическим раствором, а затем фиксирующей смесью 4 % параформальдегида. Забирали правый и левый узел для морфометрического исследования. Серии срезов толщиной 12 мкм изготовляли на криостате.

Для установления размеров ганглия и вычисление его объема определяли под контролем бинокулярной лупы с увеличением 24* (объектив 4х, окуляр 6х) при помощи морфометрической сетки длину, ширину и толщину узла На основании полученных данных, объем узла вычисляли при помощи компьютерной программы SolidWorks.

При определении НАДФН-диафоразо-позитивных структур процедуру осуществляли по стандартной методике (Норе, Vincent, 1989).

С целью выявления нейронов, содержащих тирозингидроксилазу, холинацетилтрансферазу, нейропептид Y, соматостатин, вазоинтестиналь-ный пептид, галанин, М1-холинорецепторы, Р2Х2-, Р2ХЗ- и Р2Х6 - пури-норецепторы применялось двойное мечение антителами с флуоресцентными красителями.

Анализ данных морфологических методов исследования проводился при помощи флуоресцентного микроскопа JIOMO Микмед 2, вариант 12, снабженного соответствующим набором светофильтров и цифровой камерой. При подсчете оценивались только нейроны с четко идентифицированным ядром. Процент иммунореактивных нейроцитов рассчитывался как отношение нейронов, иммунопозитивных к данному маркеру на срезе, к общему числу нейронов на срезе. Установив площадь сечения нейронов, средний диаметр тел нейронов и их плотность распределения на 1 мм2 плоскости среза ганглия, по формуле Hoff и Rhines (Г.Г. Автандилов, 1990) находили количество нейронов в 1 мм3. Количество нейронов в 1 мм3 перемножали на объем ганглия и получали общее количество нейронов в узле.

Согласно рекомендациям Г.Ф. Лакина (1980), по правилу Старджеса, все нейроны, по их морфометрическим параметрам были разбиты на 5 групп. Нейроны группировались согласно их площади сечения с шагом 200 мкм2.

При изучении фоновой электрической активности отдельных нейронов проведено две серии исследований: с интактным шейным симпатическим стволом (5 животных в каждой возрастной группе) и с перерезанной межганглионарной ветвью симпатического ствола, соединительными ветвями Tt, Тп (3 животных в каждой группе). Животные находились на самостоятельном дыхании. Игольчатые электроды помещались подкожно для регистрации ЭКГ во 2-м стандартном отведении и в межреберные мышцы

- для регистрации дыхания. Электрическая активность нейронов регистрировалась внеклеточно при помощи вольфрамовых микроэлектродов А-М Systems. При этом оценивалась амплитуда импульсов, частота импульса-ции и длительность межимпульсных интервалов.

Статистическая обработка результатов сводилась к определению средней арифметической, стандартной ошибки. Для математической обработки использовали пакет прикладных компьютерных программ "Statistica 6.0". Для оценки достоверности различий использовался дисперсионный анализ (однофакторный ANOVA), t-критерий Стъюдента и U критерий Манна-Уитни. Различия считались статистически достоверными при уровне значимости р<0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В ходе исследования установлены анатомические особенности звездчатого узла, морфометрические, иммуногистохимические характеристики нейронов звездчатого ганглия и особенности их фоновой активности у крысят в постнатальном онтогенезе.

Проведенные морфометрические и гистохимические исследования свидетельствуют о неоднородности клеточного состава нейронов звездчатого ганглия крысы уже к моменту рождения. Имеются отдельные популяции нейронов, отличающиеся по морфологическим и функциональным особенностям.

У крысят с момента рождения ганглий имеет звездчатую форму. В постнатальном онтогенезе закономерно с увеличением длины и массы животного возрастают размеры и объем звездчатого узла. По нашим данным, длина ганглия от момента рождения к шестимесячному возрасту увеличивается в 1,9 раза (с 2,0+0,21 до 3,8±0,18 мм), ширина - в 1,5 раза (с 0,6±0,04 до 0,9±0,07 мм), толщина - в 3 раза (с 0,2±0,02 до 0,7±0,05 мм), объем - в 10 раз (с 0,12±0,02 до 1,12±0,14 мм3)', в то время как длина крысы - в 4 раза (В.И. Западнюк с соавт., 1974). Таким образом, анатомически звездчатый узел у млекопитающих является сформированным к моменту рождения.

Основные варианты отхождения ветвей, присущие взрослым животным, уже наблюдаются с момента рождения и не изменяются в процессе возрастного развития. Нами выявлено, что у крыс присутствуют три варианта отхождения ветвей от медиального края звездчатого узла, причем различий между правым и левым ганглиями не обнаружено. Наиболее часто встречается раздельное отхождение краниальной и каудальной ветвей подключичной петли, каудального сердечного нерва (у новорожденного крысенка - 50%, у 10-дневного - 50%, у 20-дневного - 50%, у одномесяч-

ного - 75%, у двухмесячного - 62,5%, у шестимесячного - 50%), что соответствует данным А.Д. Ноздрачева и Е.Л.Полякова (2001). Реже присутствует тип отхождения от медиального края двух краниальных, каудальной ветви подключичной петли, каудального сердечного нерва и добавочного каудального сердечного нерва. У кошки с момента рождения обнаружено 5 вариантов для левого ганглия и 3 варианта для правого звездчатого узла (П.М. Маслюков, 1997). В отличие от котят, у крысят во всех возрастных группах нет прямых анастомозов с вагосимпатическим стволом, выявлено лишь от одной до двух соединительных ветвей, идущих в направлении ствола.

При исследовании морфометрических параметров нейроцитов звездчатого узла крысы в постнатальном онтогенезе нами установлено, что площадь сечения нейронов увеличивается в 3 раза: с 181±8 мкм2 у новорожденных до 594±23 мкм2 у шестимесячных, соответственно (различия статистически достоверны, р<0,05). Нами не выявлено различий в размерах клеток между краниальной и каудальной областями, а также между правым и левым звездчатыми узлами.

По данным Т.А. Румянцевой (2002), размеры нейроцитов звездчатого ганглия крысы стабилизируются к третьему месяцу жизни. У котят площадь сечения нейронов звездчатого узла приобретает размеры, свойственные взрослому животному, к шестимесячному возрасту (П.М. Маслюков, 2003).

После рождения происходит последовательное увеличение площади сечения нейронов, что закономерно влечет уменьшение плотности нервных клеток на центральных срезах. У новорожденных животных плотность расположения нейронов равнялась 2614±169 на мм2, у шестимесячных -515116, соответственно (различия статистически достоверны, р<0,05). Те же закономерности установлены на звездчатом узле котят разных возрастов (П.М. Маслюков, 2003). Но, в отличие от кошки, у крысят не наблюдается различий в плотности расположения нейроцитов между правым и левым ганглиями, а также между каудальной и краниальной частями узла (А.Д. Ноздрачев, М.М. Фатеев, 2002; П.М. Маслюков, 2003).

В постнатальном онтогенезе крыс увеличивается доля средних (с площадью сечения 401-600 мкм2) и крупных клеток (с площадью сечения 601-800 мкм2) и уменьшается процент мелких клеток (с площадью сечения до 400 мкм2). В ганглии новорожденного крысенка крупные клетки отсутствовали, обнаруживался лишь незначительный процент средних клеток, основную массу составляли нейроны малых размеров. У 10- дневного крысенка появлялись крупные клетки (с площадью сечения до 1200 мкм2). Клетки очень крупных размеров (более 1201 мкм2) наблюдались только у

шестимесячных животных. Эти результаты частично совпадают с данными, полученными на звездчатом ганглии котят разных возрастов, но у кошки очень крупные нейроны появляются уже на четвертом месяце жизни (П.М. Маслюков, 2003).

В онтогенезе крыс число нейронов в звездчатом узле достоверно не менялось и составило от 2063713686 у новорожденного крысенка до 22473±2894 у шестимесячного, соответственно. Достоверных различий между правым и левым ганглиями не обнаружено. Эти результаты отличаются от данных, полученных у новорожденных котят, где число нейронов в правом и левом звездчатом узле различается ц является максимальным, в то время как у взрослых кошек количество нейроцитов уменьшается и различий между ганглиями не выявлено (П.М. Маслюков, 2003). По-видимому, в звездчатом узле крыс большинство нейробластов дифференцируется уже к моменту рождения.

Результаты нашего исследования свидетельствуют, что около 100% нейронов звездчатого узла крысят уже с момента рождения содержат М1-холинорецепторы. В дальнейшем, в ходе возрастного развития, процент таких нейроцитов не меняется. Клетки на срезах ганглия располагались диффузно. Средние значения площади сечения М1- иммунореактивных нейронов постепенно увеличивались от момента рождения к шести месяцам. Причем, значения данного параметра у шестимесячных крыс примерно в три раза больше по сравнению с новорожденными животными: 155±12,3 и 547±22,3 мкм2, соответственно (различия статистически достоверны, р<0,05). В симпатических узлах взрослых млекопитающих ацетил-холин активирует никотиновые и мускариновые рецепторы, тем самым вызывая быстрый и медленный возбуждающий постсинаптический потенциал (Есс1ез й а1., 1961; КиИтапп, Нот, 2006). Синаптическая передача с участием М1- и М2-холинорецепторов доказана и в звездчатом узле взрослых крыс (Уе1 а1., 2006). Данные, полученные на краниальном шейном ганглии крысят и котят, свидетельствуют о наличии М1- и М2-иммунореактивных нейронов к моменту рождения (Вапат е! а1., 2006; Ьис11ат а1., 1994).

У взрослых крыс в чревном и краниальном шейном узлах обнаружены Р2Х2- и Р2Х6-подтипы пуринорецепторов (Х1ап§ ег а1., 1998). Нами установлено, что большинство М1-иммунопозитивных нейроцитов звездчатого узла с момента рождения одновременно являются Р2Х2- и Р2Х6-позитивными. В ходе постнатального развития площадь сечения Р2Х2- и Р2Х6-содержащих нейроцитов последовательно возрастает. Для Р2Х2-иммунореактивных нейронов новорожденных и шестимесячных крысят

значение данного параметра составило 168±14,2 и 568±20,2 мкм2, для Р2Х6-иммунопозитивных - 207±8,3 и 544+18,1 мкм2, соответственно, (различия статистически достоверны, р<0,05). Нами установлено, что средняя площадь сечения нейронов, экспрессирующих мускариновые и пуриноре-цепторы, совпадает с аналогичным параметром катехоламинергических нейронов, содержащих тирозингидроксилазу в соответствующих возрастных группах.

В нашем исследовании в звездчатом узле крысят всех возрастов выявлены единичные клетки, содержащие Р2ХЗ-пуринорецепторы. Этот тип рецепторов характерен для спинномозговых и тройничных ганглиев, кау-дального узла блуждающего нерва взрослой крысы (Xiang et al., 1998). У новорожденных и 10 - дневных животных количество Р2ХЗ- содержащих нейронов составило (3±1). Затем количество Р2ХЗ-иммунореактивных нейронов увеличивалось и достигало максимума к 20-дневному возрасту (12±5), после чего снижалось до 4±1 у 30-дневных крысят и далее не менялось. По нашим наблюдениям, наибольшее число нейронов, содержащих Р2ХЗ-рецепторы, наблюдается в 20-дневном возрасте. Похожие данные получены в работах на нервных клетках межмышечного сплетения желудка крысы, где пик экспрессии наблюдается к 14 дню постнатального развития (Xiang and Burnstock, 2004). Вероятно, Р2ХЗ-пуринорецептор влияет на созревание нейронов в ходе пренатального и начальных этапах постнатального онтогенеза (Rúan et al., 2004). Р2ХЗ-иммунореактивные нейроны в звездчатом узле представлены мелкими по размеру клетками (у новорожденного крысенка - 90±25,3 мкм2, у шестимесячного - 367±37,9 мкм2) (различия статистически достоверны, р<0,05). Согласно литературным данным, функциональная роль мускариновых и пуринорецепторов нейронов симпатических узлов заключается в модуляции синаптической передачи, осуществляемой при участии никотиновых рецепторов (Burnstock, 2007; Kullmann and Horn, 2006).

В ходе исследований выявлено изменение иммуногистохимических характеристик нейронов в постнатальном онтогенезе. Это согласуется с литературными данными, указывающими на то, что параллельно с функциональным созреванием в нейронах симпатических узлов идет перестройка медиаторного состава, которая может происходить под влиянием целого ряда различных трофических факторов (Emsberger, 2001).

Установлено, что также как и у взрослых, у новорожденных основная масса нервных клеток содержит фермент синтеза норадреналина - тирозингидроксилазу (ТГ), и имеется небольшая популяция клеток (менее 10% нейронов в общей популяции нейроцитов звездчатого узла), содер-

жащая фермент синтеза ацетилхолина - холинацетилтрансферазу (ХАТ), вазоинтестинальный пептид (ВИЛ), соматостатин (СОМ) и галанин (ГАЛ). Часть же норадренергических нейронов солокализована с данными ней-ротрансмитгерами. Различий между иммуногистохимическими особенностями нейронов правого и левого ганглия не наблюдалось. Клетки на срезах узлов располагались диффузно, а также группами.

Процентное содержание ТГ-позитивных нейронов в раннем постна-тальном онтогенезе практически не менялось и составило 88±5,1% у новорожденных, 83±4,7% у 10-дневных, 90±3,8% у 20-дневных, 86±4,4% у 30-дневных и 91±5,6% у двухмесячных животных. В звездчатом ганглии крысят с момента рождения большая часть нейроцитов содержала одновременно ТГ и нейропептид Y (НПУ). Это согласуется с данными, полученными на звездчатом узле взрослой собаки, кошки и крысы (Lindh et al., 1989; Moriartry et al., 1995; Richardson et al., 2006). В краниальном шейном ганглии морской свинки данная группа нейроцитов также преобладает, начиная с периода раннего эмбриогенеза (Morris et al., 2001). В дальнейшем, в ходе возрастного развития, процент таких нейронов увеличивается. Очевидно, это можно объяснить ангиогенным эффектом НПУ на возрастающее количество сосудов микроциркуляторного русла в процессе онтогенеза (Morris et al., 2001). TT- и НПУ-иммунореактивные нейроны представлены средними по размеру клетками во всех возрастных группах при сравнении с нервными клетками, имеющие другие иммуногистохимические характеристики. У одномесячных животных средние размеры НПУ-иммунопозитивных нейроцитов начинают преобладать над средними размерами ТГ-положительных клеток. По своим размерам нейроны, содержащие ТГ и НПУ, более мелкие по сравнению с клетками, имеющими только ТГ с момента рождения и до 30 дня жизни. В 2-х месячном возрасте наблюдалось обратное соотношение по средним размерам этих популяций нейронов.

По некоторым сведениям, холинергические нейроны во всех пара-вертебральных ганглиях зрело - и незрелорождающихся животных к моменту рождения являются норадренергическими, и лишь к началу 3-й недели жизни эти клетки приобретают присущий им фенотип (B.C. Шевелева, 1977). В результате наших исследований доказано, что небольшое количество клеток (4,5%) звездчатого узла уже с момента рождения содержало фермент синтеза ацетилхолина, а именно ХАТ. Это совпадает с данными, когда при проведении гистохимического исследования на ацетилхо-линэстеразу у новорожденных котят в звездчатом ганглии выявлены клетки, дающие интенсивную реакцию (Masliukov et al., 2003). Процент ХАТ-

иммунопозитивных нейронов возрастал до 10 дня жизни, а затем уменьшался почти в 2 раза (до 3%) у двухмесячных животных. Большинство ХАТ-позитивных нейроцитов у новорожденных, 10- и 20-дневных крысят также являлись ТГ-положительными. Процент ТГ-позитивных нейронов, содержащих ХАТ, возрастал до 10 дня жизни, а затем снижался. Данный факт, возможно, объясняется уменьшением выделения органами-мишенями трофических факторов, влияющих на синтез ацетилхолина, либо запрограммированной гибелью нервных клеток с данным фенотипом.

В звездчатом ганглии крысят разных возрастов большинство ХАТ-позитивных нейроцитов (4,4%) являлись иммунореактивными к ВИЛ. Те же данные получены на звездчатом узле взрослых крыс и кошек (Morales et al., 1995; Anderson et al., 1995). Процент таких нейронов увеличивался в первые десять дней жизни (до 5,8%), а затем уменьшался. Сходный паттерн (увеличение процентного соотношения меченых клеток между 10 и 20 днями жизни) продемонстрирован при исследовании связей нейронов звездчатого ганглия с органами-мишенями (Masliukov et al., 2000). Можно предположить, что в этом периоде орган-мишень может влиять на ней-ротрансмитгерные свойства нейрона. Эти клетки имели наиболее крупные размеры.

Более 40% СОМ-положительных нейронов с момента рождения содержало ТГ. Доля таких клеток, а также СОМ-иммунопозитивных нейроцитов, не солокализованных с ТГ, уменьшалась к десятидневному возрасту животных. Нами также установлено, что с момента рождения более 50% ВИП-содержащих нейроцитов солокализованы с СОМ. С возрастом доля таких нервных клеток понижается. Уменьшение количества СОМ- и ВИП-иммунореактивных нейронов наблюдается в звездчатом узле и у плода человека в процессе эмбриогенеза (Roudenok and Kuhnel, 2001). Эти клетки имели мелкие размеры.

Согласно литературным данным, возрастное уменьшение количества ВИП- и СОМ-позитивных нейроцитов связано с их важным влиянием именно в период эмбриогенеза и раннего постнатального онтогенеза на митоз и выживаемость нервных клеток, рост нейритов (Pincus et al., 1990; Bulloch, 1987).

У крысят всех возрастов выявлены единичные ТГ-положительные клетки, солокализованные с ГАЛ (менее 1% от всей популяции клеток в ганглии). Те же данные продемонстрированы в нейроцитах звездчатом узле взрослой морской свинки (Elfvin et al., 1994). В нейронах звездчатого узла кошки данный нейромедиатор присутствует в большем количестве клеток (Björn et al., 1989). Максимальное количество ГАЛ-положительных

нейронов звездчатого ганглия обнаружено у одномесячных животных (22±5), у двухмесячных крыс ГАЛ определяется, как и у крысят ранних возрастов, лишь в отдельных клетках (4±2). Эти клетки имели мелкие размеры.

Результаты нашей работы подтверждают имеющиеся литературные данные об отсутствии НАДФН-реактивных нейронов в симпатических ганглиях крысят и мышей (Grozdanovic et al., 1992; Santer, Symons, 1993). Эти клетки характерны для чувствительных узлов данных животных (Alm et al., 1992; Grozdanovic et al., 1992). Можно сделать вывод, что у крыс нейромодулятор N0 (оксид азота) не участвует в модуляции симпатической вазоконстрикции (Sander et al., 2000). В ганглии обнаруживались лишь НАДФНД-реактивные волокна, с 20 дня жизни интенсивность реакции которых несколько возрастала по сравнению с новорожденными и 10-дневными крысятами.

Данные, полученные при помощи микроэлектродной техники путем регистрации нейронной активности, совпадают с данными, полученными при регистрации фоновой активности в ветвях звездчатого узла, где также уже с момента рождения регистрировались колебания, синхронные с дыханием и ЭКГ (Masliukov, 2003; П.М.Маслюков, А.Д.Ноздрачев, 2006).

Фоновая электрическая активность нейронов звездчатого ганглия связана с поступлением импульсов по шейному симпатическому стволу. Перерезка преганглионарных волокон необратимо устраняет импульсацию нервных клеток в ганглии.

Импульсная активность нейронов звездчатого узла крысят ранних возрастных групп (новорожденных и 10-дневных) характеризовалась низкой частотой разрядов (0,04±0,01 и 0,1±0,03 импульсов в секунду, соответственно), малой амплитудой импульсов (102,5±10,33 и 94,6±12,15 мкВ, соответственно) и наличием большого процента нейронов с апериодической активностью (96% и 52%, соответственно) (различия статистически достоверны, р<0,05). Это можно объяснить морфологической и функциональной незрелостью нейронов и синаптической передачи в ранних возрастных периодах (Anderson et al., 2002; П.М.Маслюков, А.Д. Ноздрачев, 2006). С 10 дня жизни значительно возрастает процент нейронов, имеющих дыхательную ритмику (до 48% по сравнению с 3-дневными - 4%), а также появляются нейроциты со смешанным типом активности (чередование одиночных разрядов и серий импульсов, синхронных с дыхательными движениями). К шестимесячному возрасту доля нервных клеток, разряжающихся синхронно с дыханием, уменьшается до 25%. Нейроны, имеющие сердечную ритмику импульсации, не были обнаружены у животных

первых десяти дней жизни. У 20-дневных 1фысят процент нейронов с таким характером импульсации был очень небольшим (6%). Сравнительно небольшая доля нейронов с разрядами, синхронными с ЭКГ, в симпатических узлах у животных раннего возраста отмечена в ряде работ (Sica et al., 1994; 2002). Вероятно, причиной таких изменений является перестройка взаимоотношений между симпатическим и парасимпатическим звеном автономной нервной системы, и увеличение влияния на симпатическую нервную систему со стороны барорецепторов, преимущественно аортальной и синокаротидной зон. Максимальных значений процент нейронов, имеющих сердечный ритм импульсации, достигает к 2-месячному возрасту (21%), к шестому месяцу несколько снижаясь (12%).

Во всех возрастных группах наибольший процент нейронов звездчатого ганглия проявлял нерегулярную активность. Это совпадает с данными, полученными на взрослых животных (В.И.Скок, А.Я.Иванов, 1989; McLachlan, 2003; Malpas, 2004). Тем не менее, в спектре мощности фоновой электрической активности, зарегистрированной от нервов, наибольшую часть занимают частоты, имеющие сердечную ритмику (Masliukov, 2003; П.М.Маслюков, А.Д.Ноздрачев, 2006). Возможная причина расхождений заключается в том, что в основе регистрации электрической активности от целых нервов лежит отведение суммированных потенциалов действия отдельных волокон (Malpas, 2004).

Характер изменения средней амплитуды разряда отдельных нейронов сходен с аналогичным процессом в целом нерве (Masliukov, 2003; П.М.Маслюков, А.Д.Ноздрачев, 2006). Средняя частота импульсации и амплитуда импульсов увеличивается от момента рождения к шести месяцам, окончательно устанавливаясь к концу 1 месяца жизни, и составляет у крыс старше 30 дней от 1,8+0,3 до 2,5+0,5 импульсов в секунду и от 171,2+20,33 до 184,1+24,25 мкВ, соответственно.

Таким образом, звездчатый ганглий крысы уже с момента рождения является функционирующим элементом симпатической нервной системы. Анатомически у новорожденных крысят звездчатый ганглий является сформированным. Морфологически нейроны звездчатого ганглия с момента рождения содержат набор рецепторов и нейротрансмиттеров, характерный дам взрослой крысы, но функционально нейроциты являются незрелыми. По-видимому, данный факт объясняется перестройкой как нервных связей и синаптических контактов внутри ганглия, так и генераторов ритма в спинном и продолговатом мозге в процессе постн'атального онтогенеза. Изменение морфо-функциональных характеристик нейронов происходит гетерохронно. Окончательное формирование рецепторного состава нейронов звездчатого узла, характера фоновой нейронной активности заверша-

ется к концу первого месяца жизни. Созревание набора нейротрансмитте-ров в звездчатом ганглии крысы завершается к концу второго месяца жизни.

ВЫВОДЫ

1. У крысят с момента ровдения присутствует три варианта отхож-дения ветвей от медиального края звездчатого ганглия. Различий между правым и левым ганглиями не обнаружено. Наиболее часто встречается раздельное отхождение краниальной и каудальной ветвей подключичной петли, каудального сердечного нерва.

2. В процессе возрастного развития размеры звездчатого узла и его нейронов возрастают с момента рождения до конца второго месяца жизни. Параллельно возрастанию средней площади сечения нейроцитов происходит снижение средней плотности расположения нейронов на срезах ганглия. Число нейронов в правом и левом звездчатом узле одинаковое и с возрастом достоверно не меняется.

3. Набор нейротрансмиттеров, характерный для взрослого организма, присутствует в нейронах правого и левого звездчатого узла уже с момента рождения. У новорожденных крысят основная масса нервных клеток содержит фермент синтеза норадреналина тирозингидроксилазу. Во всех возрастных группах в большинстве нейронов тирозингидроксилаза соло-кализована с нейропептидом У. Имеется небольшая популяция клеток (менее 10% от общей популяции нейрощггов звездчатого узла), содержащая холинацетилтрансферазу, вазоинтестинальный пептид, соматостатин, га-ланин. Галанин присутствует в единичных клетках у животных всех возрастов. В звездчатом узле крысят НАДФН-реактивные нейроциты отсутствуют во всех исследованных возрастах.

4. С момента рождения в звездчатом узле крысы нейроны, содержащие различные нейротрансмиттеры, отличаются по своим морфологическим характеристикам. Наиболее крупные нейроны в звездчатом ганглии всех возрастов содержат вазоинтестинальный пептид и холинацетилтрансферазу. Соматостатин-, галанин- и Р2ХЗ-иммунореактивные нейроны представлены более мелкими по размеру клетками. Нейроны, содержащие тирозингидроксилазу и нейропептид У, имеют промежуточные значения средней площади сечения.

5. Нейроны звездчатого ганглия с различными иммуноцитохимиче-скими характеристиками развиваются гетерохронно. У новорожденных животных основная масса клеток, содержащая тирозингидроксилазу, соло-кализована с ферментом синтеза ацетилхолина, вазоинтестинальным пептидом и соматостатином. С возрастом процент таких нейронов понижается. Процент тирозингидроксилазо-позитивных нервных клеток, содержащих нейропептид У, увеличивается в ходе постнатального онтогенеза. До-

ля соматостатин-позитивных нейронов резко снижается в первые 10 дней жизни и далее с возрастом уменьшается. Процент холинацетилтрансфера-зо-позитивных нейроцитов и нейронов, содержащих вазоинтестинальный пептид, увеличивается в первые 10 дней, а затем в ходе постнатального онтогенеза уменьшается. Число нервных клеток, содержащих галанин, возрастает до первого месяца жизни, а затем понижается. Созревание набора нейротрансмитгеров в звездчатом ганглии крысы завершается к концу второго месяца жизни.

6. Большинство нейронов правого и левого звездчатого узла к моменту рождения содержит М1-холинорецепторы, Р2Х2- и Р2Х6-пуринорецеггторы. Процент Р2ХЗ-иммунореактивных нейроцитов очень мал у животных всех возрастных групп. Наибольшее число нервных клеток, содержащих Р2ХЗ-рецепторы, наблюдается в 20-дневном возрасте. Окончательный набор пуринорецепторов на нейронах симпатического узла формируется к 30-дневному возрасту.

7. В звездчатом ганглии крысят фоновоактивные нейроны представлены следующими популяциями: синхронной с дыханием, с ЭКГ и разряжающиеся апериодично. Паттерн нейронной фоновой активности формируется в онтогенезе у крыс уже к 20 дню жизни. Окончательное формирование амплитудно-частотных характеристик нейронной активности в звездчатом ганглии у крыс завершается к концу 1 месяца жизни.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Емануйлов А.И., Корзина М.Б., Маслюков П.М.. Нейротрансмит-терный состав нейронов симпатических и интрамуральных узлов в постна-тальном онтогенезе // Вопросы морфологии и патологии. - Москва. - 2007. - С. 83-87.

2. Корзина М.Б. Возрастные изменения мускариновой и пуринореак-тивной синаптической передачи в звездчатом ганглии крысят и котят // Тезисы докладов V Всероссийской конференции «Механизмы функционирования висцеральных систем». - Санкт-Петербург. - 2007. - С. 156.

3. Маслюков П.М., Корзина М.Б., Емануйлов А.И. Возрастные изменения содержания нейротрансмитгеров в симпатических узлах крысы // Тезисы докладов V Всероссийской конференции «Механизмы функционирования висцеральных систем». - Санкт-Петербург. - 2007 - С. 193-194.

4. Маслюков П.М., Корзина М.Б., Донской A.B., Степанова И.С. Возрастные изменения фоновой электрической активности и синаптической передачи в звездчатом ганглии // Тезисы докладов XX съезда физиологического общества им. И.П. Павлова. - Москва. - 2007. - С. 61.

5. Корзина М.Б., Емануйлов А.И. Постнатальное развитие мускари-новой и пуринореактивной синаптической передачи в звездчатом ганглии крысы // Тезисы докладов XX Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье». - Санкт-Петербург. - 2007. - С. 215-216.

6. Маслюков П.М., Емануйлов А.И., Корзина М.Б., Шилкин В.В., Румянцева Т.А. ИА1ЭРН-диафоразо-позитивные нейроны симпатических узлов в постнатальном онтогенезе // Морфология. - 2008. - Т.133. - №1. -С. 42-45.

7. Маслюков П.М., Корзина М.Б., Емануйлов А.И. Импульсная активность нейронов симпатических ганглиев крысы в постнатальном онтогенезе // Тезисы докладов II съезда физиологов СНГ. - Кишинев. - 2008. -С. 64.

8. Маслюков П.М., Корзина М.Б., Емануйлов А.И.. Возрастные изменения нейротрансмиттерного и рецепторного состава симпатических узлов крысы И Тезисы докладов VI Всероссийской конференции «Механизмы функционирования висцеральных систем». - Санкт-Петербург.- 2008. -С. 133.

9. Корзина М.Б., Маслюков П.М., Емануйлов А.И. Рецепторный состав нейронов симпатических узлов в постнатальном онтогенезе // Тезисы докладов IX Всероссийской научно-теоретической конференции «Физиологические механизмы адаптации растущего организма». - Казань. - 2008.

- С. 68.

10. Маслюков П.М., Корзина М.Б. Мускариновая и пуринореактив-ная синаптическая передача в звездчатом ганглии крысят и котят в постнатальном онтогенезе // Тезисы докладов Четвертой Всероссийской с международным участием школы-конференции по физиологии кровообращения.

- Москва.-2008.-С. 81.

11. Маслюков П.М., Корзина М.Б., Емануйлов А.И. Фоновая электрическая активность симпатическик узлов крысы в постнатальном онтогенезе // Материалы IV Украинской научной конференции «Нейронауки: теоретические и клинические аспекты». - Донецк. - 2008. - С. 43.

12. Маслюков П.М., Корзина М.Б., Емануйлов А.И. Нейротрансмит-терный и рецепторный состав нейронов симпатических узлов крысы в раннем постнатальном онтогенезе // Тезисы докладов конференции с международным участием «Механизмы нервных и нейроэндокринных регуляций». - Москва. - 2008. - С. 73-74.

13. Корзина М.Б., Емануйлов А.И., Новаковская С.А., Арчакова Л.И., Маслюков П.М. Развитие нейронов звездчатого узла крыс, содержащих мембранные мускариновые и пуринорецепторы // Морфология. - 2008. -Т. 134. 6. - С. 27-31.

14. Маслюков П.М., Корзина М.Б., Емануйлов А.И. Возрастные изменения ритмической электрической активности в шейном симпатическом стволе крысы и кошки // Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. - 2009. - Т.95. - №1. - С. 58-64.

15. Emanuilov A.I., Korzina М.В., Archakova L.I., Novakovskaya S.A. Nozdrachev A.D., Masliukov P.M. Development of the NADPH-diaphorase-positive neurons in the sympathetic ganglia // Annals of Anatomy. - 2008. - V. 190.-№6.-P. 516-524.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВИП - вазоинтестинальный пептид ГАЛ- галанин

НА ДФН-диафораза - маркер фермента NOS, участвующего в синтезе N0

HÏÏY - нейропептид Y

СОМ - соматостатин

ТГ - тирозингидроксилаза

ХАТ - холинацетилтрансфераза

ЭКГ - электрокардиограмма

N0 - оксид азота

NOS - сикгаза окиси азота

Подписано в печать 11.03.09. Формат 60x84 1/16. Бумага белая. Печ. л. 1. Печать ризограф Заказ 238 Тираж 100. Отпечатано в типографии Ярославского государственного технического университета г. Ярославль, ул. Советская, 14 а, тел. 30-56-63.

Развитие современных методов исследования, включая иммуноги-стохимические, молекулярно-биологические и электрофизиологические, позволило существенно дополнить прежние данные о морфологических и функциональных характеристиках нейронов автономной нервной системы, что нашло свое отражение в ряде монографий (В.Н.Швалев с соавт., 1992; Hendry, Hill, 1992; А.Д.Ноздрачев, А.В.Янцев, 1995; McLachlan, 1995; А.Д.Ноздрачев, Е.И.Чумасов, 1999; А.Д.Ноздрачев, М.М.Фатеев, 2002; Л.В.Филиппова, А.Д.Ноздрачев, 2007).

Среди паравертебральных ганглиев особое место занимает звездчатый узел, который известен как центр иннервации органов грудной полости и шеи (Langley, 1891, 1893; Ю.М.Жаботинский, 1953; М.Г.Удельнов, 1961, 1975; В.И.Скок, 1970; Е.М.Крохина, 1973; А.Я.Хабарова, 1975; А.Д.Ноздрачев, 1978, 1983; В.Н.Швалев с соавт., 1992). Анатомии звездчатого узла и вариантам отхождения его ветвей посвящено много работ, выполненных в основном на собаках и кошках (Phillips et al., 1986; А.Д.Ноздрачев, М.М.Фатеев, 2002). В то же время, имеются очень скудные данные относительно морфологии этого узла у взрослых крыс (А.Д.Ноздрачев, Е.Л.Поляков, 2001).

Нейронная организация симпатических узлов сопровождается возрастной перестройкой, происходящей с увеличением размеров нейронов (Шевелева B.C., 1977), а также перестройкой медиаторного состава (В.Н.Швалев с соавт., 1992), межнейронных связей и контактов с органами-мишенями (П.М.Маслюков, 2000). Тем не менее, очень мало сведений о сроках окончания созревания нейроцитов, динамике изменения их мор-фометрических, иммуногистохимических и электрофизиологических характеристик. Достаточно исследованы иммуноцитохимические свойства нейронов симпатических ганглиев грызунов, в т.ч. белых крыс и мышей (А.Д. Ноздрачев, 1995, 1996, 2002; Klimaschewski et al., 1996). Функциональные характеристики нейронов симпатических узлов также достаточно подробно описаны в литературе (В.И. Скок, А .Я. Иванов, 1989; McLachlan, 2003; Jobling, Gibbins, 1999). В то же время данные о развитии ней-ротрансмиттерного состава звездчатого узла в литературе отсутствуют, а сведения о характере фоновой активности нейронов в онтогенезе являются противоречивыми (В.С.Шевелева, 1977; Haddad, Armour, 1991; Gootman et al., 1992; Sica et al., 1994).

При исследовании синаптической передачи в симпатических узлах взрослых млекопитающих было установлено, что ацетилхолин активирует никотиновые и мускариновые рецепторы, тем самым, вызывая быстрый и медленный возбуждающий постсинаптический потенциал (Eccles, Libet, 1961; Kullmann, Horn, 2006). Также была доказана роль пуринорецепторов в синаптической передаче в симпатических узлах (Burnstock, 1985; Dunn et al., 2001). Лишь единичные работы посвящены изучению экспрессии мус-кариновых и пуринорецепторов в симпатических узлах в ходе постнаталь-ного развития (Guo-Hua et al., 2000; Rúan et al., 2004). Эти данные не дают полного представления о развитии мускариновой и пуринергической синаптической передачи в симпатических узлах млекопитающих в онтогенезе.

В связи с этим, целью данной работы явилось выявление анатомических особенностей звездчатого ганглия крысы, особенностей нейротранс-миттерного и рецепторного состава нейронов, характеристик фоновой активности нейронов узла у крыс в постнатальном онтогенезе.

Задачи исследования включали:

1. Установить анатомические особенности, варианты отхождения ветвей и морфометрические характеристики нейроцитов звездчатого ганглия у крыс в постнатальном онтогенезе.

2. Выявить гисто- и иммуногистохимические характеристики нейронов звездчатого ганглия крыс, содержащих различные ней-ротрансмиттеры, в процессе возрастного развития .

3. Определить иммуногистохимические характеристики нейронов звездчатого ганглия, содержащих мускариновые и пуринорецепто-ры, у крыс разного возраста.

4. Определить характер фоновой электрической активности нейронов звездчатого ганглия у крыс в онтогенезе.

Морфологические исследования звездчатого ганглия позволили установить основные типы отхождения ветвей от медиального края узла. У крысят разных возрастов выявлено три варианта отхождения ветвей. Наиболее часто встречается раздельное отхождение каудальной ветви подключичной петли и каудального сердечного нерва. Различий между правым и левым ганглиями не обнаружено. Эти результаты отличаются от данных, полученных на котятах разного возраста (П.М. Маслюков, 1997).

Морфометрический анализ нейроцитов показал, что в ходе онтогенеза возрастают средняя площадь сечения и максимальный диаметр. Доказано, что нет различий по особенностям распределения и морфометрическим характеристикам клеток с правой и левой стороны, между краниальной и каудальной частями звездчатого ганглия крысы в ходе постнатального развития.

Впервые установлено, что у всех исследованных животных подавляющее большинство нейронов (свыше 98%) являются иммунореактивны-ми к М1-холинорецепторам, Р2Х2- и Р2Х6-пуринорецепторам с момента рождения, и в ходе возрастного развития процент таких нейронов не изменяется. В то же время, процент Р2ХЗ-иммунореактивных нейронов очень мал у животных всех возрастных групп.

Получены новые данные о том, что уже у новорожденных животных в звездчатом ганглии большая часть нейроцитов содержит одновременно тирозингидроксилазу и нейропептид У. В дальнейшем, в ходе возрастного развития, процент таких нейронов увеличивается, в то время как доля со-матостатин-иммунопозитивных нейронов резко снижается в первые 10 дней жизни.

Убедительно доказано отсутствие НАДФН-диафоразопозитивных нейронов в звездчатом ганглии крысят всех возрастов. В то же время обнаружены НАДФН-диафоразореактивные волокна с наибольшей интенсивностью окраски с 20 дня жизни животных.

Впервые установлено, что импульсная активность нейронов крысят ранних возрастных групп (новорожденных и 10-дневных) характеризовалась низкой частотой разрядов и наличием большого процента нейронов с апериодической активностью. В процессе возрастного развития происходит увеличение частоты импульсации и разнообразие паттерна активности. Характер нейронной фоновой активности формируется в онтогенезе у крыс уже к 20 дню жизни. Окончательное формирование амплитудно-частотных характеристик нейронной активности в звездчатом ганглии у крыс завершается к концу 1 месяца жизни.

Таким образом, в результате исследования получены новые данные, раскрывающие морфологические особенности как самого звездчатого ганглия, так и его нейронов, содержащих различные нейротрансмиттеры, пуриновые и мускариновые рецепторы в постнатальном онтогенезе. Это представляет интерес для понимания закономерностей иннервации внутренних органов грудной полости и шеи, а также механизмов регуляции эмбрионального и постнатального развития нервной системы, внутренних органов и тканей. Полученные морфологические характеристики ветвей и иммуногистохимические особенности нейронов звездчатого ганглия могут использоваться при проведении морфологического и физиологического эксперимента, в учебном процессе и, с учетом видовых особенностей, экстраполироваться на человека.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Анатомическая структура, рецепторный состав нейронов и набор нейротрансмиттеров в звездчатом ганглии крысы к моменту рождения являются сформированными.

2. Популяции нейронов звездчатого ганглия с различными иммуно-гистохимическими характеристиками развиваются гетерохронно.

3. В процессе возрастного развития параллельно увеличению размеров нейронов происходит изменение характера их фоновой активности

4. Устойчивое становление функциональных свойств нейронов звездчатого ганглия происходит к концу первого месяца жизни, морфологических характеристик - к концу второго месяца жизни.

2.0Б30Р ЛИТЕРАТУРЫ

9. ВЫВОДЫ

1. У крысят с момента рождения присутствует три варианта отхож-дения ветвей от медиального края звездчатого ганглия. Различий между правым и левым ганглиями не обнаружено. Наиболее часто встречается раздельное отхождение краниальной и каудальной ветвей подключичной петли, каудального сердечного нерва.

2. В процессе возрастного развития размеры звездчатого узла и его нейронов возрастают с момента рождения до конца второго месяца жизни. Параллельно возрастанию средней площади сечения нейроцитов происходит снижение средней плотности расположения нейронов на срезах ганглия. Число нейронов в правом и левом звездчатом узле одинаковое и с возрастом достоверно не меняется.

3. Набор нейротрансмиттеров, характерный для взрослого организма, присутствует в нейронах правого и левого звездчатого узла уже с момента рождения. У новорожденных крысят основная масса нервных клеток содержит фермент синтеза норадреналина тирозингидроксилазу. Во всех возрастных группах в большинстве нейронов тирозингидроксилаза соло-кализована с нейропептидом У. Имеется небольшая популяция клеток (менее 10% от общей популяции нейроцитов звездчатого узла), содержащая холинацетилтрансферазу, вазоинтестинальный пептид, соматостатин, га-ланин. Галанин присутствует в единичных клетках у животных всех возрастов. В звездчатом узле крысят НАДФН-реактивные нейроциты отсутствуют во всех исследованных возрастах.

4. С момента рождения в звездчатом узле крысы нейроны, содержащие различные нейротрансмиттеры, отличаются по своим морфологическим характеристикам. Наиболее крупные нейроны в звездчатом ганглии всех возрастов содержат вазоинтестинальный пептид и холинацетилтрансферазу. Соматостатин-, галанин- и Р2ХЗ-иммунореактивные нейроны представлены более мелкими по размеру клетками. Нейроны, содержащие тирозингидроксилазу и нейропептид У, имеют промежуточные значения средней площади сечения.

5. Нейроны звездчатого ганглия с различными иммуноцитохимиче-скими характеристиками развиваются гетерохронно. У новорожденных животных основная масса клеток, содержащая тирозингидроксилазу, соло-кализована с ферментом синтеза ацетилхолина, вазоинтестинальным пептидом и соматостатином. С возрастом процент таких нейронов понижается. Процент тирозингидроксилазо-позитивных нервных клеток, содержащих нейропептид У, увеличивается в ходе постнатального онтогенеза. Доля соматостатин-позитивных нейронов резко снижается в первые 10 дней жизни и далее с возрастом уменьшается. Процент холинацетилтрансфера-зо-позитивных нейроцитов и нейронов, содержащих вазоинтестинальный пептид, увеличивается в первые 10 дней, а затем в ходе постнатального онтогенеза уменьшается. Число нервных клеток, содержащих галанин, возрастает до первого месяца жизни, а затем понижается. Созревание набора нейротрансмиттеров в звездчатом ганглии крысы завершается к концу второго месяца жизни.

6. Большинство нейронов правого и левого звездчатого узла к моменту рождения содержит М1-холинорецепторы, Р2Х2- и Р2Х6-пуринорецепторы. Процент Р2ХЗ-иммунореактивных нейроцитов очень мал у животных всех возрастных групп. Наибольшее число нервных клеток, содержащих Р2ХЗ-рецепторы, наблюдается в 20-дневном возрасте. Окончательный набор пуринорецепторов на нейронах симпатического узла формируется к 30-дневному возрасту.

7. В звездчатом ганглии крысят фоновоактивные нейроны представлены следующими популяциями: синхронной с дыханием, с ЭКГ и разряжающиеся апериодично. Паттерн нейронной фоновой активности формируется в онтогенезе у крыс уже к 20 дню жизни. Окончательное формирование амплитудно-частотных характеристик нейронной активности в звездчатом ганглии у крыс завершается к концу 1 месяца жизни.

8. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В ходе исследования установлены анатомические особенности звездчатого узла, морфометрические, иммуногистохимические характеристики нейронов звездчатого ганглия и особенности их фоновой активности у крысят в постнатальном онтогенезе.

В работе использовались методы прямой и непрямой морфометрии, л гистохимические, иммуногистохимические и электрофизиологические подходы.

Установлено, что характеристики нейронов претерпевают изменения в постнатальном онтогенезе. Проведенные морфометрические и гистохимические исследования свидетельствуют о неоднородности клеточного состава нейронов звездчатого ганглия крысы уже к моменту рождения. Имеются отдельные популяции нейронов, отличающиеся по морфологическим и функциональным особенностям.

У крысят с момента рождения шейно-грудной ганглий имеет звездчатую форму. В постнатальном онтогенезе закономерно с увеличением длины и массы животного возрастают размеры и объем звездчатого узла. По нашим данным, длина ганглия от момента рождения к шестимесячному возрасту увеличивается в 1,9 раза, ширина - в 1,5 раза, толщина - в 3 раза, объем - в 10 раз, в то время как длина крысы - в 4 раза (В.И. Западнюк с соавт., 1974). У человека звездчатый узел приобретает размеры, свойственные взрослым, к 8-13 годам. Размеры узлов к этому времени возрастают вдвое по сравнению с новорожденными (К.И. Гришан, 1965). Таким образом, анатомически звездчатый узел у млекопитающих является достаточно сформированным к моменту рождения.

Основные варианты отхождения ветвей, присущие взрослым животным, уже наблюдаются с момента рождения и не изменяются в процессе возрастного развития. Нами выявлено, что у крыс присутствуют три варианта отхождения ветвей от медиального края звездчатого узла, причем различий между правым и левым ганглиями не обнаружено. Наиболее часто встречается раздельное отхождение краниальной и каудальной ветвей подключичной петли, каудального сердечного нерва, что соответствует данным А.Д. Ноздрачева, Е.Л.Полякова (2001). У кошки с момента рождения обнаружено 5 вариантов для левого ганглия и 3 варианта для правого звездчатого узла (П.М. Маслюков, 1997). Следовательно, звездчатый узел крысы характеризуется меньшим разнообразием ветвей по сравнению с котятами. В отличие от котят, у крысят во всех возрастных группах нет прямых анастомозов с вагосимпатическим стволом, выявлено лишь от одной до двух соединительных ветвей, идущих в направлении ствола.

При исследовании морфометрических параметров нейроцитов звездчатого узла крысы в постнатальном онтогенезе нами установлено, что площадь сечения нейронов увеличивается в 3 раза: с 181±8 мкм" у новорожденных до 594±23 мкм у шестимесячных, соответственно (различия статистически достоверны, р<0,05). Нами не выявлено различий в размерах клеток между краниальной и каудальной областями, а также между правым и левым звездчатыми узлами.

По данным Т.А. Румянцевой (2002), размеры нейроцитов звездчатого ганглия крысы стабилизируются к третьему месяцу жизни. У котят площадь сечения нейронов звездчатого узла приобретает размеры, свойственные взрослому животному, к шестимесячному возрасту (П.М. Маслюков, 2003).

После рождения происходит последовательное увеличение площади сечения нейронов, что закономерно влечет уменьшение плотности нервных клеток на центральных срезах. У новорожденных животных плотность расположения нейронов равнялась 2614±169 на мм", у шестимесячных -515±16, соответственно (различия статистически достоверны, р<0,05). Те же закономерности установлены на звездчатом узле котят разных возрастов (П.М. Маслюков, 2003). Но, в отличие от кошки, у крысят не наблюдается различий в плотности расположения нейроцитов между правым и левым ганглиями, а также между каудальной и краниальной частями узла (А.Д. Ноздрачев, М.М. Фатеев, 2002; П.М. Маслюков, 2003).

В постнатальном онтогенезе крыс увеличивается доля средних (с площадью сечения 401-600 мкм2) и крупных клеток (с площадью сечения 601-800 мкм") и уменьшается процент мелких клеток (с площадью сечения до 400 мкм"). Клетки очень крупных размеров (более 1201 мкм") наблюдались только у шестимесячных животных. Эти результаты частично совпадают с данными, полученными на звездчатом ганглии котят разных возрастов, но у кошки очень крупные нейроны появляются уже на четвертом месяце жизни (П.М. Маслюков, 2003).

В онтогенезе крыс число нейронов в звездчатом узле достоверно не менялось и составило от 20637±3686 у новорожденного крысенка до 22473±2894 у шестимесячного, соответственно. Достоверных различий между правым и левым ганглиями не обнаружено. Эти результаты отличаются от данных, полученных у новорожденных котят, где число нейронов в правом и левом звездчатом узле различается и является максимальным, в то время как у взрослых кошек количество нейроцитов уменьшается и различий между ганглиями не выявлено (П.М. Маслюков, 2003). В краниальном шейном ганглии крысят также наблюдается уменьшение числа нервных клеток в течение первой постнатальной недели (Wright et al., 1983). По-видимому, в звездчатом узле крыс большинство нейробластов дифференцируется уже к моменту рождения.

Результаты нашего исследования свидетельствуют, что большинство нейронов звездчатого узла крысят уже с момента рождения содержат М1-холинорецепторы. В дальнейшем, в ходе возрастного развития, процент таких нейроцитов не меняется. Клетки на срезах ганглия располагались диффузно. В симпатических узлах взрослых млекопитающих ацетилхолин активирует никотиновые и мускариновые рецепторы, тем самым вызывая быстрый и медленный возбуждающий постсинаптический потенциал (Ес-cles et al., 1961; Kullmann, Horn, 2006). Синаптическая передача с участием

Ml- и М2-холинорецепторов доказана и в звездчатом узле взрослых крыс (Yang et al., 2006). Данные, полученные на краниальном шейном ганглии крысят и котят, свидетельствуют о наличии Ml- и М2-иммунореактивных нейронов к моменту рождения (Bairam et al., 2006; Ludlam et al., 1994).

Нами также установлено, что большинство М1-иммунопозитивных нейроцитов с момента рождения одновременно являются Р2Х2- и Р2Х6-позитивными. Есть сведения, что быстрая синаптическая пуринергическая передача, опосредуемая при участии Р2Х2 рецепторов, присутствует в верхнем шейном ганглии новорожденных и более взрослых животных (Dunn at al., 2001; Li et al., 2000). У взрослых крыс P2X2- и Р2Х6-подтипы пуринорецепторов преобладают в чревном и краниальном шейном узлах (Xiang et al., 1998). В отличие от крысы, у морской свинки в краниальном шейном ганглии обнаружены преимущественно Р2Х2- и Р2ХЗ-иммунопозитивные нейроны (Zhong et al., 2000). Нами установлено, что средняя площадь сечения нейронов, экспрессирующих мускариновые и пуринорецепторы, совпадает с аналогичным параметром катехоламинер-гических нейронов, содержащих тирозингидроксилазу в соответствующих, возрастных группах.

В нашем исследовании в звездчатом узле крысят всех возрастов выявлены единичные клетки, содержащие Р2ХЗ-пуринорецепторы. Этот тип рецепторов характерен для спинномозговых и тройничных ганглиев, кау-дального узла блуждающего нерва взрослой крысы (Xiang et al., 1998). По нашим наблюдениям, наибольшее число нейронов, содержащих Р2ХЗ рецепторы, наблюдается в 20-дневном возрасте. Похожие данные получены в работах на нервных клетках межмышечного сплетения желудка крысы, где пик экспрессии наблюдается к 14 дню постнатального развития (Xiang and Burnstock, 2004). Вероятно, Р2ХЗ-пуринорецептор влияет на созревание нейронов в ходе пренатального и начальных этапах постнатального онтогенеза (Ruan et al., 2004). Р2ХЗ-иммунореактивные нейроны в звездчатом узле представлены мелкими по размеру клетками.

Согласно литературным данным, функциональная роль мускарино-вых и пуринорецепторов нейронов симпатических узлов заключается в модуляции синаптической передачи, осуществляемой при участии никотиновых рецепторов (Burnstock, 2007; Kullmann and Horn, 2006).

В ходе наших исследований выявлено изменение иммуногистохими-ческих характеристик нейронов в постнатальном онтогенезе. Это согласуется с литературными данными, указывающими на то, что параллельно с функциональным созреванием в нейронах симпатических узлов идет перестройка медиаторного состава, которая может происходить под влиянием целого ряда различных трофических факторов (Ernsberger, 2001). Тем не менее, набор нейротрансмиттеров, характерный для взрослого организма, присутствует в звездчатом узле крыс уже с момента рождения.

Установлено, что также как и у взрослых, у новорожденных основная масса нервных клеток содержит фермент синтеза норадреналина и имеется небольшая популяция клеток, не содержащая катехоламинов. Часть же норадренергических нейронов солокализована и с другими ней-ротрансмиттерами. Различий между иммуногистохимическими особенностями нейронов правого и левого ганглия не наблюдалось. Клетки на срезах узлов располагались диффузно, а также группами.

У новорожденных животных в звездчатом ганглии большая часть нейроцитов содержала одновременно тирозингидроксилазу (ТГ) и нейро-пептид Y. Это согласуется с данными, полученными на звездчатом узле взрослой собаки, кошки и крысы (Lindh et al., 1989; Moriartry et al., 1995; Richardson et al., 2006). В краниальном шейном ганглии морской свинки данная группа нейроцитов также преобладает, начиная с периода раннего эмбриогенеза (Morris et al., 2001). В дальнейшем, в ходе возрастного развития, процент таких нейронов увеличивается. Очевидно, это можно объяснить ангиогенным эффектом нейропептида Y на возрастающее количество сосудов микроциркуляторного русла в процессе онтогенеза (Morris et al.,

2001). По своим размерам нейроны, содержащие TT и нейропептид Y, более мелкие по сравнению с клетками, имеющими только ТГ с момента рождения и до 30 дня жизни. В 2-х месячном возрасте наблюдалось обратное соотношение по средним размерам этих популяций нейронов.

По некоторым данным, холинергические нейроны во всех паравер-тебральных ганглиях зрело - и незрелорождающихся животных к моменту рождения являются норадренергическими, и лишь к началу 3-й недели жизни эти клетки приобретают присущий им фенотип (B.C. Шевелева, 1977). В отличие от этих представлений, нам удалось доказать наличие фермента синтеза ацетилхолина в нейронах звездчатого узла новорожденных животных. Это совпадает с данными, когда при проведении гистохимического исследования на ацетилхолинэстеразу у новорожденных котят в звездчатом ганглии выявлены клетки, дающие интенсивную реакцию (Masliukov et al., 2003). Большинство холинацетилтрансферазо-позитивных нейроцитов у новорожденных, 10- и 20-дневных крысят также являлись ТГ-положительными. Процент ТГ-позитивных нейронов, содержащих хо-линацетилтрансферазу, возрастал до 10 дня жизни, а затем снижался. Данный факт, возможно, объясняется уменьшением выделения органами-мишенями трофических факторов, влияющих на синтез ацетилхолина, либо запрограммированной гибелью нервных клеток с данным фенотипом.

В звездчатом ганглии крысят разных возрастов большинство холин-ацетилтрансферазо-позитивных нейроцитов являлись иммунореактивными к вазоинтестинальному пептиду (ВИП). Те же данные получены на звездчатом узле взрослых крыс и кошек (Morales et al., 1995; Anderson et al., 1995). Процент таких нейронов увеличивался в первые десять дней жизни, а затем уменьшался. Сходный паттерн (увеличение процентного соотношения меченых клеток между 10 и 20 днями жизни) продемонстрирован при исследовании связей нейронов звездчатого ганглия с органами-мишенями (Masliukov et al., 2000). Можно предположить, что в этом периоде орган-мишень может влиять на нейротрансмиттерные свойства нейрона. Эти клетки имели наиболее крупные размеры.

Более 40% соматостатин-положительных нейронов с момента рождения содержала ТГ. Доля таких клеток, а также соматостатин-иммунопозитивных нейроцитов, не солокализованных с ТГ, уменьшалась к десятидневному возрасту животных. Нами также установлено, что с момента рождения более 50% ВИП-содержащих нейроцитов солокализованы с соматостатином. С возрастом доля таких нервных клеток понижается. Уменьшение количества соматостатин- и ВИЛ- иммунореактивных нейронов наблюдается в звездчатом узле и у плода человека в процессе эмбриогенеза (Roudenok and Kuhnel, 2001).

Согласно литературным данным, возрастное уменьшение количества ВИЛ- и соматостатин-позитивных нейроцитов связано с их важным влиянием именно в период эмбриогенеза и раннего постнатального онтогенеза на митоз и выживаемость нервных клеток, рост нейритов (Pincus et al, 1990; Bulloch, 1987).

У крысят всех возрастов выявлены единичные ТГ-положительные клетки, солокализованные с галанином. Те же данные продемонстрированы в нейроцитах звездчатом узле взрослой морской свинки (Elfvin et al., 1994). В то время как в нейронах звездчатого узла кошки данный нейроме-диатор присутствует в большем количестве клеток (Lindh et al., 1989). Максимальное количество галанин-положительных нейронов обнаружено у одномесячных животных. Из литературы известно, что галанин содержится в волокнах, идущих к скелетным мышцам и капиллярам (Lindh et al., 1989).

Результаты нашей работы подтверждают имеющиеся литературные данные об отсутствии НАДФНД-реактивных нейронов в симпатических ганглиях крысят и мышей (Grozdanovic et al., 1992; Santer, Symons, 1993). Эти клетки характерны для чувствительных узлов данных животных (Aim et al., 1992; Grozdanovic et al., 1992). В отличие от грызунов, НАДФНДпозитивные нейроны наблюдаются в симпатических узлах котят уже с момента рождения (П.М. Маслюков, 2003). Можно сделать вывод, что у крыс нейромодулятор NO (оксид азота) не участвует в модуляции симпатической вазоконстрикции (Sander et al., 2000).

Данные, полученные при помощи микроэлектродной техники путем регистрации нейронной активности, совпадают с данными, полученными при регистрации фоновой активности в ветвях звездчатого узла, где также уже с момента рождения регистрировались колебания, синхронные с дыханием и ЭКГ (Masliukov, 2003; П.М.Маслюков, А.Д.Ноздрачев, 2006).

Фоновая электрическая активность нейронов звездчатого ганглия связана с поступлением импульсов по шейному симпатическому стволу. Перерезка преганглионарных волокон необратимо устраняет импульсацию нервных клеток в ганглии. Следовательно, автоматическая активность нейронов симпатических узлов отсутствует во всех возрастных периодах, начиная с момента рождения.

Импульсная активность нейронов звездчатого узла крысят ранних возрастных групп (новорожденных и 10-дневных) характеризовалась низкой частотой разрядов и наличием большого процента нейронов с апериодической активностью. Это можно объяснить морфологической и функциональной незрелостью нейронов и синаптической передачи в ранних возрастных периодах (Anderson et al., 2001; П.М.Маслюков, А.Д.Ноздрачев, 2006).

Нейроны, имеющие сердечную ритмику импульсации, не были обнаружены у животных первых десяти дней жизни. У 20-дневных крысят процент нейронов с таким характером импульсации был очень небольшим. Сравнительно небольшая доля нейронов с разрядами, синхронными с ЭКГ, в симпатических узлах у животных раннего возраста была отмечена в ряде работ (Sica et al., 1994; 2002). Вероятно, причиной таких изменений является перестройка взаимоотношений между симпатическим и парасимпатическим звеном автономной нервной системы и увеличения влияния на симпатическую нервную систему со стороны барорецепторов, преимущественно аортальной и синокаротидной зон.

Разряды, синхронные с сердечной деятельностью, являются результатом активности стволовых центров, в частности нейронов ростральной вентролатеральной области продолговатого мозга, ингибируемых импульсами от барорецепторов (Barman, Kenney, 2007; Gilbey, 2007). Дыхательная ритмика также имеет супраспинальное происхождение (Barman et al., 2005). В то же время, часть нейронов ростральной вентролатеральной области продолговатого мозга обладает спонтанной активностью, и внешние влияния могут лишь модулировать внутреннюю активность этого осциллятора. Помимо этого, приводятся доказательства участия других супраспи-нальных структур в генерации ритма: латерального тегментального поля, ретикулярной формации моста (Barman et al., 2005; Barman, Kenney, 2007; Gilbey, 2007; Pilowsky et al., 2008).

Во всех возрастных группах наибольший процент нейронов звездчатого ганглия проявлял нерегулярную активность. Это совпадает с данными, полученными на взрослых животных (В.И.Скок, А.Я.Иванов, 1989; McLachlan, 2003; Malpas, 2004). Тем не менее, в спектре мощности фоновой электрической активности, зарегистрированной от нервов, наибольшую часть занимают частоты, имеющие сердечную ритмику (Masliukov, 2003; П.М.Маслюков, А.Д.Ноздрачев, 2006). Возможная причина расхождений заключается в том, что в основе регистрации электрической активности от целых нервов лежит отведение суммированных потенциалов действия отдельных волокон. Чем более синхронны разряды в волокнах, тем больше амплитуда сигналов (Malpas, 2004). Очевидно, нейроны, проявляющие сердечную ритмику, разряжаются более синхронно по сравнению с нейронами, обнаруживающими другой характер активности.

Характер изменения средней амплитуды разряда отдельных нейронов сходен с аналогичным процессом в целом нерве (Masliukov, 2003; П.М.Маслюков, А.Д.Ноздрачев, 2006). При регистрации активности отдельных нейронов и целых нервов амплитуда потенциалов окончательно устанавливается к концу 1 месяца жизни.

Таким образом, звездчатый ганглий крысы уже с момента рождения является функционирующим элементом симпатической нервной системы. Анатомически у новорожденных крысят звездчатый ганглий является сформированным. Морфологически нейроны звездчатого ганглия с момента рождения содержат набор рецепторов и нейротрансмиттеров, характерный для взрослой крысы, но функционально нейроциты являются незрелыми. По-видимому, данный факт объясняется перестройкой как нервных связей и синаптических контактов внутри ганглия, так и генераторов ритма в спинном и продолговатом мозге в процессе постнатального онтогенеза. Изменение морфо-функциональных характеристик нейронов происходит гетерохронно. Окончательное формирование рецепторного состава нейронов звездчатого узла, характера фоновой нейронной активности завершается к концу первого месяца жизни. Созревание набора нейротрансмиттеров в звездчатом ганглии крысы завершается к концу второго месяца жизни.