Анализ профиля экспрессии генома клеток рака яичников

Малек, Анастасия Валерьевна

Диссертации по медицине → Онкология

Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Анализ профиля экспрессии генома клеток рака яичников

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Малек, Анастасия Валерьевна 0 г.

Ученая степень: кандидата медицинских наук

ВАК РФ: 14.00.14

Автореферат диссертации по медицине на тему Анализ профиля экспрессии генома клеток рака яичников

Малек

Анастасия Валерьевна

АНАЛИЗ ПРОФИЛЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОМА КЛЕТОК РАКА ЯИЧНИКОВ

Специальность: 14.00.14 ~ онкология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург 2005

Малек

Анастасия Валерьевна

АНАЛИЗ ПРОФИЛЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОМА КЛЕТОК РАКА ЯИЧНИКОВ

Специальность: 14.00.14 - онкология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург 2005

Работа выполнена в ГУН НИИ Онкологии им. проф.Н.Н.Петрова Министерства здравоохранения и Социального развития Российской Федерации и Институте Патологии Университета Гумбольдта (Германия)

Научный руководитель:

доктор медицинских наук Е.В. Бахидзе

Научный консультант:

профессор др. Райнхолъд Шефер (Германия)

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор E.H. Имянитов доктор медицинских наук, профессор В.Л. Винокуров

Ведущее учреждение:

Санкт-Петербургская Медицинская Академия Последипломного Образования

Зашита диссертации состоится « т » июня 2005 года, в_часов на заседании

Диссертационного Совета_ГУН НИИ онкологии им. проф.Н.Н.Петров

(197758, Санкт-Петербург, п.Песочный, ул. Ленинградская, 68)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке института. Автореферат разослан « 3 » мая 2005 года.

Ученый секретарь

Диссертационного Совета доктор медицинских наук

Р.В.Орлова

ВВЕДЕНИЕ Актуальность работы

Проблема диагностики и терапии эпителиальных опухолей яичников остается одной из самых трудных в современной онкологии. По данным Международного агентства по изучению рака, ежегодно в мире регистрируется более 200 тысяч новых случаев рака яичников, и более 100 тысяч женщин умирает от этого заболевания (Тег1ау I. е1 а1, 2001). В России ежегодно рак яичников выявляется более чем у 11 000 женщин, занимая седьмое место в структуре общей онкологической заболеваемости (Двойрин В.В. и соавт., 1996; Чиссов В.И. и Старинский В.В., 2000). Особенностью клинического течения рака яичпиков является отсутствие патогномопичных симптомов на начальных этапах заболевания. Наиболее частыми симптомами рака яичников являются асцит и гидроторакс, которые свидетельствуют об уже распространенном процессе. Современные представления о ключевых этапах патогенеза рака яичников носят описательный характер, что определяет отсутствие эффективных программ скрининга ранних стадий заболевания (Новикова Е.Г. и соавт., 1999; Максимов С.Я. и соавт., 2001).

Бессимптомное течение болезни является причиной тот, что почти в 70 % случаев диагноз устанавливается уже на поздней стадии. Терапия поздних стадий в большинстве случаев носит паллиативный или симптоматический характер (Орлова Р.В., 2000). В результате, рак яичников, уступая в показателе заболеваемости опухолям тела и шейки матки, является ведущей причиной смерти среди всех гинекологических опухолей. (Урманчеева А.Ф. и Мешкова Е.И., 2000; Мерабишвили В.М., 2001; Винокуров В.Л., 2004). Внедрение в широкую клиническую практику препаратов платины, и позднее, таксанов привело к некоторому росту выживаемости, наблюдающемуся с конца 80-х гг.

(Урманчеева А.Ф., 2002). За последние 20 лет несколько расширился стандартный объем оперативного вмешательства, доказана целесообразность циторедуктивных операций у больных с Ш-IV стадией заболевания (Hopkins W.J., 1993; Naijt J.P. et al, 1999; Жордания К.И., 2000). Разработаны методы системной лучевой терапии (Юркова J1.E. и соавт., 1999). Однако, не смотря на усовершенствование хирургических и лучевых методов лечения, применение современных цитостатиков, выживаемость больных раком яичников остается еще на весьма низком уровне, что определяет актуальность поиска принципиально новых подходов. Особое значение имеют фундаментальные исследования в области молекулярного канцерогенеза этой формы рака, открывающие перспективы генной терапии.

В течение последних лет активно развивается направление "таргетной" (target, англ. - мишень) генотерапии рака яичников. Метод основан на ипактивации экспрессии генов-мишеней, играющих значимую роль в прогрессии опухоли. Первые терапевтические схемы данного метода лечения рака яичников успешно проходят клинические испытания (Oza A.M. et al., 2003; Advani R. Et al., 2004). Цитостатический эффект "таргетной" генотерапии во многом зависит от правильного выбора генов - мишеней, которые должны отвечать следующим критериям:

1. активная экспрессия таких генов должна определяться в клетках рака яичников, но не в неизмененной ткани яичников,

2. инактивация экспрессии таких генов должна оказывать цитостатический эффект на клетки рака яичников.

Наличие надежных и эффективных мишеней генотерапии означает возможность расширения поля клинических исследований и вероятность скорого внедрения данной методики в практику. Это определяет актуальность работы по поиску генов, активно экспрессированных в клетках рака яичников и определению эффекта их инактивации на доклинических этапах.

Цель и задачи исследования.

Целью данного исследования являлся поиск генов, высоко экспрессированных в клетках серозного рака яичников, инактивация которых оказывает щггостатический эффект на опухолевые клетки. Поиск генов, удовлетворяющих данным критериям, требовал последовательного решения следующих задач:

1. Анализ данных геномных экспрессионных исследований рака яичников, выполненных различными методами и с использованием различного биологического материала. Данный этап работы позволял сделать предварительный выбор генов, активация экспрессии которых сопутствует развитию рака яичников.

2. Анализ литературных данных о функциональной роли протеинов, кодируемых выбранными генами. Данный этап работы позволял сузить список исследуемых генов, исходя из предполагаемой терапевтической значимости инактивации их экспрессии.

3. Оценка уровня экспрессии выбранных генов в образцах тканей серозного рака яичников и неизмененных яичников. На данном этапе работы предполагалось выбрать гены, экспрессия которых не характерна клеткам поверхностного эпителия нормальных яичников и уровень экспрессии которых отчетливо повышен в опухолевых клетках.

5. Оценка эффекта инактивации экспрессии выбранных генов в нескольких культурах клеток серозной аденокарциномы яичников методом РНК-интерференции. Результатом заключительного этапа работы

предполагалось описание генов, инактивация экспрессии оказывает цитостатический эффект на клетки рака яичников.

которых

Научная новизна и практическая значимость полученных результатов

Представленная диссертационная работа имеет научно-прикладную направленность. В частности, в исследовании:

• отработана принципиальная схема поиска генов — мишеней «таргентой» генотерапии рака яичников, основанного на сравнительном анализе результатов геномных экспрессионных исследований,

• показано, что ген HMGA2, кодирующий архитектурный фактор транскрипции, может быть использован как эффективная и безопасная мишень «таргетной» терапии серозного рака яичников.

Положения, выносимые на защиту

1. Эффективный скрининг генов - потенциальных мишеней «таргетной» терапии может быть проведен путем сравнительного анализа данных двух или более геномно-экспрессионных исследований, выполненных разными методами.

2. HMGA2 ген, кодирующий одноименный архитектурный транскрипционный фактор, не экспрессируется клетками нормального поверхностного эпителия яичников. Активация экспрессии HMG А2 гена является особенностью клеток серозного рака яичников.

3. Экзогенная экспрессия HMG А2 гена в клетках нормального поверхностного эпителия яичников не имеет значимого биологического эффекта и не инициирует трансформацию клеток. HMG А2 ген не является в данном случае онкогеном.

4. Инактивация эндогенной экспрессии НМв А2 гена в клетках рака яичников существенно ингибирует пролиферацию клеток, т.е. имеет отчетливый цитостатический эффект. НМЮ А2 ген может быть эффективной и безопасной мишенью «таргетной» генотерапии рака яичников.

5. Терапевтическая инактивация экспрессии генов, не обладающих самостоятельным трансформирующим эффектом на клетки поверхностного эпителия яичников, но активируемых в ходе неопластической трансформации этих клеток, является допустимой стратегией «таргетной» генотерапии.

Апробация работы

Результаты работы были представлены па:

• научно-практической конференции «Современные подходы к диагностике и лечению гинекологического рака» (Псков, сентябрь 2004),

• научно-практической конференции Института Пагологии Университета Гумбольдта (Берлин, сентябрь 2004),

• VIII Российском Онкологическом Конгрессе (Москва, ноябрь 2004)

• научно-практической конференции НИИ онкологии им. проф. Н.Н.Петрова (Санкт-Петрбург, апрель 2005).

Структура и объём диссертаиии

Диссертация изложена на _ страницах машинописного текста, состоит из

введения, четырех глав, выводов, приложений и списка цитируемой литературы. Работа иллюстрирована 4 таблицами, 8 графиками и 22 рисунками. Библиографический указатель включает_публикаций.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Представленная диссертационная работа состояла из трех логических этапов, которые условно могут быть названы: аналитический, клинический и экспериментальный. Материалы и методы, использованные на каждом этапе, представлены в трех разделах.

1. Аналитический этап.

Геномный анализ процесса малигнизапии ПЭЯ методом субтрактивной супрессионной гибридизации.

Работа была проведена в лаборатории Молекулярной Онкологии Института Патологии Университета Гумбольдта, Берлин (Molekulare Tumorpathologie, Institut für Pathologie, Humboldt-Universität zu Berlin) (Tchernitsa O.I. et al., 2004). Материалом для исследования послужили две клеточные линии. Клетки линии ROSE-199 (Rat Ovarian Surface Epithelium) использовалась в качестве модели нормального поверхностного эпителия яичников. Клеточная линия ROSE А2/5 была получена авторами работы в результате K-RAS-зависимой трансформации клеток ROSE-199 и использована в качестве модели рака яичников. Выделение информационной РНК (иРНК) из клеток обеих линий, синтез комплиментарной ДНК (кДНК) и супрессионная субтрактивная гибридизация между двумя пулами кДНК были проведены с помощью набора необходимых реагентов (Clontech) и в соответствии с протоколами фирмы-производителя. Пул субтрагированных кДНК последовательностей был обогащен с помощью ПЦР и клонирован в pCR2.1 экспрессионный вектор. Сиквенирующий анализ клонов полученной библиотеки и последующая идентификация каждой последовательности с помощью программы BLAST доступной через сеть Интернет на сервере National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) позволили описать более чем 200 генов, уровень экспрессии которых существенно изменился в ходе малигнизации. Для данного исследования интерес представляли

89 генов, экспрессия которых была существенно активирована в трансформированных клетках и инактивация которых могла бы иметь терапевтический эффект.

Геномный анализ экспрессионного профиля клеток рака яичников методом

«■ДНУ-чррейч гибридизации

Работа была проведена в Геномном Институте научно-исследовательской организации «Новартис», Сан Диего (Genomics Institute of the Novartis Research Foundation, San Diego, CA) (Welsh J.B. et al., 2001). Материалом для исследования послужили 27 образцов серозной аденокарциномы яичников и три образца поверхностного эпителия нормальных яичников. Выделение и мечение РНК из исследуемых образцов было проведено с помощью набора реагентов (Qiagen) и в соответствии с протоколами фирмы-изготовителя. Для исследования использовались геномные чипы (Aflymetrix), с помощью гибридизации которых был определен уровень экспрессии более чем 6000 известных генов во всех перечисленных образцах.

Сравнительный анализ данных двух геномных исследований, выбор генов

Результаты исследования John B.Welsh требовали статистической обработки, которая была проведена методом SAM -анализа (Statistical Analysis of Microarrays). Данный метод позволяет вычислить стандартное отклонение случайного показателя для данного исследования и исключить из последующего анализа статистически незначимые данные. Таким образом, из исходных шести тысяч генов было отобрано 4080.

Следующим этапом было произведено вычисление усредненного показателя интенсивности экспрессии каждого гена в 27 образцах рака и трех образцах неизмененной ткани. Для удобства последующие вычисления проводились не с собственно данным показателем интенсивности (X), а с его логарифмом по основанию 2 (Y=log2X). Отношение двух логарифмированных

показателей Z=(Ypak/YHOpMa) отражало вектор и степень изменения экспрессионной активности гена в ткани опухоли относительно нормального поверхностного эпителия яичников и колебалось от -13.2 до 18.1. Негативное значение свидетельствовало о депрессии транскрипционной активности гена в ткани опухоли относительно нормального эпителия; позитивное значение, соответственно, говорило об активации экспрессии гена в опухолевых клетках по сравнению с нормальным эпителием. Для данной работы интерес представляли гены с повышенным уровнем экспрессии в опухолевой ткани, таковых было 1810. Кроме того, имела значение степень активации. Поэтому, гены с показателем Z ниже 1 (единицы) были исключены из последующего анализа, т.к. степень их активации была сочтена не значимой. В результате данного этапа работы было отобрано 804 гена.

Затем было произведен сравнительный анализ данных двух геномных исследований, т.е. отбор генов, с высоким уровнем экспрессии как в клетках ROSF А2/5 по результатам первого исследования (89 генов), так и в клетках «усредненного» рака яичников по итогам анализа результатов второго (804 гена). Лишь 19 генов были представлены одновременно в обоих списках.

Гипотеза о возможной терапевтической эффективности инактивации исследуемых генов в клетках серозного рака яичников определяла принцип сужения списка. Выбор генов был основан на анализе информации об экспрессионной активности в различных тканях организма, изменениях экспрессии в ходе физиологических или патологических процессов, известных функциях кодируемых данными генами протеинов. Поиск литературных данных о каждом из 19 генов был проведен с помощью программы PubMed доступной через сеть Интернет на сервере National Center for Biotechnologylnformation: (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db::=PubMed).

2. Клинический этап

Отбор и подготовка биологических образцов

Работа была проведена на базе отделения Онкогинекологии НИИ Онкологии им. проф. Н.Н.Петрова, Санкт-Петербург и Отделении Гинекологии клиники Шарите Университета им. Гумбольдта, Берлин (Humboldt-Universität zu Berlin, Medizinische Fakultät Charité). Для исследования были использованы 46 образцов ткани серозного рака яичников и 12 образцов ткани неизмененных яичников, полученные во время хирургических вмешательств. Больные раком яичников имели различную степень распространенности опухолевого процесса (классификация FIGO 1989 года): I ст. (1), П ст. (6), III ст. (25) и IV ст. (14). Гистологические варианты серозного рака яичников были представлены образцами папилярной (14), гландулярной (21) и солидной (И) аденокарциномы. Образцы опухолевых тканей имели низкую G3 (23), среднюю G2 (20) или высокую Gl (3) степень дифференциации по критерию Silverberg.

Непосредственно после хирургического удаления ткани были заморожены в жидком азоте, и в дальнейшем материал хранился при -80 °С. При температуре -20°С из охлажденного материала были приготовлены срезы толщиной 8 мкм, которые переносились на предметов стекло и высушивались при комнатной температуре в течение 1 часа. Фиксация тканей производилась забуференным раствором параформальдегида.

Синтез РНК-зондов и in situ РНК гибридизация

ДНК фрагменты, соответствующие иРНК исследуемых генов, были получены в ходе ПЦР реакции на матрице плацентарной кДНК. Для синтеза антисмыслового зонда последовательность прямого праймера была дополнена промотором для Т7 РНК-нолимеразы. Для синтеза смыслового зонда последовательность обратного праймера включала в себя Т7 промотер. Условия ПЦР: 95°С 2 мин, цикл 95°С 30 сек, 67°С 30 сек, 72°С 120 сек, 30 циклов. Дизайн праймеров производился с таким расчетом, что бы полученные ДНК фрагменты имели размер 250-300 нуклеотидов и содержание GC связей 35-50%.

В ходе реакции in vitro транскрипции с использованием Т7 полимеразы, меченых дигоксигенином рибонуклеотидов и ПЦР-фрагментов в качестве матрицы бьши получены смысловые и антисмысловые РНК зонды длиной 250300 нуклеотидов для каждого исследуемого гена. Меченый дигоксигенином РНК-зонд антисмысловой ориентации, комплиментарный иРНК исследуемого гена, использовался в реакции in situ РНК гибридизации. В качестве негативного контроля проводилась гибридизация со смысловым зондом, последовательность которого идентична иРНК. С целью контроля сохранности РНК каждого образца, в качестве позитивного контроля реакции проводилась гибридизация с зондом, комплиментарным мРНК гена «домашнего хозяйства», ß-актина.

Предгибридизация приготовленных срезов проводилась в гибридизационном буфере при комнатной температуре в течение 4 часов. In situ РНК гибридизация проводилась 16-18 часов в свежем гибридизационном буфере, содержащем меченые дигоксигенином РНК-зонды в концентрации 400 нг/мл. Температурные условия гибридизации определялись по формуле:

Т= 16.6 logM + 0.41 (GC%) + 81.5 - 0.72 (% formamide), где М - молярность Na+ в гибридизационном растворе GC% - содержание GC оснований в зонде % formamide - содержание формамида в гибр. растворе После гибридизации образцы подлежали отмыванию в 5х SSC растворе, 64°С, 15 мин дважды и в 0,5 х SSC растворе, 64 °С, 30 мин. Для разрушения неспецифично связавшихся молекул зонда образцы были обработаны раствором РНКазы в концентрации 20 мкг/мл при 37°С, 30 минут.

Визуализация результатов гибридизации проводилась методом прямой иммунологической детекции. Использовались антитела, специфично связывающиеся с дигоксигенином и коньюгировапные с ферментом щелочной фосфатазой. Условия реакции соответствовали протоколу фирмы-изготовителя (Roche). Щелочная фосфатаза образует нерастворимый, контрастно окрашенный продукт в реакции с хромогенным субстратом (нитросиний тетразолий IICT и 5-

бром-4-хлор-З-индолилфосфат БХИФ). Реакция детекции проводилась в растворе, содержащем 0,16 мг/мл БХИФ и 0,33 мг/мл HCT при комнатной температуре, время инкубации 30-40 мин. В заключении, образцы были окрашены гематоксилином и монтированы в прозрачную затвердевающую среду. Оценка результатов эксперимента проводилась с помощью светового микроскопа.

3. Экспериментальный этан.

Экзогенная экспрессия HMG А2 гена в клетках поверхностного эпителия

яичников.

В качестве экспериментальной модели поверхностного эпителия яичников была использована клеточная культура ROSE-199 (Rat Ovarían Surface Epithelium) (Adams A.T. and Auersperg N., 1985). Клетки ROSE 199 линии характеризуются относительной доброкачественностью и могут служить моделью для изучения генетики клеток поверхностного эпителия яичников. Клетки культивировались в среде DMEM, Dulbecco's Modified Eagle's Medium (Mediatech) с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки, при 5% С02 и 37°С. Среда содержала все необходимые соли, органические соединения и витамины, необходимые для культивирования клеток млекопитающих in vitro.

В качестве экспрессионного вектора была использована плазмида pEF6 (Invitrogen). В состав вектора включены гены устойчивости к ампициллину и бластицидину, экспрессия клонированной последовательности происходила под контролем промотера фактора элонгации EF-la. Клонированный фрагмент включал транслируемый участок иРНК гена HMG А2 (NM_003483).

Трансфекция проводилась с помощью трансфекционного реагента FuGene (Roche) в соответствии с рекомендациями фирмы изготовителя. Трансфекция проходила в обычных условиях культивации в течение 48 часов. После чего клетки были трипсинизированы и рассажены в разведении 1:20, через 4 часа был добавлен селекционный агент, бластицидин, в концентрации 10 мг/мл. Формирование устойчивых к бластицидину колоний происходило в течение 5 -7

дттей. Затем отдельные колонии были выделены и культивированы до необходимого для анализа количества.

Инактивация эндогенной экспрессии НМО А2 гена в клетках рака яичников

Для проведения эксперимента были выбраны следующие клеточные линии:

А27/80 Культура клеток первичной аденокарциномы яичников (European Cell Culture Collection)

Ovca-3 Культура клеток первичной аденокарциномы яичников (American Type Cilture Collection)

Skov-3 Культура клеток, полученных из ацситической жидкости пациентки с цистаденокарциномой яичников (American Type Cilture Collection)

Клетки культивировались в среде DMEM, Dulbecco's Modified Eagle's Medium (Mediatech) с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки, при 5% С02 и 37°С.

Инактивация эндогенной экспрессии HMG А2 гена проводилась с помощью метода РНК-интерференции. Для этого были изготовлены РНК-РНК дуплексы, длиной 19 пар нуклеотидов, последовательность которых соответствовала последовательности гена-мишени. Дизайн дуплексов осуществлен с помощью компьютерной программы, которая проводит автомашзированный подбор оптимальних последовательностей дуплексов для РНК-интерференции с учетом вторичной структуры иРНК - мишени и известных требований к структуре дуплекса. Программа доступна через сеть Интернет на сервере New York State Department of Health: (http://sfold.wadsworth.org/index.pl) Синтез дуплексов был проведен с помощью реакции in vitro транскрипции, в соответствии с протоколом фирмы-изготовителя набора соответствующих реагентов (Ambion).

Транфекция опухолевых клеток РНК-дуплексом была проведена с помощью трансфекционного реагента Oligofektamine (Invitrogene) в соответствии с

протоколом фирмы-производителя. Трансфекционный реагент и РНК-дуплексы были объединены в рекомендованном соотношении. Количество РНК расчитывалось исходя из необходимой финальной концентрации 1нМ.

Трансфекционная смесь была добавлена в культуральную среду при конфлюэнтности клеток 40-50%. Время трансфекции - 4 часа, по истечении которых, клетки возвращались в обычные условия. Процедура трансфекции повторялась через 24 часа, т.к. такой режим позволял добиться оптимального результата. Для контроля токсического эффекта трансфекциотшого реагента использовалась трансфекционная смесь без РНК. Для контроля неспецифического воздействия РНК дуплексов параллельно проводилась трансфекция контрольным дуплексом случайной последовательности в аналогичной концентрации. Через 48 часов от начала процедуры клетки были готовы для анализа эффективности и эффекта инактивации эндогенной экспрессии HMG А2 протеина.

Оценка эффективности трансфекции

Оценка эффективности экзогенной экспрессии HMG А2 гена в клетках ROSE 199 и ингибирования эндогенной экспрессии в клетках опухолевых линий была проведена путем определения уровня иРНК и протеина HMG А2.

Для выделения тотальной РНК клетки выращивались до конфлюэнтности 80-90% в культур ал ьных чашках диаметром 10 см. Тотальная РНК выделялась с помощью набора реагентов (QIAGEN) в соответствии с протоколом фирмы-изготовителя. Определение уровня HMG А2 специфической РНК проводилось с помощью последовательных реакций обратной транскрипции и ПЦР. Праймеры: прямой 5'-tgggaggagcgaaatctaaa-3', обратный 5'-aagcaccttggtcaaccatc -3'. Условия реакции: ОТ 50°С - 30 мин, ПЦР 94°С - 2мин, 30 циклов: 94°С - 10 сек, 65°С - 30 сек, 68°С - 45 сек. Анализ ПЦР- продукта проводился с помощью электрофореза в 1.5% агарозном геле.

Для выделения протеинов клетки выращивались до конфлюэнтности 8090% в культуральных чашках диаметром 10 см. Клетки были отмыты от среды

изотоническим раствором при температуре 4°С, и затем дважды глубоко заморожены в жидком азоте на 5-10 секунд для разрушения ДНК-протеиновых связей и инкубированы в 500 мкл дотирующего буфера. Разделение протеинов было проведено с помощью электрофореза в 15% полиакриламидном геле. Затем протеины были перенесены на поливинилхлоридную мембрану с помощью устройства, обеспечивающего плотный контакт мембраны и геля и разность потенциалов между ними 16 V.

Для реакции иммунодетекции HMG А2 протеина использовались поликлональные кроличьи антитела (Babeo). Визуализация сигнала проводилась путем инкубации фотопленки с мембраной в присутствии субстратов, химическое взаимодействие которых катализировалось связанным с антителом ферментом, и сопровождалось флуоресцентной эмиссией и засвечиванием фотопленки. Интенсивность сигнала соответствовала количеству HMG А2 протеина в клетках.

Оценка эффекта трансфекпии

Оценка эффекта, оказанного экзогенной экспрессией или ингибированием эндогенной экспрессии изучаемого гена на биологию клеток, проводилась на основании функциональных исследований: измерения скорости пролиферации клеток на адгезивном и неадгезивном субстрате.

Оценка скорости пролиферации клеток проводилась методом неизотопной количественной колориметрии. Для этого использовалось биологически инертное вещество ХТТ, sodium 3'-(l-(phenylaminocarbonyl)-3,4-tetrazolium)-bis(4-methoxy-6-nitro) benzene sulfonic acid hydrate, метаболизируемое клетками до окрашенного продукта. При этом скорость метаболизма, и соответственно интенсивность окраски среды, была пропорциональна количеству клеток. Каждое измерение повторялось в трех независимых экспериментах. Затем определялось среднее значение трех измерений (ц) и стандартная ошибка трех измерений (8) по формуле:

g I (п1-ц), (п2-ц), (пЗ-ц)

Построение графических кривых, отражающих скорость пролиферации клеток производилось с помощью программы Microsoft Excel.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Выбор пяти генов - потенциальных мишеней «таргетной» терапии на основании сравнительного анализа данных геномно-экспрессионных исследований.

Выбор генов, для оценки уровня и значимости их экспрессии в клетках поверхностного эпителия нормальных яичников и клетках серозного рака яичников, был основан на анализе и сопоставлении результатов двух геномных исследований, любезно предоставленных авторами. Материалом для исследования, проведенного в лаборатории Молекулярной Онкологии (Tchemitsa O.I., 2004) послужили две клеточные линии: ROSE-199 (Rat Ovarian Surface Epithelium) - в качестве модели нормального поверхностного эпителия яичников, и ROSE А2/5, полученная в результате K-RAS-зависимой трансформации клеток ROSE-199, - в качестве модели рака яичников. Работа была выполнена методом супрессионной субтрактивной гибридизации. Непосредственная экстраполяция полученных данных на процесс малигнизации покровного эпителия яичников человека была бы некорректна по двум причинам. Во-первых, моделью служили крысиные клетки, и во-вторых, онкоген RAS участвует в развитии рака яичников лишь в 25-40% случаев и RAS-индуцированная трансформация не может отражать всех особенностей овариального канцерогенеза. Поэтому была произведена компиляция результатов этой работы с данными другого геномно-экспрессионного исследования.

В работе Геномного Института научно-исследовательской организации «Новартис» (Welsh J.B., 2000) был использован метод кДНК-эррэйз гибридизации. Материалом для работы послужило 27 образцов серозной аденокарциномы яичников, три образца нормальных яичников и несколько клеточных линий. Оценка уровня экспрессии более чем 6000 генов показала существенную разнородность образцов опухолевой ткани, несмотря на их гистологическое сходство. Поэтому определение значимости изменений экспрессионного профиля конкретного гена проводилась путем вычисления отношения усредненного показателя экспрессии данного гена во всех 27 опухолях к показателю его экспрессии в образцах нормального ПЭЯ. Число исследуемых данным методом генов сравнительно велико, но ограничено - нельзя исключить, что важные в плане диагностики или терапии гены еще не известны, и не представлены на чипе. Недостатком также является присутствие в исследуемых образцах тканей клеток крови и стромы, что привносит неизбежные искажения в результат.

Сравнительный анализ результатов двух исследований позволил исключить гены, активация которых была лишь признаком RAS-зависимой трансформации крысиных клеток или случайной особенностью отдельных образцов опухолевой ткани. Результатом такой компиляции было лишь 19 генов, но участие этих генов в овариальном канцерогенезе могло быть оценено как весьма вероятное уже на данном этапе работы. Анализ литературных данных о функциональной значимости белковых продуктов этих генов лежал в основе предположения об эффективности их терапевтической инактивации в клетках рака яичников. Последним критерием была предполагаемая безопасность инактивации этих генов в нормальных клетках. Анализ данных о тканеспецифической экспрессии выбранных генов, изучение структуры и биологической функции белковых продуктов позволили сузить список до пяти генов, представленных в таблице 1.

Таблица 1. 17

Номер (Gene Bank) Название гена

NM 000593 Homo sapiens transporter 1, sub-family В (MDR/TAP),(TAP-1 )

NM 006389 Human 150 kDa oxygen-regulated protein, (ORP150)

NM_003483 Homo sapiens high mobility group AT-hook 2, (HMGA2)

NM_004419 Ilomo sapiens dual specificity phosphatase 5, (DUSP5)

NM_012329 H.sapiens mRNA for transcript associated with monocyte to macrophage differentiation, (TAMMD)

С помощью метола in situ РНК-гибридизации показан высокий уровень экспрессии гена HMGA2 в клетках серозного рака яичников в 73.9% и отсутствие детектируемого уровня экспрессии в ткани нормальных яичников.

Методика in situ РНК гибридизации используется в биологии около 20 лет. Принцип метода заключается в комплиментарной гибридизации иРНК клеток ткани, аспирата или культуры с меченой РНК молекулой - зондом. К достоинствам метода можно отнести высокую чувствительность и возможность оценки уровня экспрессии изучаемого гена в контексте гистологической картины ткани. Именно поэтому методика in situ гибридизации была выбрана для верификации данных геномных исследований. Результаты этого этапа работы позволили оценить факт и степень активации экспрессии исследуемых генов в каждом образце опухолевой ткани и сопоставить эти данные с гистологической картиной. Позитивный гибридизационный сигнал выглядел как более или менее интенсивное скопление черных точечных преципитатов на фоне окрашенной гематоксилином ткани. На Рисунке 1. представлены результаы гибридизации HMG А2 - специфичного зонда с образцами ткани нормального яичника и серозной аденокарциномы яичника. Экспрессии HMG А2 гена не детектируется в ткани неизмененного яичника, но отчетливо определяется в опухолевой ткани.

Рисунок 1.

Ткань нормального яичника, гибридизация с антисмысловым (1.) и со смысловым (2.) зондом в качестве негативного контроля. Ткань серозной аденокарциномы яичников, гибридизация с антисмысловым зондом (3.) и со смысловым (4.) зондом в качестве негативного контроля.

Уровень экспрессии всех исследуемых генов в ткани неизмененных яичников был ниже порога чувствительности метода in situ РНК гибридизации. Результаты оценки интенсивности экспрессии этих генов в образцах опухолевых тканей и особенности распределения позитивного сигнала представлены в Таблице 2.

Таблица 2.

Название гена Интенсивность сигнала Особенности распределения

- -/+ ++ +++

ТАР-1 41 5 0 0 Локальные очаги без гистологических особенностей

ORP-150 36 4 5 1 Сигнал локализован в зоне, окружающей очаги деструкции

HMGA2 12 9 14 11 Сигнал отчетливо ассоциирован с очагами опухолевой пролиферации, практически отсутствует в строме

DUSP-5 36 9 1 0 Диффузное распределение сигнала

TAMMD 41 5 0 0 Позитивный сигнал ассоциирован с очагами мононуклеарной инфильтрации

На данном этапе исследования наиболее интересные результаты были получены для гена HMG А2. Более или менее активная экспрессия HMG А2 гена была определена в 73,9% образцов серозного рака яичников, причем активная экспрессия этого гена была более характерна для опухолей низкой степени дифференцировки. Ген HMG А2 был выбран для дальнейших исследований.

Активная экзогенная экспрессия гена HMG А2 не оказывает существенного влияния на биологию нормальных клеток поверхностного эпителия яичников.

В результате трансфекции клеток ROSE 199 плазмидным вектором pEF6, несущим транскрибируемый регион гена HMG А2 под контролем промотера фактора элонгации EF-la, удалось получить клоны клеток, имеющих высокий уровень экспрессии HMG А2 протеина. Морфология клеток не претерпела заметных изменений вследствие экспериментальной экзогенной экспрессии HMG

А2 гена. Также не изменилась скорость роста клеток на адгезивном субстрате, и клетки не приобрели способности неадгезивного роста.

Полученные данные говорят о том, что для клеток поверхностного эпителия яичников активация экспрессии НМО А2 гена не является фактором, достаточным для неопластической трансформации. Вероятно, активация экспрессии этого гена является вторичной и происходит в процессе протрессии опухоли.

Инактивация эндогенной экспрессии гена НМО А2 гена в опухолевых

клетках оказывает цитостатический эффект.

Для данного исследования были выбраны культуры клеток серозной аденокарциномы, имеющих исходно относительно высокий уровень экспрессии ШШ А2 гена: А27/80, Огса-З, Бкоу-З. Эффективное подавление функциональной активности гена было проведено методом РНК-интерференции с использованием дуплекса, комплиментарного 1193-1214 участку мРНК молекулы. В результате процедуры уровень НМв А2 протеина в клетках снизился до недетектируемого.

Инактивация эндогенной экспрессии ГО/Ю А2 гена привела к изменению морфологии опухолевых клеток, особенно отчетливых для клеток линий А27/80 и Оуса-З. Клетки приобрели несколько уплощенную форму, что определяет более доброкачественный фенотип. Оценка изменения пролиферативной активности клеток была проведена путем измерения интенсивности пролиферации в течение 92 часов на адгезивном и неадгезивном субстрате (графики 1 и 2). Исследование показало, что инактивация экспрессии НМО А2 гена приводит к подавлению как адгезивного, так и неадгезивного роста опухолевых клеток. Полученные данные свидетельствуют об отчетливом цитостатическом эффекте проведенной манипуляции.

График 1. Изменение интенсивности пролиферации опухолевых клеток на адгезивном субстрате

[□анти-НМ(ЗА2дуплекс в контроль

ж 0.5

| 0,45 У 0,4 t 0,35 | 0,3 5 0,25 -

§ 02 г

1 0.15 +

| 0,1

I 0,05

* 0-1-

А27/80

0\са-3

Экот-З

График 2. Изменение интенсивности пролиферации опухолевых клеток на неадгезивном субстрате

Представленные данные свидетельствуют о том, что активная экспрессия НМв А2 гена является значимой для биологии опухолевых клеток. Функциональная инактивация этого гена приводит к частичной реверсии клеток к нормальной эпителиальной морфологии и замедлению скорости пролиферации. Не смотря на отсутствие самостоятельной онкогенной активности, НМв А2 ген

может служить эффективной мишенью «таргетной» терапии серозного рака яичников. Результаты других исследований также свидетельствуют о том, что подавление экспрессии генов группы HMG А может иметь терапевтическое значение. Так, подавление экспрессии HMG А1 гена в клеточных культурах, полученных из опухолевых тканей с характерным высоким уровнем экспрессии этого гена (рак толстой кишки, яичников, легких, молочной железы), имело отчетливый цитостатический эффект (Scala S. et al., 2000).

Адресность воздействия является одной из основных проблем реализации не только генотерапевтических методов, но и традиционных схем лекарственной цитостатической терапии. Важной особенностью HMG А2 гена, как мишени «таргетной» терапии, является отсутствие его экспрессии в тканях взрослого организма (Hirning-Holz U. et al., 1998, Gattas G.J. et al., 1999). Неактивность HMG A2 гена в клетках здоровых тканей определяет безопасность его системной инактивации, т.е возможность внутривенного или внутриперитонеального введения терапевтического конструкта.

Достижение цитостатического эффекта путем инактивации экспрессии HMG А2 гена в клетках рака яичника in vitro - лишь шаг на пути создания метода «таргетной» генотерапии этого заболевания. Для реального применения этой методики необходима информация о десятках или сотнях генов с аналогичными терапевтическими характеристиками, что определило бы возможность диагностики и целенаправленного воздействия в каждом клиническом случае. Разработка адекватной системы трансфекции, вероятно на основе методики РНК-интерференции, является вторьм ключевым этапом этой работы. В представленном исследовании предложен и отработан метод поиска мишеней «таргетной» генотерапии серозного рака яичников.

ВЫВОДЫ

Сравнительный анализ данных геномных экспрессионных исследований рака яичников, выполненных методами кДНК-эррэйз и субтрактивной супрессионной гибридизации, показал совпадение результатов по ряду генов, в частности: ТАР-1 (NM 000593), ORP150 (NM_006389), HMGA2 (NM_003483), DUSP5 (NM_004419) и TAMMD (NM_012329). Оценка экспрессионного статуса этих генов в ткани рака яичников показала активацию экспрессии генов: ТАР-1 в 10.8%, ORP150 в 21.7%, HMG А2 в 73.9%, DUSP5 в 21,7% и TAMMD в 10.8% случаев. Эти данные позволяют заключить, что активация экспрессии HMG А2 гена является частой особенностью клеток серозного рака яичников.

Вероятность экспрессионной активности гена HMG А2 оказалась тем выше, чем ниже была степень дифференциации ткани опухоли: G3 (78.3%), G2 (70%) и G1 (66.6%). Несколько чаще экспрессия HMG А2 гена определялась в опухолях солидной структуры (81,8%), чем папиллярной (75,7%) или гландулярной (61.9%). Корреляции между фактом экспрессии HMG А2 гена клетками опухоли и стадией распространенности опухолевого процесса обнаружено не было.

Клетки покровного эпителия нормальных яичников, эпителия выстилающего глубокие инвагинации и инклюзионные кисты яичников не экспрессируют HMG А2 ген или уровень этой экспрессии ниже порога чувствительности метода in situ гибридизации.

Экзогенная экспрессия HMG А2 гена в клетках неизмененного поверхностного эпителия яичников не имеет значимого биологического эффекта и не инициирует трансформацию клеток. Таким образом, HMG А2 ген не является в данном случае онкогеном.

В результате процедуры РНК-интерференции с использованием дуплекса N3, комплементарного 1193-1214 участку иРНК молекулы, в клетках трех

опухолевых линий была достигнута полная (Ovca-3, Skov-З) или частичная (А27/80) деградация соответствующей иРНК и прекращение синтеза HMG А2 протеина.

• Максимальный эффект снижения уровня иРНК наблюдался после двукратной процедуры и сохранялся в течение 16-24 часов, через 72 часа уровень иРНК восстанавливался до исходного. Эффект депрессии иРНК был пролонгирован повторными трансфекциями.

• Инактивация эндогенной экспрессии HMG А2 гена в клетках рака яичников существенно ингибировала пролиферацию клеток па адгезивном и неадгезивном субстрате, т.е. оказывала отчетливый цитостатический эффект.

• В совокупности, результаты клинического и экспериментального этапов исследования показали специфичность и значимость экспрессии HMG А2 гена клетками серозного рака яичников, что удовлетворяет двум основным критериям поиска генов - мишеней инактивирующей терапии. Таким образом, инактивация экспрессии HMG А2 гена может быть признана стратегией безопасной и эффективной «таргетной» генотерапии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Малек A.B., Бахидзе Е.В. // Активация экспрессии HMG А2 гена в процессе развитая серозного рака яичников // Материалы научно-практической конференции «Современные подходы в диагностике и терапии гинекологического рака» (16-17 сентября 2004 года), Псков.

2. Малек A.B., Бахидзе Е.В. // Поиск генов-мишеней для антисеис-терапии серозного рака яичников // Материалы VIII Российского онкологического конгресса (23-25 ноября 2004 года), Москва.

3. Бахидзе Е.В., Малек A.B. Значение методов исследования генома для диагностики и терапии рака яичников // Вопросы онкологии.- 2005.- N1.-стр. 50-55.

На правах рукописи

Анастасия Валерьевна Малек

АНАЛИЗ ПРОФИЛЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОМА КЛЕТОК РАКА

14.00 14—Онкология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Печать Н.В. Андриановой

Подписано к печати 22 04 2005. Формат 60 х 90/16 Бумага тип Печать ризограф _Гарнитура «Т аймс» Печ л 1,5 Тираж 70 экз Заказ 535_

Санкт-Петербург 2005

I *

t !

РНБ Русский фонд

2006-4 15852

Оглавление диссертации Малек, Анастасия Валерьевна :: 0 ::

Оглавление.

Список используемых сокращений и терминов.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Молекулярная генетика рака яичников

1.1.1 .Биологические особенности поверхностного эпителия яичников.

1.1.2. Факторы риска, этиология и патогенез этителиального рака яичников.

1.1.3. Генетика злокачественной трансформации клеток поверхностного эпителия яичников.

1.1.3.1. Патологическая пролиферативная активность (рецепторы, сигнальные пути, контроль клеточного цикла).

1.1.3.2. Иммортализация (теломеразная активность, регуляция апоптоза).

1.1.3.3. Метастазирование (адгезия, инвазия, неоангиогенез).

1.2. Геномные методы исследования рака яичников

1.2.1. Значение геномно-экспрессионного анализа в исследовании рака яичников.

1.2.2. Техника основных методов геномно-экспрессионного анализа.

1.3.3. РНК-интерференция, новый метод генной терапии

Глава 2. Материалы и методы

2.1. Аналитический этап. Геномныые исследования, методика их сравнительного анализа и отбора генов

2.1.1. Геномный анализ процесса малигнизации ПЭЯ методом субтрактивной супрессионной гибридизации.

2.1.2. Геномный анализ экспрессионного профиля ткани РЯ и ПЭЯ методом кДНК-эррейз гибридизации.

2.1.3. Сравнительный анализ данных двух геномных исследований, выбор генов.

2.2. Клинический этап. Анализ уровня экспрессии генов в образцах ткани РЯ и нормальных яичников

2.2.1;Отбор и подготовка материала.

2.2.2. Синтез меченых дигоксигенином одноцепочечных РНК-зондов.

2.2.3. In situ РНК гибридизация.

2.2.4. Иммунологическая детекция.

2.3. Экспериментальный этап. Оценка эффекта экзогенной экспрессии гена HMG А2 в клетках нормального ПЭЯ и подавления эндогенной экспрессии в клетках РЯ.

2.3.1. Экзогенная экспрессия HMG А2 гена в клетках ПЭЯ.

2.3.2. Инактивация эндогенной экспрессии HMG А2 гена в клетках РЯ методом РНК-интерференции.

2.3.3. Оценка эффективности трансфекции.

2.3.4. Оценка эффекта трансфекции.

Глава 3. Результаты исследования

3.1. Анализ результатов геномных исследований и выбор генов -потенциальных терапевтических мишеней.

3.2. Оценка уровня экспрессии выбранных генов в образцах тканей РЯ и нормальных яичников.

3.3. Влияние активной экспрессии HMG А2 гена биологию клеток нормального поверхностного эпителия яичников.

3.4. Влияние инактивации эндогенной экспрессии HMG А2 гена на биологию клеток рака яичников.

Глава 4. Обсуждение результатов

4.1. Сравнительный анализ и верификация данных геномных исследований. .96 4.2 HMGA2 ген и HMGA2 протеин: Структура, экспрессия, функции.

4.3. HMG А2 протеин и канцерогенез.

4.4. HMG А2 протеин - мишень терапевтической инактивации.

Выводы.

Введение диссертации по теме "Онкология", Малек, Анастасия Валерьевна, автореферат

Диагностика РЯ на ранних стадиях затруднена. Даже с применением современных методов частота выявления ранних форм РЯ составляет приблизительно 30% среди женщин репродуктивного возраста и не более 16% - у женщин старше 65 лет. Скрининга злокачественных опухолей яичника не существует, программы скрининга РЯ в настоящее время неэффективны (11, 10). Сложность заключается в недостаточном знании ранних неопластических изменений, происходящих в эпителии яичника (2). В этио-патогенезе РЯ большое значение придается генетической предрасположенности, онкогенам и опухоль-супрессирующим генам, что оправдывает разработку молекулярно-генетических методов ранней диагностики РЯ.

Бессимптомное течение первых стадий болезни является причиной того, что почти в 70 % случаев диагноз устанавливается только на III или IV стадии (16). Терапия поздних стадий в большинстве случаев носит паллиативный или симптоматический характер (12). В результате смертность от рака яичников выше, чем от рака шейки матки и эндометрия, вместе взятых. (19, 9)

Согласно сводным данным публикуемым Международным агентством по изучению рака (IARC) по странам Европы, однолетняя выживаемость при РЯ за период с 1978 по 1985 годы составила 57,1% и выросла лишь до 62,1% за период с 1985 по 1989 годы. Показатель 5-летней выживаемости за аналогичный период изменился с 29,5% до 32,9%. (252, 253). Определенный рост выживаемости при РЯ, вероятно, связан с внедрением в широкую клиническую практику препаратов платины, и позднее, таксанов (17). За последние 20 лет несколько расширился стандартный объем оперативного вмешательства, доказана целесообразность циторедуктивных операций у больных с III-IV стадией заболевания (128, 184, 6). Разработаны новые методы системной и локальной лучевой терапии (20, 4, 31, 33). Однако, несмотря на усовершенствование хирургических и лучевых методов лечения, применение современных цитостатиков, выживаемость больных РЯ остается еще на весьма низком уровне, что определяет актуальность разработки и внедрения в клиническую практику принципиально новых терапевтических методов. Особое значение имеет развитие генной терапии, основанной на результатах фундаментальных исследований в области молекулярной генетики рака яичников.

В течение последних лет активно развивается направление «таргетной» генной терапии рака. Метод основан на специфической инактивации генов, играющих значимую роль в прогрессии опухоли, так называемых генов-мишеней. Первые терапевтические схемы «таргетной» генотерапии рака яичников уже проходят клинические испытания (193, 27). Результаты этих исследований показали, что цитостатический эффект «таргетной» генотерапии вомногом зависит от правильного выбора генов-мишеней. Гены-мишени «таргетной» терапии РЯ должны отвечать следующим критериям:

1. уровень экспрессии таких генов должен быть существенно выше в клетках РЯ по сравнению с клетками неизмененного покровного эпителия яичников,

2. терапевтическая инактивация таких генов должна оказывать цитостатический эффект на клетки РЯ.

Наличие надежных и эффективных мишеней «таргетной» терапии означает возможность расширения поля клинических исследований и вероятность скорого внедрения данной методики в клиническую практику. Это определяет актуальность работы по поиску генов-мишеней «таргетной» терапии и оценке эффекта их инактивации в клетках рака яичников на доклинических этапах.

Цель и задачи исследования.

Целью данного исследования являлся поиск генов, активно экспрессированных в клетках серозного РЯ, инактивация которых оказывает цитостатический эффект на опухолевые клетки. Поиск генов, удовлетворяющих данным критериям, требовал последовательного решения следующих задач:

3. Оценка факта и уровня экспрессии выбранных генов в образцах тканей серозного рака яичников и неизмененных яичников. На данном этапе работы предполагалось выбрать гены, экспрессия которых не характерна клеткам поверхностного эпителия нормальных яичников и уровень экспрессии которых отчетливо повышен в опухолевых клетках.

4. Оценка эффекта экзогенной экспрессии выбранных генов в клетках поверхностного эпителия яичников. Данный этап работы позволял определить значимость активной экспрессии генов в процессе неопластической трансформации клеток покровного эпителия яичников. 5. Оценка эффекта инактивации экспрессии выбранных генов в нескольких культурах клеток серозной аденокарциномы яичников методом РНК-интерференции. Результатом заключительного этапа работы предполагалось описание генов, инактивация экспрессии которых оказывает цитостатический эффект на клетки рака яичников.

Научная новизна и практическая значимость полученных результатов.

В ходе данной работы впервые был проведен сравнительный анализ данных двух геномных экспрессионных исследований, выполненных принципиально разными методами. Методика кДНК-эррейз гибридизации позволяет одновременно оценить уровень экспрессии тысяч генов в клетках опухолевой или нормальной ткани, тогда как супрессионная субтрактивная гибридизация направлена на поиск генов с разным уровнем экспрессии в опухолевых и нормальных клетках, т.е. прямое сравнение экспрессионного профиля двух образцов ткани. Технологические особенности каждого метода отражаются на результатах и предполагают определенные допущения в их оценке. Сравнительный анализ и верификация данных геномных исследований позволила исключить методологические погрешности и отобрать гены с отчетливо высоким уровнем экспрессии в клетках РЯ по сравнению с нормальным покровным эпителием.

В результате данной работы было впервые показано, что активная экспрессия гена архитектурного транскрипционного фактора HMGA2 сопровождает развитие серозного рака яичников в 73,9% случаев. Для клеток нормального покровного эпителия яичников экспрессия этого гена не характерна.

В представленной работе было впервые показано, что инактивация экспрессии HMGA2 гена в опухолевых клетках с исходно высоким уровнем его экспрессии имеет отчетливый цитостатический эффект. Таким образом, HMGA2 ген может служить безопасной и эффективной мишенью «таргетной» терапии серозного рака яичников.

Апробация работы

Результаты работы были представлены на: научно-практической конференции «Современные подходы к диагностике и лечению гинекологического рака» (Псков, сентябрь 2004), научно-практической конференции Института Патологии Университета Гумбольдта (Берлин, сентябрь 2004),

VIII Российском Онкологическом Конгрессе (Москва, ноябрь 2004) научно-практической конференции НИИ онкологии им. проф. Н.Н.Петрова (Санкт-Петрбург, апрель 2005).

Структура и объём диссертации

Диссертация изложена на 162 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, глав, излагающих материалы и методы работы, результаты собственных исследований и завершается обсуждением полученных данных и выводами. Работа иллюстрирована 5 таблицами, 8 графиками и 22 рисунками. Библиографический указатель включает 290 публикаций.

Список использованной литературы по медицине, диссертация 0 года, Малек, Анастасия Валерьевна

1. Баранов B.G. Генная терапия - медицина XX1.века // Соросовский образовательный журнал.- 1999.- N. 3.- стр. 63-68.

2. Бахидзе Е.В. Фертильность, беременность и гинекологический рак. - СПб., 2004. - 288 стр.

3. Васильев Ю.М. Клетка как архитектурное чудо // Соросовский образовательный журнал.- 1996.- N. 2.- стр. 36-43.

4. Винокуров В.Л. Рак яичников: закономерности метастазирования и выбор адекватного лечения больных. // СПб., 2004. - 336 стр.

5. Двойрин В.В., Аксель Е.М., Трапезников Н.Н. Заболеваемость злокачественными новообразованиями и смертность от них населения стран СНГ в 1995 г. // Москва, 1996. - 275 стр.

6. Жорданиа К.И. Некоторые аспекты хирургического лечения рака яичников // Практическая онкология.- 2000.- N 4. - стр. 19-22.

7. Карселадзе А.И. Некоторые проблемы клинической морфологии эпителиальных опухолей яичников // Практическая Онкология.- 2000.-N. 4.-стр. 14-18.

8. Копнин Б.П. Неопластическая клетка: основные свойства и механизмы их возникновения // Практическая Онкология.- 2002.- N. 3 (4).- стр. 229-235.

9. Новикова Е.Г. и соавт., 1999 - Новикова Е.Г., РонинаЕ.А. Особенности эпидемиологии и современные методы диагностики злокачественных опухолей яичников. // Гинекология. - 1999. - N. 2. - стр. 42-44.

10. Тюляндин А. Мишени лекарственой терапии будущего // Материалы третьей ежегодной Российской онкологической конференции.- 1999.- Санкт-Петербург (http://www.rosoncoweb.ru/library/3rd conf/14.htm)

11. Урманчеева А.Ф., Мешкова И.Е. Вопросы эпидемиологии и диагностики рака яичников // Вопросы онклогии. - 2000.- N 4. - стр. 13.

12. Урманчеева А.Ф. Современная химиотерапия рака яичников // Практическая онкология. - 2002.- N 3 (4). - стр. 295-304.

13. Хансон К.П., Имятитов Е.Н. Молекулярная генетика рака яичников // Практическая Онкология.- 2000.- N. 4 (12).- р. 3-6.

14. Чиссов В.И., Старинский В.В. Злокачественные заболевания в России в 2000 году (Заболеваемость и смертность) // Москва, 2002.- 121 стр.

15. Abdollahi A., Graver B.N., Patriotis C, Hamilton T.C. Identification of epidermal growth factor-responsive genes in normal rat ovarian surface epithelial cells // Biochem Biophys Res Commun.- 2003.- 307(1).- p. 188-197.

16. Abdollahi T. Potential for TRAIL as a therapeutic agent in ovarian cancer // Vitam Horm.- 2004.- N. 67.- p. 347-364.

17. Abrahams V.M., Straszewski S.L., Kamsteeg M., Hanczarak В., Schwartz P.E., Rutherford T.J., Мог G. Epithelial ovarian cancer cells secrete functional Fas ligand // Cancer Res.- 2003.- N. 63(17).- p. 5573-5581.

18. Adams A.T., Auersberg N. A cell line, ROSE 199, derived from normal rat ovarian surface epithelium // Exp Cell Biol.- 1985.- N. 53(4).- p. 181-188.

19. Adewole I.F., Babarinsa I.A., Thomas J.O., Ajayi A.B. Ovarian cancer associated with ovulation induction: a case report // Afr J Med Sci.- 1997.- N. 26.- p. 203-204.

20. Ahmed N., Pansino F., Baker M., Rice G., Quinn M. Association between alphavbeta6 integrin expression, elevated p42/44 kDa МАРК, and plasminogen-dependent matrix degradation in ovarian cancer // J Cell Biochem.- 2002.- N. 84(4).- p. 675-686.

21. Alvarez R.D., Gomez-Navarro J., Wang M., Barnes M.N., Strong T.V., Arani R.B., Arafat W., Hughes J.V., Siegal G.P., Curiel D.T. Adenoviral-mediated suicide gene therapy for ovarian cancer // Mol Ther.- 2000.- N. 2(5).- p. 524-530.

22. Andrieux J., Demory J.L., Dupriez В., Quief S., Plantier I., Roumier C , Banters F., Lai J.L., Kerckaert J.P. Dysregulation and overexpression of HMGA2 in myelofibrosis with myeloid metaplasia // Genes Chromosomes Cancer.- 2004.- N. 39(1).-p. 82-87.

23. Arnold J.M., Cummings M., Purdie D., Chenevix-Trench G. Reduced expression of intercellular adhesion molecule-1 in ovarian adenocarcinomas // Br J Cancer.-2001.-N.85(9).-p. 1351-1358.

24. Arts H.J., de Jong S., Hollema H., ten Hoor K., van der Zee A.G., de Vries E.G. Chemotherapy induces death receptor 5 in epithelial ovarian carcinoma // Gynecol Oncol.- 2004.- N. 92(3).- p. 794-800.

25. Ashkenazi A., Dixit V.M. Death receptors: signaling and modulation // Science.- 1998.-N281(5381).-p. 1305-1308.

26. Asselin E., Mills G.B., Tsang B.K. Xiap regulates Akt activity and caspase-3- dependent cleavage during cisplatininduced apoptosis in human ovarian epithelial cancer cells//Cancer Res.-2001.-N. 61.-N. 1862- 18.

27. Auersperg N., Wong A.S., Choi K.C., Kang S.K., Leung P.C. Ovarian surface epithelium: biology, endocrinology, and pathology // Endocr Rev.- 2001.-N. 22(2).- p. 255-288.

28. Baldwin R.L., Tran H., Karlan B.Y. Primary ovarian cancer cultures are resistant to Fas-mediated apoptosis // Gynecol Oncol.- 1999.- N. 74(2).- p. 265-271.

29. Balkwill F.R. Possible role of ovarian epithelial inflammation in ovarian cancer// J Natl Cancer Inst- 2000.- N. 92(2).- p. 162-163.

30. Bates R.C., DeLeo M.J. 3rd, Mercurio A.M. The epithelial-mesenchymal transition of colon carcinoma involves expression of IL-8 and CXCR-1-mediated chemotaxis // Exp Cell Res.- 2004.- N. 299(2).- p. 315-324.

31. Beale P.J., Rogers P., Boxall F., Sharp S.Y., Kelland L.R. BCL-2 family protein expression and platinum drug resistance in ovarian carcinoma // Br J Cancer.-2000.-N.82(2).-p. 436-440.

32. Berchuck A., Kamel A., Whitaker R. Overexpression of HER-2/ neu is associated with poor survival in advanced epithelial ovarian cancer // Cancer Res.- 1990.- N. 50.-p. 4087-4091.

33. Bertrand J.R., Pottier M., Vekris A., Opolon P., Maksimenko A., Malvy C. Comparison of antisense oligonucleotides and siRNAs in cell culture and in vivo // Biochem Biophys Res Commun.- 2002.- N. 296(4).- p. 1000-1004.

34. Birchmeier С, Birchmeier W., Brand-Saberi B. Epithelial-mesenchymal transitions in cancer progression // Acta Anat (Basel).- 1996.- N. 156(3).- p. 217-226.

35. Burleson K.M., Casey R.C., Skubitz K.M., Pambuccian S.E., Oegema T.R., Skubitz A.P. Ovarian carcinoma ascites spheroids adhere to extracellular matrix components and mesothelial cell monolayers // Gynecol Oncol.- 2004.- N. 93(1).-p. 170-181.

36. Bustin M. Regulation of DNA-dependent activities by the functional motifs of the high-mobility-group chromosomal proteins // Mol Cell Biol.- 1999.- N. 19(8).- p. 5237-5246.

37. Campiglio M., Ali S., Knyazev P.G., Ullrich A. Characteristics of EGFR family- mediated HRG signals in human ovarian cancer // J Cell Biochem.- 1999.- N. 73(4).-p.522-532.

38. Cannistra S.A. Cancer of the ovary //New Engl J Med.- 1993.- N. 329.- p. 1550 - 1559.

39. Cheng J.C, Moore T.B., Sakamoto K.M. RNA interference and human disease // Mol Genet Metab.- 2003.- N. 80(1).- p. 121-128.

40. Chiaffarino F., Pelucchi C., Parazzini F., Negri E., Franceschi S., Talamini R., Conti E., Montella M., La Vecchia C. Reproductive and horaional factors and ovarian cancer // Ann Oncol.- 2001.- N. 12(3).- p. 337-341.

41. Cunat S., Hoffmann P., Pujol P. Estrogens and epithelial ovarian cancer. Gynecol Oncol.- 2004.- 94(1).- p. 25-32.

42. Cramer D.W., Welch W.R. Determinants of ovarian cancer risk. П. Inferences regarding pathogenesis. // J. Natl. Cancer Inst. - 1983. - 71. - p. 717-721.

43. Crickard K., Crickard U., Yoonessi M. Human ovarian carcinoma cells maintained on extracellular matrix versus plastic Cancer Res.- 1983.- N. 43(6).- p. 2762-2767.

44. Dabrow M.B., Francesco M.R., McBrearty F.X., Caradonna S. The effects of platelet-derived growth factor and receptor on normal and neoplastic human ovarian surface epithelium // Gynecol Oncol.- 1998.- N. 71.- p. 29-37.

45. Davidson В., Goldberg I., Gotlieb W.H., Kopolovic J., Ben-Baruch G., Nesland J.M., Reich R. The prognostic value of metalloproteinases and angiogenic factors in ovarian carcinoma // Mol Cell Endocrinol- 2002.- N. 187(1).- p. 39-45.

46. Del Bufalo D., Di Castro V., Biroccio A., Salani D., Rosano L., Spinella F., Bagnato A. Endothelin-1 acts as a survival factor in ovarian carcinoma cells // Clin Sci (Lond).- 2002.- N. 103 Suppl 48.- p. 302-305.

47. Downward J. PI 3-kinase, Akt and cell survival // Semin Cell Dev Biol- 2004.- N. 15(2).-p. 177-182.

48. Dubeau L. The cell of origin of ovarian epithelial tumor and the ovarian surface epithelium dogma: does the empreror have no clothes? // Gynecologic Oncology.-1999.-N. 72.-p. 437-442.

49. Elbashir S.M., Harborth J., Lendeckel W., Yalcin A., Weber K., Tuschl T. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured ammalian cells // Nature.- 2001.- N. 411 (6836).- p. 494-498.

50. Ellerbroek S.M., Wu Y.I., Overall СМ., Stack M.S. Functional interplay between type I collagen and cell surface matrix metalloproteinase activity // J Biol Chem.-2001.-N. 276(27).-p. 24833-24842.

51. Familiari G., Makabe S., Motta P.M. Ultrastructure of the Ovary // 1991.- Boston MA.-p. 287-310.

52. Farley J., Smith L.M., Darcy K.M. Cyclin E expression is a significant predictor of survival in advanced, suboptimally debulked ovarian epithelial cancers: a Gynecologic Oncology Group study // Cancer Res.- 2003.- N. 63.- p. 1235-1241.

53. Fathalla M.F. Incessant ovulation - factor in ovarian neoplasia? // Lancet.- 1971.- N.2(7716).-p. 163.

54. Feeley K.M., Wells M. Precursor lesions of ovarian epithelial malignancy // Histopathology.-2001.-N. 38(2).-p. 87-95.

55. Felip E., Del Campo J.M., Rubio D., Vidal M.T., Colomer R., Bermejo B. Overexpression of c-erbB-2 in epithelial ovarian cancer. Prognostic value and relationship with response to chemotherapy // Cancer.- 1995.- N. 75.- p. 2147-2152.

56. Ferlay J., Bray F., Pisani P. and Parkin D.M. Globocan 2000: cancer incidence, mortality and prevalence worldwide. // lARC Press, Lyon 2001 http://www.who.int/bookorders/anglais/detartl.isp?sesslan=l&codlan=l&codcol= 76&cod cch=12

57. Fishman D.A., Bafetti L.M., Banionis S., Keams A.S., Chilukuri K., Stack M.S. Production of extracellular matrix-degrading proteinases by primary cultures of human epithelial ovarian carcinoma cells // Cancer.- 1997.- N. 80(8).- p. 1457-1463.

58. Fishman D.A., Liu Y., EUerbroek S.M., Stack M.S. Lysophosphatidic acid promotes matrix metalloproteinase (MMP) activation and MMP-dependent invasion in ovarian cancer cells // Cancer Res.- 2001.- N. 61(7).- p. 3194-3199.

59. Fischer D.C., Noack K., Runnebaum I.B., Watermann D.O., Kieback D.G., Stamm S., Stickeler E. Expression of splicing factors in human ovarian cancer // Oncol Rep.-2004.-N. 11(5).-p. 1085-1090.

60. Fire A., Xu S., Montgomery M. K., Kostas S. A., Driver S. E., Mello С Potent and specific genetic interference by double- stranded RNA in Caeno-rhabditis elegans //Nature.- 1998.- N. 391.- p. 806-811.

61. Fix J.D., Dudek R.W. Embryology //1995.- Baltimore.- p. 171-178.

62. FIessner M.F., Choi J., He Z., Credit K. Physiological characterization of human ovarian cancer cells in a rat model of intraperitoneal antineoplastic therapy // J Appl Physiol.- 2004.- N. 97(4).- p. 1518-1526.

63. Foley E.F., Jazaeri A.A., Shupnik M.A., Jazaeri O., Rice L.W. Selective loss of estrogen receptor beta in malignant human colon // Cancer Res.- 2000,- N. 60.- p. 245-248.

64. Folkman J. Tumor angiogenesis // Adv Cancer Res.- 1985.- N. 43.- p. 175-203.

65. Fujimoto J., Ichigo S., Hirose R., Sakaguchi H., Tamaya T. Expression of E- cadherin and alpha- and beta-catenin mRNAs in ovarian cancers // Cancer Lett. 1997.-N. 115(2).-p. 207-212.

66. GattasG.J.,QuadeB.J.,NowakR.A., Morton C.C. HMGIC expression in human adult and fetal tissues and in uterine leiomyomata // Genes Chromosomes Cancer.- 1999.- N. 25(4).- p. 316-322.

67. Greenwood M.J., Lansdorp P.M. Telomeres, telomerase, and hematopoietic stem cell biology // Arch Med Res.- 2003.- N. 34(6).- p. 489-495.

68. Gupta S., Schoer R.A., Egan J.E., Hannon G.J., Mittal V. Inducible, reversible, and stable RNA interference in mammalian cells // Proc Natl Acad Sci USA,-2004.-N. 101(7).-p. 1927-32.

69. Hanahan D., Weinberg R. A. The hallmarks of cancer // Cell.- 2000.- N. 100 (1).- p. 57-70.

70. Hannon GJ. I ^ A interference //Nature.- 2002.- N. 418(6894).- p. 244-251.

71. Hashiguchi Y., Tsuda H., Yamamoto K., Inoue Т., Ishiko O., Ogita S. Combined analysis of p53 and RB pathways in epithelial ovarian cancer // Hum. Pathol.- 2001.- N. 32.- p. 988-996.

72. Hata K., Nakayama K., Fujiwaki R., Katabuchi H., Okamura H., Miyazaki K. Expression of the angopoietin-1, angopoietin-2, Tie2, and vascular endothelial growth factor gene in epithelial ovarian cancer // Gynecol Oncol.- 2004.-N. 93(1).-p. 215-222.

73. Hayflick L. Mortality and immortality at the cellular level // Biochemistry (Mosc).- 1997.-N.62(11).-p. 1180-1190.

74. Hellstrom I., Goodman G., Pullman J., Yang Y., Hellstrom K.E. Overexpression of HER-2 in ovarian carcinomas // Cancer Res.- 2001.- N. 61(6).-p. 2420-2423.

75. Henriksen R., Funa K., Wilander E., Backstrom Т., Ridderheim M., Oberg K. Expression and prognostic significance of platelet-derived growth factor and ist receptors in epithelial ovarian neoplasms // Cancer Res.- 1993.- N. 53.- p. 4550-4554.

76. Hiiger R.A., Scheulen M.E., Strumberg D. The Ras-Raf-MEK-ERK pathway in the treatment of cancer // Onkologie.- 2002.- N. 25(6).- p. 511-518.

77. Himing-Folz U., Wilda M., Rippe v., Bullerdiek J., Hameister H. The expression pattern of the Hmgic gene during development // Genes Chromosomes Cancer.- 1998.- N. 23(4).- p. 350-357.

78. Hisaoka M., Sheng W.Q., Tanaka A., Hashimoto H. HMGIC alterations in smooth muscle tumors of soft tissues and other sites // Cancer Genet Cytogenet.-2002.-N. 138(1).-p. 50-55.

79. Holbro Т., Civenni G., Hynes N.E. The ErbB receptors and their role in cancer progression // Exp Cell Res.- 2003.- N. 284(1).- p. 99-110.

80. Horvath L.G., Henshall S.M., Lee C.S., Head D.R., Quinn D.L, Makela S. Frequent loss of estrogen receptor-beta expression in prostate cancer // Cancer Res.-2001.-N. 61.-p. 5331-5335.

81. Hoskins WJ. Surgical staging and cytoreductive surgery of epithelial ovarian cancer//Cancer 1993; 71: 1534-1540.

82. Ikeda J., Kaneda S., Kuwabara K., Ogawa S., Kobayashi Т., Matsumoto M., Yura Т., Yanagi H. Cloning and expression of cDNA encoding the human 150 kDa oxygen-regulated protein, 01^150 // Biochem Biophys Res Commun.-1997.-N. 230(1).-p. 94-99.

83. Ismail R.S., Baldwin R.L., Fang J., Browning D., Karlan B.Y., Gasson J.C., Chang D.D. Differential gene expression between normal and tumor-derived ovarian epithelial cells // Cancer Res.- 2000.- N. 60(23).- p. 6744-6749.

84. James H.A., Gibson I. The therapeutic potential of ribozymes // Blood.- 1998- N91(2).-p. 371-382.

85. Jazaeri AA, Lu K, Schmandt R, Harris CP, Rao PH, Sotiriou C, Chandramouli GV, Gershenson DM, Liu ET. Molecular determinants of tumor differentiation in papillary serous ovarian carcinoma//Mol Carcinog.- 2003.-N.36(2).- p. 53-9.

86. Jin H., Varner J. Integrins: roles in cancer development and as treatment targets // Br J Cancer.- 2004.- N. 90(3).- p. 561-565.

87. Kacinski B.M., Carter D., Mittal K. Ovarian adenocarcinomas express fms- complementary transcripts and fins antigen, often with coexpression of CSF-1 // Am J Path.- 1990.- N. 137.- p. 135-147.

88. Kay M.A., Liu D., Hoogerbrugge P.M. Gene therapy // Proc Natl Acad Sci USA.-1997.-N. 94(24).-p. 12744-12746.

89. Kennerdell J. R., Carthew R. W. Use of dsRNA-mediated genetic inter-ference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway // Cell.-1998.-N. 95.-p. 1017-1026.

90. Kim D.H., Park Y.S., Park C.J., Son K.C., Nam E.S., Shin H.S., Ryu J.W., Kim D.S., Park C.K., Park Y.E. Expression of the HMGI(Y) gene in human colorectal cancer // Int J Cancer.- 1999.- N. 84(4).- p. 376-380.

91. Kohler M., Janz I., Wintzer H.O., Wagner E., Bauknecht T. The expression of EGF receptors, EGF like factors and c-myc in ovarian and cervical carcinomas and their potential clinical significance // Anticancer Res.- 1989.- N. 9.- p. 1537-1547.

92. Kong H.L., Crystal R.G. Gene therapy strategies for tumor antiangiogenesis // Natl Cancer Inst.- 1998.- N. 90(4).- p. 273-286.

93. Kurreck J. Antisense technologies. Improvement through novel chemical modifications//Eur J Biochem.-2003.-N. 270(8).-p. 1628-1644.

94. Lane D., Cartier A., L'Esperance S., Cote M., Rancourt C , Piche A. Differential induction of apoptosis by tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand in human ovarian carcinoma cells // Gynecol Oncol.- 2004.- N. 93(3).-p. 594-604.

95. Lawrence J.B., Singer R.H. Intracellular localization of messenger RNAs for cytoskeletal proteins // Cell- 1986.- N. 45(3).- p. 407-415.

96. Leitao M.M., Soslow R.A., Baergen R.N., Olvera N., Arroyo C, Boyd J. Mutation and expression of the TP53 gene in early stage epithelial ovarian carcinoma//Gynecol Oncol.-2004.-N. 93(2).-p. 301-306.

97. Lessan K., AguiarD.J., Oegema Т., Siebenson L., Skubitz A.P. CD44 and betal integrin mediate ovarian carcinoma cell adhesion to peritoneal mesothelial cells // Am J Pathol.- 1999.- N. 154(5).- p. 1525-1537.

98. Leygue E., Dotzlaw H., Watson P.H., Murphy L.C. Altered estrogen receptor alpha and beta messenger RNA expression during human breast tumorigenesis // CancerRes.-1998.-N. 58.-p. 3197-3201.

99. Li P., Nijhawan D., Budihardjo I., Srinivasula S.M., Ahmad M., Alnemri E.S., Wang X. Cytochrome с and dATP-dependent formation of Apaf-l/caspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade // Cell.- 1997.- N. 91(4).- p. 479-489.

100. Lidor Y.J., Xu F.J., Martinez-Maza O. Constitutive production of macrophage colony stimulating factor and interleukin-6 by human ovarian surface epithelial cells // Exp Cell Res.- 1993.- N. 207.- p. 332-339.

101. Lohmann J. U., Endl L, Bosch T. С Silencing of Developmental Genes in Hydra//Dev Biol.-1999.-N. 214.-p. 211-214.

102. Ma X.Y., He F.X., Wu S.F., Lu Y.P., Ma D. Expression of survivin in ovarian epithelial carcinoma and its correlation with expression of Fas and FasL // Ai Zheng.- 2004.- N. 23(2).- p. 173-176.

103. Malumbres M., Pellicer A. RAS pathways to cell cycle control and cell transformation // Front Biosci.- 1998.- N. 6(3).- p. 887-912.

104. Malik S. T. A., Griffin D. В., Fiers W., Balkwill F. R. Paradoxical effects of tumor necrosis factor in experimental ovarian cancer // Int. J. Cancer.- 1989.- N. 44.-p. 918-925.

105. Malik S. T. A., Naylor M. S., East N., Oliff A., Balkwill F. R. Cells secreting tumor necrosis factor show enhanced metastasis in nude mice // Eur. J. Gancer.-1990.-N. 26.-p. 1031-1034.

106. Manoharan M. Oligonucleotide conjugates as potential antisense drugs with improved uptake, biodistribution, targeted delivery, and mechanism of action // Antisense Nucleic Acid Drug Dev.- 2002.- N. 12(2).- p. 103-128.

107. Marchetti A., Cecchinelli В., D'Angelo M., D'Orazi G., Crescenzi M., Sacchi A., Soddu S, p53 can inhibit cell proliferation through caspase-mediated cleavage of ERK2/MAPK // Cell Death Differ.- 2004.- N. 11(6).- p. 596-607.

108. Marone M., Scambia G., Mozzetti S., Ferrandina G., lacovella S., De Pasqua A., Benedetti-Panici P., Mancuso S. bcl-2, bax, bcl-XL, and bcl-XS expression in normal and neoplastic ovarian tissues // Clin Cancer Res.- 1998.- N. 4(2).- p. 517-524.

109. Marone M., Scambia G., Giannitelli C. Analysis of cyclin E and CDbC2 in ovarian cancer: gene amplification and RNA overexpression // Int J Cancer.-1998.-N. 75.-Р. 34-39.

110. Marrs J.A., Nelson W.J. Cadherin cell adhesion molecules in differentiation and embryogenesis // Int Rev Cytol.- 1996.- N. 165.- p. 159-205.

111. Martelli A.M., Riccio M., Bareggi R., Manfioletti G., Tabellini G., Baldini G., Narducci P., Giancotti V. Intranuclear distribution of HMGIAf proteins. An immunocytochemical study // J Histochem Cytochem.- 1998.- N. 46(7).- p. 863-844.

112. Martin K.J, Sager R. Expression genetics in cancer research, prognosis, and therapy // Adv Exp Med Biol.- 1998.- N. 451.- p. 1-7.

113. Matta H., Hozayev В., Tomar R., Ghugh P., Ghaudhary P.M. Use of lentiviral vectors for delivery of small interfering RNA // Gancer Biol. Ther.- 2003.- N. 2.-p. 206-210.

114. Meden H., Marx D., Roegglen Т., Schauer A., Kuhn W. Overexpression of the oncogene c-erbB-2 (HER2/neu) and response to chemotherapy in patients with ovarian cancer// Int J Gynecol Pathol.- 1998.- N. 17.- p. 61-65.

115. Mills G.B., Eder A., Fang X. Critical role of lysophospholipids in the pathophysiology, diagnosis, and management of ovarian cancer // Gancer Treat Res.-2002.-N. 107.-p.259-283.

116. Miyagishi M., Sumimoto H., Miyoshi H., Kawakami Y., Taira K. Optimization of an siRNA-expression system with an improved hairpin and its significant suppressive effects in mammalian cells // J Gene Med.- 2004.- N. 6(7).- p. 715-723.

117. Miyazawa J., Mitoro A., Kawashiri S., Chada K.K., Imai K. Expression of mesenchyme-specific gene HMGA2 in squamous cell carcinomas of the oral cavity // Cancer Res.- 2004.- N. 64(6).- p. 2024-2029.

118. Moore K.L. Embryologie. Lehrbuch und Atlas der Entwicklungsgeschichte des Menschen // 1996.- Stuttgart.- p.229-240.

119. Moser T.L., Young T.N., Rodriguez G.C., Pizzo S.V., Bast R.C. Jr, Stack M.S. Secretion of extracellular matrix-degrading proteinases is increased in epithelial ovarian carcinoma // Int J Cancer.- 1994.- N. 56(4).- p. 552-559.

120. Nam E.S., Kim D.H., Cho S.J., Chae S.W., Kim H.Y., Kim S.M., Han J.J., Shin H.S., Park Y.E. Expression of HMGI(Y) associated with malignant phenotype of human gastric tissue // Histopathology.- 2003.- N. 42(5).- p. 466-471.

121. Naylor M.S., Stamp G.W., Foulkes W.D., Eccles D., Balkwill F.R. Tumor necrosis factor and its receptors in human ovarian cancer. Potential role in disease progression // J Clin Invest.- 1993.- N. 91(5).- p. 2194-2206.

122. Ngo H., Tschudi C , Gull K.,Ullu E. Double-stranded RNA induces mRNA degradation in Trypanosoma brucei // Proc Natl Acad Sci USA.- 1998.- N. 95.- p. 14687-14692.

123. Neijt JP, du Bois A, Williams С (eds). Advanced Ovarian Cancer - What Do We Know and What Do We Need? // Ann Oncol 1999; 10 Suppl 1: 1-92

124. Niedbala M.J., Crickard K., Bernacki R.J. In vitro degradation of extracellular matrix by human ovarian carcinoma cells // Clin Exp Metastasis.- 1987.- N. 5(2).-p. 181-197.

125. Nieto J.J., Crow J., Sundaresan M., Constantinovici N., Perrett C.W., MacLean A.B., Hardiman P.J. Ovarian epithelial dysplasia in relation to ovulation induction and nulliparity // Gynecol Oncol.- 2001.- N. 82(2).- p. 344-349.

126. Obata K., Morland S.J., Watson R.H., Hitchcock A., Chenevix-Trench G., Thomas E.J., Campbell I.G. Frequent PTEN/MMAC mutations in endometrioid but not serous or mucinous epithelial ovarian tumors // Cancer Res.- 1998.- N. 58(10).-p. 2095-2097.

127. Ochiya Т., Nagahara S., Sano A., Itoh H., Terada M. Biomaterials for gene delivery: atelocollagen-mediated controlled release of molecular medicines // Curr Gene Ther.- 2001.- N. 1(1).- p. 31-52..

128. Ono K., Tanaka Т., Tsunoda Т., Kitahara O., Kihara C , Okamoto A., Ochiai K., Takagi Т., Nakamura Y. Identification by cDNA microarray of genes involved in ovarian carcinogenesis // Cancer Res.- 2000.- N. 60(18).- p. 5007-5011.

129. Page C , Lin H.J., Jin Y. Overexpression of Akt/AKT can modulate chemotherapy-induced apoptosis // Anticancer Res.- 2000.- N. 20.- p. 407-416.

130. Pardridge WM. Intravenous, nonviral RNAi gene therapy of brain cancer // Expert Opin Biol Ther.- 2004.- N. 4(7).- p. 1103-1113.

131. Petak I., Houghton J.A. Shared pathways: death receptors and cytotoxic drugs in cancer therapy // Pathol Oncol Res.- 2001.- N. 7(2).- p. 95-106.

132. Petit M.M., Mols R., Schoenmakers E.F., Mandahl N., Van de Ven W.J. LPP, the preferred fusion partner gene of HMGIG in lipomas, is a novel member of the

133. IM protein gene family // Genomics.- 1996.- N. 36(1).- p. 118-129.

134. Powell СВ., Scott J.H., Collins J.L. Comparison of TNFalpha and TNFbeta cytolytic mechanisms in human ovarian and cervical carcinoma cell lines // Gynecol Oncol.- 1998.- N. 71(2).- p. 258-265.

136. Radke J., Schmidt D., Bohme M., Schmidt U., Weise W., Morenz J. Cytokine level in malignant ascites and peripheral blood of patients with advanced ovarian carcinoma//Geburtshilfe Frauenheilkd.- 1996.-N. 56(2).-p. 83-87.

137. Reed J.C. Double identity for proteins of the Bcl-2 family // Nature.- 1997.- N. 387(6635).- p. 773-776.

138. Reeves R. Molecular biology of HMGA proteins: hubs of nuclear function // Gene.-2001.-N. 277(1-2).-p. 63-81.

139. Reeves R, Beckerbauer L. HMGI/Y proteins: flexible regulators of transcription and chromatin structure //Biochim Biophys Acta.- 200l.-N. 1519(1-2).- p. 13-29.

140. Reeves R., Edberg D.D., Li Y. Architectural transcription factor HMGI(Y) promotes tumor progression and mesenchymal transition of human epithelial cells //Mol Cell Biol.- 2001.- N. 21(2).- p. 575-594.

141. Resta L. et al.,1993 - Resta L, Russo S, Colucci GA, Prat J. Morphologic precursors of ovarian epithelial tumors. // Obstet. Gynecol. - 1993. - 82. - p. 181-186.

142. Risch H.A. Hormonal etiology of epithelial ovarian cancer, with a hypothesis concerning the role of androgens and progesterone // J Natl Cancer Inst.- 1998.-90(23).-p. 1774-1786.

143. Rodriguez-Rodriguez L., Sancho-Torres I., Mesonero C , Gibbon D.G., Shih W.J.,Zotalis G. The CD44 receptor is a molecular predictor of survival in ovarian cancer // Med Oncol.- 2003.- N. 20(3).- p. 255-263.

144. Rosano L., Varmi M., Salani D., Di Castro V., Spinella F., Natali P.G., Bagnato A. Endothelin-1 induces tumor proteinase activation and invasiveness of ovarian carcinoma cells // Cancer Res.- 2001.- N. 61(22).- p. 8340-8346.

145. Sager R. Expression genetics in cancer: shifting the focus from DNA to KNAII Proc Natl Acad Sci USA.- 1997.- N. 94(3).- p. 952-955.

146. Sakata К., Shigemasa К., Nagai N., Ohama K. Expression of matrix metalloproteinases (MMP-2, MMP-9, MTl-MMP) and their inhibitors (TIMP-1, TIMP-2) in common epithelial tumors of the ovary // Int J Oncol.- 2000.- N. 17(4).-p. 673-681.

147. Salani D., Di Castro V., Nicotra M.R., Rosano L., Tecce R., Venuti A., Natali P.G., Bagnato A. Role of endothelin-1 in neovascularization of ovarian carcinoma. // Am J Pathol.- 2000.- N. 157(5).- p. 1537-1547.

148. Sanchez Alvarado A., Newmark P. A. Double-stranded RNA specifi-cally disrupts gene expression during planarian regeneration // Proc Natl Acad Sci USA.- 1999.- N. 96.- p. 5049-5054.

149. Sano A., Maeda M., Nagahara S., Ochiya Т., Honma K., Itoh H., Miyata Т., Fujioka K. Atelocollagen for protein and gene delivery // Adv Drug Deliv Rev.-2003.-N. 55(12).-p. 1651-1677.

150. Sawasaki Т., Shigemasa K., Shiroyama Y. Cyclin E mRNA overexpression in epithelial ovarian cancers: inverse correlation with p53 protein accumulation // J Soc Gynecol Invest.- 2001.- N. 8.- p. 179-185.

151. Scala S., Portella G., Fedele M., Chiappetta G., Fusco A. Adenovirus- mediated suppression of HMGI(Y) protein synthesis as potential therapy of human malignant neoplasias // Proc Natl Acad Sci USA.- 2000.- N. 97(8).- p. 4256-4261.

152. Schindler C, Darnell J.E. Jr. Transcriptional responses to polypeptide ligands: the JAK-STAT pathway // Ann Rev Biochem.- 1995.- p. 64.- p. 621-651.

153. Schmandt R.E., Broaddus R., Lu K.H. Expression of c-ABL, c-KIT, and platelet-derived growth factor receptorbeta in ovarian serous carcinoma and normal ovarian surface epithelium // Cancer.- 2003.- N. 98.- p. 758-764.

154. Sharpe J.C., Arnoult D., Youle R.J. Control of mitochondrial permeability by Bcl-2 family members // Biochim Biophys Acta.- 2004.- N. 1644(2).- p. 107-113.

155. Shayesteh L, Lu Y, Kuo WL, Baldocchi R, Godfrey T, Collins C, Pinkel D, Powell B, Mills GB, Gray JW. PIK3CA is implicated as an oncogene in ovarian cancer//Nat Genet.-1999.-N.21(1).-p. 99-102.

156. Shih le.M., Kurman R.J. Ovarian tumorigenesis: a proposed model based on morphological and molecular genetic analysis // Am J Pathol.- 2004.- N. 164(5).-p. 1511-1518.

157. Shin K.S., SuUenger B.A., Lee S.W. Ribozyme-mediated induction of apoptosis in human cancer cells by targeted repair of mutant p53 RNA // Mol Ther.- 2004.- N. 10(2).- p. 365-372.

158. See H.T., Kavanagh J.J., Hu W., Bast R.C. Jr Target therapy for epithelial ovarian cancer. CuiTent status and future prospects // Int J Gynecol Cancer.-2003." N. 13.-p. 701-734.

159. Sehouli J., Mustea A., Koensgen D., Chen F.C., Lichtenegger W. Interleukin-l receptor antagonist gene polymorphism is associated with increased risk of epithelial ovarian cancer // Ann Oncol.- 2003.- N. 14(10).- p. 1501-1504.

160. Selgas R., Jimenez-Heffernan J., Lopez-Cabrera M. On the epithelial- mesenchymal transition of mesothelial cells // Kidney Int.- 2004.- N. 66(2).- p. 866-867.

161. Seller Z Cellular Adhesion and Adhesion Molecules // Turk. J. Biol.- 2001.- N. 25.-p. 1-15.

162. Serov S., Scully R., Sobin L. Histological typing of ovarian tumor. International histological classification of tumors N9 // 1973.- Geneva

163. Silva E.G., Tornos C , Deavers M., Kaisman K., Gray K., Gershenson D. Induction of epithelial neoplasms in the ovaries of guinea pigs by estrogenic stimulation // Gynecol Oncol.- 1998.- N. 71(2).- p. 240-246.

164. Silver D.L., Naora H., Liu J., Cheng W., Montell D.J. Activated signal transducer and activator of transcription (STAT) 3: localization in focal adhesions and function in ovarian cancer cell motility // Cancer Res.- 2004.- N. 64(10).- p. 3550-3558.

165. Sorensen D.R., Leirdal M., Sioud M. Gene silencing by systemic delivery of synthetic silWAs in aduh mice // J Mol Biol.- 2003.- N. 327(4).- p. 761-766.

166. Spandidos D.A., Sourvinos G., Tsatsanis C , Zafiropoulos A. Normal ras genes: their onco-suppressor and pro-apoptotic functions // Int J Oncol.- 2002.-21(2).-p. 237-241.

167. Springer D.L., Auberry D.L., Ahram M., Adkins J.N., Feldhaus J.M., Wahl J.H., Wunschel D.S., Rodland K.D. Characterization of plasma membrane proteins from ovarian cancer cells using mass spectrometry // Dis Markers.-2003.-N. 19(4).-p. 219-228.

168. Stack M.S., Ellerbroek S.M., Fishman D.A. The role of proteolytic enzymes in thepathology of epithelial ovarian carcinoma//Int J Oncol.- 1998.-N. 12(3).-p.569-576.

169. Stadel BV. The etiology and prevention of ovarian cancer. // Am. J. Obstet. Gynecol.-1975.- 123.-p. 772-774.

170. Strobel Т., Cannistra S.A. Betal-integrins partly mediate binding of ovarian cancer cells to peritoneal mesothelium in vitro // Gynecol Oncol.- 1999.- N. 73(3).-p. 362-367.

171. Sun М., Wang G., Paciga J.E. AKTl/PKBa kinase is frequently elevated in human cancers and its constitutive activation is required for oncogenic transformation in NIH3T3 cells // Am J Pathol.- 2001.- N. 159.- p. 431-437.

172. Sundfeldt K., Piontkewitz Y., Ivarsson K., Nilsson O., Hellberg P., Brannstrom M., Janson P.O., Enerback S., Hedin L. E-cadherin expression in human epithelial ovarian cancer and normal ovary // Int J Cancer.- 1997.- N. 74(3).- p. 275-80.

173. Sundfeldt K. Cell-cell adhesion in the normal ovary and ovarian tumors of epithelial origin; an exception to the rule // Mol Cell Endocrinol.- 2003.- N. 28.- p. 89-96.

174. Survival of Cancer Patient in Europe: The EUROCARE Study. // lARC Sci.Publ. - 1997.-N132

175. Survival of Cancer Patient in Europe: The EUROCARE-2 Study. // lARC Sci.Publ.- 1999.- N151

176. Sutherland H.G., Mumford O.K., Newton K., Ford L.V., Farrall R., Dellaire G., Caceres J.F., Bickmore W.A. Large-scale identification of mammalian proteins localized to nuclear sub-compartments // Hum Mol Genet.- 2001.- N. 10(18).-p. 1995-2011.

177. Szamborski J. Frequency of histological types of ovarian neoplasms in various populations of women // The VI Symposium of Gynaecological Oncology. Ovarian Tumours, Abstr. - Warsaw, 1989. - p. 19.

178. Tai Y.T., Strobel Т., Kufe D., Cannistra S.A. In vivo cytotoxicity of ovarian cancer cells through tumor-selective expression of the В AX gene // Cancer Res.-1999.- N. 59(9).- p. 2121-2126.

179. Tait D.L., Obermiller P.S., Fraziier S.R., Jensen R.A., Welcsh P., Dann J., King M.C., Johnson K.H., Holt J.T. A phase I trial of retroviral BRCAl vs gene therapy in ovarian cancer // Clin Cancer Res.- 1997.- N. 3.- p. 1959-1968.

180. Tait D.L., Obermiller P.S., Hatmaker R.A., Frazier S.R., Holt J.T. Ovarian cancer BRCAl gene. Phase I and II trial differences in immune response and vector stability // Clin Cancer Res.- 1999.- N. 5.- p. 1708-1714.

181. Tamrakar S., Rubin E., Ludlow J.W. Role of pRB dephosphorylation in cell cycle regulation // Front Biosci.- 2000.- N. 1(5).- p. 121-137.

182. Tandle A., Blazer D.G. 3rd, Libutti S.K. Antiangiogenic gene therapy of cancer: recent developments // J Transl Med.- 2004.- N. 2.- p. 1-20.

183. Titus-Emstoff L., Perez K., Cramer D.W., Harlow B.L., Baron J.A., Greenberg E.R. Menstrual and reproductive factors in relation to ovarian cancer risk // Br J Cancer.- 2001.- N. 84(5).- p. 714-721.

184. Tomar R.S., Matta H., Chaudhary P.M. Use of adenoassociated viral vector for delivery of small interfering RNA // Oncogene.- 2003.- N. 22.- p. 5712-5715.

185. Truong K., Ikura M. The cadherin superfamily database // Journal of Structural and Functional Genomics.- 2001.- N. 2.- p. 135-143.

186. Valentino K.L., Eberwine J.B., Barchas J.D. In situ hybridization: Application in neurobiology // Oxford University Press.- 1987.

187. Van der Krol A.R., Mur L.A., Beld M., Mol J.N., Stuitje A.R. Flavonoid genes in petunia: addition of a limited number of gene copies may lead to a suppression of gene expression // Plant Cell.- 1990.- N. 2.- p. 291-299.

188. Van Doi-pe J., Dal Cin P., Weremowicz S., Van Leuven F., de Wever L, Van den Berghe H., Fletcher CD., Sciot R. Translocation of the HMGI-C ( HMGA2) gene in a benign mesenchymoma (chondrolipoangioma) // Virchows Arch.- 2002.-N. 440(5).- p. 485-490.

189. Van Haaften-Day C, Russell P., Davies S., King N.J., Tattersall M.H. Expression of Fas and FasL in human serous ovarian epithelial tumors // Hum Pathol.- 2003.- N. 34(1).- p. 74-79.

190. Velculescu VE, Zhang L, Vogelstein B, Kinzler KW. Serial analysis of gene expression//Science.-1995.-N.270(5235).-p.484-7.

191. Wang K., Gan L., Jeffeiy E., Gayle M., Gown A.M., Skelly M., Nelson P.S., Ng W.V., Schummer M., Hood L., Mulligan J. Monitoring gene expression profile changes in ovarian carcinomas using cDNA microarray // Gene.- 1999.- N. 229(1-2).-p. 101-108.

192. Wells A. EGF receptor // Int J Biochem Cell Biol.- 1999.- N. 31(6).- p. 637- 643.

193. Wen Y., Li-Ya S., Chun-Hai L., Li-Xin Z. Screening and identification og ovarian carcinomas related genes // Chinese Journal of cancer.- 2004.- N. 23(2).-p. 141-151.

194. Williams B.R. PKJR.; a sentinel kinase for cellular stress // Oncogene.- 1999.- N. 18(45).-p. 6112-6120.

195. Witty J.P., Jensen R.A., Johnson A.L. Expression and localization of Bcl-2 related proteins in human ovarian cancers // Anticancer Res.- 1998.- N. 18(2B).-p. 1223-1230.

196. Wolf J.K., Jenkins A.D. Gene therapy for ovarian cancer // Int J Oncology.- 2002.-N. 21.-p. 461-468.

197. WoodL.L, Maher J.F., Bunton Т.Е., Resar L.M. The oncogenic properties of i' the HMG-I gene family // Cancer Res.- 2000.- N: 60(15).- p: 4256-4261.

198. WorsleyS.D., Ponder B;A., Davies B.R. Overexpressibn of cyclinDlin epithelial ovarian.cancers//Gynecol Oncoh- 1997.-N; 64.-p. 189-195.

199. Wu X.H:, Li D.X., Li L., Guo Y.H., Yang В:, Shan B.E. Alphavbeta 6 integrin inhibits cisplatin-induced apoptosis in ovarian cancer cell lines // Zhonghua Fu Chan KeZaZhi.-2004.-N.39(2).-p> 112-115.

200. Xia H., Mao Q., Paulson H.L., Davidson B:L. siRNA-mediated gene silencing in>vitro and in vivo//Nat Biotechnol.-2002.-№20(10).-p. 1006-1010.

201. Zhang Y., Guo K.J., Shang H., Wang Y.J., Sun L.G: Expression of aFGF, bFGF, and FGFRl in ovarian epithelial neoplasm// Chin Med L- 2004>N. 117(4).-p. 601-603.

Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Анализ профиля экспрессии генома клеток рака яичников

Автореферат диссертации по медицине на тему Анализ профиля экспрессии генома клеток рака яичников

Оглавление диссертации Малек, Анастасия Валерьевна :: 0 ::

Введение диссертации по теме "Онкология", Малек, Анастасия Валерьевна, автореферат

Список использованной литературы по медицине, диссертация 0 года, Малек, Анастасия Валерьевна

Похожие научные работы

Каталог диссертаций