Автореферат и диссертация по медицине (14.00.08) на тему:Амниопластическая хирургия в комплексном лечении эпителиальной патологии переднего отдела газа

На правах рукописи

МИЛЮДИН Евгений Сергеевич

АМНИОПЛАСТИЧЕСКАЯ ХИРУРГИЯ В КОМПЛЕКСНОМ ЛЕЧЕНИИ ЭПИТЕЛИАЛЬНОЙ ПАТОЛОГИИ ПЕРЕДНЕГО ОТДЕЛА ГЛАЗА

14 00 08 - Глазные болезни 14 00 15 - Патологическая анатомия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени

003063471

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию РФ и СКОБ им Т И Ерошевского Научные консультанты

Андрей Владимирович доктор медицинских наук, профессор Волова

Лариса Теодоровна

Официальные оппоненты

доктор медицинских наук, профессор Петухов

Валерий Матвеевич доктор медицинских наук, профессор Маслякова

Галина Никифоровна доктор медицинских наук, профессор Салихов

Амир Юсупович

Ведущая организация ФГУ «Московский научно-исследовательский институт глазных болезней им Гельмгольца» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию РФ.

заседании диссертационного совета Д 208 085 02 при ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» по адресу 443079, г Самара, пр К Маркса, 165 Б

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Самарский

государственный медицинский университет» (443001, г Самара,

ул Арцыбушевская,171)

Автореферат разослан « I 0 » ji ( Q -Л 2007г

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор Л.Н.Аськова

доктор медицинских наук

Золотарев

Защита диссертации состоится

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ

Здоровая поверхность глаза сформирована двумя типами эпителия -роговичным и конъюнктивальным Передний поверхностный эпителий является одной из важнейших структур, обеспечивающих гомеостаз роговицы и глаза в целом Соответственно и патологические процессы, развивающиеся при нарушении целостности и адекватности регенераторных процессов эпителия многообразны

Наиболее частым проявлением патологии эпителиального покрова глазного яблока является птеригиум, ложный птеригиум, симблефарон, эпителиальные дистрофии роговицы (Schrrudinger G et al, 2003)

При длительном отсутствии эпителиального покрова в роговице развиваются метаболические нарушения, что приводит к развитию разнообразных по клиническому проявлению патологических состояний Данные патологические изменения могут быть подразделены на две категории Первая категория характеризуется повреждением камбиальных клеток, что может наблюдаться при химическом или термическом ожоге легкой или средней тяжести, при синдроме Stevens-Johr.son, многократных криовоздействиях на зону лимба, длительном ношении контактных линз, воздействии ультрафиолетовых лучей Для второй категории характерно разрушение непосредственно морфологической структуры, на которой фиксированы камбиальные клетки Данное патологическое состояние может быть обусловлено различными кератитами, хирургическими операциями, повреждающими область лимба, ожогами тяжелой и особо тяжелой степени (Schmidinger G et al, 2003, Tsai-R J Tseng S С , 1994)

Тяжелые и особо тяжелые ожоги всегда сопровождаются грубыми повреждениями эпителиального покрова, приводящими к рубцеванию,

деформации и формированию помутнения роговицы (Гундорова РА и др ,

1996, Макаров П В , 2003)

Решение медико-социальных проблем, вызванных патологическими изменениями со стороны переднего отдела органа зрения, возможно за счет разработки и внедрения комплекса лечебных и реабилитационных мероприятий, основу которых представляют реконструктивные операции В зависимости от степени выраженности патологических изменений выполняются хирургические операции, направленные на замещение утраченных камбиальных клеток, либо хирургические вмешательства, создающие условия для полноценной регенерации собственных тканей

В первом случае выполняется ауто- или аллотрансплантация биологических тканей Однако при этом не исключается развитие иммунного конфликта и тканевой несовместимости, появляется необходимость иммунносупрессивной терапии (Брошевский Т И , 1961, Абрамов В Г , 1968, Беляев В С, 1984)

В других случаях, для обеспечения благоприятных условий, обеспечивающих восстановление эпителиального слоя поверхности глаза, используются самые разнообразные материалы и тканевые компоненты как биологического (Гундорова РА,1996, Салихов А Ю,1997, Ченцова Е.В ,

1997, Кашоков В II ,2001), так и неорганического происхождения (Федоров С Н , 1982, Филатова И А , 2001, Р , 2003)

Успех хирургических вмешательств на переднем отрезке глазного яблока зависит от многих причин, в частности, от качества и скорости восстановления эпителия роговицы Очевидно, что одним из важнейших критериев оценки результатов реконструктивных операций является характер регенерации замещенных тканей При патологических состояниях, связанных с недостаточностью камбиальных клеток поверхностного эпителия, важно создать условия для восстановления эпителия и стромы роговицы

Используемые методы перемещения конъюнктивы, замещения дефектов ткани слизистой ротовой полости, пищевода приводят к грубому рубцеванию, развитию атипичной для данного участка слизистой, прорастанию вновь образованных сосудов Недостаточная эффективность хирургических вмешательств, частые рецидивы заболеваний позволяют нам считать неполноценной послеоперационную регенерацию патологического участка поверхности глазного яблока

Научный поиск наиболее эффективного пластического материала, используемого для обеспечения благоприятных условии регенерации поверхностного эпителия, позволил определить необходимые требования к биологическому материалу Прежде всего, материал должен быть биологически активным, способным восстановить временно или постоянно анатомическую целостность и функциональную полноценность эпителиального покрова глазного яблока Немаловажно постоянное наличие запаса стерильного и удобного для использования хирургом материала

Интеграция последних научных данных с медицинским опытом позволяет предложить амниотическую мембрану как наиболее действенный, эффективный и безопасный способ временного замещения дефектов эпителиальных и слизистых оболочек (Батманов Ю Е , 1990, Tseng S С , 1998, Момозе А ,2001) Однако применение амниотической оболочки на различных стадиях заболевания приводит к неоднозначным толкованиям эффективности и обоснованности данного лечебного мероприятия А Момозе и многие другие сравнивают амниотическую мембрану с «волшебными шелковыми одеждами», напротив, RIvekovi (2001) считает необоснованным широкое применение амниона Следовательно, остается нерешенным вопрос о целесообразности и эффективности использования амниотической оболочки при патологических состояниях переднего отрезка глазного яблока Таким образом, необходимо продолжить изучение свойств амниотической оболочки и разработку новых методов лечения патологических состояний эпителия

роговицы и конъюнктивы глазного яблока, выработать строгие критерии и показания к применению амниотической мембраны, оценки эффективности лечебного мероприятия

Расширение показаний к использованию амниотической оболочки выдвигает еще одну актуальную задачу - разработку новых и доступных методов консервации амниона, так как использование не консервированной амниотической оболочки, либо консервированной в питательных средах, имеет некоторые недостатки Прежде всего, это сложность планирования операции, так как необходимо учитывать время забора донорского материала Ограниченные длительность хранения амниона и жизнеспособность его эпителия вызывают сомнение в эффективности применения для создания условий полноценной регенерации поврежденных тканей Достаточно актуальна проблема стерильности при использовании нативного материала

Существующие методы длительной консервации лиофилизация, криоконсервация, так же обладают различными недостатками В частности, необходимо специальное и дорогостоящее оборудование, особенные условия подготовки и хранения биоматериала

Нерешенность проблемы лечения больных с эпителиальной патологией переднего отрезка глаза, необходимость создатгая единого алгоритма использования амниотической мембраны при патологии роговицы и конъюнктивы глазного яблока определили выбор цели нашего исследования Следовательно, на основании вышесказанного, представляется актуальной и современной задача по дальнейшему исследованию свойств амниотической оболочки и разработке как новых методов хирургического лечения пациентов,ы так и новых методов заготовки и консервации амниотической мембраны

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Целью настоящей работы является разработка комплексной системы хирургического лечения пациентов с эпителиальной патологией переднего отдела глаза на основе нового пластического материала - силиковысушеннои пластифицированной амниотической мембраны (СПАМ)

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1 Разработать технологию изготовления на основе амниотической мембраны нового материала с заданными свойствами механическая пластичность, низкая антигенность, вирусная и бактериальная безопасность, длительная сохранность

2 Изучить морфологические изменения амниотической мембраны, консервированной различными способами

3 Изучить воздействие химических и физических факторов при консервации путем высушивания над силикагелем с пластификаторами на иммунногенность и биологическую активность амниона

4 Исследовать в эксперименте взаимодействие силиковысушеннои пластифицированной амниотической мембраны с тканями роговицы на экспериментальной модели недостаючности региональных стволовых клеток роговичного эпителия

5 Изучить эффективность применения силиковысушеннои пластифицированной амниотической мембраны при хирургическом лечении больных с патологическими изменениями конъюнктивы, обусловленными эпителиальной недостаточностью (птеригиум, симблефарон)

6 Изучить влияние силиковысушеннои пластифицированной амниотической мембраны на результаты лечения больных с эпителиальной патологией роговицы

7 Разработать алгоритм лечения тяжелых и особо тяжелых ожогов глаза с использованием СПАМ

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Создан биологический имплантат из амниотической мембраны -силиковысушенная пластифицированная амниотическая мембрана (СПАМ) -удобный, эффективный и безопасный материал (Патент РФ №2214091, Патент РФ №36219)

Впервые доказана возможность сохранения соединительно-тканнои структуры СПАМ и изучены морфометрические изменения при высушивании над силикагелем с пластификаторами амниотической мембраны

Впервые доказана низкая анитигенность и высокая биосовместимость СПАМ

Впервые разработана экспериментальная модель недостаточности региональных стволовых клеток роговичного эпителия, изучен механизм замещения СПАМ на поверхности роговицы и доказана его биологическая активность

Разработанный в эксперименте метод получения культуры клеток роговичного эпителия, фиксированного на поверхности силиковысушенной амниотической мембраны, открывает новые возможности при реабилитации пациентов с тяжелой эпителиальной патологией переднего отдела глазного яблока

Систематизированы методы диагностики недостаточности камбиальных клеток роговичного эпителия и разработана классификация недостаточности камбиальных клеток роговичного эпителия

Разработан метод пластики конъюнктивы СПАМ при лечении рецидивирующего птеригиума Предложен способ противорецидивного

лечения птеригиума в послеоперационном периоде (Решение о выдаче патента РФ по заявке №5054173/14)

Разработан метод пластики конъюнктивы при лечении рубцовых деформации конъюнктивальной полости с использованием СПАМ

Проведен сравнительный клинический анализ эффективности применения СПАМ при лечении заболеваний роговицы

Впервые проведено изучение результатов использования СПАМ и аутоконъгонктивы

Предложен алгоритм функциональной и косметической реабилитации больных при ожоговой болезни глаза с использованием СПАМ (Свидетельство об официальной регистрации программы для ЭВМ №2004611849)

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ

Предложен простой и доступный метод консервации амниотической оболочки высушиванием над силикагелем с последующей гамма-стерилизацией

Подтвержденная гистологическими исследованиями сохранность морфологической структуры СПАМ позволила предложить данный материал для хирургического лечения больных с патологическими состояниями эпителиальной поверхности глазного яблока

Разработанный комплекс методов использования амниотической мембраны позволяет ускорить процесс реабилитации пациентов с патологическими изменениями эпителия конъюнктивы и ро1 овицы Клинические рекомендации, основанные на внедрении в практику алгоритма лечения пациентов с последствиями тяжелых ожогов глаза, позволяют выбрать наиболее рациональный путь реабилитации больного

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

• Новый пластический материал для покрытия деэпителизированных поверхностей - силиковысушенная пластифицированная амниотическая мембрана (СПАМ), с сохранением основных свойств нативного амниона, отличающийся гарантированной вирусной и бактериальной безопасностью, возможностью длительного хранения в обычных условиях

• Экспериментальная модель развития недостаточности региональных стволовых клеток роговичного эпителия без механического повреждения лимбальной зоны и особенности механизма замещения СПАМ на поверхность роговицы

• Разработанный способ пластики дефектов конъюнктивы СПАМ при хирургическом лечении птеригиума, симблефарона

• Система выбора объема хирургического вмешательства при лечении пациентов с патологией эпителия роговицы

• Алгоритм лечебных мероприятий с использованием СПАМ при ожоговой травме глаза

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Положения диссертации доложены и обсуждены на VII и VIII съездах офтальмологов России (Москва, 2000, 2005), Всероссийской научно-практической конференции «Ерошевские чтения» (Самара, 1997), на Всероссийской конференции «Геронтологические аспекты офтальмологии» и VI Международного семинара по вопросам пожилых "Самарские лекции" (Самара,2002), на Ш Евро-Азиатской конференции по офтальмохирургии (Екатеринбург, 2003), на 12th интернациональном конгрессе Европейской ассоциации тканевых банков (Brugge, Belgium, 2003), на II Всероссийском симпозиуме с международным участием «Клинические и фундаментальные

10

аспекты тканевой терапии Теория и практика клеточных биотехнологий» (Самара, 2004), на XXXIX научно-практической межрегиональной конференции врачей (Ульяновск, 2004), на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Новые технологии в лечении заболеваний роговицы» (Москва, 2004), на межрегиональной конференции офтальмологов, посвященной 40-летию Самарской клинической офтальмологической больницы им Т И Брошевского и 85-летию Самарского государственного медицинского университета (Самара,2004), заседании общества офтальмологов Самарской области (Самара, 2004), на научно-практической конференции «Регенеративная медицина и трансплантация тканей в офтальмологии» (Москва,2005), на научно-практической конференции «Актуальные вопросы контактной коррекции зрения» (Москва,2006), на научно-практической конференции «Новые технологии в пластической хирургии придаточного аппарата при травмах глаза и орбиты в условиях чрезвычайных ситуаций и катастроф» (Москва, 2007)

ПУБЛИКАЦИИ

Материалы диссертации представлены в 44 печатных работах, в том числе 8 в изданиях рекомендуемых ВАК, 2 в зарубежной печати, 2 работы в материалах съездов офтальмологов РФ, 5 в материалах научно-практических конференции с международным участием

Издана монография и учебное пособие для врачей-интернов Получено 2 патента, 1 решение о выдаче патента и 1 свидетельство о регистрации программы для ЭВМ

Получено регистрационное удостоверение на изделие медицинского назначения - Имплантат амниотическои мембраны силиковысушенный «Флексамер»

СВЯЗЬ ИССЛЕДОВАНИЯ С ПРОБЛЕМНЫМИ ПЛАНАМИ Работа выполнена по плану научно-исследовательских работ ГОУ ВПО Самарското государственного медицинского университета Номер государственной регистрации 01970004251.

ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ Созданный новый пластический материал на основе амниотической оболочки «Флексамер» был зарегистрирован Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития как изделие медицинского назначения

Результаты научных исследований используются в учебном процессе кафедры офтальмологии Самарского государственного медицинского университета, Самарского военно-медицинского института

Разработанные рекомендации и алгоритмы лечения больных внедрены в практику в ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет Росздрава» Самарской клинической офтальмологической больнице им Т И Ерошевского, в Воронежской областной клинической офтальмологической больнице

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ

Диссертация изложена на 283 страницах, состоит из введения, девяти глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 282 источника, из них 131 зарубежных Диссертация содержит 19 таблиц, 12 графиков и 88 рисунков

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Работа основана на анализе результатов хирургического лечения больных с эпителиальной патологией переднего отдела глаза за период с

1995 по 2005 гг (259 пациентов (275 глаз)), экспериментальных исследованиях на 55 кроликах и 27 крысах, а также на результатах морфологических исследований, определения влажности и стерильности амниотической мембраны

Технологический процесс изготовления пластифицированной силиковысушенной амниотической мембраны

Нами разработан и внедрен в клинику новый метод длительной консервации амниотической мембраны без фиксации на нитроцеллголозной бумаге Способ консервации амниотической мембраны осуществляется следующим образом Производится забор участка плаценты в роддоме в стерильных условиях при выполнении кесарева сечения у беременных женщин, дважды в течение беременности обследованных на ВИЧ, гепатит В и С, сифилис Плацента очищается от сгустков крови в 0,9% растворе хлорида натрия Амнион отделяется от остатков хориона обрабатывается в 0,02% растворе хлоргексидина 10 минут, в растворе, содержащем 40мг/мл гентамицина и 2,5мг/мл амфотерицина В - 10 минут Амниотическая мембрана погружается на время в глицерол, затем фиксируется на рамки и помещается в эксикатор с силикагелем Высушивание амниотической мембраны над силикагелем производится в течение 18 — 24 часов В последующем, в стерильных условиях амниотическая мембрана отделяется от рамки, упаковывается и стерилизуется гамма-лучами Срок хранения консервированной таким образом амниотической мембраны не менее 2 лет в герметичной упаковке при комнатных условиях Силиковысушенная АМ была подвергнута комплексному изучению Исследовались влажность материала, стерильность, антигенные свойства, морфологическая структура

Влажность материала определялась термогравиметрическим методом и составила 10% В бактериологической лаборатории ГЦГСЭН г Самары периодически выполняется бактериологическое исследование

консервированного материала, которое подтверждает стерильность материала Всероссийским научно-исследовательским и испытательным институтом медицинской техники МЗ РФ проведены токсикологические испытания имплантата СПАМ Получено заключение - имплантат амниотической мембраны силиковысушенный для покрытия деэпителизированных поверхностей ТУ 9393-002-04985744-2006 не токсичен, стерилен, отвечает требованиям нормативной документации (№582-04 от 14 10 2004) Научно-экспертный совет по медицинским изделиям Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития рекомендовал имплантат амниотической мембраны силиковысушенный для покрытия деэпителизированных поверхностей «Флексамер» к регистрации как изделие медицинского назначения

Экспериментальные исследования

Антигенные свойства силиковысушенной пластифицированной амниотической мембраны (СПАМ) исследовались в ходе эксперимента, который выполнялся в условиях операционной ЦНИЛ СамГМУ на 27 половозрелых белых крысах весом 250-300г Были проведены три серии экспериментальных исследований 1 серия — с имплантацией нативной АМ, 2 серия - с лиофршизированной АМ, 3 серия - с имплантацией силиковысушенной АМ На наружной поверхности задней конечности крыс формировалось ложе в большой ягодичной мышце, куда укладывался и фиксировался одним узловым швом имплантат амниотической мембраны размером 10x10мм

Оценка производилась по степени морфофункциональных изменений периферических лимфоузлов и количественных изменений показателей периферической крови экспериментальных животных

Экспериментальное исследование значения лимбальной зоны в развитии патологических изменений эпителия роговицы было выполнено на 23 кроликах (46 глаз) породы «Шиншилла» весом 3 -5 кг, содержащихся в условиях вивария ЦНИЛ СамГМУ 1 группа, экспериментальная - 15 кроликов (30 глаз), которым выполнялось удаление роговичного эпителия путем аппликации в течение 15 секунд на поверхность роговицы диска фильтровальной бумаги, пропитанного 20% раствором этилового спирта, с последующим воздействием на камбиальные клетки в области лимба митомицином -С (ММС) Забор материала для дальнейшего исследования выполнялся на 3 и 7 сутки

2 группа, контрольная - 8 кроликов (16), которым выполнялось удаление эпителиального слоя роговицы без воздействия ММС на лимбальную зону Эпителии на правых глазах кроликов данной группы удалялся при помощи аппликации на роговицу диска фильтровальной бумаги, пропитанного 20% раствором этилового спирта, а на левых глазах эпителий удалялся механическим воздействием шпателя Забор материала для дальнейшего исследования выполнялся на 3 и 7 сутки

Изучение сохранности свойств активного субстрата для эпителизации выполнялась путем фиксирования на поверхность СПАМ культивированных эпителиоцитов роговицы Забор региональных стволовых клеток роговичного эпителия осуществлялся в области лимба Оценка производилась на этапе культивирования в питательной среде, с использованием инвертированного светового микроскопа, и после фиксации с трехдневным культивированием на поверхности СПАМ Тканеинженерный комплекс был фиксирован в 12% формалине, препараты были окрашены гематоксилин-эозином

Экспериментальное исследование по изучению характера замещения силиковысушенной амниотической мембраны на поверхности роговицы нами проводилось на двух группах по 16 животных, всего 32 кролика (64

глаза) породы «Шиншилла» весом 3-5кг В контрольной группе, после удаления эпителия роговицы путем аппликации диска фильтровальной бумаги, пропитанной 20% раствором спирта и воздействия на камбиальные клетки роговичного эпителия в области лимба митомицином -С (ММС), наблюдали за регенерацией эпителия и выполняли морфологические исследования на 3, 7, 14, 21 сутки В экспериментальной группе, после удаления эпителия роговицы путем аппликации диска фильтровальном бумаги, пропитанной 20% раствором спирта и воздействия на камбиальные клетки роговичного эпителия в области лимба митомицином -С (ММС), выполнялось покрытие роговицы силиковысушенной амниотической мембраной Диск силиковысушенной амниотической мембраны фиксировался стромальной стороной к поверхности роговицы и укреплялся узловыми швами 8/00 В послеоперационном периоде наблюдали за процессом восстановления эпителия на поверхности роговицы Забор материала для морфологического исследования выполнялся на 3, 7, 14, 21 сутки

Изучение морфологических изменений при консервации амниотической мембраны проводилось на морфологических препаратах , изготовленных из 20 объектов нативной амниотической мембраны, 30 объектов, консервированных в среде Eagle's с добавлением хондроитин сульфата при температуре 4°С, 20 объектов при температуре минус 80°С, 20 объектов амниона, консервированных путем силиковысушивания Гистологические препараты изготавливались после фиксации в 12% нейтральном растворе формалина, проведения через батарею спиртов и заливки в целлоидин Нативная амниотическая мембрана фиксировалась сразу после отделения от плаценты и обработки в физиологическом растворе с антибиотиками Амниотическая мембрана, консервированная в среде Eagle при температуре плюс 4°С, фиксировалась после 3, 6 и 9 суток консервации Образцы амниона, консервированного в среде Eagle's с глицеролом при

температуре минус 80°С, фиксировались после 90 суток консервации Высушенная над силикагелем с пластификаторами амниотическая мембрана фиксировалась в нейтральном формалине после стерилизации гамма лучами с суммарной дозой поглощения 15,20,25 кГр

Приготовленные срезы окрашивались гематоксилин-эозином по методу Маллори, по Ван Гизон гематоксилином Вейгерта и исследовались под световым микроскопом Подсчет клеток и морфометрия осуществлялись в 10 - 23 полях зрения

Морфологические исследования патологических изменений эпителиальной поверхности глаза и характера замещения силиковысушенной амниотической оболочки выполнены на 110 прооперированных кроличьих глазах Глаза фиксировались в 12% нейтральном растворе формалина, проводились через батарею спиртов и заливались в целлоидин Выполнялось не менее 500 срезов с различных участков переднего отдела каждого глазного яблока Каждый десятый срез окрашивался гематоксилин-эозином, по Ван Гизон

Лимфатические узлы, селезенка и участок мышцы с фиксированной амниотической мембраной крыс-самцов также фиксировались в 12% нейтральном формалине, с последующей заливкой в парафин Срезы выполнялись через центральную часть ыакропрепарата, обычно получали для окраски около 50 срезов, которые окрашивались гематоксилин-эозином Препараты исследовались под световым микроскопом

Цитологические исследования патолог ических изменений эпителия роговицы проводились по цитограммам «Отпечатки» готовились на предметном стекле, высушивались при комнатной температуре, а затем фиксировались в 97,3% этиловом спирте в течение 15 минут Препараты окрашивались по Романовскому-Гимза Микроскопическое исследование цитограмм проводилось с помощью иммерсионного объектива, имеющего увеличение х90

Клинические исследования

Клиническую группу составили 259 пациентов (275 глаз), находившихся в травматологическом отделении СКОБ им Т И Брошевского с 1995 по 2005гг на стационарном лечении В их числе 106 (106 глаз) пациентов с птерягиумом, 37 (37 глаз) пациентов с Рубцовыми деформациями конъюнктивы, 40 (40 глаз) пациентов с эндотелиально-опителиальной дистрофией роговицы и рецидивирующими эрозиями роговицы, 76 (92 глаза) пациентов с тяжелыми и особо тяжелыми ожогами глаз Учитывая множество вариантов проявления патологии покровных тканей глаза, нами в каждом случае разрабатывались определенные критерии включения пациентов в изучаемые группы Исследования проводились с параллельным (одновременным) контролем Выборки больных для проведения исследований формировались по принципу случайного формирования экспериментальных групп Исключением было исследование эффективности применения силиковысушеннои амниотической мембраны при патологических состояниях эпителия роговицы В данной группе анализ результатов применения предлагаемой методики изучался путем проведения исследований до- и после лечения

Обследование пациентов включало как общепринятые офтальмологические, так и функциональные и лабораторные методы исследований

Офтальмологические методы Острота зрения определялась с помощью проектора оптотипов фирмы «ПЗ-МД» В случаях отсутствия предметного зрения, светоощущение и светопроекция определялись с помощью прямого офтальмоскопа фирмы «HEINE» ВЕТА-200

Метод фокального бокового освещения использован для общего осмотра переднего отдела глаза

Биомикроскопические исследования проводились с помощью щелевой лампы фирмы «Karl Zeiss Jena», «Reichert» -XCEL 200 по методикам, описанным Н Б Шульпиной для оценки состояния роговицы, склеры и глублежащих структур Размер дефекта роговицы определялся флюоресцеиновой пробой Фоторегистрация выполнялась с помощью щелевой лампы «Reichert» -XCEL 200 с видеосистемой, состоящей из видеокамеры CCD-IRIS SSC-C370P и видеоадаптера YS-W130P фирмы «Sony»

Офтальмоскопия (по возможности) осуществлялась с помощью прямого ручного офтальмоскопа фирмы «HEINE» ВЕТА-200

Внутриглазное давление измерялось бесконтактным тонометром «Tonometer - ТХ-10» фирмы «Canon», с помощью тонометра по Маклакову Тонографические исследования выполнялись на тонометре-тонографе ТНЦ-100

Ультразвуковые исследования применялись для оценки состояния преломляющих сред, положения внутренних оболочек, размеров глазного яблока. Использовали А- и B-методы эхографии (с помощью и ультразвуковых сканеров "Tomey-UD-6000" и «OPHTHASONIC а/р - Ш» фирмы «MENTOR» Электрофизиологические исследования выполнялись на комплексе ЕР-! 000 Исследования и фоторегистрация проводились в диагностическом отделении СКОБ им Т И Брошевского

Лабораторные исследования выполнялись в условиях клинико-диагностической лаборатории СКОБ им Т И Брошевского Наряду с обязательными исследованиями периферической крови выполнялось цитологическое исследование эпителия поверхности глазного яблока при различных патологических состояниях Отпечаток на предметном стекле фиксировался спиртом и окрашивался по Романовскому-Гимза В последующем выполнялось исследование цитограммы под световым микроскопом «ЛОМО» с фоторегистрацией

Методы лечения больных

Все пациенты, включенные в группы изучения эффективности применения силиковысушенной пластифицированной амниотической мембраны, получали традиционное лечение, принятое в нашей клинике и основанное на методических рекомендациях ведущих научно-исследовательских институтов Хирургические операции выполнялись с использованием операционного микроскопа Hi-R 900 фирмы «Mollcr-Wedel»

Лечение пациентов с прогрессирующим и рецидивирующим птеригиумом включало в себя кроме хирургического удаления птеригиума с различными вариантами пластики слизистой, применение противовоспалительных препаратов, инсталляции антисептиков,

заменителей слезы Лечение в стационаре продолжалось до полной эпителизации роговицы При выписке из стационара пациенты продолжали инсталляции противовоспалительных препаратов в течение 2 недель

Консервативное лечение пациентов с патологическими изменениями эпителиального слоя роговицы заключалось в применении препаратов, стимулирующих регенеративные процессы (баларпан, тауфон 4%, альфа-токоферол 5% актовегин или солкосерил в желе 20% и др), инсталляции противовоспалительных препаратов (например - наклоф 0,1 %) При выраженном болевом синдроме и отсутствии эффекта от проводимого консервативного лечения выполнялось хирургическое лечение На первом этапе трансэпителиально выполнялась фототерапевтическая кератоэктомия на эксимерном лазере «LaserScan 2000» производства компании «LaserSight Technologies Inc » (USA ), диаметр пятна 0,9 мм, частота импульсов 100 Гц и энергия импульса 5 мДж Глубина абляции варьировала от 90 до 200 мкм, диаметр абляции 9,0мм Имплантация СПАМ осуществлялось через 2-18 часов после эксимерлазерного воздействия Трансплантат выкраивался

трепаном 9,25 - 9,5 мм и фиксировался к эпителию узловыми швами 10-00 В послеоперационном периоде проводилось стандартное лечение, направленное на ускорение эпителизации и уменьшение воспалительных явлений

Лечение тяжелых и особо тяжелых ожоговых травм глаза проводилось в зависимости от стадии ожогового процесса При поступлении в стационар выполнялись обычные мероприятия по обезболиванию, профилактике столбняка (подкожное введение противостолбнячной сыворотки 3000 ед по Безредко (по показаниям), противостолбнячного анатоксина 10 мл), устанавливалась система для длительного орошения конъюнктивальной полости охлажденным раствором гемодеза Назначались инсталляции 6 раз в день антибиотиков (раствор левомицетина 0,25%, тобрекс и др), препаратов для коррекции биохимических нарушений (гордокс, контрикал), препаратов, улучшающих микроциркуляцию и стимулирующих репаративные процессы (тауфон 4%, альфа-токоферол 5%, актовегин или солкосерил в желе 20% и др) Назначались субконъюнктивальные инъекции антибиотиков (пенициллин 30 тыс ед, гентамицин 10 мг), препаратов, стимулирующих репарацию (раствор тауфона 4% -0,5 мл, эмоксипина 1%- 0,5мл) Внутривенно вводились препараты гемодез 200,0 № 3-5, реополиглюкин 200,0 № 3-5, ингибиторы протеолитических ферментов гордокс 100 тыс ед, контрикал 30-50 тыс ед ежедневно При повышении внутриглазного давления во второй и третьей стадии течения ожоговой травмы назначались инсталляции мидриатиков кратковременного действия - мезатон 1%, гоматропин 0 25%, мидриацил 0 5% один раз в день, на фоне воздействия препаратами р-блокаторов (арутимол 0,5%, тимолол 0,5%), ингибиторов карбангидразы (азопт)

В течение второй стадии, после ограничения зоны некроза, проводилось хирургическое лечение В основной группе выполнялось иссечение некротических тканей с последующим покрытием поверхности глазного

яблока и выстиланием конъюнктивальных сводов специально разработанной силиковысушенной пластифицированной амниотической мембраной В группе сравнения также иссекались некротические ткани, но покрытие глазного яблока и выстилание конъюнктивальных сводов выполнялось аутослизистой В послеоперационном периоде продолжалось консервативное лечение Больные выписывались из стационара после стихания воспалительных процессов и завершения эпителизации

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Экспериментальные исследования

Расширение показаний к использованию амниотической мембраны выдвигает новую актуальную задачу, а именно, важен ли эпителий амниона и насколько необходимо сохранять его жизнеспособность С этой целью нами было выполнено сравнительное морфологическое и морфометрическое исследование нативного амниона, консервированного в питательной среде при температуре плюс 4°С , минус 80°С и силиковысушенной пластифицированной амниотической мембраны

Результаты морфологических исследований более 500

микропрепаратов, подтвержденные морфометриеи и статистическими расчетами, показали неравнозначное воздействие консервации на различные структуры амниона В частности, с высокой степенью достоверности, утверждается повреждение всего клеточного состава при силиковысушивании, однако нарастающий кариопикноз наблюдается также, как при консервации в питательной среде Eagle's при плюс 4°С и минус 80С. При консервации в питательных средах при плюс 4°С° происходит значительное разбухание стромальных слоев амниона, что может привести к отслоению последних при подготовке к использованию Криоконсервация в среде Eagle при минус 80С также приводит к значительному изменению

22

толщины соединительнотканных слоев, но структурные изменения при этом не происходят Напротив, значительное уплотнение слоев амниона наблюдается при высушивании над силикагелем Однако существенные во всех случаях морфометрические изменения слоев амниотической мембраны не приводят к разрушению морфологической структуры коллагеновых волокон

Следовательно, сравнительные морфологические и морфометрические исследования показали, что при консервации амниона путем высушивания над силикагелем, в отличие от других способов, сохраняется архитектоника амниотической мембраны, что обеспечивает механические свойства биоматериала, необходимые для пластической хирургии Клеточные структуры повреждаются при консервации любым методом в большей (при силиковысушивании), или в метшей степени (при консервации в питательных средах)

Антигенные свойства силиковысушенной пластифицированной амниотической мембраны до настоящего времени не изучались В связи с этим была поставлена задача изучить антигенные свойства силиковысушенной и лиофилизированной амниоотческои оболочки в сравнении с нативным амнионом Иммуногенность амниотической мембраны изучалась на экспериментальной модели, предложенной Л Т Воловой, путем ксеногенной трансплантации амниотической мембраны человека в мышечный карман крысы

В результате изучения микропрепаратов лимфатических узлов и селезенки белых половозрелых крыс, которым в мышечный карман фиксировалась амниотическая мембрана, нативная и консервированная методом лиофилизации и высушивания над силикагелем, нами выявлено отсутствие во всех трех группах активности процессов по выработке антител Незначительная лимфоцитарная активность проявляется на микропрепаратах

лимфоузлов и селезенки у животных, которым имплантировалась лиофилизированная амниотическая мембрана Выявленное незначительное изменение клеточного состава у животных данной серии по сравнению с животными, которым имплантировалась нативная амниотическая мембрана, связано с более длительным течением процесса замещения лиофилизированной амниотической мембраны в мышечном кармане крысы

Таким образом, наши экспериментальные исследования подтверждают литературные данные о невозможности продуцирования НЬА-В антигенов как нативной, так и консервированной без сохранения жизнеспособности клеточных структур амниотической мембраны Следовательно, имплантация СПАМ не вызывает иммунной реакции в организме реципиента

Сохранность биологически активных свойств амниотической мембраны после высушивания над силикагелем с пластификаторами нами исследовалась с применением современной методики - высевания на поверхность мембраны культивированных клеток Использование данного метода оценки сохранности свойств активного субстрата для эпитедизации основано на оценке взаимодействия клеток с биоматериалом Перспективность использования амниона в качестве биологического матрикса обусловлена имеющимися в его структуре гликопротеидами Данные вещества усиливают пролиферацию, миграцию и дифференциацию стволовых клеток эпителия, предупреждают эпителиальный апоптоз и угнетают развитие фиброза Высокая механическая прочность, стабильная и равномерная толщина, обусловленная биохимическим составом и структурой коллагеновых волокон стромы амниона, обеспечивают условия для прочной фиксации клеток Все перечисленные свойства характерны для нативной или консервированной в питательной среде при 4°С амниотической мембраны, т е при сохранении жизнеспособности клеточных структур амниона Сведений об использовании АМ с нежизнеспособными клеточными структурами в качестве биологического матрикса для культивированных

клеток в литературе нами не обнаружено Оценка производилась по степени адгезии культивированных клеток, прочности формируемого тканеинженерного комплекса Исследовалась жизнеспособность культивированных клеток фиксированных на поверхности биоматериала Источником клеточного материала были малодифференцированные клетки мезенхимального происхождения - региональные стволовые клетки роговичного эпителия Специфическая способность к размножению, миграции и закреплению в области дефекта эпителиального слоя обуславливают возможность применения региональных стволовых клеток в качестве материала для биологического тестирования

В ходе выполнения данного исследования нами была разработана методика забора клеточного материала В результате разработан метод получения камбиальных клеток роговичного эпителия Осуществлялся забор клеточного материала путем иссечения лимбальной зоны в верхнем сегменте роговицы диаметром до 2мм и толщиной до 200мкм Иссеченные кусочки ткани промывались физиологическим раствором и помещались в среду MEM с содержанием 10%-ой эмбриональной телячьей сыворотки и при температуре плюс 4°С транспортировались в клеточную лабораторию ЦНИЛ СамГМУ

Камбиальные клетки роговичного эпителия размножались быстро, плотность удваивалась приблизительно через 20 часов На втором этапе, через 5-7 дней культивации клеток при 37°С с содержанием 5%С02 в подаваемом в инкубатор воздухе, осуществлялось нанесение культуры эпителиальных клеток на матрицу диаметром 12 мм В качестве матрицы использовалась предварительно подвергнутая специальной физической и химической обработке силиковысушенная амниотическая мембрана Культивированные клетки в количестве не менее 50 клеток/мм2, осаждались на эпителиальную поверхность амниотической мембраны в один слой К 10 -12 суткам формировались второй - третий слои эпителиальных клеток

Клетки поверхностных слоев приобретают многоугольную форму и более типичный для роговичного эпителия ядерно-цитоплазменный индекс, формируют единый пласт Силиковысушенная пластифицированная амниотическая оболочка сохраняет свою соединительнотканную структуру Фиксации культивированных эпителиальных клеток на стромальной стороне амниотической мембраны не наблюдается Эпителиальная сторона амниотической мембраны обеспечивает фиксацию культивированных клеток и последующую их специализацию

Отсутствие признаков десквамации, продолжающийся рост и увеличение численности клеток после пересева на СПАМ позволяет утверждать о сохранности, после консервации путем высушивания над силикагелем с пластификаторами, биологически активных свойств нативного амниона

Для изучения механизма замещения силиковысушенной амниотической мембраны на поверхности патологически измененной роговицы, нами была создана экспериментальная модель недостаточности региональных стволовых клеток роговичного эпителия Модель недостаточности регионарных стволовых клеток роговичного эпителия создавалась нами без повреждения ткани лимбалыюй зоны Для угнетения функции камбиальных клеток роговичного эпителия нами использовался 0,02% раствор цитотстатика митомицина-С Как известно, ММС достоверно угнетает процесс деления клеток Экспозиция воздействия препарата была значительно увеличена для достоверного угнетения камбиальных клеток роговичного эпителия

Для морфологического изучения эффективности созданной экспериментальной модели недостаточности регионарных стволовых клеток были проведены эксперименты на двух группах животных Выполненное в

рамках данного эксперимента исследование эффективности деэпителизации морфологически подтвердило наименьшую травматизацию и повреждение подлежащих слоев роговицы при удалении эпителия с помощью 20% раствора этилового спирта

Воссозданная нами в эксперименте картина недостаточности РСК роговичного эпителия подтверждает принятую в настоящее время теорию наличия региональных монопотентных стволовых клеток, являющихся источником регенерации роговичного эпителия и расположенных в области лимба [113, 160, 211, 258] Развивающаяся в результате недостаточность РСК приводит к разрастанию на поверхности роговицы клеток конъюнктивального эпителия, прорастанию сосудов и нарушению прозрачности

С целью изучения эффективности использования СПАМ для хирургического лечения патологических изменений роговицы, развивающихся в результате недостаточности лимбальных клеток, нами в следующей серии экспериментов на 16 кроликах было выполнено покрытие роговицы СПАМ Изучался процесс репаративной регенерации, характер замещения СПАМ и степень влияния биологического покрытия на регенерацию роговичного эпителия У животных контрольной группы эпителизация роговицы завершалась к 5 суткам после начала эксперимента На поверхности роговицы формировался эпителиальный слой из эпителиоцитов, характерных для конъюнктивы На глазах экспериментальных животных, которым было выполнено покрытие роговицы силиковысушенной амниотической мембраной, эпителизация заканчивалась значительно позже, к 14 - 18 суткам, но сформированный эпителиальный слой состоял из 2-3 рядов эпителиоцитов, характерных для роговичного эпителия К 18-20 суткам после покрытия на поверхности роговицы формировался полноценный специализированный эпителиальный слой, полностью лизировалась амниотическая мембрана

Полученные нами результаты экспериментальных исследований документально подтверждают сохранность биологически активных свойств амниона при консервации путем высушивания над силикагелем Таким образом, результаты экспериментальных исследований позволили предложить пластифицированную силиковысушенную амниотическую мембрану для применения в клинической практике при патологических состояниях эпителиальной поверхности глаза

Клиничсскис исследования

На следующих этапах выполнения данной работы нами были поставлены задачи по выработке методов использования в клинике СПАМ для лечения патологических состояний эпителия роговицы и конъюнктивы глаза Были выработаны строгие критерии и показания к применению СПАМ, оценки эффективности лечебного мероприятия

С целью определения роли РСК в патогенезе развития птеригиума, нами проведены исследования состояния роговичного эпителия у больных с птеригиумом Было выполнено цитологическое исследование роговичного эпителия у 35 пациентов с различной степенью выраженности патологических процессов Патологические изменения были обнаружены во всех мазках-отпечатках Патология проявлялась в прорастании на поверхность роговицы конъюнктивального эпителия Конъюнктивальные клетки на поверхности птеригиума были удлиненные, полиморфные, увеличены в размерах, наблюдалась сквамозная метаплазия В 73% клеток наблюдались пикнотические изменения в ядрах Клетки роговичного эпителия увеличены в размерах, во многих клетках ядра расположены эксцентрично, в 35% клеток наблюдается кариопикноз

С целью активации сохранившихся жизнеспособных РСК и восстановления нарушенного местного гомеостаза, нами была разработана методика использования биологически активного материала СПАМпосле иссечения

патологически измененных тканей птеригиума Было выполнено исследование на двух группах пациентов 1 группа, 78 человек, больные, подвергшиеся хирургическому лечению птеригиума с пластикой конъюнктивы местными тканями, 2 группа - 28 человек, больные, оперированные по поводу птеригиума с применением для пластики конъюнктивы СПАМ Эти группы были составлены из больных, госпитализированных в Самарскую клиническую офтальмологическую больницу им Т И Брошевского за период с 1999 по 2005 с диагнозами «Прогрессирующий птеригиум Ш степени» и «Рецидивирующий птеригиум»

Выполненный анализ результатов хирургического лечения, позволил нам определить критерий эффективности лечебных мероприятий и провести сравнительное клинико-статистическое исследование применения для хирургического лечения птеригиума нового материала - СПАМ Для оценки эффективности лечения по исходам заболевания нами был применен точный критерий Фишера Определен главный критерий эффективности хирургического лечения - частота рецидива заболевания в исследуемой группе При этом за выздоровление принималось отсутствие рецидива заболевания в течение всего срока наблюдения, но не менее шести месяцев с момента хирургического лечения В первой группе, после хирургического удаления птеригиума с пластикой слизистой местными тканями, рецидив произошел в 55,1% случаев, а во второй группе - в 7,1% случаев Различие частоты случаев рецидива в сравниваемых группах статистически значимо при вероятности ошибки 0,01 Выполненные статистические исследования с высокой достоверностью подтверждают, что найденные различия между двумя группами исследуемых пациентов неслучайны и отражают действительные события

Следовательно, предлагаемый нами алгоритм лечения прогрессирующего птеригиума Ш степени и рецидивирующего птеригиума,

заключающийся в использовании для замещения иссеченной патологически измененной слизистой силиковысушенной мембраны и послеоперационного лечения, направленного на восстановление местного гомеостаза роговицы, позволяет в 8 раз снизить вероятность развития рецидива заболевания

Следующей проблемой, для решения которой необходимо замещение больших участков иссеченной патологической ткани донорскими тканями и обеспечение полноценной регенерации слизистой, являются рубцовые деформации конъюнктивы и симблефарон За длительную историю изучения данной проблемы было предложено множество материалов для замещения дефектов слизистой Однако до сегодняшнего времени наиболее часто используемым методом является пластика аутослизистой В связи с этим, нами были изучены результаты хирургического лечения 37 пациентов с Рубцовыми изменениями в конъюнктивальной полости, а именно с диагнозами частичный симблефарон, ложный птеригиум, рубцовое укорочение конъюнктивальных сводов

Исследуемые пациенты были разделены на две группы 1 группа 20 человек - больные, подвергшиеся хирургическому лечению частичного симблефарона с пластикой конъюнктивы местными тканями либо аутослизистой с губы, 2 группа 17 человек - больные, оперированные по поводу рубцовых деформаций конъюнктивы с применением для пластики конъюнктивы СПАМ Результаты оценивались при помощи клинико-статистического исследования Для оценки эффективности лечения по исходам заболевания нами был применен точный критерий Фишера При этом за выздоровление принималось отсутствие рецидива заболевания в течение всего срока наблюдения, но не менее шести месяцев с момента хирургического лечения В первой группе, после хирургического лечения частичного симблефарона с пластикой конъюнктивы местными тканями либо аутослизистой с губы, рецидив произошел в 50% случаев, а во второй группе,

после хирургического лечения частичного симблефарона с применением для пластики конъюнктивыСПАМ, в 23,5 % случаев Различие частоты случаев рецидива в сравниваемых группах статистически значимо при значении Хи-квадрата с поправкой Йейтса =1,73 и р=0Д8 Следовательно, только в 2% случаев невозможно исключить нулевую гипотезу или одинаковую эффективность сравниваемых методов Данные статистических расчетов подтверждаются клиническими примерами А именно, при использовании значительных по размерам трансплантатов силиковысушенной амниотической мембраны эффективность хирургического вмешательства значительно уменьшается

Таким образом, анализ результатов применения силиковысушенной амниотической мембраны при хирургическом лечении патологии конъюнктивы показал высокую эффективность только при условии сохранности здоровой конъюнктивы в области сводов, где располагаются региональные камбиальные клетки, способные обеспечить полноценную регенерацию и замещение донорской ткани При значительных размерах патологически измененной конъюнктивы эффективность хирургического лечения с использованием СПАМ существенно снижается Следовательно, при замещении дефектов конъюнктивы СПАМ необходимо учитывать сроки замещения донорского материала собственными тканями к сохранность здоровой конъюнктивы обеспечивающей полноценную регенерацию

Сообщения об успешном применении амниотической мембраны при различной патологии роговицы, доступность материала, результаты наших экспериментальных исследований позволили нам использовать СПАМ при патологии эпителиального слоя роговицы С целью определения показании к применению силиковысушенной амниотической мембраны была предложена классификация проявлении недостаточности камбиальных клеток роговичного эпителия Согласно данной классификации хирургическое

лечение патологических состояний роговичного эпителия путем покрытия деэпителизированных участков силиковысушенной амниотической мембраной возможно только при 1-3 степени недостаточности При 4 степени недостаточности камбиальных клеток подразумевается их полное отсутствие, и соответственно невозможность регенерации роговичного эпителия В данных случаях показана трансплантация лимба либо кератопластика большим диаметром трансплантата Во всех случаях, когда сохраняется часть функционирующих клеток в области лимба, можно создать определенные условия для формирования полноценного регенерата роговичного эпителия Основным элементом лечебных мероприятий по нашему мнению может быть покрытие роговицы силиковысушенной амниотической мембраной Имеющиеся в структуре амниона факторы роста, ламинины и другие биологически активные вещества уменьшают процессы апоптоза, способствуют увеличению пролиферативной активности сохранившихся камбиальных клеток, способствуют перемещению и фиксации на поверхности роговицы зрелых эпителиоцитов

С целью определения эффективности хирургического лечения патологии эпителия роговицы, вызванной недостаточностью камбиальных клеток было выполнено клиническое исследование на группе пациентов Всего в клиническую группу включено 40 пациентов, обследование проводилось до и после покрытия роговицы СПАМ

В исследуемые группы были включены. 1 группа- 17 больных с длительно незаживающими и рецидивирующими дефектами эпителия роговицы, средний возраст 47,3 +16,2лет, 2 группа- 23 больных с эндотелиально-эпителиальной дистрофией роговицы, средний возраст 65,3 ±7,7 лет Каждый из больных, отобранных в исследуемую группу, длительно и безуспешно лечился консервативными средствами Причиной патологических изменений у пациентов первой группы были воспалительные заболевания (вирусные и бактериальные кератиты) и нейротрофические

32

нарушения, приведшие к развитию недостаточности камбиальных клеток роговичного эпителия Вторая группа больных эпителиально-эндотелиалъной дистрофией роговицы с рецидивирующим течением заболевания в течение не менее трех лет

Главной целью хирургического вмешательства у данных пациентов являлось временное покрытие длительно существующего дефекта эпителия и создания условий для активации сохранившихся камбиальных клеток, способных сформировать эпителиальный слой на поверхности роговицы Оценивались результаты лечения по эффективности купирования болевого синдрома, по срокам восстановления эпителия роговицы и частоте развития рецидива заболевания

Выполненные клинико-статистические исследования показали недостаточно высокую статистическую значимость вероятности различий при применении терапевтических методов по сравнению с использованием силиковысушенного амниона для хирургического лечения патологии эпителия роговицы В первой группе пациентов с длительно существующими и рецидивирующими дефектами эпителия роговицы в 17,6% хирургическое лечение было неэффективно Значение критерия Мак-Нимара для исследовании типа «до-после» в данной группе Хи-квадрат =1,71 при значении р=0,19 Покрытие роговицы силиковысушенной амниотичессой мембраной после фототерапевтической кератоэктомии в 90% случаев позволило получить ремиссию заболевания не менее чем в течение двух лет Следовательно, в 10% случаев у пациентов 2 группы наблюдался рецидив заболевания Статистическая значимость данного показателя определялась путем расчета коэффициента Мак-Нимара, который в данном случае был равен- 0,5 при р=0,47

Однако, значительное снижение показателя «Риск развития неблагоприятного исхода» при проведении хирургического лечения с использованием силиковысушенной амниотической мембраны (в первой

группе =0,17, во второй группе =0,1) и снижение абсолютного риска при применении для хирургического лечения силиковысушенной амниотической мембраны (в первой группе =0,83, во второй группе =0,9) подтверждают высокую клиническую значимость предлагаемого метода Результаты статистического исследования еще раз подтверждают необходимость соблюдения определенных нами показаний к использованию СПАМ

Наиболее тяжелые патологические изменения передней поверхности глазного яблока наблюдаются при ожоговой болезни, они характеризуются многофакторностью, волнообразным течением, и во-многом определяются состоянием кровообращения лимбальной зоны Использование достижений фармакологии и новых хирургических методик позволило значительно повысить частоту благоприятных исходов тяжелых ожогов глаз Однако по-прежнему ожоговая болезнь является наиболее сложной задачей офтальмотравматологии

Для выработки алгоритма лечебных мероприятий с использованием в качестве покрытия поверхности глаза силиковысушенной пластифицированной амниотической мембраны нами была определена степень нарушения цикличности нейротрофического обеспечения при ожоговой травме глаза С этой целью у пациентов с тяжелыми и очень тяжелыми ожогами было определен вегетативным статус путем проведения кардиоинтервалографии на приборе «Мустанг-диагност» фирмы «Техника» Кардиоинтервалография, являющаяся интегральным показателем в оценке адаптационно-компенсаторных возможностей организма, позволяет использовать состояние вегетативного гомеостаза в качестве основного маркера эффективности и прогноза применения предлагаемого лечения

Патологическое преобладание эрготропных нейрогуморальных влияний после ожоговой травмы определяет основную симптоматику первой стадии ожоговой болезни, для которой характерно значительное преобладание процессов лизиса над процессами пролиферации

Клиническими проявлениями данного дисбаланса при ожоговой болезни являются некроз ткани, сдвиг иммунного статуса в сторону ослабления Преобладание трофотропных неиротрофических процессов в период второй стадии ожоговой болезни приводит к нарушению протеазно-ингибиторного баланса и соответственно увеличению площади поражения, возможно даже перфорации роговицы Патологический дисбаланс неиротрофических процессов во время третьей стадии ожоговой болезни приводит к смещению регуляторных нейрогуморальных механизмов в сторону относительной активации симпатических катехоламинергических влияний Развитие четвертой стадии определяется преобладанием эрготропных нейрогуморальных влияний с последующей постепенной нормализацией биоритмики нейрогуморальных процессов Степень выраженности смещения баланса нейротрофической регуляции в сторону преобладания эрготропных процессов оказывает влияние на ход созревания и специализации коллагеновых волокон и характер рубцовых деформаций

На основании стадийности ожоговой болезни, определяемой нейрогуморальной регуляцией, нами разработан алгоритм лечебных мероприятий с использованием для лечебного покрытия силиковысушенной амниотической мембраны

Алгоритм разработанных нами лечебных мероприятии направлен на устранение дисбаланса нейрогуморальных регуляторных влияний, обеспечивая тем самым профилактику развития осложнений ожогового процесса и сохранение функциональной перспективности глазного яблока для последующих реконструктивных операций Хирургическое лечение ожога глаз нами выполняется во вторую стадию ожоговой болезни Покрытие деэпителизированной поверхности глаза СПАМ в данный период позволяет нам уменьшить неирорегуляторный дисбаланс, блокировать активность протеаз, уменьшить площадь поражения и активизировать сохранившиеся РСК эпителия роговицы и конъюнктивы Предложенная

методика патогенетически обоснованного метода лечения ожоговой травмы глаза применена при лечении 31 больных (41 глаз) с тяжелыми и очень тяжелыми ожогами глаза в травматологическом отделении СКОБ им Т И Брошевского С целью сравнения эффективности предлагаемого метода, параллельно проводилось исследование 45 больных (51 глаз) с тяжелыми и очень тяжелыми ожогами глаз, у которых для покрытия поверхности глаза использовалась аутоконъюнктива Группы больных при поступлении были достаточно однородными как по возрасту, повреждающим агентам, так и по остроте зрения Все больные наблюдаемых групп были оперированы в первые 7-14 суток после травмы Выполнялась однотипная операция некрэктомия с покрытием поверхности глаза и выстиланием сводов биологическим материалом В основной группе для покрытия использовалась СПАМ, в группе сравнения для этих целей использовалась аутослизистая с губы или аутоконъюнктива В послеоперационном периоде проводилось медикаментозное лечение, направленное на купирование явлении воспаления и эпителизацию поверхности глаза

В основной группе за первые 8-10 дней послеоперационного периода купировался воспалительный процесс, рассасывался гипопион, инфильтраты в строме роговицы рассасывались в течение 15-21 дней, в среднем по основной группе 19,2 дня В группе сравнения отмечалось более длительное и тяжелое течение воспалительных процессов Купирование явлений воспаления в некоторых случаях затягивалось до 60 дней, в среднем 27, 2 дня Анализ длительности процесса восстановления эпителиальной поверхности глаза и явлений воспаления позволил выявить зависимость между этими явлениями Корреляция между длительностью воспаления и эпителизацией очень высокая, в основной группе 0,96 при р <0,05, а в группе сравнения 0,97 при р <0,05 Следовательно, дефект эпителия поверхности глаза усугубляет течение ожоговой болезни, поддерживает воспалительные процессы и вероятно способствует развитию осложнений Для

36

подтверждения данного предположения нами проведен анализ частоты, характерных для ожоговой травмы глаза, осложнений, в зависимости от скорости купирования явлений воспаления, и эпителизации роговицы Для исследования вероятности корреляции между временем наступления эпителизации, явлениями воспаления и развитием осложнения применялась статистика ранговой корреляции II Спирмена с использованием статистического пакета «БТАПБТГСА» Расчеты показали, что выбранные нами факторы риска с высоким уровнем значимости подтверждают достоверную связь с развитием в последующем осложнения течения ожоговой травмы глаза Таким образом, замедленная эпителизация и длительно некупированное воспаление, как в основной группе, так и в группе сравнения, одинаково значимо способствует развитию осложнении ожоговой болезни в травмированном глазу

В результате проведенного лечения осложненное течение ожогового поражения глаз наблюдалось в 50,9% случаев в группе сравнения и в 21,9% случаев в основной группе Достоверность полученных результатов и их клиническая значимость была подтверждена статистическими исследованиями

Установлено, что разработанный нами алгоритм применения лечебных мероприятий, направленных на регуляцию нейротрофических процессов, значительно уменьшает вероятность развития осложнений ожоговой болезни глаза Так как осложнение является самым тяжелым прогностическим признаком для больных с ожоговой травмой глаза, то полученное в результате использования СПАМ уменьшение частоты развития осложнений повышает вероятность получения предметного зрения в процессе реабилитации больных с данной патологией

Таким образом, результатом проведенного исследования явилась разработка комплекса лечебных мероприятий на основе хирургического лечения с использованием пластифицированной силиковысушенной

амниотической мембраны для лечения ряда патологических состояний эпителиальной поверхности глаза

Разработанный нами новый пластический биоматериал на основе амниотической мембраны подвергнут комплексному исследованию

Комплекс экспериментальных и морфологических исследований СПАМ подтвердил сохранность уникальных свойств биологической ткани после консервации Сохранность биологически активных свойств, возможность длительного хранения и стерилизации материала расширили возможности применения амниотической мембраны

Кроме того, нами намечены наиболее актуальные направления дальнейших исследований по данной проблеме

-разработка способов создания тканеинженерных комплексов, основанных на подложке из силиковысушенной амниотической мембраны; -разработка методов лимбопластики при патологических состояниях, характеризующихся полной потерей камбиальных клеток роговичного эпителия,

-разработка новых методов лечения патологических состояний глаза на основе управления нейрогуморальной регуляцией трофических процессов

ВЫВОДЫ

1 Разработана комплексная система хирургического лечения больных с эпителиальной патологией переднего отдела глаза на основе применения нового пластического материала - силиковысушенной пластифицированной амниотической мембраны, позволяющей повысить эффективность лечения птеригиума, симблефарона и ожоговой травмы глаза путем обеспечения полноценной репаративной регенерации поврежденных тканей

2 Разработан, широко апробирован и внедрен новый материал для амниопластической хирургии, силиковысушенная

пластифицированная амниотическая мембрана, с сохранением основных свойств нативного амниона, отличающийся гарантированной вирусной и бактериальной безопасностью, возможностью длительно сохраняться в обычных условиях

3 Сравнительные морфологические и морфометрические исследования показали, что при консервации амниона путем высушивания над силикагелем в отличие от других способов, сохраняется архитектоника амниотической мембраны, что обеспечивает механические свойства биоматериала необходимые для пластической хирургии Длительная сохранность и стерильность силиковысушенной амниотической мембраны обуславливают приоритетное использование данного материала

4 Впервые экспериментально подтверждено что, в процессе высушивания амниотической мембраны над силикагелем с пластификаторами сохраняются свойства активного субстрата для эпителизации и не повышается иммунногенность пластического биоматериала

5 Применение силиковысушенной пластифицированной амниотической мембраны при недостаточности камбиальных клеток эпителия роговицы обеспечивает формирование полноценного роговичного эпителия, путем лизиса и замещения регенерирующими специализированными эпителионитами, предотвращает конъюнктивилизацию роговицы

6 Применение силиковысушенной пластифицированной амниотической мембраны при хирургическом лечении патологических изменений конъюнктивы позволяет достичь надежного анатомического эффекта в ходе операции, сократить длительность послеоперационного лечения, снизить количество осложнений, облегчить послеоперационный период и снизить вероятность развития рецидива заболевания при

хирургическом лечении птеригиума в 8 раз, частичного симблефарона в 2 раза

7 Применение силиковысушенной амниотической мембраны позволяет повысить эффективность хирургического лечения эпителиальной патологии роговицы достоверно снизить риск эрозии роговицы - в 5 раз, и существенно повысить эффективность ФТК для купирования эпителиального компонента эндотелиально-эпителиальной дистрофии роговицы

8 Разработан алгоритм хирургического лечения ожоговой травмы глаза основанный на использовании силиковысушенной амниотической мембраны с учетом стадийности нейрогуморальной регуляции трофических процессов Применение разработанного алгоритма позволило повысить эффективность лечения ожоговой травмы глаза на 78% по сравнению с консервативным лечением, и на 33% по сравнению с хирургическим лечением

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

При лечении пациентов с патологией эпителиального покрова и подлежащих тканей фиброзной оболочки глазного яблока рекомендуется использовать силиковысушенную пластифицированную амниотическую мембрану (СПАМ)

• Амниопластика при удалении птеригиума и симблефаронов Использование СПАМ для пластики показано при грубых деформирующих рубцах конъюнктивы, при рецидивах птеригиума, при необходимости выполнения поверхностной кератоэктомии

Пластика СПАМ возможна при дополнительном воздействии на ткани митомицина-С, 5-фторурацила Фиксируется СПАМ при помощи узловых швов 8-00 или 10-00

• Амниопластика при лечении эпителиальной патологии роговицы

Для уменьшения болевого синдрома и стимуляции регенераторной активности региональных стволовых клеток рекомендуется покрытие роговицы СПАМ Фиксация СПАМ возможна узловыми швами 800, 1000 либо контактной линзой Возможно повторное наложение имплантата СПАМ

• Амниопластика кистозных изменений конъюнктивы в области фильтрационных подушек после антиглаукоматозных операций

При угрозе перфорации кистозно измененной конъюнктивы в области фильтрационной подушки после выполненной антиглаукоматозной операции возможна пластика участка слизистой СПАМ

• Биолопгческое покрытие глаза при тяжелых ожогах

Применение хирургических методик с использованием СПАМ особенно эффективно при лечении тяжелых ожогов глазного яблока СПАМ необходимо использовать для покрытия поверхности глазного яблока и выстилания конъюнктивальных сводов после удаления некротических тканей

• Пластины или диски СПАМ используються как бесклеточный матрикс для переноса культивированных фибробластов или эпителиальных клеток

• Рекомендовано использование СПАМ для биологического покрытия длительно незаживающих кожных ран, временною покрытия при лечении ожогов кожи

Противопоказаний для применения СПАМ у больных с деэпителизированными поверхностями глазного яблока и кожи не выявлено

СПАМ выпускается под торговой маркой «Флексамер», упакована в двойной пакет фирмы «Wipak medical» Имплантаты «Флексамер» выпускаются трех типоразмеров диск 0 8мм, квадрат 20x20мм и 40x40мм По согласованию возможно изготовление имплантатов других размеров и формы «Флексамер» выпускается стерильным Срок хранения 2 года Перед

использованием необходимо проверить целостность упаковки, годность материала

Адрес предприятия изготовителя ООО «Арго-мед»

ул Ново-Садовая, д 158, Самара, Россия, 443068

тел /факс (846)926-05-93

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Нейродинамическая регуляция раневого процесса //Новые медицинские технологии-Нижний Новгород, 1994-с 119-121 (Скупченко В В ,Милюдин ЕС)

2 Фазотонный гомеостаз и врачевание Монография -Самара, 1994 -256с (Скупченко В В , Милюдин Е С )

3 Практическая реализация принципов фазотонной нейродинамической регуляции раневого процесса //Актуальные проблемы офтальмологии. -Ижевск, 1995 -С 87-90 ( Милюдин Е.С.)

4 Опыт применения управляемой коррекции репарации в пластической хирургии // Ерошевские чтения Тезисы докладов Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 95-летию со дня рождения перофессора Т И Брошевского Самара 1997 -С 222-223 (Милюдин ЕС)

5 Локальный репаративный морфогенез и нейротрофика //Брошевские чтения -Самара, 1997 -С 329-331 ( Скупченко В В , Милюдин ЕС)

6 Нейродинамическя модель тканевой репарации// Неврологический вестник 1997,т XXIX, №3-4 -С 89-93 (Скупченко ВВ, Милюдин Е С.)

7 Скупченко В В , Милюдин Е С Новая технология в пластической хирургии//Вестник Офтальмологии 1997, №4 -С 3-7

8 Нейродинамичеекая модель репарации //Моделирование и прогнозирование заболеваний, процессов и объектов -Самара, 1998 -С 8283 (Скупченко В В , Милюдин ЕС)

9 Перспективы развития глазного банка в клинике им Т И Брошевского// Волжские зори -Самара, 1998 -С 159-160 (Милюдин ЕС)

10 Закономерности репаративного морфогенеза с позициии фазотонной теории /ЯП Самарская конференция неврологов и нейрохирургов, посвященная 100-летаю со дня рождения профессора А И Златоверова Самара, 1999 -С 117-121 (Скупченко ВВ, Милюдин ЕС)

11 Влияние кислотно-щелочного баланса на приживление сквозного роговичного аллотрансплантата //Съезд офтальмологов России, 7-й (16-19 мая 2000г) Тез докл -М Издательский центр «Федоров», 2000 -Ч 2 -С 3334 (Милюдин ЕС)

12 Анализ сохранности донорского материала в зависимости от метода консервации //Пролемы и перспективы здравоохранения Матер XXXVI научно-практической межрегиональной конференции, посвященной 200-летию Ульяновской областной клинической больницы №1 -Ульяновск 2001 -С 292-293 (Золотарев А В , Милюдин Е С , Сильченок А И )

13 Покрытие поверхности глазного яблока амниотической мембраной при тяжелых ожогах //Труды Всеросийской конференции «Геронтологические аспекты офтальмологии» и VI Международного семинара по вопросам пожилых "Самарские лекции" посвященные 100-летию профессора Т И Брошевского /Под ред Г П Котельникова -Самара "Офорт", СамГМУ, 2002 -С 341-343 (Золотарев АВ, Миюдин ЕС, Татар енко И Г )

14 Роль принятого законодательства в развитии трансплантации донорских тканей в офтальмологии //Труды Всеросийскои конференции

«Геронтологические аспекты офтальмологии» и VI Международного семинара по вопросам пожилых "Самарские лекции" посвященные 100-летию профессора Т И Брошевского /Под ред Г П Котельникова -Самара "Офорт", СамГМУ, 2002 -С 232-234 ( Золотарев А В , Милюдин Е С )

15 История развтия кератопластики и создания первого отечественного глазного банка в Куйбышеве (Самаре) //Труды Всеросийской конференции «Геронтологические аспекты офтальмологии» и VI Международного семинара по вопросам пожилых "Самарские лекции" посвященные 100-летию профессора Т И Брошевского /Под ред Г П Котельникова -Самара "Офорт", СамГМУ, 2002 -С 248-250 (Степанов В К, Милюдин ЕС)

16 Субтотальная сквозная кератопластика - основа для реконструктивных вмешательств в переднем отрезке глазного яблока //Труды Всеросийской конференции «Геронтологические аспекты офтальмологии» и VI Международного семинара по вопросам пожилых "Самарские лекции" посвященные 100-летию профессора Т И Брошевского /Под ред Г П Котельникова-Самара "Офорт", СамГМУ, 2002 -С 250-251 (Степанов В К , Милюдин Е С )

17 Эффективность использования силиковысушетюй амниотической мембраны на ранних стадиях ожоговой болезни //Материалы Щ Евро-Азиатской конференции по офтальмохирургии Екатеринбург, 2003 - Ч 1 -С 159-160 (Золотарев А В , Милюдин Б С , Татаренко ИГ)

18 Новый метод длительной консервации амниотической мембраны //Материалы Ш Евро-Азиатской конференции по офтальмохирургии Екатеринбург, 2003 - 42 -С 69-70 (Золотарев А В, Милюдин Е С, ВоловаЛ Т)

19 Silica gel chssication of amniotic membrane for long-term conservation //12th International congress of the European Association of Tissue

Banking Brugge, Belgium, 2003 -P 76-77 (Zolotaryov A V , Miljudin E S , Volova LT)

20 Хирургическое лечение птеригиума с пластикой слизистой силиковысушенной амииотической мембраной //Материалы XXXIX научно-практической межрегиональной конференции врачей Ульяновск, 2004 -С 343-345 (Милюдин Е С Золотарев А В )

21 Эффективность использования силиковысушенной амниотической мембраны //Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Новые технологии в лечении заболеваний роговицы» М , 2004 -С 473-479 (Милюдин ЕС)

22 Роль тканевого банка в работе офтальмологической больницы //Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Новые технологии в лечении заболеваний роговицы» М , 2004 -С 479-485 (Милюдин Е С , Золотарев А В, Степанов В К)

23 Симптоматическое лечение буллезной кератопатии /ЯП Международная научно-практическая конференция «Пролиферативный синдром в офтальмологии» М, 2004 Т 2 -С 98-99 (Милюдин Е С, Спиридонов Е А)

24 Silica gel dissication of amniotic membrane with related epithelium cells for ocular surface reconstruction //Cell and Tissue Banking 5 271-275, 2004 (Miljudm E S , Zolotaryov A V, Volova L T , Ahrncrova UM)

25 Гистологическое исследование силиковысушенного амниона //Сб науч тр межрегиональной конференции офтальмологов, посвященной 40-летию Самарской клинической офтальмологической больницы им Т И Брошевского и 85-детию Самарского государственного медицинского университета. Под ред Г П Котельникова, Г.И.Гусаровой - Самара, 2004 -С 177-181 (Золотарев А В , Милюдин Е С , Ахмерова Ю М , Россиская В В )

26 Роль тканевого банка в работе Самарской клинической офтальмологической больницы им Т И Брошевского //Сб науч тр

межрегиональной конференции офтальмологов, посвященной 40-летию Самарской клинической офтальмологической больницы им Т И Брошевского и 85-летию Самарского государственного медицинского университета Под ред Г П Котельникова, ГИГусаровой - Самара, 2004 -С 181-188 (Золотарев А В , Милюдин Б С , Степанов В К , Волова Л Т , Кириллов АЮ)

27 Хирургическое лечение рецидивирующего птеригиума с пластикой слизистой амшютической мембраной //Сб науч тр межрегиональной конференции офтальмологов, посвященной 40-летию Самарской клинической офтальмологической больницы им Т И Брошевского и 85-летию Самарского государственного медицинского университета Под ред Г П Котельникова, Г.ИГусаровой - Самара, 2004 -С 201-205 (Милюдин Е С , Золотарев А В )

28 Применение митомицина-С при хирургическом лечении птеригиума //Сб науч тр межрегиональной конференции офтальмологов, посвященной 40-летию Самарской клинической офтальмологической больницы им Т И Брошевского и 85-летию Самарского государственного медицинского университета Под ред Г П Котельникова, Г И Гуеаровой -Самара, 2004 -С 205-208 (Милюдин Е С , Золотарев А В )

29 Медико-технологическая схема работы глазного банка //Клинические и фундаментальные аспекты тканевой терапии Теория и практика клеточных биотехнологий Мат П Всероссийского симпозиума с международным участием - Самара, 2004 -С 29-30 (Милюдин ЕС)

30 Способ длительной консервации амниотической мембраны //Клинические и фундаментальные аспекты тканевой терапии Теория и практика клеточных биотехнологий. Мат П Всероссийского симпозиума с международным участием - Самара, 2004 -С 30-32 (Милюдин Е С, Золотарев А В , Волова Л Т , Кучук КБ)

31 Аллогенные материалы для склероилаетики //Клинические и фундаментальные аспекты тканевой терапии Теория и практика клеточных биотехнологии Мат II Всероссийского симпозиума с международным участием - Самара, 2004 -С 94-95 (Милюдин Е С , Волова JI Т , Степанов ВК)

32 История создания глазного банка в СКОБ им Т И Брошевского // Волжские зори - Самара, 2004 - С 84-91 (В К Степанов, Б С Милюдин)

33 Амниопластика как метод лечения буллезной кератопатии //Тездокл VIII съезда офтальмологов России - М, 2005 -С 470-471 (Милюдин ЕС)

34 Применение силиковысушенной амниотической мембраны при хирургическом лечении рецидивирующего птеригиума //Тез докл VIII съезда офтальмологов России -М,2005 -С 471-472 (Милюдин Б С )

35 Неотложная офтальмологическая помощь в общеврачебной практике //Учебное пособие для врачей-интернов Самара, 2004 56с, приложений -4 (Белянин А Ф , Братиичук А H , Милюдин ЕС)

36 Технология консервации амниотической мембраны путем высушивания над силикагелем //Технологии живых систем 2006 Т - 3 № -3 -С44-50 (МилюдинЕС)

37 Сравнительная морофлогическая оценка консервированной различными способами амниотической мембраны //Вестник Оренбургского государственного университета 2006 - №11(61) -С 207-210 (Милюдин ЕС)

38 Применение контактных линз Pure Vision для фиксации силиковысушенной пластифицированной амниотической мембраны при лечении эпителиальной патологии роговицы //Вестник оптометрии - 2006 -№6 - С 47-48 ( Милюдин Е С , Спиридонов Е А )

39 Применение MKJI Pure Vision при лечении эпителиальной патологии роговицы //Актуальные вопросы контактной коррекции зрения

Тез довел Москва, 15 декабря М - 2006 -С 33-34 ( Милюдин Е С, Спиридонов Е А)

40 Экспериментальная модель недостаточности региональных стволовых клеток роговичного эпителия // Вестник СамГУ 2006 - №9(49) -С 219-227 ( Милюдин Е С )

41 Восстановление эпителия роговицы под силиковысушенной пластифицированной амниотической мембраной у больных с патологией переднего сегмента глаза // Вестник СамГУ 2006 - № 9(49) -С -227-233 (Милюдин ЕС)

42 Хирургическое лечение рецидивирующего птеригиума с пластикой силиковысушенной амниотической мембраной //Вестник офтальмологии 2007 - №1 -С 39-42 (Золотарев А В , Милюдин ЕС)

43 Эффективность покрытия силиковысушенной пластифицированной амниотической мембраной при патологии переднего роговичного эпителия //Клиническая офтальмология 2007 Т 8 -№1 -С 1214 (Милюдин ЕС)

44 Обоснование применения силиковысушенной пластифицированной амниотической мембраны для пластики на ранних стадиях ожоговой болезни глаза //Новые технологии в пластической хирургии придаточного аппарата при травмах глаза и орбиты в условиях чрезвычайных ситуаций и катастроф Матконф (11-13 апреля 2007г. г Москва) -С 79-80 (Милюдин Е С )

Изобретения по теме диссертации

1 Способ консервации амниотической мембраны /Патент РФ №2214091 20 10 2003 Бюл№29 (Милюдин ЕС, Золотарев АВ, Волова ЛТ)

2 Устройство для фиксации амниотической оболочки при консервации /Патент РФ на полезную модель №36219 10 03 2004, Бюл №7 (Милюдин Е С , Золотарев А В )

3 Способ противорецидивного лечения птеригиума в послеоперационном периоде /Решение о выдаче патента РФ по заявке №5054173/14 (Милюдин Е С )

4 Программа для сбора, анализа и учета данных о состоянии глаз ожоговых больных /Свидетельство об официальной регистрации программы для ЭВМ №2004611849 зарегистрировано в Реестре программ для ЭВМ 11 08 2004г (Милюдин Е С , Косенок Б Б)

Биографическая справка

Милю дин Евгений Сергеевич родился в 1958г , в Самарской области В 1982 году окончил лечебный факультет Куйбышевского медицинского института им Д И Ульянова После интернатуры три года работал окулистом в ЦРБ г Похвистнево Самарской области В последующем обучался в клинической ординатуре по офтальмологии С сентября 1988г врач-офтальмолог СКОБ им Т И Брошевского, с 1990 по 1998гг заведующий лабораторией индивидуального глазного протезирования, с 1998 по настоящее время заведующий глазным банком С 2000г совмещает работу в больнице с работой на кафедре офтальмологии СамГМУ в качестве ассистента, а с 2006г в качестве научного сотрудника ЦНИЛ СамГМУ В 1995г защитил кандидатскую диссертацию на тему «Пластическая хирургия век» (14 00 08 -глазные болезни)

Милюдин Е С является высококвалифицированным врачом, педагогом, целеустремленным научным сотрудником Имеет сертификат специалиста, высшую квалификационную категорию по специальности "Офтальмология" Автор 9 патентов РФ на изобретение, 77 научных работ в отечественных и зарубежных изданиях (из них 37 по теме докторской диссертации) За свои добросовестный, творческий и плодотворный труд награжден Почетной грамотой Самарского государственного медицинского университета

Компьютерная верстка Давыдов В Л

Подписано в печать 30 03 2007 Формат 60x84/16 Бумага офсетная Печать оперативная Объем 2,56 уел печ л Тираж 120 экз Заказ №1356

Отпечатано в типографии ООО "ЦПР" 443013, г Самара, Московское шоссе, 3 Тел (846)276-85-92,276-85-72

Актуальность темы

Здоровая поверхность глаза сформирована двумя типами эпителия -роговичным и конъюнктивальным. Передний поверхностный эпителий является одной из важнейших структур обеспечивающих гомеостаз роговицы и глаза в целом. Патологические процессы, развивающиеся при нарушении целостности и адекватности регенераторных процессов эпителия многообразны.

При длительном отсутствии эпителиального покрова в роговице развиваются метаболические нарушения, аутолиз что приводит к развитию аутоинтоксикации и аутосенсибилизации и соответственно к развитию разнообразных по клиническому проявлению патологических состояний. Данные патологические изменения могут быть подразделены на две категории. Первая категория характеризуется повреждением камбиальных клеток что может наблюдаться при химическом или термическом ожоге, при синдроме Stevens-Johnson, многократных криовоздействиях на зону лимба, длительном ношении контактных линз, воздействии ультрафиолетовых лучей. Для второй категории характерно разрушение непосредственно морфологической структуры, на которой фиксированы камбиальные клетки. Данное патологическое состояние может быть обусловлено различными кератитами, хирургическими операциями, повреждающими область лимба [255, 269].

Наиболее частым проявлением патологии эпителиального покрова глазного яблока является птеригиум, ложный птеригиум, симблефарон, эпителиальные дистрофии роговицы [255].

Травматические повреждения, тяжелые и особо тяжелые ожоги, всегда сопровождаются грубыми повреждениями эпителиального покрова, приводящими к рубцеванию, деформации и формированию помутнения роговой оболочки [43, 77]. Решение медико-социальных проблем, вызванных патологическими изменениями со стороны переднего отдела органа зрения, возможно за счет разработки и внедрения комплекса лечебных и реабилитационных мероприятий, основу которых представляют реконструктивные операции. В зависимости от степени выраженности патологических изменений выполняются хирургические операции, направленные на замещение утраченных камбиальных клеток, либо хирургические вмешательства создающие условия для полноценной регенерации собственных тканей.

Для замещения утраченных региональных стволовых клеток выполняется ауто- или аллотрансплантация здоровых участков лимбальной ткани. Однако при этом не исключается развитие иммунного конфликта и тканевой несовместимости, появляется необходимость иммунносупрессивной терапии [1, 18, 52; 99, 146].

Во втором случае, для обеспечения благоприятных условий обеспечивающих восстановление эпителиального слоя поверхности глаза1 используются самые разнообразные материалы и тканевые компоненты как биологического [18, 74, 130 43, 44, 45 63, 74, 114, 144], так и неорганического происхождения [129, 132, 206]. К настоящему времени предложено множество различных методов хирургического лечения патологических состояний эпителия роговицы и слизистой оболочки глазного яблока. Используемые методы перемещения конъюнктивы, замещения дефектов ткани слизистой ротовой полости, пищевода приводят к грубому рубцеванию, развитию атипичной для данного участка слизистой, прорастанию вновь образованных сосудов. Недостаточная эффективность хирургических вмешательств, частые рецидивы заболеваний позволяют нам считать неполноценной послеоперационную регенерацию патологического участка поверхности глазного яблока.

Научный поиск наиболее эффективного пластического материала позволил определить необходимые требования к биологическому материалу, используемому для обеспечения благоприятных условий регенерации поверхностного эпителия. Прежде всего, материал должен быть биологически активным, способным восстановить временно или постоянно анатомическую целостность и функциональную полноценность эпителиального покрова глазного яблока. Немаловажно постоянное наличие запаса стерильного и удобного для использования хирургом материала. Интеграция последних научных данных с медицинским опытом позволяет предложить амниотическую мембрану как наиболее действенный, эффективный и безопасный способ временного замещения дефектов эпителиальных и слизистых оболочек [14, 84, 269].

Однако применение амниотической оболочки на различных стадиях заболевания приводит к неоднозначным толкованиям эффективности и • обоснованности данного лечебного мероприятия. А.Момозе и многие другие сравнивают амниотическую мембрану с «волшебными шелковыми, одеждами» [84, 151], напротив, R.Ivekovi [201] считает необоснованным широкое применение амниона. Следовательно, остается нерешенным вопрос , о целесообразности и эффективности использования амниотической оболочки при патологических состояниях переднего отдела глазного яблока. Таким образом, необходимо продолжить изучение свойств амниотической оболочки и разработку новых методов лечения патологических состояний эпителия роговицы и конъюнктивы глазного яблока, выработать строгие критерии и показания к применению амниотической мембраны, оценки эффективности лечебного мероприятия.

Расширение показаний к использованию амниотической мембраны выдвигает новую актуальную задачу - разработка новых и доступных методов консервации амниотической оболочки. Использование неконсервированной амниотической оболочки, либо консервированной в питательных средах, имеет некоторые недостатки. Прежде всего это сложность планирования операции, так как необходимо учитывать время забора донорского материала, длительность его хранения, сохранность и жизнеспособность эпителия. Достаточно актуальна проблема стерильности при использовании свежего материала. Существующие методы длительной консервации лиофилизация, криоконсервация, так же обладают различными недостатками. В частности, необходимо специальное и дорогостоящее оборудование, специальные условия подготовки и хранения биоматериала.

Успех хирургических вмешательств на переднем отрезке глазного яблока зависит от многих причин, в частности, от качества и скорости восстановления эпителия роговицы. Очевидно, что одним из важнейших критериев оценки результатов реконструктивных операций является характер регенерации замещенных тканей. При патологических состояниях, связанных с недостаточностью камбиальных клеток поверхностного эпителия, важно создать условия для восстановления эпителия роговицы. Полноценность эпителиальной поверхности роговицы и конъюнктивы, глазного яблока, острота зрения, отсутствие рецидивов заболевания являются достаточно объективными критериями и могут быть использованы для определения эффективности использования амниотической мембраны.

Таким образом, изучение влияния амниотической мембраны на регенерацию эпителиальной поверхности глазного яблока является актуальной проблемой. Следовательно, на основании вышесказанного, проблема создания единого алгоритма использования амниотической мембраны при патологии роговицы и конъюнктивы глазного яблока представляется актуальной и современной, требующей дальнейшего исследования свойств амниотической оболочки и разработки как новых методов хирургического лечения пациентов, так и новых методов заготовки и консервации амниотической оболочки.

Цель исследования

Целью настоящей работы является разработка комплексной системы хирургического лечения пациентов с эпителиальной патологией переднего отдела глаза на основе нового пластического материала - силиковысушенной пластифицированной амниотической мембраны (СПАМ).

Задачи исследования

1. Разработать технологию изготовления на основе амниотической мембраны нового материала с заданными свойсвами: механическая пластичность, низкая антигенность, вирусная и бактериальная безопасность, длительная сохранность.

2. Изучить морфологические изменения амниотической мембраны консервированной различными способами.

3. Изучить воздействие химических и физических факторов при консервации путем высушивания над силикагелем с пластификаторами на иммунногенность и биологическую активность амниона.

4. Исследовать в эксперименте взаимодействие силиковысушенной пластифицированной амниотической мембраны с тканями роговицы на экспериментальной модели недостаточности региональных стволовых клеток роговичного эпителия.

5. Изучить эффективность применения силиковысушенной пластифицированной амниотической мембраны при хирургическом лечении больных с патологическими изменениями конъюнктивы обусловленых эпителиальной недостаточностью (птеригиум, симблефарон).

6. Изучить влияние силиковысушенной пластифицированной амниотической мембраны на результаты лечения больных с эпителиальной патологией роговицы.

7. Разработать алгоритм лечения тяжелых и особо тяжелых ожогов глаза с использованием СПАМ.

Научнаи новизна

Создан биологический имплантат из амниотической мембраны -силиковысушенная пластифицированная амниотическая мембрана (СПАМ) -удобный, эффективный и безопасный материал (Патент РФ №2214091, Патент РФ №36219).

Впервые доказана возможность сохранения соединительно-тканной структуры СПАМ и изучены морфометрические изменения при высушивании над силикагелем с пластификаторами амниотической мембраны.

Впервые доказана низкая анитигенность и высокая биосовместимость СПАМ.

Впервые разработана экспериментальная модель недостаточности региональных стволовых клеток роговичного эпителия роговицы и изучен механизм замещения СПАМ на поверхности роговой оболочки и доказана его биологическая активность.

Разработанный в эксперименте метод получения культуры клеток роговичного эпителия, фиксированного на поверхности силиковысушенной амниотической мембраны, открывает новые возможности при реабилитации пациентов с тяжелой патологией эпителиальной поверхности глазного яблока.

Систематизированы методы диагностики недостаточности камбиальных клеток роговичного эпителия и разработана классификация недостаточности камбиальных клеток роговичного эпителия.

Разработан метод пластики конъюнктивы СПАМ при лечении рецидивирующего птеригиума. Предложен способ противорецидивного лечения птеригиума в послеоперационном периоде (Решение о выдаче патента РФ по заявке №5054173/14)

Разработан метод пластики конъюнктивы при лечении рубцовых деформаций конъюнктивальной полости с использованием СПАМ.

Проведен сравнительный клинический анализ эффективности применения СПАМ при лечении заболеваний роговицы.

Впервые проведено изучение результатов использования СПАМ и ауто конъюнктивы.

Предложен алгоритм функциональной и косметической реабилитации при ожоговой болезни глаза с использованием СПАМ (Свидетельство об официальной регистрации программы для ЭВМ №2004611849).

Практическая значимость работы

Предложен простой и доступный метод консервации амниотической оболочки высушиванием над силикагелем с последующей гамма-стерилизацией.

Подтвержденная гистологическими исследованиями сохранность морфологической структуры СПАМ позволила предложить данный материал для хирургического лечения больных с патологическими состояниями эпителиальной поверхности глазного яблока.

Разработанный комплекс методов использования амниотической мембраны позволяет ускорить процесс реабилитации пациентов с патологическими изменениями эпителия конъюнктивы и роговицы.

Клинические рекомендации, основанные на внедрении в практику алгоритма лечения пациентов с последствиями тяжелых ожогов глаза, позволяют выбрать наиболее рациональный путь реабилитации больного.

Апробация работы Положения диссертации доложены и обсуждены на VII и VIII съездах офтальмологов России (Москва, 2000, 2005); Всероссийской научно-практической конференции «Ерошевские чтения» (Самара, 1997); на Всероссийской конференции «Геронтологические аспекты офтальмологии» и VI Международного семинара по вопросам пожилых "Самарские лекции", посвященные 100-летию профессора Т.И.Ерошевского (Самара,2002); на III Евро-Азиатской конференции по офтальмохирургии (Екатеринбург, 2003); на 12th интернациональном конгрессе Европейской ассоциации тканевых банков (Brugge, Belgium, 2003); на II Всероссийском симпозиуме с международным участием «Клинические и фундаментальные аспекты тканевой терапии. Теория и практика клеточных биотехнологий» (Самара, 2004); на XXXIX научно-практической межрегиональной конференции врачей (Ульяновск, 2004); на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Новые технологии в лечении заболеваний роговицы» (Москва, 2004); на межрегиональной конференции:» офтальмологов, посвященной 40-летию Самарской клинической офтальмологической больницы им.Т.И.Брошевского и 85-летию Самарского государственного медицинского университета (Самара,2004); заседании общества офтальмологов Самарской области (Самара, 2004); на научно-практической конференции «Регенеративная медицина и трансплантация тканей в офтальмологии (Москва,2005); на научно-практической конференции «Актуальные вопросы контактной коррекции зрения» (Москва,2006); на научно-практической конференции «Новые технологии в пластической хирургии придаточного аппарата при травмах глаза и орбиты в условиях чрезвычайных ситуаций и катастроф» (Москва, 2007).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 41 работа, из них 7 в изданиях рекомендуемых ВАК, 2 в зарубежной печати. Получено 3 патента и 1 свидетельство о регистрации программы для ЭВМ. Издана монография и учебное пособие для врачей-интернов.

Получено регистрационное удостоверение на изделие медицинского назначения - Имплантат амниотической мембраны силиковысушенный «Флексамер».

Объем и структура работы

Диссертация изложена на 281 странице, состоит из введения, девяти глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 283 источника, из них 131 зарубежных. Диссертация содержит 19 таблиц, 12 графиков и 88 рисунков.

выводы

1. Разработана комплексная система хирургического лечения больных с эпителиальной патологией переднего отдела глаза на основе применения нового пластического материала - силиковысушенной пластифицированной амниотической мембраны, позволяющей повысить эффективность лечения птеригиума, симблефарона и ожоговой травмы глаза, путем обеспечения полноценной репаративной регенерации поврежденных тканей.

2. Разработан, широко апробирован и внедрен новый материал для амниопластической хирургии, силиковысушенная пластифицированная амниотическая мембрана, с сохранением основных свойств нативного амниона, отличающийся гарантированной вирусной и бактериальной безопасностью, возможностью длительно сохраняться в обычных условиях.

3. Сравнительные морфологические и морфометрические исследования показали, что при консервации амниона путем высушивания над силикагелем в отличие от других способов, сохраняется архитектоника амниотической мембраны, что обеспечивает механические свойства биоматериала необходимые для пластической хирургии. Длительная сохранность и стерильность силиковысушенной амниотической мембраны обуславливают приоритетное использование данного материала.

4. Впервые экспериментально подтверждено что, в процессе высушивания амниотической мембраны над силикагелем с пластификаторами сохраняются свойства активного субстрата для эпителизации и не повышается иммунногенность пластического биоматериала.

5. Применение силиковысушенной пластифицированной * амниотической мембраны при недостаточности камбиальных клеток эпителия роговицы обеспечивает формирование полноценного роговичного эпителия, путем лизиса и замещения регенерирующими специализированными эпителиоцитами, предотвращает конъюнктивилизацию роговицы.

6. Применение силиковысушенной пластифицированной амниотической мембраны при хирургическом лечении патологических изменений конъюнктивы позволяет достичь надежного анатомического эффекта в ходе операции, сократить длительность послеоперационного лечения, снизить количество осложнений, облегчить послеоперационный период и снизить вероятность развития рецидива заболевания при хирургическом лечении птеригиума в 8 раз, частичного симблефарона в 2 раза.

7. Применение силиковысушенной амниотической мембраны позволяет повысить эффективность хирургического лечения эпителиальной • патологии роговицы: достоверно снизить риск эрозии роговицы - в 5 раз, и существенно повысить эффективность ФТК для купирования эпителиального компонента эндотелиально-эпителиальной дистрофии роговицы.

8. Разработан алгоритм хирургического лечения ожоговой травмы глаза основанный на использовании силиковысушенной амниотической мембраны с • учетом стадийности нейрогуморальной регуляции трофических процессов. Применение разработанного алгоритма позволило повысить эффективность лечения ожоговой травмы глаза на 78% по сравнению с консервативным лечением, и на 33% по сравнению с хирургическим лечением.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

При лечении пациентов с патологией эпителиального покрова и подлежащих тканей фиброзной оболочки глазного яблока следует использовать силиковысушенную пластифицированную амниотическую мембрану.

• Амниопластика при удалении птеригиума и симблефаронов. Использование силиковысушенной пластифицированной амниотической мембраны для пластики показано при грубых деформирующих рубцах конъюнктивы, при рецидивах птеригиума, после иссечения патологически измененных тканей, при необходимости выполнения поверхностной кератоэктомии.

Пластика силиковысушенной пластифицированной амниотической мембраной возможна при дополнительном воздействии на ткани митомицина-С, 5-фторурацила.

Фиксируется силиковысушенная пластифицированная амниотическая мембрана при помощи узловых швов 8-00 или 10-00.

• Амниопластика при лечении эпителиальной патологии роговицы.

Для уменьшения болевого синдрома и стимуляции регенераторной активности региональных стволовых клеток рекомендуется покрытие роговицы силиковысушенной пластифицированной амниотической мембраной. Фиксация силиковысушенной пластифицированной амниотической мембраны производится узловыми швами 800, Ю00 либо контактной линзой.

• Амниопластика кистозных изменений конъюнктивы в области фильтрационных подушек после антиглаукоматозных операций.

При угрозе перфорации кистозно измененной конъюнктивы в области фильтрационной подушки рекомендуется пластика участка слизистой силиковысушенной пластифицированной амниотической мембраной.

• Биологическое покрытие глаза при тяжелых ожогах. Силиковысушенная пластифицированная амниотическая мембрана используется для покрытия поверхности глазного яблока и выстилания коныонктивальных сводов после удаления некротических тканей.

• Пластины или диски силиковысушенной пластифицированной амниотической мембраны используются как бесклеточный матрикс для переноса культивированных фибробластов или эпителиальных клеток.

• Рекомендовано применение силиковысушенной пластифицированной амниотической мембраны для биологического покрытия длительно незаживающих кожных ран, временного покрытия при лечении ожогов кожи.

Противопоказаний для применения силиковысушенной пластифицированной амниотической мембраны у больных с деэпителизированными поверхностями глазного яблока и кожи не выявлено.

Силиковысушенная пластифицированная амниотическая мембрана выпускается под торговой маркой «Флексамер», упакована в двойной пакет фирмы «Wipak medical». Имплантаты «Флексамер» выпускаются трех типоразмеров: диск 0 8мм; квадрат 20x20мм и 40x40мм. По согласованию возможно изготовление имплантатов других размеров и формы. «Флексамер» выпускается стерильным. Срок хранения 2 года. Перед использованием необходимо проверить целостность упаковки, годность материала.

Адрес предприятия изготовителя: ООО «Арго-мед» ул. Ново-Садовая, д. 158, Самара, Россия, 443068. тел./факс (846)926-05-93.