Автореферат и диссертация по медицине (14.00.15) на тему:Активность пролиферации и ядрышковых организаторов клеток рака молочной железы как показатель биологического поведения опухоли

На правах рукописи

Упоров Александр Валерьевич

АКТИВНОСТЬ ПРОЛИФЕРАЦИИ И ЯДРШКОВЫХ ОРГАНИЗАТОРОВ КЛЕТОК РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ КАК ПОКАЗАТЕЛЬ БИОЛОГИЧЕСКОГО ПОВЕДЕНИЯ ОПУХОЛИ

14.00.15 - патологическая анатомия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург 1998

Работа выполнена в НИИ онкологии им.проф. Н.Н.Петрова Министерства здравоохранения РФ; Санкт-Петербург

Научный руководитель:

член-корр.РАЕН, доктор медицинских наук, профессор K.M.Пожарисский

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор В.Ф. Семиглазов

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Э.Л.Нейштадт доктор медицинских наук Б.М.Ариэль

Ведущее учреждение:

Санкт-Петербургская медицинская академия им.И.И.Мечникова

Зашита состоится "//" /Я 1993г., в_/£часов на заседании диссертационного совета Д 074.16.04 з Санкт-Петербургской медицинской академии последипломного образования (193015, Санкт-Петербург, ул.Салтыкова-Щедрина, 41).

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке академии

Автореферат разослан ff 1993г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор медицинских наук

A.B.Соболев.

Актуальность mm.. Рак молочной железы (PMffl) в большинстве стран является' самой частой злокачественной опухолью у женщин, причем заболеваемость и смертность от PME в мире неуклонно растет (Двойрин В.В. и соавт., 1991; Fisher В., 1993). В частности в Санкт-Петербурге заболеваемость РМНС занимает первое место, составляя более 20% всех злокачественных опухолей у женщин (Худолей В.В. и соавт., 1998).

Прогноз и тактика лечения при РМЖ определяются целым рядом клинических и морфологических факторов. К основным клиническим факторам относят размер первичной опухоли и количество регионарных лимфоузлов, пораженных метастазами (Lipponen Р. и соавт., 1992; Meyer J.S. и Province M.А., 1994), клинико-патогенетические формы РМЖ (Семиглазов В.Ф., 1979). К морфологическим факторам прогноза относят степень гистологической злокачественности опухоли (Bloom H.J.Q. и Richardson W.W., 1957), характер роста опухоли, инвазию кровеносных сосудов и др. Пролиферативная активность (ПА) опухолевых клеток является особенно значимым фактором в определении биологического поведения PMS (Amerlov С. и соавт., 1992; Ferno M. и соавт., 1992; Wenger С.R. и соавт., 1993; Mansour E.G. и соавт, 1994). Скорость репродукции клеток PME (как и других злокачественных опухолей) имеет важное терапевтическое значение: быстрорастущие опухоли более чувствительны к химиотерапии, медленно растущие оказываются более чувствительными к гормо-нональному лечению (Silvestrini R., 1994; Amador! D. и соавт., 1997).

В течение длительного времени возможности оценки ПА опухолей у человека были ограничены. Они сводились к определению митоти-ческого индекса (Нейштадт Э.Л.,1977; Казанцева И.А., 1981), который далеко не полностью отражает темп воспроизводства клеток (Donhujsen К. и соавт., 1990). Метод тимидиновой гистоавторадиог-рафии у человека in vivo по этическим причинам использован быть не может, а его вариант in vitro имеет ряд методологических ограничений (необходимость взятия маленького тканевого образца - не более 1мм3, сложные условия инкубации, очень поверхностное про-

- S - '

никновение в ткань меченого предшественника ДНК - около ЮОмкм), что сильно отражалось на результатах исследования.

В последнее время ситуация резко изменилась: разработаны относительно простые и высокоинформативные способы определения различных параметров пролиферации клеток опухолей. Так, величина фракции S-фазы может быть определена по содержанию ДНК с помощью проточной цитометрии-и более прямым способом - по инкорпорации в ядерную ДНК клеток вводимого в организм 5-бром-2'-дезоксиуридина (БДУ), выявляемого в гистологических препаратах с помощью иммуно-гистохимического метода (Goodson W.H. и соавт., 1991). Близким к выше описанному.параметру пролиферации может служить ядерный антиген пролиферирующих клеток - ЯАПК (proliferating cell nuclear antigen - PCNA), также определяемый иммуногистохимически (Ogata К-. и соавт., 1987; Waseem N.H. и Lane D.P., 1990). Особенно следует подчеркнуть, что в настоящее время получены моноклональные и поликлональные антитела к антигену Ki-67, которые обладают свойством маркировать клетки, находящиеся во всех фазах митотического. цикла (МЦ) (Cattoretti G. и соавт., 1992; Delahunt В. и соавт., 1995). Таким образом, возникла возможность определять не только "импульсную метку", но и приблизиться к оценке пролиферативного пула опухоли.

В последнее десятилетие в онкоморфологии широко используют метод серебрения аргентофильных кислых белков, связанных с ядрыш-ковыми организаторами (ЯО) и отражающих активность рибосомальных генов (Мамаев H.H. и соавт., 1984 - 1998; Ploton D. и соавт., 1986; Crocker J. и соавт., 1987; Xie X. и соавт.,.1997; Wolansky K.D. и соавт., 1998). Имеются сведения литературы о том, что интенсивность серебрения ЯО может быть показателем степени диффе-ренцировки опухоли и коррелирует с ПА неопластических клеток (Dervan P.A. и соавт., 1989; Scucchi L. и соавт., 1992; Sasaki К. и соавт., 1992).

Таким образом, в настоящее время имеется комплекс методичес-,ких подходов для полноценного изучения пролиферативного статуса опухоли и связанных с ним состояний неопластических клеток (сте-

пень дифференцировки, интенсивность рибосомального . синтеза и др.). На основании их проведены отдельные исследования, свидетельствующие о перспективности использования показателей активности пролиферации и ЯО клеток опухоли для дифференциальной диагностики доброкачественных и злокачественных новообразований молочной железы, для оценки биологического поведения опухолей и прогноза их клинического течения (Smith R. и Crocker J., 1988; Goodson W.H. и соавт., 1991; Egan M.J. и Crocker J., 1992; Veronese S.M. и соавт., 1993). Однако проведенные в этом направлении исследования еще малочисленны, часто противоречивы и в них использованы лишь отдельные методики изучения репродукции клеток опухолей молочной железы (Giri D.D. и соавт., 1989; Isola J.J. и соавт., 1990; H.-O.Wintzer и соавт., 1991 и др.), а для наиболее популярных маркеров пролиферации ЯАПК и антигена Ki-67 отсутствуют строгие доказательства приуроченности их только к процессу пролиферации, что не дает возможности всесторонне исследовать особенности пролиферации клеток молочной железы в условиях опухолевого роста.

Цет и задачи исследования. Цель настоящего комплексного исследования - взяв за основу данные метки БДУ ¡сак наиболее точного способа оценки репродуктивной способности клеток, изучить ПА с использованием трех маркеров пролиферации (БДУ, ЯАПК и антигена Ki-67), отражающих различные фазы МЦ, и активность ЯО наиболее часто встречающейся формы FMI - инвазивного протокового рака (ИПР) в связи с его клинико-анатомическими особенностями, такими как размер опухоли, степень гистологической злокачественности и инвазивности, степень нарушения гистотшической и цитотипической дифференцировки, клиническая стадия заболевания, потенции новообразования к рецидивированию и метастазированио, содержание в клетках опухоли рецепторов стероидных гормонов.

Задачи исследования:

1)изучение активности пролиферации и ЯО клеток РМЖ в сопоставлении "с такими же параметрами доброкачественных опухолей и неопухолевых поражений молочной железы.

2)сравнительное изучение активности пролиферации и ЯО в первичном РМЖ, его рецидивах и метастазах в регионарные лимфатические узлы.

3)изучение особенностей пролиферации и активности ЯО в клетках ИПР молочной железы в зависимости от таких его характеристик, как размеры опухоли, клиническая стадия заболевания, степень гистологической злокачественности и отдельные параметры, определяющие ее, степень инвазивности новообразования, склонность его к рецидивированию и метастазированию, содержание в опухолевых клетках рецепторов эстрогена и прогестерона.

4)определение доли клеток РМЖ, находящихся в фазе синтеза ДНК и митозе и соответственно относительной длительности этих фаз митотического цикла

5)определение взаимоотношения между активностью пролиферации и ЯО в опухолях молочной железы

6)сравнительное изучение ПА опухолей с использованием различных маркеров пролиферации с целью выбора наиболее информативного и наиболее оптимального для широкого использования в онкоморфоло-гических исследованиях.

Основные положения, выносимые ва защиту

1) Сочетанное использование трех маркеров пролиферации (БДУ,

.. ЯАПК и антигена К1-67), отражающих различные фазы МЦ, дает возможность определить индекс Б-фазы и величину пролиферативного пула опухоли, а также оценить долю клеток, находящихся в З-фазе и митозе и соответственно относительную длительность этих фаз.

2) Показатели пролиферации при трех использованных нами маркерах характеризуются высокой (г - 0,73 - 0,94) прямой достоверной корреляцией.

3) Показатели ПА РМЖ в 5 раз вше, чем в доброкачественных образованиях и достоверно увеличиваются в рецидивных опухолях и по мере нарастания степени гистологической злокачественности новообразования.^

4) Между ПА первичного РМЖ и таковой его метастазов в регионарные лимфатические узлы имеется достоверная прямая корреляция,

но в большинстве случаев показатели пролиферации в метастазах ниже, чем в первичных опухолях.

5) В РМЖ S-фаза - самая длительная фаза МЦ, занимающая около 45% его, на долю митоза приходится около 5% времени. По мере нарастания ПА РМЖ происходит увеличение относительной длительности митоза, относительная продолжительность S-фазы остается постоянной.

Научвая вотава. Впервые проведено комплексное исследование ПА, оцениваемой по инкорпорации БДУ в ДНК ядер опухолевых клеток при его введении больным, по экспрессии ЯАПК и антигена Ki-67, и активности ЯО в РМЖ. Взяв за основу • определения ПА опухоли методику с инкорпорированием БДУ в ядерную ДНК при ее репликации in vivo, отличающуюся точностью эксперимента, в сопоставлении с про-диферативными показателями, установленными двумя другими способами, удалось показать достоверную высокую прямую корреляцию между всеми изученными маркерами пролиферации. Использование трех маркеров пролиферации, отражающих метаболические события, происходящие в разных фазах МЦ, дало возможность получить индекс S-фазы и величину пролиферативного пула РМЖ, а также оценить долю клеток, находящихся в фазе синтеза ДНК и-митозе и относительную длительность этих периодов МЦ.

Сопоставление ПА опухолей с их клинико-морфологическими особенностями привело к установлению новых фактов. Так, показано, что рецидивные опухоли характеризуются более высокой пролиферацией клеток, чем первичные опухоли, а в метастазах она, наоборот, понижена по сравнению с первичными РМЖ, хотя между их пролифера-тивными показателями сохраняется прямая корреляционная связь. ПА ИПР интенсифицируется по мере нарастания степени гистологической злокачественности новообразования. При этом'она связана с нарушением гистотипической дифференцировки опухоли и не отражает цитологического и ядерного атипизма и полиморфизма, (цитотипическая дифференцировка).

В настоящей работе,установлено, что длительность митоза, которая в среднем занимает около 5% продолжительности МЦ, увеличи-

- 6 - ■

вается в связи с нарастанием ПА; в то же время длительность Б-фазы, занимающей около половины МЦ, оказывается величиной постоянной, не меняющейся в зависимости от количества, пролиферирующих клеток.

Активность ЯО четко коррелирует с изученными нами показателями пролиферации и является ценной характеристикой структурных и функциональных особенностей опухоли.

Практтеская значимость. Показано значение определения активности пролиферации и ЯО в оценке степени злокачественности РМЖ. Для оценки ПА опухолей наиболее оптимальным является определение экспрессии антигена К1-67. Во-первых, она отражает наиболее важный показатель репродукции клеток - пролиферативный пул новообразования. Во-вторых, использование этого способа не требует каких-либо предварительных воздействий на больного и дает возможность получать полноценные результаты при исследовании архивного материала в виде парафиновых блоков. В-третьих, при этом способе наблюдается отчетливая, высоко селективная окраска пролиферирующих клеток и их подсчет не вызывает затруднений.

Активность ЯО является важной характеристикой поведения опухоли, так как служит показателем интенсивности рибосомального синтеза и, четко коррелируя с показателями ПА, может быть дополнительным параметром оценки репродуктивной способности опухолевых клеток. К тому же простота определения активности ЯО дает возможность использовать ее в патологоанатомических лабораториях и отделениях, не требуя'специального оснащения.

В диссертации даются многочисленные методические рекомендации по использованию способов определения ПА и активности ЯО в онко-морфологии.

Апробация диссертации. Результаты диссертационного исследования' обсуждены на 1-й медико-биологической конференции молодых ученых Санкт-Петербурга (ноябрь 1997г), на заседании С-Петербург-ской Ассоциации патологоанатомов (декабрь 1997г), на научной конференции "Новые методы и разработки в онкоморфологии" (Москва, февраль 1998г), на научных конференциях патологоанатомической ла-

боратории с прозектурой НИИ онкологии им.проф.Н.Н.Петрова в 1996-1998гг. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ.

Сгарумяура и объем диссертации. Диссертация изложена на 208 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методик, результатов собственного исследования, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы. Работа содержит 31 таблицу, 24 графика и 19 микрофотографий. Библиографический указатель включает 289 литературных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКИ

Было изучено 58 опухолей молочной железы (10 доброкачественных опухолей, 48 PME, 41 из которых составил.ИПР) и 15 метастазов этих опухолей в регионарные лимфатические узлы.

Клиническую стадию заболеванйя определяли по системе pTNM (Sobin L.H. и Wittekind Ch., 1997). В случаях ИПР определяли степень гистологической злокачественности согласно рекомендациям ВОЗ (Скарфф Р.Уо. и ТорлониГ., 1975).

Содержание рецепторов эстрогена и прогестерона в опухолевых клетках проводили в лаборатории эндокринологии НИИ онкологии им. проф. Н.Н.Петрова методом разделения фаз на декстране-угле (Wilson D.W. исоавт., 1984).

Для определения индекса пролиферации (ЙП) по включению БДУ в ядра клеток in vivo примерно за 1ч. до удаления опухоли больным вводили внутривенно это вещество в дозе 200мг/м2 поверхности тела в физиологическом растворе (использование БДУ в клинической работе разрешено Фармакологическим комитетом Минздравмедпрома РФ). Инкорпорированный БДУ определяли в парафиновых срезах непрямым иммунопероксидазным методом с помощью моноклональных мышиных антител к галогенированным уридинам IU-4 (Caltag lab., San Francisco, CA, USA) в разведении 1:250 после денатурации ДНК в растворе -2Н соляной кислоты.

■■■ ■■ - 8 - ' • ЯАПК выявляли в парафиновых срезах непрямым иммунолероксидаз-ным методом с помощью моноклональных мышиных-антител РС10 (DAKO, Дания) в разведении 1:100. Применяли два способа подсчета: 1) учитывали все клетки, зкспрессирущие ЯАПК, 2) регистрировали только клетки с интенсивной экспрессией антигена.

Антиген Ki-67 определяли в парафиновых срезах непрямым имму-нопероксидазным методом с помощью поликлональных кроличьих антител к человеческому антигену Ki-67 (DAKO, Дания) в разведении 1:200 после демаскировки антигена кипячением срезов в скороварке в цитратном буфере.

ПА клеток определяли при подсчете 1000-150Ö клеток и Ш1 выражали в процентах. Кроме того, производили подсчет митотических фигур среди Ki-67-позитивных клеток (МИТ) и результаты выражали в процентах. . .

Относительную длительность S-фазы. Щ производили по формуле Sasaki К. и соавт. (1988):

ИП БДУ относительная длительность S-фазы х 1OOZ

ИП Ki-67 относительная длительность МЦ Относительную длительность митоза производили по формуле: МИТ __ относительная длительность митоза х 100% ИП Ki-67 —• относительная длительность МЦ Аргентофильные кислые белки, связанные с зонами ЯО, окрашивали по способу W.M.Howell и D.A.Black (1980) в модификации H.H.Мамаева и соавт. (1984). Подсчитывали число ядрышек и зерен серебра внутри ядрышек и в кариоплазме в 1!00-150 ядрах клеток опухолей.

Сопоставление ИП с клинико-патологоанатомическими характеристиками РМЖ проводили с использованием тестов ранговой корреляции Спирмена, Манна-Уитни, Медианного и Знакового (Гублер Е.В. и Ген-кин A.A., 1973; Сидоренко Е.В.,' 1996). Вычисления и построение графиков производили с использованием программы Statistica for Windows (Release 4.3, StatSoft Inc., 1993).

- 9, -

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Результат иммуногистохимического выявления инкорпорированного БДУ был представлен в виде окрашенных в черно-коричневый цвет ядер, ДНК которых включила данное тимидиновое основание. Полученный нами ИМ ВДУ в РМЕ составил 10,94 (2,2 - 26,9)%, что ближе всего к значениям ИМ БДУ в Mí, полученным K.Sasaki и соавт. (1992) -.10,6 (1,65 - 21,5)% и W.H.Goodson и соавт. (1991) - 7,7 (0,1 - 23,9)%. Мы не наблюдали несоответствия между меткой БДУ клеток в срезе опухоли и большим количеством митотических фигур, которая могла бы произойти вследствие нарушения проницаемости для БДУ в некоторых участках опухали (Kotelnikov V.M. и соавт., 1996).

Использованная нами в исследовании доза ВДУ да внутривенного введения (200 мг/м2) соответствует верхнему пределу следовой дозы, определенной экспериментально. Это означает, что введенный в данном количестве БДУ не оказывает. влияния на метаболизм ДНК клеток (Boswald М. и соавт., 1990), и поэтому не представляет опасности для больных.

Иммуногистохимическая реакция выявления ЯАПК имела вид окрашенных с разной интенсивностью (от золотисто-желтого до темноко-ричневого) ядер; в делящихся клетках, слабо окрашивалась цитоплазма вокруг хромосом. По нашим данным, .индекс общей экспрессии ЯАПК в РМЖ составил 44,87 (23,19 - 67,58)%, а индекс интенсивной экспрессии - 25,71 (7,50 53,70)%, что ближе всего к данным S.Aaltomaa и соавт. (1993) - 26,2+1,7%. 'Индекс интенсивно экс-прессирующих ЯАПК- клеток в 2,5 раза превышает ИМ БДУ, который отражает долю клеток, находящихся в S-фазе. Это наблюдение можно объяснить длительным периодом полу-жизни белка ЯАПК, составляющим около 20 ч. (Wada Т. и соавт. ,1994). Имеющиеся в литературе разногласия по поводу учета результатов иммуногистохимического выявления ЯА1Ж(Ьая! К.-У.и соавт. ,1996) можно объяснить 3 основными причинами: 1) длинным периодом полу-жизни белка ЯАПК, благодаря чему он может быть выявлен даже в непролиферирующих клетках' (Hall P.A.

и соавт., 1990), 2) участием белка ЯАПК в репарации поврежденных участков молекулы ДНК, не связанной с пролиферацией (Shivjl M.J.K, и соавт., 1992) и 3) зависимостью результатов иммуногисто-химичесского окрашивания от разведения антител (Yu G.C.W, и соавт., 1993), Однако-специфичность ЯАПК для клеточной-пролиферации очевидна:' коэффициент корреляции между ИМ БДУ и показателем общей экспрессии составил г-0,77, а для интенсивной экспрессии г-0,94 (тест ранговой корреляции Спирмена).

Результат ишуногистохиыического выявления антигена Ki-67 был представлен в виде очень четко окрашенных в темнокоричневый цвет ядер с более интенсивным окрашиванием ядрышек, а также отчетливого окрашивания митотических фигур. Индексы экспрессии Ki-67 в РМЖ, равные 24,89, (8,64 - 65,16)%, больше всего соответствуют данным, полученным S.E.Pinder и соавт. (1995) - 27,3 (0,.6 -62,5)% и T.Pietilainen и соавт. (1996) - 22,4 (1 - 63)%. Использование антигена К1-67 обладает рядом преимуществ по сравнению с другими маркерами клеточной пролиферации. Во-первых, он отражает наиболее важный параметр пролиферации - величину пролиферативного пула. Во-вторых, он не требует дополнительного введения метки больным. В-третьих, антитела к Ki-67, в отличие от антител к ЯАПК, дают высокоселективное окрашивание экспрессируювдх его клеток (Lam K.-Y. и соавт.). Последнее обстоятельство вызвано быстрым (в течение 60-90 мин) катаболизмом белка Ki-67 после окончания митоза.

Полученные нами данные с использованием 3 "разных маркеров клеточной пролиферации показывают, что ПА клеток PMS приблизительно в 5 раз выше таковой доброкачественных опухолей (табл.1). Наше наблюдение подтверждает литературные данные (Lelle R.J. и соавт.,1987; Dervan P.A. и соавт.; Wintzer Н.-О. и соавт.). Однако обращает на себя внимание большой разброс значений ПА клеток РМЖ от низких значений, не превышающих таковую доброкачественных опухолей, до очень высоких значений, равных 65-68% клеточной по-' пуляции. Данное наблюдение подчеркивает резко выраженную гетерогенность РМЖ, которую следует учитывать при определении прогноза

Таблица 1. Пролиферативная активность клеток опухолей молочной железы.

Маркер Индекс Тест Манна-Уитни,

пролиферации пролиферацииД р

Доброкачественные РМЖ

опухоли

Включение ЕДУ 1,97 (0,80 - 4,90) 10,95 (2,20 - 26,90) 0,000002

Экспрессия ЯАПК: -общая 30,11 (11,57 - 54,78) • 44,87 (23,19 - 67,58) 0,005

-интенсивная 6,21 (1,08 - 13,79) 25,71 (7,50 - 53,70) 0,000003

Экспрессия К1-67 4,75 (1,60 - 11,76) 24,89 (8,64 - 65,16) 0,000001

■ - 12 -

клинического течения опухоли и выработке тактики лечения. Причины увеличения ПА клеток злокачественных опухолей не вполне ясны. Возможно, это связано с мутациями супрессорного гена р53, по современным представлениям, играющего ведущую роль в регуляции клеточного деления (Lane D.P., 1992), или генов BRCA1 и BRCA2, также принимающих участие в регуляции митотического цикла (Wang S.С. и соавт., 1997).

ПА клеток ИПР молочной железы четко связана с уровнем его дифференцировки, определяющей степень гистологической злокачественности (СГЗ) новообразования. Интересно, что имеется корреляция между ПА и как интегральным показателем СГЗ, так и 2 показателями иэ 3, его определяющих (табл.2). Большинство исследователей обнаружили такую же зависимость(Goodson W.H. и соавт.,1991;Weidner N. и соавт., 1993; Pinder S.E. и соавт.; Pietilainen Т. и соавт.; Moriki Т. и соавт., 1996; Dettmar Р. и соавт., 1997). Данное наблюдение подчеркивает важное значение ПА как показателя, точно характеризующего биологическую природу опухоли.

ПА рецидивов PME оказалась достоверно выше ПА первичных опухолей (р-0,02 для БДУ и р-0,05 для антигена Ki-67; тест Манна-Уитни). Это может означать, что рецидивные опухоли образованы клоном опухолевых клеток, обладающих более высоким пролифератив-ным потенциалом. Такие же данные получены другими .авторами (Shrestha Р. и соавт., 1992; Linn S.С. и соавт., 1997).

Значения клеточной пролиферации первичных ВШ и их метастазов в регионарные лимфатические узлы, по нашим данным, достоверно коррелируют между собой (г-0,9; р-0,000006 для БДУ и г-0,8; р-0,002 для антигена Ki-67; тест ранговой корреляции Спирмена). Такие же данные опубликованы другими исследователями (Boodson W.H. и соавт., 1993);. Однако в литературе не сложилось единого мнения о значениях ПА первичной опухоли и ее метастаза. По нашим данным, ПА клеток метастазов в преобладающем большинстве случаев достоверно ниже таковой первичных опухолей (р-0,002 для ЕДУ и р-0,009 для антигена Ki-67; Знаковый тест). Вероятно, при этом на

Таблица 2. Пролиферативная активность инвазивного протокового рака молочной железы в зависимости от СГЗ опухоли.

Показатель ИП(БДУ);р . ИЩЯАПКобщ); р ИП(ЯАПКинт);р ИЩ К1-67) ;р

Степень гистологической злокачественности: I 6,08% II 9,60% III 15,27% 0,0001 35,54% 50,86% 50,31% 0,001 15,21% 29,08% 34,19% 0,0001 14,27% 22,18% 36,11% 0,00001

Способность к образованию тубулярных структур: -высокая -средняя -низкая 6,32% 7,91% 14,00% 0,002 - 36,66% 38,86% 50,93% 0,002 , 15,06% 19,44% 33,52% 0,0001 . 13,89% 18,15% 33,40% 0,0004

Митотическая активность; -низкая -средняя -высокая 5,95% 9,53% 15,60% 0,0001 36,66% 48,68% 51,02% 0,0005 15,61% 27,69% 35,49% 0,0003 14,82% 23,64% 34,81% 0,0002

Ядерные атипия тн полиморфизм: -низкие -средние -высокие 5,82% 11,45% 11,54% 0,34 32,83% 46,19% 47,56% 0,04 14,13% 27,88% 27,94% 0,04 13,24% 26,29% 28,40% 0,05

Примечание: В таблице приведены средние значения показателей ПА. р-Медианный тест.

ПА клеток метастаза могут влиять неблагоприятные факторы микроокружения (Yoshimine Т. и соавт., 1986; Karlsson M. и соавт., 1994) По нашим данным, ПА клеток ШК не коррелирует с размером опухоли (г—0,11; р-0,5 для БДУ и г-0,15; р-0,3 для антигена Ki-67; тест ранговой корреляции Спирмена). В литературе также имеются подобные наблюдения (Nicotina P.A. и соавт., 1991; Silvestrini R,, 1994; Ashton-Key M. и соавт., 1993). Такое положение может означать: 1) зависимость размеров опухоли в момент операции скорее от качества диагностики новообразования, нежели от скорости его роста, 2) высокую величину клеточной потери в раке..

Нами также не выявлено зависимости между ПА клеток FMI и наличием метастатически пораженных регионарных лимфоузлов (р-0,2 для ЕДУ и р-0,2 для антигена Ki-67; тест Манна-Уитни). Такие же результаты получены другими исследователями (Ashton-Key M. и соавт.; Pinder S.E. и соавт.; Pietilainen Т. и соавт.). Вероятно, на метастазирование FWffi более сильное влияние оказывают другие факторы, такие как изменения клеточной адгезии, состояние внеклеточного матрикса (Pietilainen Т. и соавт.), ферментные клеточные факторы инвазии, активность неоангиогенеза и другие►

В нашей работе мы не выявили корреляции между ПА клеток PMS i содержанием в них рецепторов эстрогена и прогестерона, что соответствует результатам других исследователей (Bouzubar N. и соавт. , 1989; Pinder S.E. и соавт.). Кроме того, нами также не найдено зависимости между ПА клеток РМЖ и возрастом больных (г-0,01 р-0,9 для БДУ и г-0,008; р-0,9 для антигена Ki-67; тест рангово: корреляции Спирмена), даже при. ограничении выборки только больны ми с сохранившейся овариальной функцией: В других работах такк не обнаружено зависимости между ПА FMI и возрастом пациенто (Корман Д.В., 1990). Таким образом, отсутствие корреляции межд ПА клеток MI, с одной стороны, и содержанием в клетках рецепто ров половых стероидных гормонов и возрастом пациентов, с другой означает, что рост опухоли настолько автономен, что он не завися от гормонального статуса больных.

По нашим данным, нет зависимости между ПА клеток РМЖ и инва-зивными потенциями опухоли.

Показатели ПА опухолей молочной железы, определенные с помощью 3 маркеров пролиферации, имели высокую степень корреляции (табл.3). С одной стороны, это делает более обоснованными обнаруженные нами закономерности. С другой стороны, высокая корреляция между показателями, отражающими разные фазы МЦ, позволяет сделать вывод о прохождении раковыми клетками фаз МЦ без блока в каких-либо из них.

Полученная нами относительная длительность S-фазы клеток FMK, равная 44,64 (24,40 - 89,21)% МЦ, в общем близка к результатам K.Sasaki и соавт. (1988) - 0,58+0,28. По нашим данным, относительная длительность митоза клеток РМЯ равна 5,04 (1,00 -11,20)% МЦ. При этом мы обнаружили, что относительная длительность митоза достоверно нарастает с увеличением ПА клеток при сохранении постоянной длительности S-фазы. Это может означать: 1) задержку клетки в митозе', либо 2) пропорциональное сокращение Si~, S и 02-фаз при сохранении длительности митоза (McGurrin J.F. й соавт., 1987). Литературные данные по этому вопросу скудны и противоречивы. Учитывая данные И.А.Алова (1972), можно предположить, что происходит истинное удлинение митоза за счет задержки опухолевых клеток в метафазе вследствие поломки тиолового механизма клеточного деления.

По нашим данным, значения всех показателей активности ЯО, за о- исключением количества ядрышек, в клетках РШ достоверно выше, чем в клетках доброкачественных образований (табл.4), что соответствует данным других aBTopoB(Smith И.и Crocker J.;Dervan P.A. И соавт.). Однако перекрывание значений количества гранул серебра в доброкачественных и злокачественных опухолях не дает возможности использовать показатель активности ЯО в качестве абсолютного критерия для дифференциальной диагностики этих новообразований.

Количество внутрядрышковых гранул и общее количество гранул серебра в ядре находится в тех же взаимоотношениях со СГЗ ИПР и клинико-анатомическими особенностями РШ, что и все показатели

Таблица 3. Коэффициенты корреляции между показателями пролиферации клеток ШЖ при использовании различных маркеров (Тест ранговой корреляции Спирмёна,г).

Маркеры пролиферации"'

Включение БДУ

Общая

экспрессия

ЯАПК

Интенсивная

экспрессия

ЯАПК

Экспрессия М-67

г-0,92

г-0,73

Г-0,90

я о

Интенсивная экспрессия . ЯАПК

г-0,94

г-0,86

Обл(ая'

экспрессия

ЯАПК

г-0,77

Примечание: Все корреляции статистически достоверны.

Таблица 4. Показатели активности ЯО клеток опухолей молочной железы.

Показатель Доброкачественные опухоли РМЯ Тест Манна-Уитни, Р

Ядрышки/ядро 1,10 (1,04 - 1,21) 1,16 (1,01 - 1,78) 0,33

Внутриядрышковые гранулы/ядро 3,52 ' (1,71 - 5,51) 6,73 (3,29 - 16,38) 0,00003

Внеядрышковые гранулы/ядро 1,91 (0,79 - 4,09) 2,80 (0,58 - 6,60) 0,006

Общее количество гранул/ядро 5,43 (3,25 - 8,30) 9,52 (3,86 - 22,98) 0,0001

• - 18 -

параллельно определенной ПА. Количество внеядрышковых зерен серебра в нуклеоплазме бшо связано лишь со степенью митотической активности. Количество ядрышек в ядре не коррелировало ни с одним из вышеперечисленных показателей. Другие исследователи также выявили корреляцию между активностью ЯО и СГЗ РШ (Giri D.D. и соавт. ; Aaltomaa S. и соавт., 1993).

Почти все показатели активности ЯО, за исключением количества внеядрышковых зерен серебра в кариоплазме, показали достоверную корреляцию между первичными РЫЖ и их метастазами. Но лишь количество внутриядрышковых гранул серебра было достоверно ниже в метастазе по сравнению с первичной опухолью, остальные показатели не выявили различий в активности ЯО между первичными РМЖ и их метастазами. Данное наблюдение свидетельствует о том, что количество внутриядрышковых гранул серебра является наиболее информативным показателем активности ЯО, особенно тесно связанным с ПА РШ.

Все показатели активности ЯО, так же как и маркеры пролиферации, показали отсутствие зависимости между активностью ЯО и такими клинико-морфологическими признаками РМЖ, как-возраст больных, размер опухоли и содержание рецепторов стероидных гормонов, инвазия жировой клетчатки, развитие метастазов и рецидивов. Данное наблюдение показывает, что рибосомальный синтез в клетках FMS связан главным образом с делением клеток.

Почти все показатели активности ЯО коррелировали с ПА РШ, причем наиболее тесную корреляцию продемонстрировали количество внутриядрышковых зерен серебра и общее количество зерен серебра в ядре, вероятно, за счет входящих в их состав внутриядрышковых гранул (табл.5). Это подтверждает выводы других исследователей (Busch Н. и соавт., 1979; Crocker J. и соавт., 1989; Ruschoff J. и соавт., 1990) о том, что только количество внутриядрышковых гранул дает наиболее достоверную информацию об активности ЯО. Количество внеядрышковых гранул серебра также коррелирует с ПА клеток РМЖ, но в меньшей степени (см.табл.5). Последнее наблюдение говорит в пользу того', что внеядрьшковые гранулы, располагающиеся

Таблица Б.' Соотношение активности ЯО и ПА опухолей молочной железы (Тест ранговой корреляции Спирмена).

Маркер Ядрышки/ядро Внутриядрышковые Внеядрышковые Общее количество

пролиферации гранулы/ядро гранулы/ядро гранул/ядро

ИП(БДУ): ■

-доброкачественные г-О,18(р-0,6) г-0,42(р-0,2) г-0,26(р-0,5) г-0,52(р-0,1) опухоли

-РМЖ Г-0,36(р-0,01) г-0,55(р-0,00003) г-0,31(р-0,03) г-0,53(р-0,0001)

_1_:_■

ИП(ЯАПКобщ):

-Доброкачественные г-0,30(р-0,4) г-0,20(р-0,6) г-0,04(р-0,9) г-0,26(р-0,5) "опухоли I

-РМЖ. Г-0,43(р-0,003) Г-0,37(р-0,01) г-0,23(р-0,1) Г-0,37(р-0,01) £

-;----;-' I

ИП(ЯАПКинт):

-доброкачественные г-0,14(р-0,7) г-0,22(р-0,5) г-0,006(р-0,9) г-0,30(р-0,4) опухоли

-РМЖ г-0,41(р-0,005) Г-0,51(р-0,0002) г-0,25(р-0,09) г-0,48(р-0,0006) _____

-доброкачественные г-0,41(р-0,2) г-0,79(р-0,006) г-0,47(р-0,2) г-0,71(р-0,02) опухоли

-РМЖ г-0,25(р-0,09) г-0,61(р-0,000007) г-0,32(р-0,03) г-0,58(р-0,00002)

в кариоплазме, не являются артефактом. Кроме того, : количество зерен серебра вне ядрышек повышается ' параллельно с их ростом внутри ядрышек (г-0,60; р=0,000001; тест ранговой корреляции Спирмена), что подтверждает необходимость для оценки активности рибосомального синтеза в клетке включать в подсчет также внеяд-рышковые зерна серебра. Данные о' корреляции между активностью пролиферации и ЯО клеток PME также получены другими авторами (Dervan P.A. и соавт; Mourad W.A. и соавт., 1992; Sasaki. К. и соавт., 1992).

Наше исследование доказывает, что активность ЯО клеток BSE достоверно связана с их ПА. В доброкачественных же.опухолях активность ЯО коррелирует лишь с 1 из 3 показателей пролиферации, а именно, с экспрессией антигена Ki-67 (тэбл.'5).- На основании этих фактов можно предположить, что рибосомальный синтез, отражением которого является количество белков ЯО, в раковых клетках связан преимущественно с их размножениемГ В клетках же доброкачественных опухолей молочной железы рибосомальный синтез, вероятно, связан с отправлением специфической функции дифференцированной, клетки (секреция, синтез рецепторов, медиаторов и т.п.). Полученные факты о корреляции между экспрессией антигена Ki-67 и активностью ЯО в доброкачественных опухолях и РМЖ находятся в соответствии с представлениями ряда .исследователей (van Dierendonck J.H. и соавт., 1989; Bruno S. и Darzynkiewicz Z., 1992) об участии антигена Ki-67 в рибосомальном синтезе.

выводы

1. Сочетанное использование трех маркеров пролиферации (5-бром-2*-дезоксиуридина, ядерного антигена пролиферирую-щих клеток и антигена Ki-67), отражающих различные фазы ми-тотического цикла, дает возможность определить индекс S-фа-зы и величину пролиферативного пула опухоли, а также оценить долю клеток, находящихся в S-фазе и митозе и соответственно относительную длительность этих фаз.

2. Показатели пролиферации при трех использованных нами маркерах -характеризуются высокой (г-0,73 - 0,94; р<0,000001) прямой корреляцией.

3. Показатели пролиферативной активности рака молочной железы в 5 раз выше, чем в доброкачественных образованиях и достоверно увеличиваются в рецидивных опухолях и по мере нарастания степени гистологической злокачественности новообразования.

4. Между пролиферативной активностью первичного рака молочной железы и таковой его метастазов в регионарные лимфатические узлы имеется достоверная прямая корреляция, но в большинстве случаев показатели пролиферации в метастазах ниже, чем в первичных опухолях.

5. В раке молочной железы Б-фаза - самая длительная ■ фаза мито-тического цикла, занимающая около 45% его; на долю митоза приходится около 5% времени. По мере "нарастания пролиферативной активности рака молочной железы происходит увеличение относительной длительности митоза, относительная продолжительность З-фазы остается постоянной.

6. Среди исследованных маркеров пролиферации наиболее информативным является антиген К1-67, так как его экспрессия отражает пролиферативный пул опухоли, не требует дополнительных воздействий на больных и подсчет пролиферирующих клеток прост и надежен.

7. Нарушение гистотипической дифференцировки инвазивного про-токового рака молочной железы отчетливо связано с его пролиферативной активностью, которая увеличивается при снижении органной организации опухоли; нарушение вдтотипической дифференцировки не сказывается на степени пролиферации опухолевых клеток.

8. Активность ядрышковых организаторов служит важным показателем биологического поведения опухоли: она возрастает в раке молочной железы по сравнению с доброкачественными новообразованиями и по мере увеличения его степени гистологической

злокачественности. Она имеет прямую корреляцию с пролифератив-ной активностью рака молочной железы. Наиболее информативным показателем активности ядрышковых организаторов является число внутриядрышковых зерен серебра.

9. Возраст больных, размер опухоли, степень ее инвазивности, потенции к метастазированию, клиническая стадия заболевания и гормонально-рецепторный статус опухолевых клеток не связаны с пролиферативной активностью и активностью ядрышковых организаторов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. ПА является важной характеристикой опухоли, отражающей ее биологическое и клиническое поведение.

2. Наиболее информативным и простым способом определения ПА . новообразований служит иммуногистохимическое определение экспрессии антигена Ki-67. Этот показатель дает представление о величине пролиферативного пула опухоли и может быть использован в ретроспективных исследованиях при изучении архивного материала, заключенного в парафин.

3. Активность ЯО может служить показателем интенсивности рибо-сомалыюго синтеза и дополнительным критерием,-величины пролиферации в опухолях и в силу простоты ее определения может быть использована в патологоанатомических лабораториях и отделениях, не требуя специального оснащения. Наиболее информативным параметром активности ЯО являетсяколичество внутриядрышковых зерен серебра. Оптимальные результаты определения активности ЯО дает метод серебрения по W.M.Howell и D.A.Black (1980) в модификации H.H.Мамаева и соавт. (1984).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Упоров A.B. ,Цырлина Е.В. ,Семиглазов В.Ф. ,Поадрисский K.M. Определение пролиферативной активности клеток рака молочной железы с использованием введения 5-бром-2'-дезоксиуридинй"

: - 23 -

in Vivo // Bónp. онкол. - 1997. - 1.43. - G. 176-182.

2. Упоров A.B. Сравнительное иммуногистохимическое изучение пролиферативной активности клеток рака молочной железы с использованием различных маркеров пролиферации // Материалы 1-й медико-биологической конференции молодых ученых Санкт-Петербурга. - 17-19 ноября 1997. - СПб, 1997. - С.79-80.

3. Упоров А.В.,Цырлина Е.В..Семиглазов В.Ф..Пожарисский K.M.

. Сравнительное иммуногистохимическое изучение пролиферативной активности и ядрышковых организаторов клеток рака молочной железы // Тез. VI научн. конф. "Новые методы и разработки в онкоморфологии". - М., 1988. - С.72-73.

4. Упоров A.B., Цырлийа Е.В., Пожарисский K.M. Иммуногистохимическое изучение пролиферативной активности клеток рака молочной железы по экспрессии ядерного антигена пролифери-рующих клеток (PCNA) // Вопр. онкол. - 1998. - Т.44. -С.49-53.

5. Упоров A.B., Цырлина Е.В., Пожарисский K.M. Сравнительное изучение пролиферации (по выявлению антигена Kí-67) и активности ядрышковых организаторов клеток рака молочной железы // Вопр. онкол. - 1998. - Т.44. - С.316-324.