Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Фармакогностическое изучение комплексного растительного средства, рекомендуемого для профилактики заболеваний мочевыделительной системы

На правах рукописи

ЮГДУРОВА ЕЛИЗАВЕТА ДОЛГОРОВНА

«ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ КОМПЛЕКСНОГО РАСТИТЕЛЬНОГО СРЕДСТВА, РЕКОМЕНДУЕМОГО ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ЗАБОЛЕВАНИЙ МОЧЕВЫДЕЛИТЕЛЬНОЙ СИСТЕМЫ

15. 00 02 - фармацевтическая химия и фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Улан-Удэ 2004

Работа выполнена в Институте общей и экспериментальной биологии Сибирского отделения Российской академии наук.

Научные руководители: доктор фармацевтических наук

Николаева Галина Григорьевна

Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук,

профессор

Маняк Виктор Андреевич

кандидат фармацевтических наук Шелухеева Марина Геннадьевна

Ведущая организация: Всероссийский институт лекарственных

и ароматических растений

Защита состоится «30» июня 2004 года в 10 часов на заседании диссертационного совета К 003.028.01 при Институте общей и экспериментальной биологии СО РАН по адресу: 670047, г. Улан-Удэ, ул. Сахья-новой, 6.

С диссертацией можно ознакомиться в центральной научной библиотеке Бурятского научного центра СО РАН

Автореферат разослан « В/» мая 2004 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета К 003.028.01

кандидат биологических наук Хобракова В Б.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы Актуальность разработки и стандартизации растительных средств, предназначенных для профилактики и вспомогательной терапии различных нарушений функций почек и мочевыводящих путей, обусловлена широким распространением, особой тяжестью их течения, приводящим к потере трудоспособности населения. В настоящее время до 90 % мужчин старше 60 лет страдают заболеваниями почек, мочевого пузыря, хроническими простатитами, или аденомой предстательной железы. До 70 % женщин в возрасте, старше 50 лет страдают почечнокаменной болезнью, пиелонефритами, циститами (Ужегов, 1999). По данным ВОЗ воспалительные заболевания мочевых путей у детей занимают второе место после ОРВИ. Около 15 % женщин в замужестве, беременности и родах страдают воспалительными заболеваниями мочеполовой системы (Корсун, Суворов, 1999).

Медико-социальная значимость болезней почек помимо их широкой распространенности обусловливается тем, что они являются одной из ведущих причин инвалидизации и смертности в молодом возрасте. (Мажд-раков,1980; Тареев, 1983). Растет число токсических, в том числе алкогольных и лекарственных повреждений почек, преимущественно развивающихся у трудоспособной части населения, отмечается развитие лекарственной устойчивости патогенной микрофлоры и развитие побочных эффектов, среди которых наиболее значимой является нефротоксичность антибиотиков. Следует отметить, что для профилактики и лечения заболеваний мочевыделительной системы применяется ограниченный набор лекарственных средств растительного происхождения, не удовлетворяющий возросшие в последние годы потребности населения.

В этой связи, особый интерес представляют биологически активные добавки (БАД) к пище, являющиеся эффективной формой первичной и вторичной профилактики, а так же применяемые в комплексном лечении многих хронических заболеваний с целью повышения неспецифической резистентности организма к воздействию неблагоприятных факторов среды и регуляции функциональной активности организма.

Заслуживают внимания легкорастворимые чаи из сухих экстрактов, при получении которых обеспечивается максимальный выход биологически активных веществ. К преимуществам сухих экстрактов относятся также удобство при применении больными и стойкость при хранении.

Таким образом, исследования по созданию отечественных комплексных профилактических средств и БАД из растительного сырья, доступных широким массам населения, безопасных при их длительном применении является актуальной задачей.

Цель и задачи исследованияю. Целъюнастоящей работы является разработка и стандартизация биологически активной добавки к пище в виде чая, экстракта сухого «Байкальский - 6» и его таблетированной формы, рекомендуемых для профилактики заболеваний мочевыделительной системы.

Для достижения указанной дели необходимо было решить следующие задачи:

- обосновать и разработать состав многокомпонентной растительной композиции для профилактики заболеваний мочевыделительной системы;

- провести фармакогностическое изучение исходной растительной композиции;

- разработать способ получения биологически активной добавки к пище «Байкальский - 6» в виде чая, его сухого экстракта и готовой формы,

- определить качественное и количественное содержание биоло! иче-ски активных веществ в сухом экстракте и готовой форме (таблетках);

- разработать нормативные документы на рекомендуемые биологически активные добавки к пище с целью внедрения их в производство (технические,условия, технологические инструкции и рецептуры).

Научная новизна работы Разработан и обоснован состав многокомпонентной растительной композиции чая «Байкальский-6». Рациональность рецептуры подтверждена сведениями о клинической эффективности и безопасности его состава.

Определены критерии подлинности чая «Байкальский -6», установлены числовые показатели, внесенные в нормативные, документы. Доказано наличие биологически активных веществ в исходной растительной композиции с помощью современных физико-химических методов анализа.

Теоретически обоснован и экспериментально подтвержден способ получения сухрго экстракта и на его основе готовой формы (таблеток). С учетом химического состава подобраны оптимальные параметры технологического процесса, выявлены закономерности экстрагирования биологически активных веществ.

Разработаны методики качественного и количественного анализа чая «Байкальский - 6», его сухого экстракта и готовой формы по сумме фла-воноидов в пересчете на рутин и фенологликозидов в пересчете на арбутин методом спектрофотометрии.

На основании полученных результатов составлены нормативные до кументы на биологически активные добавки: рецептуры, технические условия (ТУ), технологические инструкции (ТИ).

Практическая значимостьработы

На основании проведенных исследований разработаны и внедрены:

Биологически активная добавка к пище чай "Байкальский -6", РУ № 005463.Р.643.06.2003 от23.07.2003.

Получено положительное решение о выдаче патента на изобретение по заявке №2004101614/15(001813) от 22.01.2004: Средство «Чай Байкальский - 6», обладающее диуретической активностью и способ его получения.

Наработано пять опытных серий сухого экстракта и таблеток.

Разработаны и утверждены:

- Технические условия ТУ 9171-19-03533369-04, технологическая инструкция (ТИ) по производству биологически активной добавки к пище в виде сухого экстракта «Экстракт Байкальский -6».

- Технические условия ТУ 9361-020-03533369-04, технологическая инструкция (ТИ) по производству биологически активной добавки к пище «Таблетки экстракта Байкальский - 6».

Чай "Байкальский -6" внедрен в производство (акты о внедрении Центра восточной медицины Республики Бурятия, 2004 г).

Апробация работы и публикации Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены:

- У1 Симпозиуме по фенольным соединениям (Москва, 2004); научно-практической конференции «Биологически активные добавки в профилактической и клинической медицине» (Улан-Удэ, 2003);

заседании объединенного семинара лабораторий экспериментальной фармакологии, медико-биологических исследований и лаборатории безопасности биологически активных веществ ИОЭБ СО РАН (Улан-Удэ, 2003),

- международной научной конференции «Состояние эпидемиологии туберкулеза в приграничных районах территории Монголии и России» (Сухэ-Батор, 2003);

Основное содержание диссертации опубликовано в 7 научных работах; ТУ на БАД к пище чай «Байкальский -6»; ТИ чай «Байкальский -6»; ТУ на «Экстракт Байкальский - 6» сухой; ТУ на «Таблетки экстракта Бай-кальский-6».

Связь задач исследований с проблемным планом научного совета по фармакологии и фармации Работа выполнена в соответствии с планом научных исследований Отдела биологически активных веществ Института общей и экспериментальной биологии СО РАН по программам: «Регуляция свободнорадикальных процессов при повреждении органов пищеварения с использованием биологически активных веществ из арсенала традиционной медицины» и «Лекарственные растения Сибири и

Дальнего Востока», являющейся разделом (6.3) Государственной программы «Сибирь» на период 1986-2006 гг.

На защиту выносятся:

- результаты теоретического, экспериментального, клинического обоснования разработки состава чая «Байкальский - 6», экстракта сухого и готовой формы (таблеток), рекомендуемых для профилактики и вспомогательной терапии заболеваний мочевыделительной системы;

- результаты исследований по установлению показателей подлинности, качественного и количественного определения биологически активных веществ в чае, экстракте сухом и готовой форме.

Объем и структура диссертации Диссертационная работа выполнена на 164 страницах машинописного текста: состоит из введения, обзора литературы (глава 1), экспериментальной части (4 глав), 38 таблиц и 35 рисунков, общих выводов и списка литературы (включено 172 источника, из которых 24 - на иностранном языке) и приложений.

Во введении раскрыта актуальность темы, сформулированы цель и задачи исследования, приведены научная новизна и практическая значимость работы.

В первой главе на основании данных литературы обсуждены возможности применения фитосредств с лечебной и профилактической целью при заболеваниях мочевыделительной системы с учетом этиологии и патогенеза. Рассмотрен современный ассортимент лекарственных препаратов растительного происхождения и биологически активных добавок. Отражены особенности современного производства создания лекарственных форм.

Вторая глава посвящена установлению оптимального соотношения ингредиентов в исходной растительной композиции и разработке технологической схемы производства чая, товароведческому анализу сырья и чая.

Глава третья содержит данные по установлению морфолого-анатомических признаков чая, по фитохимическому изучению биологически активных веществ, определены реакции подлинности и разработаны методики количественного определения содержания действующих веществ по доминирующим компонентам в растительной композиции с использованием методов ТСХ, ВЭЖХ, УФ-спектроскопии.

Глава четвертая посвящена разработке способа получения сухого экстракта, методов его контроля, технологии получения таблеток на основе сухого экстракта чая «Байкальский-6», разработке методик стандартизации.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты и методы исследования В качестве объектов исследования служило растительное-сырье, заготовленное в различных районах республики Бурятия и полученное от ОАО «Красногорсклексредства»: листья брусники (Folia Vaccinum vitis-idaea L.) - ГФ XI изд., вып.2. ст. 27; листья крапивы двудомной (Folia Urtica dioica L.) - ГФ XI изд., вып.2. ст. 25; листья толокнянки обыкновенной (Folia Arctostaphylos uva ursi L.) - ГФ XI изд., вып.2. ст. 26; цветки ноготков лекарственных (Flores Calendula officinalis L.) - ГФ XI изд., вып.2. ст. 5; трава горца птичьего (Herba Polygonum aviculare L.) - ГФ XI изд., вып.2. ст. 56.

В исследованиях использовали различные варианты композиций чая, сухие экстракты и таблетки, полученные из чая «Байкальский -6».

Отбор средней и аналитических проб, измельчение воздушно-сухого сырья проводили согласно ГФ XI, вып. I, стр. 273;

Микроскопические исследования в чае лекарственного растительного сырья проводили по методике, описанной в ГФ XI изд., вып. 1, стр. 277 .

В работе использованы реактивы, растворители, стандарты, отвечающие требованиям соответствующей нормативной документации.

Исследование качественного состава чая и сухого экстракта «Байкальский - 6» проводили методом одномерной и двумерной хроматографии на бумаге марки «Ленинградская - М» и "Filtrak" FN-16, FN-13(Германия)", а также тонкослойной хроматографии на пластинках "Kieselgel 60, F-254" размером 20 х 20 см., фирмы Merck (Германия) и "Silufol" в следующих системах растворителей: н-бутанол-уксусная кислота- вода (4:1:2); уксусная кислота 15 %; . хлороформ-метанол 95:5; хлороформ-метанол 9:1; хлорофом-этанол 7:3; этилацетат-метилэтилкетон-муравьиная кислота - вода 50:30:10:10; этилацетат-этанол 95:5; этилацетат-уксусная кислота-вода 5:1:1.

Оптическую плотность растворов измеряли на спектрофотометре СФ-46 (ЛОМО) в кюветах с толщиной слоя 10 мм.

Качественный и количественный анализ фенольных соединений проводили методом ВЭЖХ на высокоэффективном жидкостном хроматографе фирмы "Gilston" (Франция) с последующей компьютерной обработкой результатов исследования с помощью программы "Мультихром" для "Windows". Содержание аминокислот определяли методом ВЭЖХ, с использованием хроматографа "Gilson - 321", Франция и спектрофотометри-ческого детектора J SCO ДЖААСО 821 - FP, США.

При разработке методик количественного определения были использованы хроматографически чистые вещества - государственные стандартные образцы (ГСО): рутин-стандарт - ФС 42 -2508-87, ВИЛР ТУ 9369-141 - 048668244; арбутин - Fluka, кат. №10960, СО ВИЛАР (ТУ 9363-133-

04668-44-01); галловая кислота - Fluka, кат. №48630; кофейная кислота -Sigma, кат. №0625; хлорогеновая кислота - Sigma, кат. №3378; апигенин -Fluka, кат. №10748; гесперидин - Sigma, кат. №04125; лютеолин ГСО - ФС 423130-95; лютеолин-7-гликозид ГСО - ФС 42-3130-95, кверцитин - ФС 42-290-79 ВИЛАР ТУ 9369-128-04868244-03; гилерозид ГСО - ФС 420106-03.

Разработка способа получения биологически активной добавки к пище «Байкальский — 6» в виде чая.

На основании анализа литературных данных, химического состава, фармакологических свойств биологически активных веществ. используемых растений, их сырьевой базы, проведен подбор растительной композиции, где доля каждого компонента определялась с учетом многофакторных механизмов развития различных нарушений функций мочевыделительной системы.

С целью выбора оптимального соотношения входящих в чай ингредиентов, были изучены несколько вариантов чаев.

На основании предварительного фармакологического скрининга и результатов анализа была выбрана композиция чая из растительного лекарственного сырья следующего состава: травы горца птичьего (Polygonum aviculare L.) - 30 %; листьев толокнянки обыкновенной (Arctostaphylos uva ursi L.) - 20 %; листьев брусники обыкновенной (Vaccinum vitis-idaea L.) -20 %; листьев крапивы двудомной (Urtica dioica L.) - 15 %; цветков ноготков лекарственных (Calendula officinalis L.) - 15 %.

Проведена оценка исходного растительного, сырья по действующей нормативной документации. По числовым показателям образцы сырья соответствуют требованиям НД.

Разработанная схема получения БАД к пище включает следующие основные стадии технологического процесса:

ТП. 1. Измельчение и просеивание растительного сырья;

ТП. 2.Получение готового продукта;

УМО. I. Фасовка и упаковка.

Проведен товароведческий анализ чая. Определены числовые показатели: экстрактивных веществ - не менее 20 %; влажности - не более \2 %; золы общей - не более 10 %; золы нерастворимой в 10 % НС1 - не более 2%; органической примеси - не более 2 %; минеральной - не более 1 %.

Фармакогностическо'е изучение чая «Байкальский — 6»..

Для установления критерия подлинности чая, содержащих растения, относящихся к различным морфологическим группам, макро- и микроскопическими методами установлены диагностические признаки.

Чай представляет собой смесь неоднородных частиц светло-зеленого цвета с желтовато-коричневыми, красновато-оранжевыми, оранжевыми, ярко-, или бледно-желтыми и беловатыми вкраплениями.

Микроскопические исследования позволили разделить компоненты чая по частоте встречаемости их диагностических признаков в микропрепаратах на три группы. Наиболее часто встречающимися видами сырья являлись: листья крапивы - в 96 % случаях, трава горца птичьего - в 92 %, цветки календулы - в 84 %; встречающиеся в каждом третьем препарате -листья брусники; редко встречающиеся — листья толокнянки.

Диагностические признаки компонентов чая соответствуют, описанным в ГФ XI изд., из них наиболее значимыми являются: форма клеток эпидермиса, толщина их стенок, тип устьичного аппарата (трава горца птичьего, листья толокнянки определяются преимущественно по этим признакам); наличие включений и пигментных клеток, характерной формы железок (листья брусники); опушенность (листья крапивы и цветки календулы) и наличие фрагментов с клетками, содержащими ярко оранжевые хромопласты (цветки календулы).

Химический анализ чая, проведенный с помощью общеизвестных принятых качественных реакций на отдельные группы БАВ, позволил сделать предварительное заключение о наличии основных классов природных соединений, таких как: флавоноиды, дубильные вещества, сапонины, фе-нологликозиды, полисахариды и др.

Для подтверждения наличия в составе чая соединений полифенольной природы (флавоноидов, дубильных веществ, фенологликозидов, фенол-карбоновых кислот) использован метод хроматографии на бумаге в нескольких системах растворителей и со стандартными образцами идентифицированы кверцетин - Лг -0,07 (1), Яг~ 0,68 (II); рутин - Яг~ 0,59 (I), ~ 0,46 (II); мирицетин - ~ 0,06 (I), Яг - 0,52 (И); гиперозид -0,40 (I), ~ 0,56 (II); лготеолин -~ 0,09 (I), 0,80 (II). Установлено наличие галловой кислоты Яг ~ 0,64 (I), Яг ~ 0,62 (II); кофейной кислоты ~ 0,38 (I), Яг ~ 0,85 (II); хлорогеновой кислоты ~ 0,78 (I), ~ 0,68 (II). Методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) подтверждено наличие рутина и кверцетина, арбутина, галловой и хлорогеновой кислот. Полученные данные подтверждены ВЭЖХ, который более информативен и позволяет охарактеризовать основные компоненты, содержащиеся в смеси. Полученные данные приведены на рис. 1

Хроматограмма ВЭЖХ водно-спиртового извлечения из чая «Байкальский - 6»

№ Время Площадь Площадь %

мин МУ*сек

1 137.5 3.33 0.01

2 221.9 4751.22 8.64

3 242.7 4637.30 8.43

5 310 8701.82 15.82

6 368.8 14582.91 26.51

9 653.6 379.90 0.69

13 862.7 9Г9.86 1.67

14 901.5 8^0150. 1.58

15 1090 5621.22 10.22

21 1968 475.36 0.86

Название

Олеанол.к-та

Арбутин Галловая к-та Хлорогеновая к-та Кофейная к-та Гесперидин Апигенин Лютелин-7-гликоз Рутин Кверцетин

Рис. 1

Изучен аминокислотный состав чая методом ВЭЖХ. Результаты приведены в таблице 1.

Таблица 1

Определение свободных и связанных аминокислот методом ВЭЖХ

Название аминокислоты Количественное содержание свободных АК Количественное содержание связанных АК

Пмоль Мкг Пмоль Мкг

Гистидин 4334 0,7 - -

Аргинин 12,54 0,0022 - •

Треонин 97.56 0,012 4,16 0,0005

Продолжение табл. 1

1 . 2 3 4 5

Алании 19,09 0,0017 39,34 0,0035

Пролин 117,0 0,013 4,858 0,0006

Цистин 38,79 0,0093 7,365 0,002

Тирозин 388,8 0,07 107,6 0,02

Валин 6,363 0,00075 8,571 0,001

Лизин 41.1 0,006 - -

Фенилаланин 23,46 0,0039 2,106 0,0007

Всего: 5078,7 0,82 178,82 0,28

На основании данных анализа, в чае «Байкальский - 6» содержатся аминокислоты, как связанные, так и свободные. Среди свободных аминокислот превалирует гистидин (84,47 %) и тирозин, а связанных: тирозин (54,57 %) и аланин (19,95 %).

Разработка методик количественного определения < содержания суммы флавоноидов и фенологликозидов в чае «Байкальский-6»

Принимая во внимание данные о широком спектре фармакологического действия фенольных соединений, в том числе флавоноидов и фено-логликозидов, а так же о наличии этих веществ в компонентах исходной растительной смеси, стандартизацию чая проводили по содержанию суммы флавоноидов и суммы фенологликозидов.

Разработке методики предшествовали исследования по установлению оптимальных условий экстракции (тип экстрагента, степень измельченно-сти, способ экстракции, температура, время контакта фаз и др.).

Количественное определение флавоноидов чая проводилось методом дифференциальной спектрофотометрии, преимуществами которой являются: высокая точность и экспрессность. Данный метод базируется на реакции комплексообразования флавоноидов с алюминия хлоридом, сопровождающийся батохромным сдвигом первой полосы поглощения флаво-ноидов. В качестве стандартного образца при количественном определении суммы флавоноидов в чае выбран рутин на основании совпадения максимумов дифференциальных спектров поглощения извлечений чая и стандарта (рис. 2).

Для проверки воспроизводимости методики проведено 11 определений содержания суммы флавоноидов одной серии чая.

Дифференциальные спектры поглощения

1 - РСО рутина

2 - водно-спиртовое извлечение из чая

Рис. 2

Метрологические характеристики представлены в таблице 2

Таблица 2

Метрологические характеристики методики количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на РСО рутина в чае

Относительная ошибка методики не превышает ± 4,35 %. Отсутствие систематической ошибки методики подтверждено «опытами с добавками» РСО рутина в навеску сырья. Результаты представлены в таблице 3

Таблица 3

Результаты опытов с добавками РСО рутина

№ Содержание суммы флаво-ноидов в 1 мл извлечения, г Добавлено ГСО рутина, г Должно быть, мг Найдено, г Относительная ошибка, %

1 0,145 10'3 0,0362 103 0,1812 103 0,1827 10"3 -0,83

2 0,145 10° 0,0724 10"3 0,2174 10'3 0,2149 10'3 + 1,15

3 0,145 10"3 0,1086 10"3 0,2536 10"3 0,2518 Ю"3 -0,73

Содержание суммы фенологликозидов в чае определяли хроматоспек-трофотометрическим методом, обладающим высокой чувствительностью и точностью в сравнении с методиками, описанными ГФ XI. В качестве стандартного образца для проведения анализа суммы фенологликозидов выбран арбутин, как доминирующий компонент в составе исходного сырья (рис. 3)

УФ спектры поглощений

1 - РСО арбутина

2 - водно-спиртовое извлечение из чая

Рис.3

Для определения воспроизводимости методики проведено 11 определений содержания суммы фенологликозидов в чае Метрологические данные представлены в таблице 4.

Таблица4

Метрологические характеристики методики количественного определения суммы фенологликозидов в пересчете на арбутин в чае

Относительная ошибка методики не превышает ± 6,92 % Отсутствие систематической ошибки методики подтверждено «опытами с добавками» РСО арбутина в навеску сырья» (табл 5).

С целью установления нормы содержания суммы флавоноидов и фе-нологликозидов в чае проведен количественный анализ по разработанным методикам в пяти сериях чая.

Таблица 5

Результаты опытов с добавками РСО арбутина

№ Содержание сум- Добавлено Должно Найдено Относи-

мы фенологлико- PCO арбу- быть арбутина, г тельная

зидов в 1 мл из- тина, г арбутина, ошибка.

влечения, г г %

1. 0,783 10 "3 0,195 10 "5 0,979 10° 0,994 10 -3 -1,57

2. 0,783 10"3 0,391 10 "3 1,744 10"3 1,146 10 -3 + 2,36

3 0,783 10"3 0,587 10 "3 1,307 10 3 1,35710"3 + 0,94

На основании приведенных результатов установлено, что содержание суммы флавоноидов и фенологликозидов в чае должно быть не менее 1,0 %; 6 ,0 % соответственно.

Установленные нормы числовых показателей включены в НД. Проведено исследование по установлению срока годности чая. При хранении в обычных условиях при температуре 20 °С показатели качества (описание, подлинность, потеря в массе при высушивании, содержание суммы флавоноидов и фенологликозидов) определялись через каждые 6 месяцев. Установлен предварительный срок годности 2 года.

Разработка сухого экстракта «Байкальский - 6», его таблетиро-ванной формы и их стандартизация.

В связи с тем, что флавоноиды и фенологликозиды являются основными действующими веществами исходной композиции чая «Байкальский -6», оптимизация процесса экстрагирования проводилась по установлению содержания суммы флавоноидов, фенологликозидов и экстрактивных веществ.

Изучены основные факторы, влияющие на полноту и скорость экстракции: тип и концентрация экстрагента, степень измельчения сырья, время достижения равновесной концентрации, гидродинамические условия.

На основании экспериментальных данных установлено, что максимальное извлечение БАВ из сырья обеспечивается следующими параметрами: степень измельчения для листьев толокнянки и брусники 1- 2 мм; для травы горца птичьего, листьев крапивы и цветков календулы - 3 мм; экстрагент - горячая вода (80-90 °С); соотношение сырье-экстрагент 1: 10(12); время первой экстракции - 2 ч; второй- 1ч.

По результатам проведенных исследований разработана технологическая схема получения сухого экстракта (рис. 4).

По разработанной схеме получено пять партий сухого экстракта.

Технологическая схема производства экстракта сухого

Рис.4.

Экстракт представляет собой порошок от коричневого до темно-коричневого цвета, со специфическим запахом, гироскопичен, комкуется. Растворим в горячей воде и в 20 - 30 % спирте.

Насыпная масса экстракта при свободной засыпке 0,835 г/см3, при уплотнении 0,65 - 0,69 г/см . Сыпучесть 1,1- 1,5 г/с, угол естественного откоса 35-45°. Потеря в массе при высушивании не должна превышать - 5 %.

Изучение химического состава сухого экстракта Проведено фотохимическое исследование экстракта сухого методами бумажной, тонкослойной хроматографии и ВЭЖХ. Установлено наличие в экстракте основных групп биологически активных веществ, содержащихся в исходном чае: флавоноидов (апигенина, кверцетина, рутина, мирицети-на, лютеолина, лютеолин-7 гликозида); фенологликозидов (арбутин), дубильных веществ, фенол карбоновых кислот (галловой, кофейной, хлоро-геновой);

Хроматограммы ВЭЖХ извлечений из сухого экстракта представлены на рис. 5

Хроматограмма ВЭЖХ сухого экстракта

№ Время мин Площадь МУ*сек Площадь Название

1 137.5 3.33 001 Олеаноловая к-та

2 221.9 4751.22 8.64 Арбутин

3 242.7 4637.30 8.43 Галловая к-та

5 310 8701.82 15.82 Хлорогеновая к-та

6 368.8 14582.91 26.51 Кофейная к-та

9 653.6 379.90 0.69 Гесперидин

13 862.7 919.86 1.67 Апигенин

14 901.5 870.50 1.58 Лютелин-7-гликоз

15 1090 5621.22 10.22 Рутин

21 1968 475.36 0.86 Квериетин

Рис. 5.

На основании проведенных исследований можно сделать следующие выводы: в сухом экстракте, полученном из смеси растений чая «Байкаль-ский-6» содержатся флавоноидные вещества, идентифицированные по времени' удерживания стандартных растворов. Методом внутренней стандартизации определено, что наибольшее количество среди флавоноидов в процентном отношении приходится на рутин (10,22 %), среди фенолкар-боновых кислот - на кофейную кислоту (26,51 %), хлорогеновую -15,82 %; и 8,64% среди обнаруженных веществ занимает арбутин.

Разработка методик количественного определения суммы флавоноидов и фенологликозидов в сухом экстракте.

При разработке методик количественного определения был учтен опыт разработки в чае: стандартизация сухого экстракта и проводилась спектрофотометрическим методом по сумме флавоноидов и хроматоспек-трофотометрическим методом по сумме фенологликозидов.

В качестве стандартных образцов выбраны рутин (в качестве аналитической выбрана длина волны 412 нм) и арбутин соответственно (выбранная аналитическая длина волны 285 нм), максимумы дифференциальных спектров которых совпадают с максимумами дифференциальных спектров растворов сухого экстракта.

Дифференциальные спектры поглощения раствора экстракта и РСО приведены на рис. 6.

Дифференциальные спектры поглощения сухого экстракта и РСО рутина._

08-

05.

04-

? 1 р 02- i-JS" р! 1

X Ü2-•04- 2

4Ю • an - fOO 7Я». ЯВ - ЯП 1

1 - PCO рутина

2 — сухой экстракт

Рис. 6,

Для расчета метрологических характеристик методики проведены определений в одной серии в 11 повторностях (табл. 6).

Таблица 6

Метрологические характеристики методики количественного определения . суммы флавоноидов в пересчете на рутин в сухом экстракте

Как видно из данных таблицы, относительная ошибка единичного определения с 95 % вероятностью составляет ± 3,12 для экстракта, что свидетельствует о воспроизводимости методики. Отсутствие систематической ошибки хметодики доказано при помощи опытов с добавками РСО рутина в навеску сырья.

Для определения метрологических характеристик разработанной методики содержания суммы фенологликозидов проведено 11 независимых определений в одной серии экстракта (табл. 7).

Таблица 7

Метрологические характеристики методики количественного определения суммы фенологликозидов в пересчете на арбутин в сухом экстракте

Относительная ошибка единичного определения с 95 % доверительной вероятностью составляет ± 4,87. Отсутствие систематической ошибки методики доказано при помощи опытов с добавками РСО арбутина в навеску экстракта.

По разработанным методикам проведен количественный анализ пяти серий сухого экстракта. Содержание суммы флавоноидов и фенологлико-зидов в проанализированных образцах колебалось от 2,73 - 3,17 %; от 13,79 - 17,66 % соответственно.

Проведены исследования по установлению срока годности сухого экстракта. При хранении в обычных условиях (температура 20°С), показатели качества определяются через каждые шесть месяцев. На основании полученных данных установлен предварительный срок годности - 1 год.

Разработка лекарственной формы - таблеток.

Исходя из того, что таблетки имеет ряд преимуществ перед другими готовыми формами, разработана технологическая схема изготовления таблеток.

Оптимальный состав таблетки экстракта сухого 0,05 г подобран в учетом показателей качества: прочности, распадаемости, растворения.

Состав на одну таблетку:

Экстракта «Байкальский - 6» сухого в пересчете на абсолютно сухое вещество

Сахара молочного (ОСТ 4963-85) Вспомогательных веществ (крахмал картофельный, магний стеариновокислый, поливинилпирролидон).

- 0,040 г

- 0,062 г до получения таблетки массой 0,2 г

Выбор наполнителей проводили на основании получения удовлетво-. рительных характеристик таблеточной массы.

Таблетки круглой формы с плоской поверхностью, с насечкой от серого до коричневато-серого цвета. Масса одной таблетки - от 0,1850 до 0,2150 г. Прочность 2,5 - 5 кг. Распадаемость не более 15 мин.

По разработанной технологической схеме изготовлено пять серий таблеток.

Разработка методик стандартизации.

В связи с тем, что фармакотерапевтический эффект экстракта в основном обусловлен наличием в нем суммы фенологликозидов, по содержанию этих веществ и ведется стандартизация таблеток.

За основу приняли хроматоспектрофотометрический метод количественного определения суммы фенологликозидов в экстракте сухом.

Метрологические характеристики методики приведены в таблице 8

Таблица 8

Метрологические характеристики методики количественного определения суммы фенологликозидов в пересчете на арбутин в таблетках -

Относительная ошибка единичного определения составляет ± 5,66 %.

Разработанные показатели качества: описание внешнего вида, подлинность, потеря в массе при высушивании, содержание фенологликози-дов в пересчете на арбутин включены в нормативные документы.

При хранении в обычных условиях установлен предварительный срок годности-1 год.

выводы

1. На основании данных литературы о химическом составе растений, применении их в научной и традиционной медицине, их фармакологической направленности и состояния сырьевой базы составлена рациональная растительная композиция, как биологически активная добавка к пище в виде чая.

2. На основании фармакогностического изучения выявлены диагностические признаки пяти компонентов чая «Байкальский -6» при их совместном присутствии. Установлены числовые показатели, введенные в нормативные документы. Исследован качественный состав чая методом хроматографии на бумаге, в тонком слое сорбента и методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, при этом идентифицированы: апиге-нин, лютеолин, кверцетин, рутин, гиперозид, мирицетин; фенолкарбоно-вые кислоты: хлорагеновая, галловая; фенологликозид: арбутин. Установлено наличие свободных и связанных аминокислот. Разработаны методики количественного определения действующих веществ по сумме флавонои-дов и фенологликозидов в пересчете на рутин и арбутин спектрофотомет-рическим методом в чае.

3. Разработан способ получения экстракта сухого. Исследовано влияние основных факторов на процесс экстрагирования биологически активных веществ из чая. Установлены оптимальные условия-экстракции: тип экстрагента - горячая вода с температурой 80 - 90 °С; соотношение 1(10-12); кратность - 2; время первой экстракции - 2 Часа, второй- 1час. На основе экстракта сухого разработан состав и технология изготовления таблеток.

4. Изучен качественный и количественный состав сухого экстракта и таблеток методом хроматографии на бумаге, в тонком слое сорбента и высокоэффективной жидкостной хроматографии, при этом идентифицированы: апигенин, лютеолин, кверцетин, рутин, гиперозид, мирицетин; фенол-карбоновые кислоты: хлорагеновая, галловая; фенологликозид: арбутин. Разработаны методики стандартизации по сумме флавоноидов и фенолог-ликозидов в пересчете на рутин и арбутин в сухом экстракте и таблетках.

5. Разработаны нормативные документы Технические условия (ТУ), технологические инструкции (ТИ), рецептура на БАД к пище - чай, сухой экстракт и таблетки «Байкальский - 6».

По теме диссертационной работы опубликованы следующие

работы:

1. Югдурова Е. Д., Маркарян А. А., Николаева Г. Г., Даргаева Т. Д. Разработка методики количественного определения суммы флавоноидов в чае «Байкальский - 6» //Биологически активные добавки в профилактической и клинической медицине: Тезисы докладов научно-практической конференции. -Улан-Удэ. 2003. - С. 99-100.

2. Югдурова Е. Д., Маркарян А. А., Николаева Г. Г., Даргаева Т. Д. Изучение содержания аминокислот в чае «Байкальский - 6» методом ВЭЖХ //Биологически активные добавки в профилактической и клинической медицине: Тезисы докладов научно-практической конференции. -Улан-Удэ. 2003.-С. 110-111.

3. Югдурова Е. Д., Маркарян А. А., Мондодоев А. Г. Антиоксидант-ное действие многокомпонентного чая растительного происхождения неф-ропротекторного действия //Материалы международной научной конференции. -Сухе-Батор. 2003. С. 35-37.

4. Югдурова Е. Д., Маркарян А. А., Мондодоев А. Г. Перспективы поиска и разработки биологически активных добавок для больных с патологией органов мочевыделительной системы //Материалы международной научной конференции. - Сухе-Батор. 2003. С. 57-58.

5. Югдурова Е. Д., Николаева Г. Г. , Маркарян А. А., Даргаева Т. Д., Нагаслаева Л. А., Башкуева Ю. Л., Мондодоев А. Г. Стандартизация сухого экстракта «Байкальский -6» //У1 Симпозиум по фенольным соединениям: Тезисы докладов. - Москва. 2004. С. 110.

6. Югдурова Е. Д., Николаева Г. Г., Нагаслаева Л. А., Николаев С. М., Маркарян А. А. Разработка методики количественного определения суммы флавоноидов методом УФ - спектрофотометрии в чае «Байкальский - 6» //Сибирский медицинский журнал, №4. - Иркутск. 2004. С. 74 - 76.

7. Патент № 2004101614/15(001813) от 22.01.2004: Средство «Чай Байкальский - 6», обладающее диуретической активностью и способ его получения.

Подписано в печать 28.05.2004 г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Объем 13 печ. л. Тираж 100. Заказ № 108.

Отпечатано в типографии Изд-ва БНЦ СО РАН, 670047 г. Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, 6.

»126 34

Актуальность темы. Актуальность разработки и стандартизации растительных средств, предназначенных для профилактики и вспомогательной терапии различных нарушений функций почек и мочевыводящих путей, обусловлена широким распространением, особой тяжестью их течения, приводящим к потере трудоспособности населения. В настоящее время до 90 % мужчин старше 60 лет страдают заболеваниями почек, мочевого пузыря, хроническими простатитами, или аденомой предстательной железы. До 70 % женщин в возрасте старше 50 лет страдают почечно-каменной болезнью, пиелонефритами, циститами (Ужегов, 1999). По данным ВОЗ воспалительные заболевания мочевых путей у детей занимают второе место после ОРВИ. Около 15 % женщин в замужестве, беременности и родах страдают воспалительными заболеваниями мочеполовой системы (Корсун, Суворов, 1999).

Медико-социальная значимость болезней почек помимо их широкой распространенности обусловливается тем, что они являются одной из ведущих причин инвалидизации и смертности в молодом возрасте. (Маждраков,1980; Тареев, 1983). Растет число токсических, в том числе алкогольных и лекарственных повреждений почек, преимущественно развивающихся у трудоспособной части населения, отмечается развитие лекарственной устойчивости патогенной микрофлоры и развитие побочных эффектов, среди которых наиболее значимой является нефротоксичность антибиотиков. Следует отметить, что для профилактики и лечения заболеваний мочевыделительной системы применяется ограниченный набор лекарственных средств растительного происхождения, не удовлетворяющий возросшие в последние годы потребности населения.

В этой связи, особый интерес представляют биологически активные добавки (БАД) к пище, являющиеся эффективной формой первичной и вторичной профилактики, а так же применяемые в комплексном лечении многих хронических заболеваний с целью повышения неспецифической резистентности организма к воздействию неблагоприятных факторов среды и регуляции функциональной активности организма.

Заслуживают внимания легкорастворимые чаи из сухих экстрактов, при получении которых обеспечивается максимальный выход биологически активных веществ. К преимуществам сухих экстрактов относятся также удобство при применении больными и стойкость при хранении.

Таким образом, исследования по созданию отечественных комплексных профилактических средств и БАД из растительного сырья, доступных широким массам населения, безопасных при их длительном применении является актуальной задачей.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является разработка и стандартизация биологически активной добавки к пище в виде чая, экстракта сухого «Байкальский - 6» и его таблетированной формы, рекомендуемых для профилактики заболеваний мочевыделительной системы.

Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи:

- обосновать и разработать состав многокомпонентной растительной композиции для профилактики заболеваний мочевыделительной системы;

- провести фармакогностическое изучение исходной растительной композиции;

- разработать способ получения биологически активной добавки к пище «Байкальский - 6» в виде чая, его сухого экстракта и готовой формы;

- определить качественное и количественное содержание биологически активных веществ в сухом экстракте и готовой форме (таблетках);

- разработать нормативные документы на рекомендуемые биологически активные добавки к пище с целью внедрения их в производство (технические условия, технологические инструкции и рецептуры).

Научная новизна работы. Разработан и обоснован состав многокомпонентной растительной композиции чая «Байкальский -6». Рациональность рецептуры подтверждена сведениями о клинической эффективности и безопасности его состава.

Определены критерии подлинности чая «Байкальский -6», установлены числовые показатели, внесенные в нормативные документы. Доказано наличие биологически активных веществ в исходной растительной композиции с помощью современных физико-химических методов анализа.

Теоретически обоснован и экспериментально подтвержден способ получения сухого экстракта и на его основе готовой формы (таблеток). С учетом химического состава подобраны оптимальные параметры технологического процесса, выявлены закономерности экстрагирования биологически активных веществ.

Разработаны методики качественного и количественного анализа чая «Байкальский - 6», его сухого экстракта и готовой формы по сумме флавоноидов в пересчете на рутин и фенологликозидов в пересчете на арбутин методом спектрофотометрии.

На основании полученных результатов составлены нормативные документы на биологически активные добавки: рецептуры, технические условия (ТУ), технологические инструкции (ТИ).

Практическая значимость работы. На основании проведенных исследований разработаны и внедрены:

Биологически активная добавка к пище чай «Байкальский -6», РУ № 005463.Р.643.06.2003 от 23.07.2003.

Получено положительное решение о выдаче патента на изобретение по заявке №2004101614/15(001813) от 22.01.2004: Средство «Чай Байкальский-6», обладающее диуретической активностью и способ его получения.

Наработано пять опытных серий сухого экстракта и таблеток.

Разработаны и утверждены:

- Технические условия ТУ 9171-19-03533369-04, технологическая инструкция (ТИ) по производству биологически активной добавки к пище в виде сухого экстракта «Экстракт Байкальский-6».

- Технические условия ТУ 9361-020-03533369-04, технологическая инструкция (ТИ) по производству биологически активной добавки к пище «Таблетки экстракта Байкальский - 6».

Чай «Байкальский -6» внедрен в производство (акты о внедрении Центра восточной медицины Республики Бурятия, 2004 г).

Апробация работы и публикации. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на:

VI Симпозиуме по фенольным соединениям (Москва, 2004); научно-практической конференции «Биологически активные добавки в профилактической и клинической медицине» (Улан-Удэ, 2003); заседании объединенного семинара лабораторий экспериментальной фармакологии, медико-биологических исследований и лаборатории безопасности биологически активных веществ ИОЭБ СО РАН (Улан-Удэ, 2003); международной научной конференции «Состояние эпидемиологии туберкулеза в приграничных районах территории Монголии и России» (Сухэ-Батор, 2003);

Основное содержание диссертации опубликовано в 7 научных работах; ТУ на Б АД к пище чай «Байкальский -6»; ТИ чай «Байкальский -6»; ТУ на «Экстракт Байкальский - 6» сухой; ТУ на «Таблетки экстракта Байкальский - 6».

Связь задач исследований с проблемным планом научного совета по фармакологии и фармации. Работа выполнена в соответствии с планом научных исследований Отдела биологически активных веществ Института общей и экспериментальной биологии СО РАН по программам: «Регуляция свободнорадикальных процессов при повреждении органов пищеварения с использованием биологически активных веществ из арсенала традиционной медицины» и «Лекарственные растения Сибири и Дальнего Востока», являющейся разделом (6.3) Государственной программы «Сибирь» на период 1986-2006 гг.

На защиту выносятся:

- результаты теоретического, экспериментального, клинического обоснования разработки состава чая «Байкальский - 6», экстракта сухого и готовой формы (таблеток), рекомендуемых для профилактики и вспомогательной терапии заболеваний мочевыделительной системы; результаты исследований по установлению показателей подлинности, качественного и количественного определения биологически активных веществ в чае, экстракте сухом и готовой форме.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа выполнена на 164 страницах машинописного текста: состоит из введения, обзора литературы (глава 1), экспериментальной части (3 глав), 38 таблиц и 34 рисунков, общих выводов и списка литературы (включено 172 источника, из которых 24 - на иностранном языке) и приложений.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. На основании данных литературы о химическом составе растений, применении их в научной и традиционной медицине, их фармакологической направленности и состояния сырьевой базы составлена рациональная растительная композиция, как биологически активная добавка к пище в виде чая.

2. На основании фармакогностического изучения выявлены диагностические признаки пяти компонентов чая «Байкальский -6» при их совместном присутствии. Установлены числовые показатели. Исследован качественный состав чая методом хроматографии на бумаге, в тонком слое сорбента и методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, при этом идентифицированы: апигенин, лютеолин, кверцетин, рутин, гиперозид, мирицетин; фенолкарбоновые кислоты: хлорогеновая, галловая; фенологликозид: арбутин. Установлено наличие свободных и связанных аминокислот. Разработаны методики количественного определения действующих веществ по сумме флавоноидов и фенологликозидов в пересчете на рутин и арбутин спектрофотометрическим методом в чае.

3. Разработан способ получения экстракта сухого. Исследовано влияние основных факторов на процесс экстрагирования биологически активных веществ из чая. Установлены оптимальные условия экстракции: тип экстрагента - горячая вода с температурой 80 - 90 °С; соотношение 1(10-12); кратность - 2; время первой экстракции - 2 часа, второй- 1час. На основе экстракта сухого разработан состав и технология изготовления таблеток.

4. Изучен качественный и количественный состав сухого экстракта и таблеток методом хроматографии на бумаге, в тонком слое сорбента и высокоэффективной жидкостной хроматографии, при этом идентифицированы: апигенин, лютеолин, кверцетин, рутин, гиперозид, мирицетин; фенолкарбоновые кислоты: хлорогеновая, галловая; фенологликозид: арбутин. Разработаны методики стандартизации по сумме флавоноидов и фенологликозидов в пересчете на рутин и арбутин в сухом экстракте и таблетках.

5. Разработаны нормативные документы Технические условия (ТУ), технологические инструкции (ТИ), рецептура на БАД к пище — чай, сухой экстракт и таблетки «Байкальский — 6».

Заключение

Широкое распространение заболеваний почек и мочевыводящих путей в связи с неблагополучными факторами среды, ухудшением качества питания, сложность этиологии и патогенеза обусловливают необходимость поиска и создания эффективных профилактических средств растительного происхождения специфического противовоспалительного и диуретического действия. Перспективным направлением для фармакопрофилактики является разработка и стандартизация БАД к пище направленного действия, преимущество которых, в отличие от JIC - в возможности массового применения при практически отсутствующих противопоказаниях.

Получение сухих экстрактов, доведение до лекарственной формы удобной для употребления пациентом, способствует рациональному, экономичному использованию растительного сырья, позволяет обеспечить стандартизацию лекарственного средства, как на стадии изготовления, так и на стадии получения конечного продукта, повышает точность дозирования, удобство при хранении и повышение их устойчивости.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

ПОЯСНЕНИЯ К ЭКСПЕРИМЕНТУ

В качестве объектов исследования служило растительное сырье, заготовленное в различных районах республики Бурятия и полученное от ОАО «Красногорсклексредства»:

Folia Urtica dioica L.); листья толокнянки обыкновенной - ГФ XI изд., вып.2. ст. 26

Folia Arctostaphylos uva ursi L.); цветки ноготков лекарственных - ГФ XI изд., вып.2. ст. 5

Flores Calendula officinalis L.) трава горца птичьего - ГФ XI изд., вып.2. ст. 56

Herba Polygonum aviculare L.).

На основе вышеперечисленных растений создана растительная композиция пищевой добавки для приема с пищей в виде чая, сухого экстракта и его готовой формы (таблеток) «Байкальский - 6».

Измельчение воздушно-сухого сырья проводили на мельнице, фракционирование порошков измельченного сырья осуществляли просеиванием последовательно через набор сит с размерами отверстий: 1,0- 10,0 мм.

Отбор средних и аналитических проб проводили согласно ГФ XI изд., вып. 1, стр. 273.

Микроскопические исследования в чае проводили по методике, описанной в ГФ XI изд., вып.1, стр.277.

Исследования проводили на микроскопах БИОЛАМ-С11 и МБИ-6 с окулярами х8, хЮ, х15 и объективами х15, х20, х40, фотосъемку листья брусники

Folia Vaccinum vitis-idaea L.); листья крапивы двудомной

-ГФ XI изд., вып.2. ст. 27

-ГФ XI изд., вып.2. ст. 25 осуществляли на микроскопе МБИ-6 с пленочной насадкой и с использованием фотопленки «Свема-64».

Сгущение полученных извлечений на стадии экспериментальных исследований проводилось на вакуум-выпарном ротационном испарителе марки ИРМ-1.

Исследование качественного состава чая и сухого экстракта «Байкальский - 6» проводили методом одномерной и двумерной хроматографии на бумаге марки «Ленинградская - М» и "Filtrak" FN-6, FN-17 (Германия), а также тонкослойной хроматографии на пластинках "Kieselgel 60, F-254" размером 20 х 20 см., фирмы Merck (Германия) H"Silufol".

Хроматографирование выполняли в определенной системе растворителей при температуре + (19-23) °С в герметически закрытых стеклянных камерах. Нанесение исследуемых растворов на хроматографические пластины и бумажные полосы осуществляли при помощи капилляров и микропипеток.

Растворители для хроматографии и реактивы для получения производных использовали марки ХЧ или ЧДА. Соотношение растворителей учитывали в объемных частях. Все величины Rfi обнаруженных соединений являются средними из пяти измерений.

Системы растворителей:

1. н-бутанол-уксусная кислота- вода (4:1:2);

2. уксусная кислота 15 %;

3. хлороформ-метанол 95:5;

4. хлороформ-метанол 9:1;

5. хлорофом-этанол 7:3;

6. этилацетат-метилэтилкетон-муравьиная кислота - вода 50:30:10:10;

7. этилацетат-этанол 95:5

8. Этилацетат-уксусная кислота-вода 5:1:1

Обнаружение пятен у-пироновых веществ производили после высушивания хроматограмм просмотром в фильтрованном УФ-свете (фильтр X max 254 нм) до и после обработки 2 % спиртовым раствором алюминия хлорида. Флавоноиды с данным реактивом при нагревании (100 °С) и просмотре в УФ-свете дают желтое окрашивание (до обработки коричневое).

Фенолкарбоновые кислоты обнаруживали по их собственной флуоресценции голубого или фиолетового цвета в парах аммиака.

Анализ фенологликозидов проводили в системе растворителей 5 и 6, для проявления использовали 10 % водно-спиртовый раствор едкого натра и свежеприготовленный диазоректив (3,0 сульфаниловой кислоты, 6 мл концентрированной соляной кислоты, 14 мл н-бутанола и 200 мл очищенной воды).

УФ- спектры снимали на приборах «Gelios», использую следующие растворители: 96 % спирт этиловый, 60 %, 30 % спирт этиловый и воду. Измерение оптической плотности в методиках количественного определения проводили на спектрофотометре СФ-26 и СФ - 46 (Россия) в кюветах с толщиной поглощающего слоя 10 мм.

Качественный и количественный анализ фенольных соединений проводили методом ВЭЖХ на высокоэффективном жидкостном хроматографе фирмы "Gilson" (Франция) с последующей компьютерной обработкой результатов исследования с помощью программы "Мультихром" для "Windows".

В качестве неподвижной фазы использована металлическая колонка Platinum EPS С-18 размером 4,6x250 мм LUNA С-18, в качестве подвижной фазы - метанол - вода - фосфорная кислота 40:60:0,5. Анализ проведен методом градиентного элюирования при комнатной температуре. Скорость подачи элюента 1 мл/мин., анализ проведен при комнатной температуре.

Продолжительность анализа 50,75 минут, детектирование проводилось с помощью УФ-детектора при длине волны 254 нм.

При разработке методик количественного определения были использованы хроматографически чистые вещества - государственные стандартные образцы (РСО): рутин-стандарт - ФС 42 -2508-87, ВИЛР ТУ 9369-141 - 048668244; арбутин - Fluka, кат. №10960, СО ВИЛАР (ТУ 9363-133-04668-44-01); галловая кислота - Fluka, кат. №48630; кофейная кислота -Sigma, кат. №0625; хлорогеновая кислота — Sigma, кат. №3378; апигенин - Fluka, кат. №10748; гесперидин - Sigma, кат. №04125; лютеолин РСО - ФС 42313095; лютеолин-7-гликозид РСО - ФС 42-3130-95, кверцитин - ФС 42-29079 ВИЛАР ТУ 9369-128-04868244-03; гиперозид РСО - ФС 42-0106-03. м.

Приготовление раствора РСО рутина: около 0,05 г (точная навеска) РСО рутина, предварительно высушенного при температуре 130-135 °С в течение 3 часов растворяют в 85 мл 96 % спирта этилового в колбе вместимостью 100 мл, доводят 96 % спиртом до метки и перемешивают. Срок годности раствора 1 месяц.

Приготовление комплекса РСО рутина с алюминия хлоридом: в мерную колбу, вместимостью 25 мл помещают 1 мл приготовленного РСО рутина, прибавляют 1 мл 2 % раствора алюминия хлорида, доводят объем раствора 60 % спиртом этиловым до метки и перемешивают. В качестве раствора сравнения используют раствор, содержащий 1 мл приготовленного раствора РСО рутина, доведенный 60 % спиртом этиловым до метки в мерной колбе вместимостью 25 мл.

Приготовление 2 % спиртового раствора алюминия хлорида: 2 ,0 г алюминия хлорида шестиводного (ГОСТ 3759-75) помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в 50 мл 96 % спирта и доводят объем раствора этим же растворителем до метки. Срок годности раствора - 1 месяца.

Приготовление раствора РСО арбутина: около, 0,05 г (точная навеска) РСО арбутина (ТУ 9363-133-04668-44-01), предварительно высушенного при температуре (72-78)°С в течении 2 часов, растворяют в 96 % спирте этиловом в мерной колбе вместимостью 50 мл, доводят объем раствора до метки 96 % спиртом этиловым и перемешивают. Срок годности раствора 1 месяц.

Определение аминокислот.

Содержание аминокислот определяли методом ВЭЖХ, с использованием хроматографа "Gilson - 321", Франция и спектрофотометрического детектора JA SCO ДЖААСО 821 - FP, США.

Использованный метод определения аминокислот (AccQ Tag) акью таг основан на применении дериватизационного реагента, специально синтезированного для анализа аминокислот (6-minoqinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate (ACQ), представляющего собой N-hydroxysuccinimide- activated hetrocycylic carbamate - новый класс аминодериватизирующих химикатов. Реагент ACQFluor превращает как первичные, так и вторичные аминокислоты в стабильные флюоресцирующие дериваты. Излишек реагента быстро гидролизуется, продуцируя 6-aminoqinolin AMQ N-hydroxysuccinimide (NHS) и двуокись углерода, который не мешает разделению и детекции. Реагент ACQFluor готовили путем растворения порошка реагента в ацетонитриле при температуре 55 °С, в термостате в течение 10 минут.

Процесс дериватизации состоит в добавлении реагента к образцу с определённым рН и последующем нагреве. Обычные буферы и детергенты имеют слабое влияние на реакцию и на воспроизводимость результатов.

В качестве неподвижной фазы использована металлическая колонка Waters AccQ Tag размером 3,9 х150 мм. В качестве подвижной фазы использовали:

Элюент А: натрия ацетат- кислота фосфорная конц.-триэтиламин -вода - EDTA (19%:6-7%:1-2%:72-73%:0,1 %);

Элюент В: ацетонитрил;

Элюент С: вода.

Метод элюации - градиентный, скорость подачи элюента - 1 мл/мин., анализ проводили при температуре 37° С. Детектирование проводилось с помощью спектрофотометрического детектора JA SCO ДЖААСО 821 -FP, США. Расчет количественного содержания аминокислот производили методом абсолютной калибровки с помощью компьютерной программы «Мультихром» для "Windows" в пересчете на количество образца, взятого для анализа в мг. Для этого параллельно вводили в хроматограф дериваты калибровочного стандарта аминокислот, содержащих 100 пМ\мкл каждой аминокислоты, за исключением цистина (50 пМ\мкл). Дериваты аминокислот готовили аналогично деривату исследуемого образца.

Для разработки состава гранул и таблеток использованы вспомогательные вещества, разрешенные к медицинскому применению: метилцеллюлоза водорастворимая - ТУ 2231-107-057442755-96, поливинилпирролидон низкомолекулярный - ФС 42-1194-98, крахмал картофельный ГОСТ 7699-78, вода очищенная ФС 42-2619-89, стеарат кальция - ТУ6-09-129- 75, тальк медицинский - ГОСТ 7669-68.

Использованы физические методы для определения технологических свойств субстанций: метод определения сыпучести, фракционного состава (ситовой метод - ГФ XI, вып.2, С. 17), объемной насыпной плотности, микроскопический метод для определения внешнего вида. Методы определения физико-механических параметров качества таблеток, внешнего вида, прочности на истирание, средней массы, распадаемости. Разработка технологии осуществлялась с применением следующих методов: прямого прессования, влажного гранулирования на оборудовании фирмы «Erweka».

Отработка технологии получения сухих экстрактов осуществлялось на оборудовании экспериментального завода ГУП «ВИЛАР»: н/ст экстрактор вместимостью 50 л, с мешалкой лопастного типа при 60 оборотах в минуту, с подогревом и охлаждением (Волго-Вятского СНХ), вакуум-выпарной аппарат (Чехия), производительностью 20 л/ч, сепаратор, гу шкаф вакуум-сушильный (Польша) с рабочим давлением -1-0-1,5 кгс/см " Статистическая обработка результатов анализа Статистическая обработка результатов анализа проводится при - п повторных анализов однородного материала, где:

- число измерений;

- данные отдельных определений;

- среднее значение из п определений;

- число степеней свободы;

- средняя квадратичная ошибка отдельного определения (выборочное стандартное отклонение);

- средняя квадратичная ошибка среднего арифметического или стандартное отклонение среднего результата;

- коэффициент надежности (доверительная вероятность);

- критерий Стьюдента, зависящий от надежности и числа определений;

- абсолютная ошибка среднего арифметического;

- относительная ошибка результата отдельного определения. п

Xi

Ex. х = n f=n-l sJ(Vx)2~

S = x

Vn

T(p,f)

Ax = t(p,f)-Sx

Дх- 100 p

OTH

Фармакологический скрининг, специфическая активность биологически активных добавок к пище проводили на соответствующих моделях, острая и хроническая токсичность (к. б. н. 3. Г. Самбуева), эмбриотоксичность и тератогенность ( д.б.н. И. О. Убашеев). Работы проведены в Отделе биологически активных веществ Института общей и экспериментальной биологии СО РАН под руководством д.м.н., проф. С. М. Николаева.

ГЛАВА II. РАЗРАБОТКА СПОСОБА ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОЙ ДОБАВКИ К ПИЩЕ «БАЙКАЛЬСКИЙ - 6» В ВИДЕ ЧАЯ.

2.1. Обоснование подбора композиции фиточая.

В настоящее время существуют различные подходы к составлению комплексных растительных средств. Первый из них предполагает достижения суммирования, или же взаимного усиления позитивных свойств используемых сочетаний, другой направлен на ослабление побочного действия одного из компонентов, третий - преимущественно эмпирический, основан на подборе компонентов исходя из данных об их химическом составе, фармакологической активности, применения в научной и народной медицине [14, 47, 66, 102].

Оптимальным целесообразно считать подбор растений, действие которых направлено на устранение причины заболевания, уменьшение патогенетических изменений, усиление защитных и компенсаторно-приспособительных механизмов организма. Известно, что многокомпонентные растительные средства имеют более широкий спектр терапевтического действия, чем отдельные его компоненты [65, 66, 87, 113].

На основании предварительного фармакологического скрининга, проведенного в лаборатории экспериментальной фармакологии (зав. лаб. д. м. н., проф. С. М. Николаев) ИОЭБ и данных литературы в качестве объекта исследования выбрана смесь из пяти видов лекарственного растительного сырья: травы горца птичьего, листьев толокнянки и брусники обыкновенной, листьев крапивы двудомной и цветков ноготков лекарственных.

Доля каждого растительного компонента и рациональность их сочетания определялась с учетом механизмов развития болезней почек и мочевыводящих путей, безопасности (возможности их длительного применения с минимальными побочными эффектами), официнальности и состояния сырьевой базы ингредиентов.

Горец птичий - Polygonum aviculare L., сем. гречишных — Polygonaceae. Известен под названиями птичья гречиха, гусиная травка, травка-муравка, спорыш.

В траве содержатся флавоноиды до 9,4 %: авикулярин, гиперин, изорамнетин, мирицетин, кверцитрин, кверцетин, кемпферол; дубильные вещества; витамины: аскорбиновая кислота, витамины К, Е; каротин; фенолкарбоновые кислоты: кофейная, хлорогеновая, п-кумаровая, галловая; кумарины: скополетин, умбеллиферон; эфирные масла; антрахиноны и соединения кремниевой кислоты [9, 96].

Биологически активные вещества горца птичьего обладают капилляроукрепляющей, фунгицидной, антибактериальной, противовоспалительной, диуретической, противовирусной, спазмолитической, радиопротекторной, противоатеросклеротической, гипоазотемической, кардиостимулирующей, антиоксидантной, противо-вопухолевой, гепатопротекторной, кровоостанавливающей, желчегонной, гипогликемической и тонизирующей активностью [79, 139, 157]. В традиционной медицине настой травы применяют в качестве кровоостанавливающего, противовоспалительного средства и способствующего отхождению конкрементов при камнях в почках и мочевом пузыре. Трава входит в состав сбора по прописи Здренко, используемого при злокачественных новообразованиях [80, 92, 136]. Флавоноидные соединения кремния и дубильные вещества из горца птичьего уменьшают проницаемость стенок сосудов, повышают свертываемость крови. Галеновые препараты из травы горца птичьего повышают диурез, выводят с мочой избыток ионов натрия и хлора, увеличивают фильтрацию в почечных клубочках, что препятствует образованию мочевых камней. Спорыш - кладовая белков и Сахаров [79, 96, 125, 155].

Толокнянка обыкновенная - Arctostaphylos uva-ursi (L) Spreng., сем. вересковых - Ericaceae. Действующие вещества: фенологликозиды: арбутин (до 17,4 %), метиларбутин, гидрохинон, пицеин и др.; дубильные вещества гидролизуемой группы (7,2 - 41,6 %); флавоноиды: гиперозид, кверцетин, кемпферол, мирицетин, цианидин; фенолкарбоновые кислоты: галловая, эллаговая, протокатеховая; витамин С; каротин; иридоиды; органические кислоты: муравьиная, хинная, яблочная и др.; микроэлементы: марганец, алюминий, медь, серебро, барий, селен [32, 34, 50, 52, 70, 145, 154, 163].

Отвар листьев в традиционной медицине применяют как мочегонное, дезинфицирующее и противовоспалительное средство при заболеваниях мочевыводящих путей. В научной медицине галеновые препараты назначают в качестве антисептических, вяжущих, и диуретических средств при пиелитах, циститах, уретритах. Входит в состав мочегонных чаев [16, 98, 162].

Брусника обыкновенная - Vaccinium vitis-idaea L., - сем. вересковых - Ericaceae. Листья брусники содержат фенолы и их производные: арбутин (до 9 %), метиларбутин, свободный гидрохинон, пирозид; флавоноиды: гиперозид, кверцитрин, изокверцитрин, рутин, авикулярин, кемпферол; дубильные вещества конденсированного ряда; фенолкарбоновые кислоты: хлорогеновая, кофейная, изохлорогеновая, неохлорогеновая и феруловая; иридоиды; тритерпеноиды; бензойная и урсоловая кислоты; витамины С и РР [20, 26, 34]. Сухой экстракт обладает желчегонным действием [26]. В научной медицине применяют, как мочегонное, противовоспалительное, антисептическое средство при пиелонефритах, циститах, уретритах и при мочекаменной болезни [9, 81].

Крапива двудомная - Urtica dioica L., - сем. крапивных - Urticaceae.

Листья содержат до 5 % хлорофилла, аскорбиновую кислоту, витамин К, витамины группы В; флавоноиды (до 1,96 %): кумарин, эскулетин; органические кислоты: янтарную, фумаровую, молочную, лимонную, муравьиную, хинную; фенолкарбоновые кислоты: галловую, кофейную, феруловую, кумаровую; дубильные вещества и каротиноиды [3, 30, 96, 142].

Настой из листьев крапивы и жидкий экстракт используют в качестве кровоостанавливающего средства при маточных, почечных, кишечных, легочных кровотечениях. Препараты крапивы усиливают свертывание крови, повышают антикоагулянтную и фибрииолитическую активность крови, способствуют увеличению содержания гемоглобина и эритроцитов, повышают тонус гладкой мускулатуры [3, 30, 80, 142]. Препараты, полученные из крапивы успешно применяются для лечения плохо заживающих ран, хронических язв. Известен способ получения хлорофилла, который успешно используется в фармацевтической и пищевой промышленности. Хлорофилл обусловливает тонизирующее действие, усиливает основной обмен, стимулирует грануляцию и эпителизацию пораженных тканей. Эффективны препараты крапивы при С-гипо и авитаминозах. Листья и корни в народе употребляют как мочегонное, противолихорадочное, противокашлевое средство [14, 76, 78, 116, 142].

Ноготки лекарственные - Calendula officinalis L., сем. астровых -Asteraceae. Цветочные корзинки содержат до 3 % каротиноидов: вилоксантин, каротин, ликопин, неоликопин, рубиксантин, флавохром, флавоксантин; флавоноиды: изорамнетин, рутин, нарциссин; тритерпеновые сапонины: календулозиды А, В, С, Дь Д2; смолы (до 3,4 %); слизи (до 4 %); дубильные вещества; эфирные масла (до 0,024 %); органические кислоты: яблочную (до 6,8 %), пентадециловую и следы салициловой; витамин С [71, 96, 153].

Галеновые препараты календулы обладают широким спектром фармакологической активности, применяются при воспалительных заболеваниях слизистой оболочки полости рта, ангинах; при лечении незаживающих ран, язв, пролежней, ожогов, фурункулов, лишаев; при язвенной болезни желудка, гастритах. Применение календулы в основном обусловлено ее бактерицидным, противовоспалительным, дезинфицирующим и ранозаживляющим действием [79, 92, 152]. В традиционной медицине цветки ноготков используются как мочегонное средство при мочекаменной болезни, как потогонное и как вяжущее, противовоспалительное, дезинфицирующее средство для лечения ран, язв, отморожений, конъюнктивитов, блефаритов, угрей.

2.2. Выбор оптимального соотношения ингредиентов растительной композиции.

С целью выбора оптимального соотношения ингредиентов, входящих в состав растительной композиции, было исследовано несколько вариантов растительных смесей (таблица 2.2.5)