Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Разработка экспресс-метода фармакологической и токсикологической оценки индивидуальных лекарственных средств и комплексных препаратов (составов) на одноклеточном организме Paramecium caudatum

"О од

На правах рукописи

ДАССАИЕ Чандрадутт Радж

MKH:G 01 N33/15

РАЗРАБОТКА ЭКСПРЕСС МЕТОДА ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ И

ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОЙ ОЦЕНКИ ИНДИВИДУАЛЬНЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ И КОМПЛЕКСНЫХ ПРЕПАРАТОВ (СОСТАВОВ) НА ОДНОКЛЕТОЧНОМ ОРГАНИЗМЕ PARAMECIUM CAUDATUM 15.00.02 - фармацевтическая химия и фармакогнозия 14.00.25 - фармакология

Автореферат диссертации иа соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Москва 1996

Работа выполнена в Московской меддицинской академии им И.М.Сеченова

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ

Академик РАЕН, Заслуженный деятель науки РФ, Доктор мсдидинских наук,Проф. А.Н.Кудрин

Оффицифальные оппоненты Доктор медицинских наук, Проф. Изюмов Е.Г Доктор химических наук, Проф. Ершов Ю.А

Ведущее учреждение-Государсвеипый медицинский университет им Н.И. Пирогова

Защита состоится...............................................................1996 г.

в..............часов на заседании диссертационного Совета Д-074.05.06 при

Московской медицинской академии имени И.М.Сеченова (Москва, Суворовский бульвар, д. 13)

С диссертацией можно ознакомится в фундаментальной библиотеке академии(Зубовский бульвар, 37/1)

Автореферат разослан............................................................1996 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Д-074.05.06 кандидат фармацевтических

наук, доцент Il.fi. Садчикова

- ] -

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ В последнее время отмечается тенденция к исползованию одноклеточных организмов (парамеции) в качестве тест-объекта для фармакологических и токсикологических исследований, т.к. они представляют собой ¡дашиатюрную копию многоклеточного организма. Ранее на кафедре фармакологии фармацевтического факультета впервые было установлено (Кудрин А.Н, Каторгина И.Ф.,1971), что в теле парамеции имеются те же самые функциональные системы и адренергические рецепторные образования, с помощью которых можно проводить скрининг новых синтетических веществ и фармакологическую оценку безопасности природных комплексных препаратов. Разработка экспресс-метода фармакологической опенки препаратов, извлечении из растений и пишевых добавок на парамециях янляется весьма актуальным для научных, педагогических и практических целей и экономически рациональным. ЦЕЛЬ И ОСНОВНЫЕ ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

- установление увствительностн и токсичности изучаемых препаратов на парамециях.

- изучение адаптогенной и рсзистогенной эффективности препаратов и комплексных составов, в частности антиоксиданттов- селенита натрия, витамина Е и их комбинации на парамециях при воздействии на них мембранных ядов - алкоголя, перекиси водорода.

- изучить влияние селенита натрия, витамина Е и их комбинации на парамеции в диапазоне от 1.10(-20) г/мл до дозы, вызывающей гибель парамеций.

- изучить влияние пороговой дозы и дозы, вызывающей максимальный фармакологический эффект, селенита натрия, витамина Е и их комбинации при

недельной экспозиции на выработку резистентности парамеций к средним и максмальным токсическим концентрациям алкоголя.

- установить широту безопасности комплексных составов: Элеутерококк, пантокрин, аралии, масла облепихового, безалкоголных и алкогольных напитков.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА Впервые было проведено изучение развития толерантности у парамеций к мембранному яду- алкоголю на фоне введения антиокемдантов (х-токоферола, селенита начрия п их комбинации, элеутерококка, аралии, облепихового масло)

Установлена для всех испытуемых веществ широта толерантности парамеций, которая характеризуется величиной изменения концентрации от пороговой до токсической.

Предложен биологический интегральный метод на парамециях для ориентировочной экспресс- оценки токсичности фармацевтических препаратов, различных веществ, экологической ситуации, а так же для выявления адаптационных свойств изучаемых веществ.

Предлагаемый нами метод на парамециях дает возможность оценить интегральные эффекты веществ на клеточном уровне для суждения о полезном и отрицательном влиянии различных веществ и комплексных составов в биологии, токсикологии и фармакологии. Практическая значимость работы

Разработан новый методологический подход к исползованию Paramecium caudatum в качестве тест-объекта для изучения клеточной фармакологии и токсикологии с целью оценки эффективности веществ, качества препаратов и различных экологических факторов.

Предложено исползовать парамеции в качестве объекта при проведении опытов на лабораторных занятиях по фармакологии, токсикологии и экологии. Положение вносимые на защиту:

I .Одноклеточный организм Р.Саи(ЗаШт можно исползовать в качестве объекта для фармакологических и токсикологических исследований индивидуальных веществ, комбинированных составов, фармацевтических препаратов, комплексных извлечений из природных объектов растительного, животного, минерального происхождения и лекарственного сырья.

2.При взаимодействий различных составов с Р. саиёаШт в острых опытах при наблюдении в течение 30-40 минут развиваются доза-зависимые интегральные явления:

а. Пороговая реакция в форме изменения движения, при увеличения дозы остановка движений. При дальнейшем увеличении дозы - изменение формы и дальнейшее увеличения дозы разрушение (лизис).

б. При сравнении этих доз между собой можно судить о степени нарастания фармакологических и токсикологических эффектов.

в. В хронических опытах при добавлений к среде парамеций пороговых доз, полученных в остром опыте, и доз которые менше и больше пороговых доз и при содержании их в течение 5-7 дней можно судить о влиянии веществ на скорость размножении (генетический эффект веществ) парамеций. Исползование этих парамеций на предмет изменения толерантности их к индикаторным веществам, позволяющим косвенно судить об изменении процессов адаптации у них к патогенным воздействиям.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ Результаты исследований доложены на научных конференциях кафедры фармацевтической химии (1993-1994г.) и фармакологии

(1994-1995г.); международной конференции фармацевтического факультета (март 1996г), и международной конференции "фундаментальные и прикладные проблемы охраны окружающей среды," 12-16 сентября 1995 г., г.Томск. Публикации

По теме диссертации опубликована 1 работа

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук Диссертационная работа выполнена в соответсвии с планом научных исследований ММА им И.М.Сеченова, союзной проблемой "Фармация" научного совета N.10 АМН Р.Ф. "фармакология и фармация"; частной проблемой"

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, и 6 глав, описывающих результаты экспериментальных исследовании, обсуждения результатов, общих выводов и списка использованной литературы. Диссертация содержит 165 страниц машинописного текста, 28 таблиц, 25 рисунков, 2 схемы. Библиографический указатель включает 101 источников литературы отечественных и зарубежных авторов.

Во введении сформулированы актуальность темы, цель и задачи исследования, научная новизна и практическая значимость работы приведены объем и структура диссертации.

В обзоре литературы содержаться сведения об структуре парамеции Глава 1 представляет Общая морфология парамеций. Глава 2 представляет влияние окружающей среды па парамеций. Глава 3 представляет влияние физических факторов на парамеций.

Глава 4 представляет влияние различных веществ на парамеций.

Глава 5 представляет нсползование парамеции для определения токсичности

комплексных составов.

Часть 2 представляет собственные экспериментальные исследования. 1 "лава 6 представляет методы фармакологического и токсикологического исследования веществ и различных комплексных составов на парамеции. Глава 7 представляет действии лекарственных веществ метаболического типа действия (витаминов) на парамеции.

Глава 8 представляет влкяние селенита натрия, а-токоферола (витамин Е) и их комбинации на выживаемость парамеции.

Глава 9 представляет влияние различных комплексных препаратов на парамешш.

Глава !0 представляет влияние на парамеций различных комплексных извлечений (экстрактов) из объектов исследования.

Глава 11 представляет обсуждение полученных результатов, выводы, и указатель литературы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Метод определение токсичности комплексных составов и отдельных веществ на инфузориях вида Paramecium caudatum

1. Содержание биологического объекта -

2. Метод визуального исследования: приборы - бинокулярная лупа с увеличением

Микроскоп с увеличением МБС - 9.

Стандартные предметные стекла высушенные, вымытые, предварительно протертые ватой, смоченной 70% этиловым спиртом (можно без спирта), пипетки глазные (другие объемом ОД мл). Физиологический раствор для промывания пинеток, дистиллированная вода для промывания пипеток. 3. Проведение исследования: на предметное стекло наносят три капли парамеций с количеством особей (парамеций) примерно от 8-10. Первую каплю оставляют для контроля, во вторую каплю с парамециями добавляют одну каплю исследованного вещества в концентрации 1.10(-6) г/мл, в третью каплю с концентрацией 1.10(-5) г/мл. При проведении исследований на парамециях большое значение имеет рН среды, в которой содержались парамеиин.Так показатели рП менее 5,0 и более 8,5 несовместимы с жизнью парамеций. При постановке экспериментов на парамециях ежедневно контролировался показатель рН среды, который был около 7,0, что является оптимальным для жизнедеятельности парамеций. Кроме этого, растворы испытуемых препаратов доводились до величины рП близкой к 7,0. Затем наблюдают 2 минуты за изменением движения. После этого стекло оставляют и закрывают целлофановым колпаком (во избежание высыхания) и через 15-20 минут вновь наблюдают за движением парамеций и отмечают характерные изменения в их поведении (движениях). После этого стекло снимают, закрывают колпачком и оставляют еше на 20 мнн, и вновь проверяют состояние парамеций. Такие сроки исследования необходимы для выяснения развития эффекта во времени и его устойчивости. Если эффект остановки движения парамеций устойчив, то в этом случае производят "отмывку" парамеций постепенным последовательным добавлением физиологического раствора: вначале одну каплю, если движения не восстановились через 5 минут, то добавляют вторую каплю, и если движения

не восстановились через 5 минут, то добавляют третью каплю, и если через еще 5 мннут восстановление движения не происходит, то делают заключение о необратимом эффекте - торможения парамеций. В случае восстановления движений парамеций после добавления одной, или двух капель считают эффект остановки за обратимый процесс торможения парамеций. Затем повышая концентрацию испытуемого состава или индивидуального вещества устанавливают концентрацию которая изменяет форму парамеций или вызывает их дегенерацию (распад парамеций). Затем вычисляют коэффициент нарастания токсичности путем деления смертельной концентрации на пороговую коицеитрацию.останавливаюшую парамеции.

В том случае, когда испытуемый состав в диапазоне концентраций ).10(-6) г/мл до 1.10(-3) г/мл не оказывает останавливающего и разрушающего эффекта, то проводят исследование с концентрациями 1.10(-2) до 1.10(-1) г/мл и в этом случае делают заключение об отсутствии токсичности состава на парамеции.

В том случае, когда концентрации индивидуального вещества или комплексного состава препарата в диапазоне 1.10(-6) и 1.10(-5) г/мл вызывает остановку парамеций, тогда исследование продолжают с уменьшенными концентрациями: 1.10(-6), 1.10(-7), 1.10(-8) г/мл и т.д., находя ту или те концентрации, которые вызывают их остановку. Затем подсчитывают коэффициент нарастания токсичности. После исследования результаты записывают в виде таблицы.

Составляют заключение о токсичности вещества для одноклеточного организма с указанием диапазона концентраций и соответствующего коэффициента. Определение влияния комплексных составов и отдельных веществ на генетический аппарат клетки (геном) интегральным методом-

осуществляют путем изучения размножения парамеций в присутствии испытуемого препарата в хроническом опыте. Для этого в среду с парамециями добавляют пороговую концентрацию препарата и концентрации, уменьшение в 5 и 10 раз по сравнению с пороговой и эти три концентрации испытывают на темп размножения парамеций в течение 7-8 дней. Через 1,2 и 3 дня начинают определять количество парамеций , их величину и подвижность. Острые и хронические методы исследования клеточной токсичности являются модельными по показателям на основные функции клетки - движение ц размножение парамеций.

4. Приготовление препарата (обьект исследования).

Готовят 2% маточный раствор или суспензию препарата в количестве 10 мл. Определяют рН препарата, и в остром опыте, проводят испытание исходного раствора на токсичность. К одной капле парамеций прибавляют 1 каплю испытуемого 2% раствора. В случае остановки или гибели парамеций делают последовательное десятикратное разведение от 3 до 5 и более порядков и их испытывают.

Туфелька (Paramecium caudatum) - одноклеточный организм - относится по общепринятой классификации к типу простейщих (Protozoa), классу Ciliata (ciliophora). Она занимает промежуточное положение между растениями и первичными животными организмами. Она имеет дифференцированные органеллы, структурные части и физиологические системы, жизнеобеспечения, размножения, обладая типичными признаками саморсгулируемого животного организма в экологическом окружении. В связи с этим парамецию можно рассматривать в качестве модели целого организма и отдельной клетки.

Ноэтому на парамеции были проведено острые и хронические оныты.В острых и хронических опытах под микроскопом наблюдали двигательные реакции, изменение формы и лизис парамеций.

Прн этом, вполне очевидно, что опыты на парамециях не исключают классических опытов фармакологии и токсикологии на других живых обьектах.

При естественном визуальном наблюдении парамеции код микроскопом и воздействии на нее различных химических и физических факторов можно наблюдать изменение функций по двигательными реакциям, а так же изменение общей структуры ее по изменению формы и лизису. Для анализа общих физиологических механизмов пармений были нсползованы фармакологические индикаторы.

В хронических опытах при содержании парамеций в течение нескольких дней в исследуемом составе можно определить влияние веществ или комплекса их на выработку толерантности у парамеций, а в специальных опытах изучить влияние на механизм размножения.

Проведение острых опытов на парамециях с неизвестными веществами целесообразно начинать с разведения 1.10(-10)г/мл. и, затем, повышая концентрацию на порядок:

10(-9); 10(-8); 10(-7); !0(-6); 10(-5); 10(-4); 10(-3); 10(-2); 10(-1) г/мл. при 30-минутной экспозиции или более. Затем устанавливают концентрации вещества по влиянию на движение и форму парамеций: пороговую, остановочную, изменяющую форму, вызывающую лизис. Определение этих концентраций и установление разницы или коэффициентов позволяет сделать суждение о степени нарастания фармакологического и токсикологического эффектов. Обнаруживается дозазавиеимый (концентрация-зависимый) эффект.

- 10В острых опытах экстракты элеутерококка и аралии в концентрациях от 2% до 15% оказывали наибольший защитный эффект при воздействии этанола на парамеций. 1% концентрации указанных экстрактов оказывали незначительный защитный эффект.Лантокрин был наименее активным.

В хронических опытах, после 2-х суточного пребывания парамеций в 2% растворах указанных адаптогенов, наблюдалось защитное действие к этанолу. 2% концентрации элеутерококка и аралии одновременно ускоряли темп деления парамеций. Поэтому можно полагать, что толерантность парамеций к этанолу является следствием активирующего влияния 2% концентрации экстракта элеутерококка и аралии. Пантокрин не оказал заметного влияния. Повышение толерантности к этанолу наблюдалось в течение 2-4 суток, а через 5 и б суток она утрачивалась. Таким образом, эффект повторной дачи адаптогенов можно проверить на лягушках через 4 суток. Если он подтвердится, то можно полагать, что составные части комплексных экстрактов быстро (опыты острые) и прочно соединяются с молекулами парамеций (опыты хронические). 1% концентрация образцов элеутерококка и аралии, имеющихся в продаже, и приготовленных в нашей лаборатории, обладала незначительным толерантным эффектом. Удивительно то, что концентрации этих адаптогенов !.10(-5) г/мл проявили тенденцию к повышению толерантности парамеций при более длительном содержании их. Однако, эти данные следует проверить и обсудить при использовании веществ, повышающих проницаемость мембран. 20% эмульсия облепихового масла из района озера Иссык-Куль при экспозиции от 1-го до 7 дней умеренно повышает толерантность к этанолу и ускоряет незначительно темп размножения парамеций. Три образца меда 20% концентрации из района

озера Иссык-Куль не оказали заметного влияния на развитие толерантности к этанолу и на темп размножения парамеций.

По критерию остановки движений парамеций все исследованные безалкогольные напитки оказались отчетлива токсичными в разведении 1:1, т.е. в 50% концентрации. Фанта вызывала мгновенную остановку движения парамеций с изменением формы парамеций в виде палочек, что свидетельствует о структурных изменениях тела парамеций, связанных с изменением мембран и стеноп парамеций. Под влиянием остальньсс напитков остановка происходила через 1-2 минуты без изменений формы.

Напитки: Hershi-cola, Pepsi, Crush-lemon в разведении 1:4 вызывали остановку парамеций через 10-15 минут. Поэтому для исключения прямого токсического влияния на слизистую желудка их необходимо развести в 5 или более раз, а сравнительно менее токсичные напитки: Coca-cola, Sprite-lemon в 3-4 раза. Наиболее токсичной является Fanta.

Она еше в разведении 1:8 вызывает резкое возбуждение, парамеций а в разведении 1:4 после резкого возбуждения уже через 5 минут наступает их остановка. Поэтому для исключения отрицательного влияния Fanta на слизистую желудка, ее целесообразно разводить в 10 раз. После деароматизации возбуждающее действие и токсичность напитков несколько уменьшается, но характер угнетающего токсического действия заметно не изменяется. Изученные напитки в малых концентрациях (в 3-4 раз меньше пороговой) не оказали заметного влияния на размножение парамеций.

Оценку крепких алкогольных напитков можно производить по сравнению концентраций, которые вызывают постепенную остановку, быструю остановку, изменение формы и лизнс. По показателю постепенной остановки пармеций

спмрт этиловый технический в 2 раза токсичней (3-4%) спирта этилового медицинского (6-7%). По показателю мгновенной остановки парамеций токсичность водки "Абсолют" и "Распутин" была одинаковой и не превышала токсичность. спирта этилового медицинского (8-17%), но они несколько превышали токсичность водки "Игорь Арланов",-бальзамов: "Амрита", "Бурятия", "Рижский' бальзам", "Бальзам Биттнера". Незначительное уменьшение токсичности бальзамов может быть связано с наличием на которых готовятся бальзамы. "Бальзам Биттнера" показал менее отчетливое токсическое действие на парамеций в повышенных концентрациях. 22% концентрации бальзам Биттнера вызывал лизис парамеций, а другие бальзамы вызывали лизис в концентрации 18-20%. В разряде первоначальных пороговых концентрациях токсичность всех изученных бальзамов была одинаковой. При определении токсичности спиртных напитков наиболее информативным является показатель пороговой концентрации, вызывающей постепенную остановку парамеций в течение 10-15 минут. Если на этикетке бальзама указана концентрация спирта выше 40%, тогда для сравнения токсичности необходимо брать (контроль) спирт медицинский соответствующей концентрации.

При изучении 8 образцов чая были обнаружены количественные различия биологической активности различных образцов. Пороговая активность по показателям замедления и остановки движений парамеций обнаружена: китайский чай, черный байховый, ароматизированный ромашкой аптечный, зеленый, цейлонский, и турецкий чай. Они в концентрации инфуза 1.10(-1)г/мл (т.е. в 10% разведении приготовленного инфуза) вызывали постепенную остановку парамеций.

- L3 -

Пороговая активность но этим же показателям обнаружена у чая азербайджанского которая составлена концентрацию 3.!0(-2) (т.е. в 3% разведении инфуза). Пороговая активность поэтим же показателям обнаружена у чая Big-Ben в концентрации 2. 10(-2) (т.е. в 2 % разведении инфуза). По убывающей активности разведения инфузов чаев на парамеции можно расположить в следующем порядке: Big-Ben (2%) >, азербайжданский 3%, затем: китайский = черный байховый = зеленый = цейлонский = турецкий (все они равнозначны в 10% разведении). Обращает на себя внимание тот факт, что инфуз из смеси чая краснодарского с 15% зверобоем, и инфуз из смеси чая черного байхового с ромашкой оказались активными в концентрации 1Д0(-2) г/мл (т.е. в 1% разведении инфуза). Они вызывали остановку и изменение формы парамеций, что свидетельствовало об изменении структуры парамеций, как показателя деструктивного влияния на протоплазму. В ряде опытов краснодарский чай со зверобоем при большом разведении инфуза (2:10(-3) г/мл, т.е. 0,2% разведения инфуза) оказывал тормозящее влияние на парамеций. Чай байховый с ромашкой при еще большем разведении инфуза (1.10(-3) г/мл, т.е. 0,1% разведения инфуза) оказывал тормозящее влияние на парамеций. Эти наблюдения свидетельствуют о том, что ароматизация чая зверобоем и ромашкой аптечной увеличивает отчетливо его специфическое тормозящее действие на парамеций. Подобное повышение активности безалкогольных напитков мы наблюдали под влиянием ароматических добавок к ним. В связи с этим можно полагать, что парамеции чувствительны к добавкам, содержащимся в натуральном продукте.

Зеленый чай обнаружил высокую пороговую активность при разведении инфуза 1.10(-3) г/мл (т.е. в 0,1% разведении инфуза) он вызывая замедление

движений парамеций. Зеленый чай отличается от черного байхового чая отсутствием специальной обработки и ферментации и представляет собой 2-3-х листные побеги-флеши чайного куста. Процесс обработки зеленого чая включает завяливание, склучивание, при которых увеличивается доля экстрактивных веществ. Приготовление черного чая включает ферментацию, при которой происходят изменения чайного листа. Качество чая определяют орпшолептически по цвету, аромату, вкусу, микроскопии. Нами предпринята попытка биологического определения качества чая. Сделаны первые шаги на этом пути. Нами обнаружены показательные различия во влиянии 8-ми разных сортов чая в форме зависимости эффектов от концентрации инфуза. Можно выработать стандартные .условия для оценки качества и экологической безопасности сортов чая,имеющихся в продаже, на основании сравнения их с образцами, выращенными в условиях экологической чистоты в питомниках, а так же раскрытия физиологического механизма замедлений движения ресничек и полной остановки парамеций.

В действии кофе и чая проявились различия. Пороговые концентрации всех образцов кофе вызывали стимуляцию подвижности парамеций. Образцы экстрактов кофе "Арабика" в зернах, Бразильского в гранулах вызывали стимуляцию подвижности парамеций в концентрациях 1.10(-3)г/мл (т.е. в 0,1% концентрации).

Торможение подвижности от кофе "Арабика" наступало в концентрации 2.10(-2) г/мл (т.е. в 20% концентрации) а остановка с изменением формы парамеций в концентрации 1.10(-!)(г.е. 10% концентрации). Извлечения бразильского кофе по влиянию на парамеций примерно равнозначны извлечениям из кофе "Арабика".

Извлечения из растворимого кофе "Cacique" и растворимого индийского подействовали на парамеций одинаково. Извлечения из них в концентрации 2.10(-3) г/мл (т.е. 0,2% концентрации вызывали стимуляцию подвижности парамеций. По пороговому возбуждающему показателю эти два сорта (Cacique и индийский) кофе менее активны (в 2 раза), чем "Арабика" и в гранулах и растворимый.

По показателям остановки парамеций все четыре сорта кофе одинаковы.

Имеются небольшие различия в первоначальной тормозной концентрации (в 2 раза). Растворимые сорта Cacique и индийский начинают тормозить движение парамеций уже в концентрации 1%, а сорт "Арабика" и в гранулах начинает тормозить движение парамеций только в 2% концентрации, т,е. они обладают в 2 раза меньшей тормозной активностью, чем быстрорастворимые сорта кофе. Поэтому можно сделать заключение, что кофе сорта "Арабика" и бразильский в гранулах в 4 раза превосходит растворимые сорта кофе, так как сорт "Арабика" в 2 раза слабее по тормозящему эффекту и в 2 раза активнее по стимулирующему эффекту.

Особое внимание обращает на себя зеленый кофе в зернах. Экстракт из зеленых зерен кофе не обладает заметным стимулирующим влиянием на парамеции и. тем самым, качественно отличается в своем физиологическом действии от 4-х изученных сортов кофе, которые в первоначальных концентрациях стимулируют движение парамеций (1.10(-3); 2.10(-3) г/мл). При изучении витаминов была обнаружена у них заметная активность. Никотиновая кислота и пнрндоксин в концентрации 1.10(-6) г/мл, цианокобаламин при контакте с парамециями стимулировали ее движения, а через 10-15 минут она возвращались к прежнему состоянию. При увеличении

концситрации никотиновой кислоты до 1.10(-5) г/мл, а ниридоксина, витамина В12 до 1.10(-3) г/мл происходила остановка парамеций. Под влиянием никотиновой кислоты в концентрации 1.10(-1) р-р произошел лизис. Пиридоксин и цианокобаламип (витамин В12) лизиса парамеций не вызывали. Витамин Е (а-токоферол) вызвал ускорение движения 1 ЛО(-З) г/мл, а в большой дозе - 1.10(-2) - 1.10(-1) г/мл наступала остановка без лизиса. Аскорбиновая кислота в широком диапазоне доз от 1.10(-9) до 1.10(-2) не изменяла движения парамеций.

Результаты опытов с витаминами группы В (РР, В6, В12) показали, что способны активировать двигательную систему парамеций.Витамины группа В в малой концентрации (1.10(-6) г/мл). Никотиновая кислота уже при небольшом увеличении в концентрации (1.18(-5) г/мл) способна тормозить двигательную систему. Феномен торможения сократительных актомиозиновых нитей, вызываемых никотиновой кислотой, находит использование в медицине для расслабления гладких мышц. 2% р-ра никотиновой кислоты и выше не оказывает токсического воздействия на мембраны парамеций (изменение формы тела), что исключает деструктивное влияние больших доз ее на мембранный скелет. Другие испытанные витамины в больших лозах также не влияют разрушающим образом на структуру мембран.

В связи с этим можно полагать, что стимулирующее влияние малых доз (малых концентраций) и отсутствие разрушающего действия больших концентраций на структуру тела парамеций является одним из признаков безопасности изучаемого состава.

Под влиянием метаболических макроэргических соединений обнаружилась необычная картина. Под влиянием кокарбоксилазы развился 3-х фазный эффект

- 17в зависимости от ее концентрации. В малых пороговых концентрациях (1.10(-7) г/мл) кокарбокснлаза вызывала ускорение движений, а в последующих трех средних концентрациях (1.10(-6); 1.10(-5); 1.10(-4) г/мл) наступило торможение, сменившееся возникновением движений к краю капли. У АТФ первая возбуждающая фаза не наблюдалась. При концентрациях !.10(-б)-1.10(-4) возникло торможение, сменившееся при концентрации 1.10(-3) на вращательные движения парамеций.

Под влиянием фосфотиамина (монофосфата витамина В1) первоначальное замедление движений у парамеций было только от двух концентраций (1.10(-6), 1.10(-5) г/мл), а затем возникло ускорение от концентрации 1.10(-4) и 1.10(-3) г/мл. По внешней картине действия этим соединениям свойственно регулирующее влияние, которое наиболее отчетливо проявляется у кокарбоксилазы (дифосфага витамина В1). Все три соединения в средних дозах вызывают торможение движений, а в больших (1.10(-3)г/мл) активацию. Однако, выяснение механизма этого явления потребует специальных исследований.

Исследование селенита натрия в сверхмалых малых концентрациях 1,10(-18) до ).10(-5) на парамециях не выявило токсического влияния на них . Эти же концентрации в хронических опытах' (от 1 до 7 суток) не оказывали отрицательного влияния на размножение парамеций.

Однако при содержении парамеций в растворах селенита натрия в малых концентрациях (1.10(-8)-1.10(-6) г/мл) в хронических опытах (от 1 до 7 суток) наблюдалн тенденцию к повышению толерантности к алкоголю. По методике М.С. Ирлнной (1967 г.) при дробном последовательном добавлении к парамециям ранее выдержанных в растворе селенита натрия, имела тенденция к

переносимости алкоголя в более высоких концентрациях, чем в контроле. Под влиянием очень малой концентрации селенита натрия (1.10(-Я) г/ мл толерантность к спирту имеет тенденцию к повышению на 2 %, при концентрации 1.10 (-7) г/мл на 3 %, а под влиянием концентрации 1.10(-6) г/мл отсуствует гибель от пороговых токсических концентраций спирта не наблюдается по сравнению с интактными парамециями.

При повышении концентрации спирта до 14 % отмечается 30% гибель парамеций при добавлении селенита натрия в среду с парамециями,а без него -51%.

Таким образом, однократно добавляемая концентрация селенита натрия 1.10(-6) г/мл в среду с парамециями уже на 2-3 сутки заметно повышает выносливость парамеций к этиловому спирту (в пределах концентрации до 14 %) и эта толерантность сохраняется в течение 7 суток (более длительное наблюдение может быть предметом специальной работы). Алкоголь относится к ядам, которые вызывают нарушение структуры и функции мембран. При исследовании другого вещества першдроли (перекись водорода), вызывающим деструкцию липидной части мембраны путем перекисного окисления,добавление селнита натрия в концентрации (1.10(7) - 1.10(-6) г/мл) в среду с парамециями, уже через 2-3 дня заметно повышает устойчивость их к пергидролю. Селенит натрия в концентрации 1.10(-6) г/мл полностью защитил парамеций от 2 % р-ра пергидроля. Повышенная толерантности парамеций сохранялась и при увеличении концентрации пергидроля до 12 %, но степень защиты уменьшалась. В этих опытах заметно проявилась высокая актпоксидантная зашита селенита натрия. Эмульсия витамина Е в малых концентрациях (1,10(-5) - 1.10(-6) г/мл) способствовала заметному умеренному

ускорению размножения парамеций, начиная с суточного содержания их и до 7-м!1 дневного. При этом выявлялась у парамеций тенденция к повышению толерантности к этиловому спирту лишь в пределах 10%. Зато заметно повысилась толерантность парамеций к пергидролю, примерно в пределах 15%, что совпадает с общепринятой теорией о стабилизации мембран витамином Е и его антиоксидантными свойствами. При сочетании селенита натрия с витамином Е проявился синергизм в отношении ускорения размножения парамеций до умеренных размеров (14%), толерантность к этиловому спирту возросла примерно до 15%, толерантность к пергидролю осталась в прежних размерах, свойственных каждому веществу в отдельности. При этом была полная защита парамеций от действия малых (пороговых) концентраций алкоголя и пергидроля. Степень толерантности парамеций при повышении концентраций алкоголя в пергидроля постепенно уменьшалась. Наши данные о повышении толерантности одноклеточного организма-парамеции совпадают с известными данными о повышении толерантности целого организма. Интересно то, что селенита натрия в хронических опытах на парамециях оказывает положительное влияние в концентрациях в 100 раз меньшей (1.10(-7) г/мл) той концентрации, которая не оказывает заметного влияния на парамеции в острых опытах и в 1000 раз меньшей токсической (1.10(-4) г/мл). Витамин Е в концентрациях 1.10(~4) и 1.10(-3) г/мл вызывает лишь торможение движения парамеций без последующего лизиса (токсического эффекта). Опыты показали, что а-токоферол активен в очень малых концентрациях (1.10(-6)-1.10(-5) г/мл) и в своей активности уступает селениту натрия на один-два порядка (1.10(-7)-1.10(-8) г/мл). Степень активности этих веществ, полученная на парамециях, сопоставима с активностю на теплокровных животных.

Для представления о возможности влияния исследуемого вешества на генетические процессы проводился опыт с изучением влияния малой концентрации (не более 1/20 части от действующей дозы или концентрации) вешества или состава (экстракта) на скорость размножения парамеций при экспозиции от 3 до 7 дней. Если эта малая концентрация испытуемого вещества не задерживает размножение, то тогда можно сделать заключение о экологической безвредности его в случае торможения размножения можно ориентировочно суждить об его экологической вредности. Выводы

1. Разработан экспресс-метод для фармакологической и токсикологической оценки безопасности индивидуальных веществ, комбинированных составов, комплексных экстрактов с использованием интегральных показателей двигательной активности, изменения формы парамеций в острых опытах и темпа размножении и выработки толерантности к фармакологическим и токсическим индикаторам в хронических опытах.

2. В хронических опытах на парамециях (при экспозиции 1-6 суток) с помощью разработанного метода была установлена генетическая токсичность или безопасность веществ и комплексных составов по показателыо размножения парамеций при действии на них концентраций веществ в 20-400 раз меньшей, чем пороговых концентраций в острых опытах.

3. Витамины РР, В6 и Е в малых концентрациях вызывали возбуждение движения парамеций; при увеличении концентрации указанных веществ наступала остановка движений без явления лизиса парамеций.

4 Вещества метаболического тина действия (АТФ, кокарбоксилаза, фосфотиампн), содержащие фосфатные связи обладают регулирующим

влиянием на движения ресничек парамеций, обнаруживая стимулирующее и тормозящее действие,которое наиболее отчетливо проявляется у кокарбоксилазы.

5. В хронических оныатах концентрации селена от 1.10(-8) г/мл до 1.10(-5) г/мл (средние 1.10(-7) -1.10(-6) г/мл) умеренно повышают толерантность парамеций к токсическим концентрациям .этилового спирта, заметно повышают толерантность к стимулятору (инициатору) перекисного окисления пергидролю, перекиси водорода.

6.В хронических опытах на парамециях было установлено, что витамин Е в,концентрациях (1.10(-6) - 1.10(-5) г/мл), экстракты элеутерококка, аралии, 20% эмульсия облепихового масла и растворы меда не оказывают токсического влияния на парамеции и повышают толерантность парамеций к алкоголю и пергидролю.

7. Безалкогольные напитки оказались токсичными в разной степени. Их можно расположить по степени пороговых токсических разведений в следующий убывающий ряд : Fan fa (1:8) > Hershi - cola (1:4) = Pepsi (1:4) = Crush - limon (1:4) > Coca - cola (1:2) > Sprite - lemon(l:l).

8. Токсичность спиртовых бальзамов:" Амрита ", "Бурятия", "Биттнера", "Рижский", водка "Игорь Арланов" для парамеций оказалась одинаковой и была равна токсичности спирта этилового медицинского.

Токсичность водки:"Абсолют" и "Распутин" превышала токсичность указанных составов по показателю быстрой остановки парамеций.

9. Проведена оценка биологической активности различных сортов чая и кофе на двигательную активность парамеций в острых опытах. Наибольшую биологическую активность проявили образцы чая в следующем порядке: чай

зеленый-,чай краснодарский с добавлением зверобоя -,чаи байховый с добавлением ромашки-, май Big-Ben. Экстракты различных образцов поджаренного и быстрорастворимого кофе вызывают первоначальную стимуляцию движения парамеций. При увеличении дозы наступает торможение парамеций с последующей их остановкой. Стимулирующее влияние на парамеции кофе "Арабика"," Бразильское кофе" в гранулах было в 4 раза выще, чем быстрорастворимого кофе марки: Cacique и Индийский. СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1.0 возможности биологического тестирования токсичности индивидуальных веществ и комплексных извлеченийй из объектов окружающей среды на одноклеточном организме -Парамеииум каудатум

Кудрин А.Н., Зацепилова Т.А., Дассайе Ч., Акимов II.П., Преферанская Н.Г., Чубарев В.Н

(Международная конференция "Фундаментальные и прикладные проблемы охраны окружающей среды" 12 - 16 сентября 1995 г., г. Томск Тезисы докладов 2 том